Isolamento e Purificao de Biomolculas Aula 04

CFBio 2010 Emanuel Carrilho

P2. INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA 12. Tcnicas/Escopo 12.a. Cromatografia por adsoro 12.b. Cromatografia por partio 12.c. Cromatografia por pareamento inico 12.d. Cromatografia quiral 12.e. Cromatografia por bioafinidade 12.f. Cromatografia por troca inica 12.g. Cromatografia por excluso

POLARIDADE DO SOLUTO

ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LQUIDO espcies MM>104: cromatografia por excluso espcies inicas de baixa MM: cromatografia por troca inica espcies pequenas e polares, mas no-inicas: mtodos de partio (srie homloga)
massa molecular

insolvel em gua no-polar polar no-inico

solvel em gua inico

102 103 104 105 106

ADSORO

PARTIO fase normal fase reversa

TROCA INICA

permeao em gel EXCLUSO filtrao em gel

espcies no-polares: cromatografia por adsoro (ismeros estruturais, hidrocarbonetos alifticos)

Figura 28-1 Skoog p642 vp

CROMATOGRAFIA POR ADSORO

fase mvel fase estacionria

CROMATOGRAFIA POR PARTIO

fase mvel fase estacionria

Polaridade da fase mvel

CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL Polaridade do soluto: Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente a > b > c c b a

tempo

tempo

polares, como gua e trietilenoglicol adsorvidos sobre slica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou ter isoproplico, eram usados como fase mvel; por razes histricas, este tipo de cromatografia chamado de fase normal

Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da fase mvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluio

Polaridade da fase mvel

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Polaridade do soluto: a > b > c a b c

Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionria apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase mvel relativamente polar (gua, metanol, acetonitrila, etc)

tempo

tempo

Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da fase mvel aumenta-se o tempo de eluio

EFEITO DO COMPRIMENTO DA CADEIA

Cadeias mais longas produzem recheios mais retentivos.

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA

cromatografia por troca inica (IC, ion exchange chromatography) ou cromatografia de ons: mtodos de separao e determinao de ons com base em resinas de troca inica desenvolvida durante o projeto Manhattan para a separao de ctions de terras raras com propriedades semelhantes, com resinas trocadoras de ctions; esse trabalho forneceu a base terica das separaes por troca inica e, aps a Segunda Guerra, foi estendido a outros tipos de materiais; deteco era feita por medidas de condutividade; hoje em dia outros detectores so possveis falta de um detector sensvel para as espcies inicas eludas retardou o desenvolvimento da tcnica moderna; em 1975, Dow Chemical Company, introduziu o conceito de supresso do eluente, tornando possvel a deteco condutomtrica em linha

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA

PRINCPIO: equilbrios de troca entre ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido (resina ou polmero de alta massa molecular e insolvel) trocadores de ons naturais: argila e zelitas foram usados por dcadas trocadores sintticos: produzidos em 1930, para amolecer a gua, nos processos de desionizao da gua e purificao de solues stios ativos mais comuns nos trocadores de ctions: grupo cido sulfnico -SO3-H+ (cido forte) e grupo cido carboxlico COO-H+ (cido fraco) stios ativos mais comuns nos trocadores de nions: grupos amina terciria N(CH3)3+OH- (base forte) e grupos amina primria NH3+OH- (base fraca)

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA

Quando um trocador inico de cido sulfnico colocado em contato com uma soluo aquosa contendo o ction C, o equilbrio de troca estabelecido o seguinte:

x RSO3-H+ + Cx+ (RSO3-)xCx+ + x H+

slido soluo slido

soluo

analogamente, um trocador de nions interage com o nion A segundo a reao:

y RN(CH3)3+OH- + Ay- (RN(CH3)3+)yAy- + y OHslido soluo slido soluo

MECANISMO DE TROCA

B+ C2+
X+ X+ X+

Z+

W+

X+

B+ C2+
X+

C2+ B+
X+ X+

Z+

C2+
Z+

W+ Z+

W+ W+

X+ X+

X+

X+

C2+ B+ c

X+

X+ X+ X+

B e C: analitos X, Z e W: so ons contidos nos eluentes

+ B B+ + B

C2+ C2+ C2+ d

W+ Z+ W+ W+ W+

MECANISMO DE TROCA

B+ C2+
X+ X+ X+

B+

C2+

X+

C2+ B+
X+ X+ X+ X+ X+ X+

(a): trocador catinico est em equilbrio com o eluente inicial X+; B+ e C2+ so materiais a serem separados (b): quando determinada quantidade da amostra introduzida na coluna, ocorre uma reao de troca liberando quantidade equivalente de X+, anteriormente ligado matriz

MECANISMO DE TROCA Z+

B+

C2+

Z+

C2+
Z+

C2+ B+

C2+

(b): aps a adsoro do analito na resina, aplicado um eluente que contm ons Z+, com uma afinidade um pouco maior pelos grupos trocadores da resina (c): os ons Z+ iro provocar a liberao da substnca B+, ligada mais fracamente resina que a substncia C2+

B+ + B B+ + B

MECANISMO DE TROCA W+ Z+

C2+
Z+

W+ Z+

W+ W+

C2+

(c): passando a seguir o segundo eluente, contendo os ons W+, com maior afinidade pela matriz, haver liberao do material C2+ (d) e, assim a separao de B+ e C2+ foi obtida

C2+ C2+ C2+ c d

MECANISMO DE TROCA X+ W+ Z+ W+ W+ X+ X+ X+
(d): a remoo dos ons de maior afinidade pela resina, que X+ , ou seja W+ e Z+, pode ser conseguida se concentraes crescentes de X+ forem usadas (volumes de 5-10 vezes a capacidade da resina) (e): o equilbrio entre a fase mvel e estacionria alcanado, o menor grau de afinidade de X+ pela resina superado e a resina est regenerada para outra aplicao de amostra

X+

W+ Z+ W+ W+ W+

PERFIL DE ELUIO
medida relativa das substncias

B+

C2+

X+

Z+

W+

X+
volume do efluente

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA

FASES MVEIS MAIS COMUNS: solues aquosas que podem estar tamponadas ou conter quantidades moderadas de um solvente miscvel com gua fora e seletividade so moduladas pelo tipo e concentrao dos aditivos (sal e solvente) FASES ESTACIONRIAS MAIS COMUNS: resinas de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, na qual so ligados grupos inicos pelicular: leito polimrico ou vtreo esfrico no poroso recoberto com resina micropartculas porosas de slica recobertas com filme do trocador

GRUPOS TROCADORES
o tipo de grupos ligados matriz classificam os trocadores inicos de fortes, mdios e fracos. grupos forte so aqueles ionizados em grande faixa de pH grupos mdios e fracos: grau de ionizao influenciado pelo pH, e a capacidade de troca varia com o pH

capacidade

capacidade

TROCADORES FORTES

bsicos

TROCADORES FRACOS

cidos

cidos

bsicos

14

14

pH

pH

CAPACIDADE DE TROCA
medida da quantidade de troca de ons que pode ocorrer entre a matriz e os ons presentes na fase mvel capacidade total a quantidade de grupos carregados, ou potencialmente carregados, que podem ser trocados por grama de peso seco do trocador; a capacidade total expressa em meq/g ou meq/100 mL de suspenso de resina, sendo determinado por titulao capacidade disponvel a capacidade real do trocador sob determinadas condies; ela dependente de vrios fatores como a fora inica, pH, e temperatura do eluente amostra: a quantidade de amostra que pode ser aplicada em um trocador inico depende de sua capacidade de troca; no deve exceder 1-5% da capacidade total do trocador

SELETIVIDADE
Considere a reao de troca do cation B+ na resina sulfnica:

RSO3-H+ (s) + B+ (aq) RSO3-B+ (s) + H+ (aq)

a eluio da resina com soluo cida diluda desloca o equilbrio para a esquerda, fazendo com que parte dos ons B+ na fase estacionria seja transferida para a fase mvel; esses ons movemse coluna baixo numa srie de transferncias sucessivas entre fase estacionria e mvel O equilbrio governado pela constante:

Ktr =

[RSO3-B+]s . [H+]aq [RSO3-H+]s . [B+]aq

SELETIVIDADE
Rearranjando temos:

[RSO3-B+]s [B+]aq

= Ktr

[RSO3-H+]s [H+]aq

durante a eluio, a concentrao de H+ muito maior que a concentrao de B+ na fase mvel alm disso, o trocador tem um nmero aprecivel de stios disponveis para troca de B+ Assim, quando [H+]aq >> [B+]aq e [RSO3
- H+ ] s

[RSO3-B+]s [B+]aq

= K =

CS CM

>> [RSO3

-B +]

o lado direito da equao acima constante

constante de distribuio

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA RSO3-H+ (s) + B+ (aq) RSO3-B+ (s) + H+ (aq) [RSO3-B+]s . [H+]aq [RSO3
- H+ ] s

Ktr =

Ktr representa a afinidade da resina pelo on B+ em relao ao ons H+ quando Ktr grande significa que existe uma grande tendncia da fase reter B+

[B+]

aq

para H+ como on de referncia tm-se: ons polivalentes so mais fortemente retidos que espcies monocarregadas; para grupos de ons de mesma carga, diferenas de reteno aparecem devido ao grau de hidratao e outras propriedades o trocador inico prefere: ons que tm alta carga, seguido de ons que tm pequeno tamanho (solvatado), ons altamente polarizveis e por fim ons que tm interaes fracas com a fase mvel

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA

Para uma resina de troca catinica, os valores de Ktr decrescem na ordem para ctions monovalentes: e ctions divalentes:

Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+

Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+
Para uma resina de troca aninica, os valores de Ktr decrescem na ordem:

SO42- > C2O42- > I- > NO3- > Br- > Cl- > HCOO- > CH3COO- > OH- > F-

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA em colunas supressoras de eluente

inicialmente, a cromatografia de troca inica era praticada em materiais com alta capacidade de troca: aplicao restrita devido eficincia moderada e a falta de um detector genrico que permitisse a determinao quantitativa dos ons eludos da coluna escolha bvia: detectores por condutividade que so altamente sensveis, universais para espcies carregadas, respondem de forma previsvel a mudanas de concentrao; simples de construo e manuteno barata, fceis de serem miniaturizados e comumente funcionam por longo tempo sem problemas limitao sria: era mecessria uma alta concentrao do eletrlito (fase mvel) para eluir a maioria dos analitos inicos em um tempo razovel; como conseqncia, a condutividade dos componentes da fase mvel tendia a sobrepujar a dos analitos, reduzindo acentuadamente a sensibilidade do detector

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA em colunas supressoras de eluente

o problema da alta condutncia do eluente foi resolvido com a introduo da chamada coluna supressora de eluente, posicionada imediatamente aps a coluna analtica de troca inica a coluna supressora recheada com uma segunda resina de troca inica que efetivamente converte os ons da fase mvel a espcies moleculares de ionizao limitada, sem afetar os ons do analito

REAO NA COLUNA SUPRESSORA

quando ctions (analito) esto sendo separados, freqentemente utilizado HCl como reagente eluente e a coluna supressora uma resina de troca aninica na forma de hidrxido o produto da reao no supressor gua

H+(aq) + Cl-(aq) + Resina+OH-(s) Resina+Cl-(s) + H2O

REAO NA COLUNA SUPRESSORA

na separao de nions (analito), eluentes comuns so carbonato ou bicarbonato de sdio e a coluna supressora um trocador de ctions na forma cida

Na+(aq) + HCO3-(aq) + Resina-H+(s) Resina-Na+(s) + H2CO3

O EFEITO DA SUPRESSO
eluente: NaOH coluna analtica: troca aninica amostra: F-, Cl-e SO42OHS SEM SUPRESSO Cl-

SO42-

contraons

rudo
S

NaF, NaCl e Na2SO4 em NaOH Na+ (lixo) H+ (regenerador) HF, HCl e H2SO4 em H2O

coluna supressora: troca catinica H+

SUPRESSO QUMICA

Cl-

SO42-

F-

tempo

O EFEITO DA SUPRESSO
condutncia equivalente inica (S.cm2/eq) concentrao (mol/L)

exemplo

eluente: 5 mmol/L

G =

(+ + -) C 1000

Supressor-H+ + NaOH Supressor-Na+ + H2O

constante da cela (cm-1)

condutncia do eletrlito (microSiemens, S)

Na+ = 50 S.cm2/eq OH- = 198 S.cm2/eq = 10 cm-1

G = (50+198).5x10-3/104 = 124 S GH2O = 0,05 S

condutncia do eluente decresce 104 vezes aps supresso

O EFEITO DA SUPRESSO (+ + -) C 1000

NaF, NaCl e Na2SO4 em NaOH

exemplo

analito: 1 mmol/L G =

aps supresso HF, HCl e H2SO4 em H2O GNaCl = (50+76,3).1x10-3/104 = 12,6 S GHCl = (380+76,3).1x10-3/104 = 45,6 S condutncia da banda do cloreto aumenta 3,6 vezes aps supresso

Na+ = 50 S.cm2/eq H+ = 380 S.cm2/eq F- = 55 S.cm2/eq Cl- = 76,3 S.cm2/eq 1/2SO42- = 79,8 S.cm2/eq = 10 cm-1

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA regenerao das colunas supressoras

inconveniente do uso de colunas supressoras: necessidade de regenerao peridica (8-10h) para converter a coluna a sua forma original cida ou bsica uso de duas colunas supressoras: enquanto uma das colunas usada como supressora (retm Na+, supressor-Na+), a outra condicionada pela passagem do eluente (HX, supressor-H+); quando a primeira coluna satura (7-12h), uma vlvula dirige o fluxo para a segunda coluna e assim sucessivamente, e novamente o sistema pode ser usado por ais 7-12 h. membrana supressora sistemas eletrolticos

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA membranas supressoras

coluna analtica

prcoluna injetor reservatrio do eluente bomba para eluente

SISTEMA DE REGENERAO RSO3Na coluna de troca catinica coluna supressora (membrana)

RSO3H

bomba para regenerante

detector RSO3H R = alquilbenzeno de cadeia longa

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA membrana supressoras

ELUENTE
RSO3Na RSO3Na resina de troca catinica RSO3Na forte tubo canal externo membrana permevel RSO3H canal do RSO3H eluente RSO3H

ELUENTE

R = alquilbenzeno de cadeia longa