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Vigilncia Sanitria Digital 1

DECRETO N 96.607, DE 30 DE AGOSTO DE 1988


DOU de 31/08/1988 - Suplemento

Aprova a Parte I da Quarta Edio da Farmacopia
Brasileira Generalidades e Mtodos de Anlise e d
outras providncias.

O PRESIDENTE DA REPBLICA, usando das atribuies que lhe confere o art. 81, item
III, da Constituio,

DECRETA:

Art. 1 Fica aprovada a Parte I da Quarta Edio de Farmacopia Brasileira
Generalidades e Mtodos de Anlise que a este acompanha, elaborada pela Comisso
Permanente de Reviso da Farmacopia, do Conselho Nacional de Sade.

Pargrafo nico. delegada ao Ministro de Estado da Sade competncia para aprovar a
Parte II da Farmacopia Brasileira monografias sob forma de fascculos.

Art. 2 Na elaborao de medicamentos e insumos farmacuticos sero observadas as
normas e condies estabelecidas pela Farmacopia Brasileira e seus fascculos.

DECRETA:

Art. 1 Fica aprovada a Parte I da Quarta Edio da Farmacopia Brasileira
Generalidades e Mtodos de Anlise que a este acompanha, elaborada pela comisso
Permanente de Reviso da Farmacopia, do Conselho Nacional de Sade.

Pargrafo nico. delegada ao Ministro de Estado da Sade competncia para aprovar a
Parte II da Farmacopia Brasileira monogrficas sob a forma de fascculos.

Art. 2 Na elaborao de medicamentos e insumos farmacuticos sero observadas as
normas e condies estabelecidas pela Farmacopia Brasileira e seus fascculos.

Pargrafo nico. O frmaco ou adjuvante de fabricao no includo na Quarta Edio da
Farmacopia Brasileira ser analisado na forma prevista em outros cdigos oficiais.

Art. 3 Incumbe ao Ministrio da Sade, por meio da Comisso Permanente de Reviso
da Farmacopia Brasileira, manter constante atualizao das monografias, bem assim promover
novas edies ou propor alteraes edio vigente da Farmacopia Brasileira.

Art. 4 As drogarias e farmcias, os estabelecimentos de ensino de medicina, farmcia,
odontologia e veterinria, os rgos de fiscalizao e controle de qualidade de medicamentos, os
laboratrios industriais e os estabelecimentos congneres, so obrigados a manter exemplar
atualizados da Farmacopia Brasileira.

Art. 5 vedada a impresso, distribuio, reproduo ou venda da Farmacopia
Brasileira, sem a prvia e expressa autorizao do Ministrio da Sade.

Art. 6 Este Decreto entra em vigor na data de sua publicao.

Art. 7 Revogam-se as disposies em contrrio.

Braslia, 30 de agosto de 1988; 167 da independncia e 100 da Repblica.

JOS SARNEY
Luiz Carlos Borges da Silveira

A Comisso Permanente de Reviso da Farmacopia Brasileira formaliza agradecimentos
organizao Panamericana da Sade OPAS. particulamente aos Drs. Marcelo Jorge
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Vernengo e Goy Enrique Navas, e Comisso da Farmacopia, na pessoa do Dr. Peter-Josef
Schorn, pelo apoio recebido no decorrer da elaborao desta obra.

PARTE I

Em decorrncia da nova sistemtica de apresentao da Farmacopia Brasileira adotada
nesta edio, os textos da Parte I constituem-se recomendaes oficiais para todas as
monografias a partir de janeiro de 1989.

CONTEDO

I. PREFCIO
II. HISTRICO
III. COMISSO PERMANENTE DE REVISO DA FARMACOPIA BRASILEIRA E
COLABORADORES
IV. GENERALIDADES
V. MTODOS DE ANLISE
V.1 PROCEDIMENTOS TCNICOS APLICADOS A MEDICAMENTOS
V.1.1. Determinao de peso em formas farmacuticas
V.1.2. Determinao de volume em formas farmacuticas
V.1.3. Determinao de resistncia mec6anica em comprimidos
V.1.3.1. Dureza
V.1.3.2. Friabilidade
V.1.4. Testes de desintegrao
V.1.4.1. Determinao do tempo de desintegrao para comprimidos e cpsulas
V.1.4.2. Determinao do tempo de desintegrao de supositrios, vulos e
comprimidos vaginais
V.1.5. Determinao do tempo de dissoluo para comprimidos e cpsulas.
V.2. MTODOS FSICOS E FSICO-QUMICOS
V.2.1. Determinao da massa
V.2.2. Determinao da temperatura e faixa de fuso
V.2.3. Determinao da temperatura de ebulio e faixa de destilao
V.2.4. Determinao da temperatura de congelamento
V.2.5. Determinao da densidade de massa e densidade relativa
V.2.6. Determinao do ndice de refrao
V.2.7. Determinao da viscosidade
V.2.8. Determinao do poder rotatrio e do poder rotatrio especfico
V.2.9. Determinao da perda por dessecao
V.2.10. Determinao de cinzas sulfatadas (resduo por incinerao)
V.2.11. Determinao da granulometria dos ps
V.2.12. Cr de lquidos
V.2.13. Espectrofotometria de absoro atmica
V.2.14. Espectrofotometria de absoro no ultravioleta, visvel e infravermelho
V.2.15. Espectrometria de fluorescncia
V.2.16. Turbidimetria e nefelometria
V.2.17. Cromatografia
V.2.17.1. Cromatografia em camada delgada
V.2.17.2. Cromatografia em papel
V.2.17.3. Cromatografia em coluna
V.2.17.4. Cromatografia lquida de alta presso
V.2.17.5. Cromatografia a gs
V.2.17.6. Material para cromatografia
V.2.18. Polarografia
V.2.19. Determinao do pH
V.2.20 Determinao de gua
V.2.20.1. Mtodo volumtrico
V.2.20.2. Mtodo da Destilao azeotrpica
V.2.20.3. Mtodo gravimtrico
V.2.21. Anlise de solubilidade por fases
V.2.22. Eletroforese
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V.3. MTODOS QUMICOS
V.3.1. Reaes de identificao
V.3.1.1. ons, grupos e funes
- Acetato
- Acetila
- Alcalde
- Alumnio, on
- Amina aromtica primria
- Amnia e amina aliftica voltil
- Amnio, on
- Antimnio (III), on
- Arsnio
- Barbitrico sem substituinte no nitrognio
- Brio, on
- Benzoato
- Bicarbonato
- Bismuto, on
- Bissulfito
- Borato
- Brometo
- Clcio, on
- Carbonato
- Chumbo, on
- Cianeto
- Citrato
- Clorato
- Cloreto
- Cobre (II), on
- ster
- Ferro
- Frrico, on
- Ferroso, on
- Fosfato (ou ortofosfato)
- Hipofsfito
- Iodeto
- Lactato
- Ltio, on
- Magnsio, on
- Mercrio
- Mercrio (II), on
- Mercro (I), on
- Nitrato
- Nitrito
- Oxalato
- Permaganato
- Perxido
- Potssio, on
- Prata, on
- Salicilato
- Sdio, on
- Succinato
- Sulfato
- Sulfito
- Tartarato
- Tiocinato
- Tiossulfato
- Xantina
- Zinco, on
V.3.1.2. Identificao de esterides por cromatografia em camada delgada
V.3.1.3. Pesquisa de esterides estranho por cromatografia em camada delgada
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V.3.1.4. Pesquisa de substncia relacionadas a sulfonamidas por cromatografia em
camada delgada
V.3.1.5. Identificao de fenotiazinas por cromatografia em camada delgada
V.3.1.6. Pesquisa de impureza relacionadas a fenotiazinas por cromatografia em
camada delgada
V.3.2. Ensaio-limite para impurezas inorgnicas
V.3.2.1. Ensaio-limite para cloretos
V.3.2.2. Ensaio-limite para sulfatos
V.3.2.3. Ensaio-limite para metais pesados
V.3.2.4. Ensaio-limite para ferro
V.3.2.5. Ensaio-limite para arsnico
V.3.2.6. Ensaio-limite para amnia
V.3.3. Determinao em gorduras e leos
V.3.3.1. Determinao de densidade relativa
V.3.3.2. Determinao da temperatura de fuso
V.3.3.3. Determinao da temperatura de solidificao
V.3.3.4. Determinao do ndice de refrao
V.3.3.5. Determinao do poder rotatrio
V.3.3.6. Determinao da gua e sedimentos
V.3.3.7. Determinao da ndice de acidez
V.3.3.8. Determinao do ndice de saponificao
V.3.3.9. Determinao do ndice de steres
V.3.3.10. Determinao do ndice de iodo
V.3.3.11. Determinao do ndice de perxidos
V.3.3.12. Determinao do ndice de hidroxila
V.3.3.13. Determinao do ndice de acetila
V.3.3.14. Determinao de matria insaponificvel
V.3.4. Ensaios
V.3.4.1. Titulaes por diazotao
V.3.4.2. Determinao de nitrognio pelo mtodo de Kjeldahi
V.3.4.2.1. Macrodeterminao (Mtodo I)
V.3.4.2.2. Semi-microdeterminao (Mtodo II)
V.3.4.3. Mtodo de combusto em frasco de oxignio
V.3.4.4. Titulaes complexomtricas
Alumnio
Bismuto
Clcio
Chumbo
Magnsio
Zinco
V.3.4.5. Titulaes em meio no aquoso
Titulao de substncias de carter bsico
- Titulao de sais de cidos halogenados
- Titulao de substncias de carter cido
V.3.4.6. Determinao da metoxila
V.3.4.7. Determinao do dixido de enxofre
V.3.4.8. Determinao do lcool
V.3.4.8.1. Mtodo por destilao
V.3.4.8.2. Mtodo por cromatografia a gs
V.3.4.9. Anlise de aminocidos
V.4. MTODOS DE FARMACOLOGNOSIA
V.4.1. Preparo de material vegetal para observao e estudos histolgicos
V.4.2. Mtodos de anlise de drogas vegetais
V.4.2.1. Amostragem
V.4.2.2. Determinao de material estranho
V.4.2.3. Determinao de gua
V.4.2.4. Determinao de cinzas totais
V.4.2.5. Determinao de cinzas insolveis em cidos
V.4.2.6. Determinao de leos essenciais
V.4.2.7. Determinao de leos fixos
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V.4.2.8. Determinao do cineol
V.4.2.9. Determinao do ndice de espuma
V.4.2.10. Determinao de substncias extraveis por lcool
V.5 MTODOS BIOLGICOS
V.5.1. Testes de segurana biolgica
V.5.1.1. Esterilidade
V.5.1.2. Pirognios
V.5.1.3. Toxidade
V.5.1.4. Substncias vasodepressoras
V.5.1.5. Histamina
V.5.1.6. Contagem de microorganismos viveis em produtos que no necessitam
cumprir com o teste de esterelidade
V.5.1.7. Mtodo geral para pesquisa e identificao de patgenos
V.5.1.7.1. Enrriquecimento no seletivo
- Substncias solveis em gua
- Substncias oleosas miscveis em gua
- Substncias solveis em miristato de isopropila
- Pomadas e Cremes insolveis em miristato de isopropila
- Gelatina
- Substncias insolveis ou parcialmente solveis em gua
V.5.1.7.2. Fase seletiva e teste de confirmao
- Pseudomas aeruginosa
- Staphilococus aureus
- Salmanella sp.
- Escherichia coli
V.5.1.7.3. Descrio dos meios de cultura e reagentes
V.5.1.7.4. Esterilizao e acondicionamento dos meios de cultura
V.5.1.7.5. Capacidade seletiva e nutritiva dos meios de cultura e validao do
teste para pesquisa e identificao de patgenos
V.5.1.8. Substncias Pressoras
V.5.2. Ensaios
V.5.2.1. Ensaio Biolgico de oxitocina
- Mtodo A: hipotenso arterial em frango
- Mtodo B: contrao do tero de rata in vitro
V.5.2.2. Ensaio biolgico de corticotrofina
- Mtodo A: subcutneo
- MtodoB: intravenoso
V.5.2.3. Ensaio biolgico de insulina
- Mtodo A: convulso em camundongos
- Mtodo B: glicose sangnea em coelhos
- Mtodo C: glicose sangnea em camundongos
V.5.2.4. Durao do efeito da insulina
V.5.2.5. Ensaio biolgico de glucagon
V.5.2.6. Ensaio biolgico da heparina
V.5.2.7. Ensaio biolgico de Sulfato de protamina
V.5.2.8. Ensaio biolgica de gonadotrofina srica
V.5.2.9. Ensaio biolgico de gonadotrofina corinica
V.5.2.10. Ensaio biolgico de gonadorelina
V.5.2.11. Ensaio biolgico de menotrofina
V.5.2.12. Ensaio biolgico de digital
V.5.2.13. Ensaio biolgico de vasopressina
V.5.2.14. Ensaio biolgico de lipressina
V.5.2.15. Ensaio biolgico de felipressina
V.5.2.16. Ensaio biolgico de soatotrof
- Mtodo A: aumento do peso corporal
- Mtodo B: mtodo da tbia
V.5.2.17. Ensaio microbiolgico de antibiticos
V.5.2.17.1. Ensaio microbiolgico por difuso em gar
V.5.2.17.2. Ensaio microbiolgico por tubidimetria
VI. PROCEDIMENTOS ESTATSTICOS APLICVEIS AOS ENSAIOS BIOLGICOS
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VI.1. GLOSSRIO DE SMBOLOS
VI.2. FUNDAMNETOS
VI.3. VALORES ABERRANTES
VI.4. ENSAIOS DIRETOS
VI.5. ENSAIOS INDIRETOS QUANTITATIVOS
VI.5.1. Tipos de delineamento
VI.5.2. Anlise de varincia
VI.5.3. Testes de validade
VI.5.4. Estimativa da potncia e limites de confiana
VI.6. MDIAS MVEIS
VI.7. ENSAIOS INDIRETOS TUDO OU NADA
VI.8. COMBINAO DE ESTIMATIVAS DE POTNCIA
VI.8.1. Potncia mdia ponderada e limites de confiana
VI.9. TABELAS ESTATSTICAS
VI.10. EXEMPLOS DE ENSAIOS ESTATSTICOS
VI.10.1. Exemplo de ensaio direto
VI.10.2. Exemplo de ensaios indiretos quantitativos
VI.10.3. Exemplo de ensaio indireto tudo ou nada
VI.10.4. Exemplo de combinao estimativas de potncia

VII. RADIOFRMACOS
VIII. PRODUO DE DISCOS E METOTOLOGIA PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS
ANTIBACTERIANOS
VIII.1. PRODUO DE DISCOS
VIII.2. CONTROLE DOS DISCOS
IX. RECIPIENTES E MATERIAIS EMPREGADOS NA SUA FABRICAO
IX.1. MATERIAIS EMPREGADOS NA FABRICAO DE RECIPIENTES
IX.1.1. Material Plstico
- Mtodos gerais de anlise de material plstico
- Limpidez e grau de opalescncia de solues
- Ensaio por combusto e atmosfera de oxignio
IX.1.1.1. Materiais plsticos base de cloreto de polivinila (PUC)
IX.1.1.2. Polietileno de baixa densidade
IX.1.1.3. Polietileno de alta densidade
IX.1.1.4. Poliestireno
IX.1.1.5. Poliestireno opaco
IX.2. RECIPIENTES
IX.2.1. Recipientes de vidro
IX.2.2. Recipientes de material plstico
IX.2.2.1. Recipientes de material plstico para solues injetveis aquosas
IX.2.2.1.1. Recipientes base de cloreto de polivinila
IX.2.2.2. Recipientes de material plstico para sangue e produtos do sangue
IX.2.2.2.1. Recipientes base de cloreto de polivinila para sangue e produtos
do sangue, contendo ou no soluo anticoagulante
X. MTODOS DE PREPARAO
X.1. MTODOS DE ESTERELIZAO
X.1.1. Mtodos fsicos
X.1.1.1. Esterilizao pelo calor
X.1.1.2. Esterilizao por radiao
X.1.1.3. Esterilizao por filtrao
X.1.2. Mtodos Qumicos
X.1.2.1. Esterilizao pelo xido de etileno
X.2. INDICADORES BIOLGICOS
XI. SUBSTNCIAS CORANTES
XII. REAGENTES
XII.1. INDICADORES
XII.2. REAGENTES E SOLUES REAGENTES
XII.3. SOLUES VOLUMTRICAS
XII.4. TAMPES
XIII. ANEXOS
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XIII.1. METODOLOGIA PARA O TESTE DE ESTABILIDADE AOS ANTIBACTERIANOS
(ANTBIOGRAMA)
XIII.2. ANIMAIS DE LABORATRIO
XIII.2.1. Condies sanitrias
XIII.2.2. Ambiente
XIII.2.3. Nutrio
XIII.2.4. Gentica
XIII.2.5. tica
XIII.3. NOMES, SMBOLOS E MASSAS ATOMICAS
XIII.4. UNIDADES DO SISTEMA INTERNACIONAL (SI) USADAS NA FARMACOPIA E
EQUIVALNCIA COM OUTRAS UNIDADES
XIII.5. MICROORGANISMOS EMPREGADOS EM TESTES E ENSAIOS.

I. PREFCIO

Dando cumprimento s disposies do Decreto Federal nmero 78.840. de 25/11/1976, a
nova edio da Farmacopia Brasileira vem ao encontro dos desejos da comunidade tcnico-
cientfica brasileira, manifestante interessada na reviso da edio anterior.
A comisso Permanente de Reviso da Farmacopia Brasileira, constituda pela Portaria
nmero 151/82 do Exmo. Ministro da Sade, s pde realizar seu trabalho graas ao apoio
decisivo da Secretaria Nacional de Vigilncia Sanitria SNVS- do Ministrio da Sade.
Acordos e convnios celebrados entre SNVS, a Central de Medicamentos CEME do
Ministrio da Previdncia e Assistncia Social MPAS e o Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ -, asseguram Comisso recursos financeiros
indispensveis, incluindo bolsas de estudos para execuo dos trabalhos.
A elaborao das monografias foi confiada a profissionais com efetiva experincia no
assunto, estas monografias foram revisadas por outros profissionais do mesmo campo de
atividade. Apesar disto, eventuais imperfeies, erros ou omisses so de responsabilidade
exclusiva da Comisso Permanente de Reviso da Farmacopia Brasileira, a quem coube a
aprovao do texto final.
A 4

Edio da Farmacopia Brasileira marca o incio de nova era. Trata-se de edio na


qual se adota novo sistema de apresentao. O rpido avano da tecnologia e a crescente
complexidade das substncias medicinais determinadas a necessidade de frequentes revises da
farmacopia. Para facilitar estas revises e possibilitar introduo de novas monografias e
mtodos de anlise necessrios, a Comisso adotou esta nova forma de apresentao.
O presente volume constitui a Parte I da Farmacopia e compreende as generalidades e
os mtodos gerais de anlise. A Parte II ser constituda de monografias de matrias primas e
especialidades farmacuticas, publicadas em fascculos. Um ndice indicar o ttulo das
monografias, seus nmeros de refer6encia e a data para a sua entrada em vigor.
A Farmacopia Brasileira em sua 4
a
edio tem vigncia em todo o Territrio Nacional. A
nomenclatura, os mtodos em identificao e anlise e todos os demais dados nela contidos
prevalecem sobre quaisquer outros assinalados em cdigos farmacuticos diversos. Nos casos
omissos, podem ser utilizados a Farmacopia Internacional, a Farmacopia Europia e outros
cdigos farmacuticos em suas ltimas edies.
As monografias da Farmacopia Brasileira 4a. edio estabelecem parmetros que o
produto dever satisfazer a qualquer tempo durante seu perodo de uso e no para serem
interpretados somente como especificaes para liberao por parte do fabricante.
* Normas Nacionais extrafarmacopias devero obter previamente aprovao da
Comisso Permanente de Reviso da Farmacopia Brasileira do Conselho Nacional de Sade.
A no incluso de um frmaco ou adjuvante de fabricao na 4

edio da Farmacopia
Brasileira no dispensa estas substncias de anlise segundo outros cdigos oficiais; assim como
a presena de impureza no descrita especificamente na Farmacopia no significa que a
substncia pode ser usada pelo simples fato de a Farmacopia no a especificar. Nestes casos, a
deciso deve ser tomada com base no bom senso tcnico e nas boas prticas de fabricao.
A Farmacopia obra para profissionais devidamente qualificados e treinados. Por este
motivo, no fornece explicaes didticas, apresentando as monografias com redao clara,
sucinta e desprovida de mincias julgadas desnecessrias pela Comisso.
A Comisso Permanente de Reviso da Farmacopia Brasileira torna pblicos seus
agradecimentos a todos aqueles que colaboraram no preparo desta edio e, em especial, ao
Conselho Federal de Farmcia pelo apoio que viabilizou a publicao oficial da F. Bras. IV.
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II. HISTRICO

So de natureza efmera os livros desta ordem, destinados a espelharem um dos lados
da farmacologia, cincia que vai percorrer atualmente a fase mais acelerada da sua evoluo.
SOUZA MARTINS, in Relatrio de Introduo da 3

edio da Farmacopia Portuguesa,


1876.
O vocbulo farmacopia provm da aglutinao de dois termos gregos, a saber, =
medicamento ou veneno, e = fabricante e fabricao. As farmacopias constituem cdigos
farmacuticos oficiais ou oficialmente adotados, nos quais se estabelecem a identificao, os
padres de qualidade e os mtodos de anlise dos frmacos em uso. Existentes desde o sculo
III, os primeiros compndios eram de carter regional, pois os frmacos de ento eram
provenientes de rgos de animasi, de minerais e, sobretudo, da flora local e nativa. Alguns
chegaram a ser oficializados, embora em carter regional, como, por exemplo o formulrio da
Escola de Salermo Regimem Sanitatis, de 1066, adotado em 1240 por Frederico II, Rei das
Duas Siclias. As tentativas empreendidas individualmente por diversos autores no sentido de
unificar a descrio e identificao dos farmcos mais importantes datam do final do sculo XVII,
e do sculo XVIII. Entre outras obras, merecem citao a Pharmacopeia Internationalis de Lmery
(1690), as farmacopias de James (1747), de De Quincy (1758), de Triller ( 1764) e,
especialmente a Pharmacopeia Universalis, de Jourdan (1828), que compilava dados de quase
50 farmacopias e compndios diferentes. Nenhum destes trabalhos, entretanto, possua carter
oficial.
As farmacopias nacionais, de carter oficial e adoo obrigatria, comeam a surgir na
final do sculo XVIII e incio do sculo XIX. Assim, foram publicadas as primeiras edies das
farmacopias, portuguesa (1794), holandesa (1805), francesa (1818) e americana (1820).
O Brasil Colnia adotava a Pharmacopia Geral para o Reino e Domnios de Portugal, de
1794, cuja autoria atribuda a Francisco Tavares, professor da Universidade de Coimbra.
Com a Independncia, volta-se o Brasil orientao cultural francesa e, no campo da
Farmcia, o Codex Medicamentarius francs adquire fora legal. O Regulamento da Junta de
Higiene Pblica, mandado executar pelo Decreto nmero 828 de 29/09/1851, sem especificar
qual a farmacopia a ser cumprida, estabelece lista de livros que as farmcias deveriam possuir,
constando dela, entre outros, a Farmacopia Portuguesa de 1794, o Codex Francs e o Cdigo
Farmacutico Lusitano, da autoria de Agostinho Albano da Silveira Pinto, cuja primeira edio foi
publicada em 1835 e hoje considerada como a 2

edio da Farmacopia Portuguesa.


J o Decreto nmero 8.387 de 19/01/1882 estabelece textualmente: para a preparao
dos remdios oficiais seguir-se- a farmacopia francesa, at que esteja composta uma
farmacopia brasileira...*, situao esta que iria perdurar at 1926, guando o Decreto nmero
17.509 de 04/11/1926 aprovou a primeira Farmacopia Brasileira, de autoria de Rodolpho Albino
Dias da Silva, tornada obrigatria a partir de 15 de agosto de 1929.
A primeira edio da Farmacopia Brasileira ombreava com as farmacopias da poca,
dos pases mais desenvolvidos, revelando-se notvel pela preciso das monografias e,
sobretudo, pelo grande nmero de incluso de frmacos obtidos da flora brasileira, no existentes
em nenhuma outra farmacopia.
A constante evoluo da farmacologia, a introduo de novos frmacos na teraputica, o
surgimento de novos mtodos de anlise, mais modernos e precisos, e a necessidade de
especificaes atualizadas para o controle de matria-prima e produtos farmacuticos so fatores
fundamentais determinantes da obsolescncia dos cdigos farmacuticos e da necessidade dos
cdigos farmacuticos e da necessidade de revis-los e atualiz-los periodicamente. O Decreto
que aprovou a primeira edio da Farmacopia Brasileira foi omisso quanto s revises: assim, a
Segunda edio veio luz quase 30 anos aps a primeira e representou cinco anos de trabalho
de dez subcomisses especializadas. A 2

edio incorporou as aquisies decorrentes da prpria


atualizao da farmacologia. No conseguiu, contudo, ser mais rica e precisa do que a primeira
edio, fruto de um s autor.
O Decreto Federal nmero 45.502 de 27/02/1959, ao aprovar a 2

edio da Farmacopia
Brasileira, fixou sua reviso a cada dez anos.
Infelizmente, empecilhos diversos no permitem a cumprimento desse Decreto. Mais de
15 anos decorreram, at que se cogitasse de uma nova edio.
Assim que, em 25 de novembro de 1976, foi oficializada, pelo Decreto nmero 78.840, a
terceira edio da Farmacopia Brasileira. O mesmo Decreto fixou em cinco anos o prazo para
sua reviso. Realizada em tempo determinado e muito curto, tarefa possvel de levar a termo
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somente graas ao apoio do Conselho Federal de Farmcia, a obra despertou sensveis
manifestaes da comunidade tcnico-cientfica, a recomendarem rpida reviso do seu texto
independente do dispositivo legal.
Assim, a 4

edio surge com algum atraso. Procurou-se, nesta edio sanar as


deficincias da anterior. Procurou-se, tambm, adotar mtodos modernos de anlise,
compatveis, porm, com a realidade nacional. A publicao desta parte e a adoo de uma nova
sistemtica de apresentao que possibilita sua contnua atualizao atravs de revises
permanentes so metas prioritrias que a Comisso Permanente de Reviso da Farmacopia
Brasileira se prope alcanar.

III. COMISSO PERMANENTE DE REVISO DA FARMACOPIA BRASILEIRA


PORTARIA MINISTERIAL N 333 DE 31.05.88.
PUBLICADA NO DIRIO OFICIAL DE 01.06.1988
E PORTARIA MINISTERIAL N 353 DE 09.06.88


PRESIDENTE
JOO GILVAN ROCHA
Prof. Dr. Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade Federal de Sergipe
Conselho Nacional da Sade
Braslia, DF

PRESIDENTE SUBISTITUTO
CELSO FIGUEIREDO BITTENCOURT
Prof. Dr. Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

ANDREJUS KOROLKOVAS
Prof. Dr. Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ANGELO JOS COLOMBO
Prof. Dr. Faculdade Farmacutica de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

CIPRIANO CARDOSO FILHO
Farmacutico, Produtos Roche Qumicos e Farmacuticos S.A.
Rio de Janeiro, RJ

EDUARDO AUGUSTO MOREIRA
Prof. Dr. Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

EUFRIDES EVA S. SCHAPOVAL
Profa. Dra. Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

ELZA ANDERS SAAD
Farmacutica, Degussa S.A.
So Paulo, SP

GERALDO FEMERICH
Farmacutico, Central de Medicamentos Ministrio da Sade
Braslia, DF

JOS ALEIXO PRATES E SILVA
Prof. Dr. Curso de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal, RN
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NICOLAI SHARAPIN
Prof. Dr. Instituto de Qumica da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ

SEBASTIO BAETA HENRIQUE
Prof. Dr. Instituto Butant
So Paulo, SP

SUZANA MACHADO DE AVILA
Farmacutica, Secretaria Nacional de Aes Bsicas da Sade
Ministrio da Sade
Braslia, DF

TEREZINHA C. BARBOSA TOMASSINI
Profa. Dra. Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro, RJ

COLABORADORES

ARCYR RODRIGUES DO PRADO
Mdico, Central de Medicamentos Ministrio da Sade
Braslia, DF

ADELA ROSENKRANZ
Profa. da Escola Paulista de Medicina Consultora da Organizao Pan-Americana da Sade
OPAS
So Paulo, SP

ADILSON CADONHA
Farmacutico, UpJohn Produtos Farmacuticos Ltda.
So Paulo, SP

ALEXANDRE PINTO CONRRADO
Prof. Da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto Universidade de So Paulo
Ribeiro Preto, SP

ALFREDO KARL MASLOWSKY
Qumico, Biogalnica Qumica e Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

ALVARO NORONHA DA COSTA
Farmacutico, Industria Qumica e Farmacutica Schering S.A.
Rio de Janeiro, RJ

AMAURY CARON DOS ANJOS
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

ANA BEATRIZ DA SILVA
Engenharia-Qumica, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

ANA MARIA BERGOLD
Profa. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Porto Alegre, RS

ANA MARIA DA PENHA BRAGUIM PELLIN
Farmacutica, Boehringer & Cia. Ltda.
Vigilncia Sanitria Digital 11
So Paulo, SP

ANDR ROSEIRA DE MATOS
Farmacutico, Cirumdica S.A., Produtos Mdicos-Cirurgicos
So Paulo, SP

ANDREJUS KOROLKOVAS
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ANGELO JOS COLOMBO
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ANTONIO CARLOS ZANINI
Prof. da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ANTONIO EUGNIO CASTRO CARDOSO DE ALMEIDA
Farmacutico, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

ANTONIO PAIVA
Prof. Da Escola Paulista de Medicina
So Paulo, SP

ANTONIO ROBERTO TEIXEIRA
Mdico, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

ARNALDO H. BECKETT
Prof., Chelsea College Universidade de Londres,
Consultor da Organizao Pan-Americana da Sade - OPAS
Londres, Inglaterra

ARON JURKIEWICZ
Prof. da Escola Paulista de Medicina
So Paulo, SP

AUGUSTO VILSON BORTOLUZZI
Prof. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

BARTYRA DE CASTRO AREZZO
Comisso Nacional de Energia Nuclear
Rio de Janeiro, RJ

BEATRIZ RIGON
Ncleo de Processamento de Dados da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

CECLIA ELENA FIGUEIREDO OGNIBENE
Farmacutica, Sasnrisil S.A.
So Paulo, SP

CLIA COLI
Prof. Da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

CELINA XAVIER DE MENDONA
Vigilncia Sanitria Digital 12
Farmacutica
So Paulo, SP

CELSO FIGUEIREDO BITTENCOURT
Prof. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

CLARISSE CAVICCHIA
Farmacutica, UpJohn Produtos Farmacuticos Ltda.
So Paulo, SP

CLAUDIA GONALVES TORRES DE OLIVEIRA
Prof. do Instituto de Qumica da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ

CLEODORO WALTER
Ncleo de Processamento de Dados da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

DAVID ACKERMAN
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

DECIO MELHEM
Prof. Da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

DERBLAY GALVO
Prof. Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Braslia, DF

DOMINGOS CORRA
Qumico, Biogalnica Qumica e Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

EDUARDO AUGUSTO MOREIRA
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

EDUARDO JOS CENTENO DE CASTRO
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

ELFRIDES EVA S. SCHAPOVAL
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

ELFRIDE MARIANNE BACCHI
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ELIANE DE VARES CAO
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
CNPQ
Niteri, RJ

ELIZABETH IGNE FERREIRA
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

Vigilncia Sanitria Digital 13
ELOIR PAULO SCHENKEL
Prof. Da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

ELZA ANDERS SAAD
Farmacutica, Degussa S.A.
So Paulo, SP

FERNANDO DE OLIVEIRA
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

FRANCO MARIA LAJOLO
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

GALBA MORANELLI DE ALMEIDA
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte, MG

GEORGE CONZALES ORTEGA
Prof. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

GERALDO FENERICH
Farmacutico, Central de Medicamentos Ministrio da Sade
Braslia, DF

GERCY SEVERO ALVES
Prof. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

GERMNIO NAZZAQRIO
Qumica, Instituto Adolfo Lutz
So Paulo, SP

GILBERTO ANTONIO ASSIS BRASIL E SILVA
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

GILSON DE FREITAS VIEIRA
Farmacutico, Glaxo do Brasil S.A.
Rio de Janeiro, RJ

GOY ENRIQUE NAVAS
Farmacutico, Consultor da Organizao Pan-Americana de Sade OPAS
Rio de Janeiro, RJ

GRANVILLE GARCIA DE OLIVEIRA
Mdico, Central de Medicamentos Ministrio da Sade
Braslia, DF

GUNTER HOXTER
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

HANNA ROTHSCHILD
Prof. da Escola Paulista de Medicina
So Paulo, SP

Vigilncia Sanitria Digital 14
HECTOR ARALDI
Farmacutico, Consultor da Organizao Pan-Americana da Sade OPAS
Buenos Aires, Argentina

HEILO JOS BERTUZZI
Prof. da Diviso de Farmcia do Hospital Universitrio da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

HELIO MORRONI COSENTINO
Fsico, Sanrisil S.A.
So Paulo, SP

IDA CARAMICO SOARES
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ITACY PEREIRA TORQUILHO
Farmacutico, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

IVONE BAREICHA
Profa. do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade de Minas Gerais
Belo Horizonte, MG

IVONE CARVALHO
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

IVONE SARTOR
Profa. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

IVONETE BATISTA DE ARAJO
Profa. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Natal, RN

JOO BATISTA DOMINGUES
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

JOO HAIKAL HELDU
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP


JOS ABRAHO NETO
Farmacutico, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico
CNPQ
So Paulo, SP

JOS ALEIXO PRATES E SILVA
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal, RN

JOS APARECIDO BRITTES FUNK
Prof. da Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

JOS PEDRO SALGADO EGREJA
Vigilncia Sanitria Digital 15
Farmacutico, Byk-Procienx Industria Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

JOS XIMENES
Farmacutico, Cefar Farmacodiagnstica Ltda.
So Paulo, SP

JOSINO COSTA MOREIRA
Farmacutico, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

LAERTE KAWANCHI
Farmacutico, Byk-Procienx Indstria Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

LAURA MARIA ESPINHOSA RAMOS
Farmacutica, Boehringer & Cia Ltad.
So Paulo, SP

LAUREN ROSA CROSSETTI VAUCHER
Profa. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

LAURO DOMINGOS MORETTO
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

LA GUSMO CHIAPINI
Profa. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento CNPQ
Porto Alegre, RS

LEILA MACEDO ODA
Qumica, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

LEOBERTO COSTA TAVARES
Farmacutico
So Paulo, SP

LIANE LEIPMITIZ ENE
Profa. da Faculdade de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Porto Alegre, RS

LIGIA MARIA MOREIRA DE CAMPOS
Profa. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte, MG

LILIAN BASSANI
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
CNPQ
Santa Maria, RS

LORE LAMB
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico
CNPQ
Curitiba, PR

LUCIA DE ARAJO COSTA
Vigilncia Sanitria Digital 16
Profa. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico CNPQ
Natal, RN

LUCIA EIKO ABE
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico
CNPQ
So Paulo, SP

LUCIA EMY DOS SANTOS
Profa. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte, MG

LUCY BRENNER RAMOS
Profa. do Instituto de Cincias e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul
Porto Alegre, RS

LUIZ ALBERTO MASCHIETTO
Farmacutico, Biogalnica Qumica e Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

LUIZ ANTONIO GIOIELLI
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

LUIZ BAUER (FALECIDO)
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

LUIZ EDUARDO CHAVES CAIADO
Farmacutico, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico
CNPQ
Rio de Janeiro, RJ

LUIZ FELIPE MOREIRA LIMA
Mdico, Fundao Oswaldo Cruz
Rio de Janeiro, RJ

LUIZ FLBIO FREITAS LEITE
Farmacutico, Biobrs Bioqumica do Brasil S.A.
Montes Claros, MG

LUIZ MANOEL SCAVAZZA
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

LUIZ RODRIGUES AGUAXO
Mdico Veterinrio, Consultor da Organizao Pan-Americana de Sade OPAS
Rio de Janeiro, RJ

MARA LANE CARDOSO
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
CNPQ
Santa Maria, RS

MARCELO JORGE VERNENGO
Qumico, Consultor da Organizao Pan-Americana de Sade OPAS
Rio de Janeiro, RJ

Vigilncia Sanitria Digital 17
MARCO ANTONIO ALMEIDA
Farmacutico, Biobrs Bioqumica do Brasil S.A.
Montes Claros, MG

MARCO ANTONIO DEXHEIMER
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

MARCO AURELIO XAVIER
Farmacutico, Biobrs Bioqumica do Brasil S.A.
Montes Claros, MG

MARGARETE REGINATTO GIACOMINI
Farmacutica, Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

MARGARETE TRINDADE HAHN
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e tecnolgico
CNPQ
Santa Maria, RS

MARGARETH LINDE ATHAYDE
Farmacutica, Secretaria Nacional de Vigilncia Sanitria do Ministrio da Sade
Braslia, DF

MARIA AMLIA BARATA DA SILVEIRA
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

MARIA DE FTIMA DANTAS
Farmacutica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal, RN

MARIA ELIZABETH DE AVILA DALMORA
Profa. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

MARIA GISELA PIROS
Farmacutica, Majer Meyer S.A. Indstria Farmacutica
So Paulo, SP

MARIA INS ROCHA MIRITELLO SANTORO
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

MARIA LUCIA NOSSAR SIMES DE DALGO
Profa. do Instituto de Qumica da Universidade Federal Fluminense
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Niteri, RJ

MARIA LUIZA CRUZ
Farmacutica
So Paulo, SP

MARIA TEREZA ALVES RODRIGUES
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

MARIA TEREZA FARIA PIRES DE MELO
Qumica Industrial, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Vigilncia Sanitria Digital 18
Rio de Janeiro, RJ

MARILENE PEREIRA BASTOS CENEVIVA (FALECIDA)
Profa. Da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

MARLIA APPEL DE MATTOS BORTOLUZZI
Profa. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

MARILIA MARTINS NISHIKAWA
Biomdica, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

MARIO GERALDO KRISTELLER
Qumico, Biogalnica Qumica e Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

MARIO GERALDO KRISTELLER
Qumico, Biogalnica Qumica e Farmacutica Ltda.
So Paulo, RJ

MARIO MUNIZ LANNES
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ

MARTHA DE LCIA
Profa. da Faculdade Fluminense de Farmcia da Universidade Federal Fluminense
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Niteri, RJ

MICHAEL SIMON NOTHENBERG
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

MILTON LEONCIO BRAZZACH
Prof. da Diviso de Farmcia do Hospital Universitrio da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

MIRIAN TERESINHA KNORST
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
CNPQ
Santa Maria, RS

NARA RITA DEITOS
Educadora Especial
Santa Maria, RS

NELCI FENALTTI HOEHR
Profa. do Curso de Cincias Farmacuticas da Faculdade de Cincias Mdicas da Pontifcia
Universidade Catlica
Campinas, SP

NILTON BEZERRA DO VALE
Prof. do Curso de Biologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal, RN

NIKOLAI SHARAPIN
Prof. do Instituto de Qumica da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ
Vigilncia Sanitria Digital 19

OLINDA SUZUKI
Farmacutica do Instituto de Qumica da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ

OSCAR VILLAA DE MELO (FALECIDO)
Prof. Da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Pernambuco
Recife, PE

PAOLO BARTOLINI
Qumico, Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares
Da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

PAULO ANTONIO RODRIGUES
Farmacutico, Biogalnica Qumica e Farmacutica Ltda.
So Paulo, SP

PAULO CEZAR SANDER
Prof. do Curso de farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

PEDRO DOS REIS PETROVICK
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS

PETER J. SCHORN
Farmacutico, Consultor da Organizao Pan-Americana da Sade OPAS
Strasbourg, Frana

REINALDO SPITZNER
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

RENATO BARUFFALDI
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

RENI KRANBECK
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

RICARDO SCHUCH
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

ROBERTO EDUARDO MORTEO
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ

ROBERTO PELLEGRINI
Farmacutico, Upjonh Produtos farmacuticos Ltda.
So Paulo, SP

ROBERTO RITTINER NETO
Prof. do Instituto de Qumica da Universidade de Campinas
So Paulo, SP

RONALDO ALVES SILVEIRA
Farmacutico, Bayer do Brasil S.A.
Vigilncia Sanitria Digital 20
So Paulo, SP

RONALDO NOGUEIRA DE MORAES PITOMBO
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

RUBENS LEONART
Bilogo, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnolgico CNPQ
Curitiba, PR

RUTH WIEDAMANN VELLOSO
Profa. do Instituto de Cincias e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul
Porto Alegre, RS

RUY MASSAKAZO YOSHINAGA
Farmacutico, Fontoura-Wyeth S.A.
So Bernardo do Campo, SP

SALVADOR ALVES PEREIRA
Prof. da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal Fluminense
Niteri, RJ

SERGIO LUIZ DALMORA
Prof. do Curso de Farmcia e Bioqumica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

SIGURO WALTER BACH
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR

SILVANA FERREIRA VACCARI
Mdica Veterinria da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

SILVIA STORPIRTS
Farmacutica, Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
CNPQ
So Paulo, SP

SIMONE GONALVES CARDOSO
Farmacutica da Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, RS

SONIA MARIA FERREIRA SIMAS SANTOS
Biloga, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade / FIOCRUZ
Rio de Janeiro, RJ

TAKAKO SAITO
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

TARCISIO JOS PALHANO
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPQ
Natal, RN

THERESA CHRISTINA VESSONI PENHA
Prof. da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP
Vigilncia Sanitria Digital 21

TOSHIO NARAGUCHI
Prof. do Curso de Cincias Farmacuticas da Faculdade de Cincias Mdicas da Pontifcia
Universidade Catlica
Campinas, SP

TOMAS D. ARIAS
Farmacutico, Consultor da Organizao Pan-Americana da Sade OPAS
Cidade do Panam, Panam

TOMDE NAKASHIMA
Prof. do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran
Curitiba, PR


VENI MARIA FELLI NAKASONE
Profa. da Faculdade de Cincias Farmacuticas Da Universidade de So Paulo
So Paulo, SP

VIRGINIA TUTNDJIAN
Engenheira Qumica, Boheringer
So Paulo, SP

ZELI ISABEL ROESSLER
Especialistas em Assuntos Educacionais, Ministrio da Cincia e Tecnologia
Braslia, DF

IV. ESPECIALIDADES

TTULO

O ttulo completo desta obra Farmacopia da Repblica Federativa do Brasil, Quarta
edio. Sua denominao pode ser abreviada para Farmacopia Brasileira, 4
a
edio, ou F.
Bras. IV.

DEFINIES

Farmacopico

A expresso farmacopia substitui as expresses oficial e oficinal, utilizadas do edies
anteriores, equivalendo-se as trs expresses para todos os efeitos.

Frmaco

Substncia ativa, droga, insumo farmacutico ou matria-prima empregada para modificar
ou explorar sistemas fisiolgicos ou estados patolgicos em benefcio da pessoa qual se
administra.

Medicamento

Produto farmacutico, tecnicamente obtido ou elaborado, que contm um ou mais
frmacos juntamente com outras substncias, com finalidade profiltica, curativa, paliativa ou para
fins de diagnstico.

Medicamento farmacopico

Medicamento inscrito na 4
a
edio da Farmacopia Brasileira.

Medicamento magistral

Vigilncia Sanitria Digital 22
Medicamento, preparado na farmcia, cuja prescrio estabelece a composio, a forma
farmacutica e a posologia.

NOMENCLATURA

Os ttulos das monografias obedecem denominao Comum Brasileira para Frmacos,
estabelecida com base nas recomendaes da Organizao Mundial da Sade. Os subttulos so
em latim.
Em casos excepcionais, nomes muito difundidos, porm diferentes dos adotados pela
Denominao Comum Brasileira para Frmacos, podem ser citados como outra denominao.

NOME QUMICO

O nome qumico de substncia farmacopica est de acordo com a nomenclatura
preconizada pela Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada.

FRMULA QUMICA

Quando a substncia farmacopica possui composio qumica definida, a sua frmula
bruta e massa molecular constam da monografia.
No caso de substncias orgnicas de composio qumica definida, estes dados so
acrescidos da respectiva frmula estrutural.

MASSA ATMICA RELATIVA

As massas atmicas relativas usadas para o clculo de pesos moleculares so as
constantes da tabela de Massas Atmicas Relativas e baseada na massa do carbono-12.

UNIDADES DE MEDIDA

So adotadas nesta farmacopia as unidades constantes do Sistema Internacional de
Unidades (SI), em conformidade com o Decreto Federal N 81621, 03 de maio de 1978.
Excepicionalmente so utilizadas outras unidades de uso somente na prtica farmacutica.
As unidades e fraes do Sistema Internacional de Unidades (SI), utilizadas na F. Bras.
IV. So representadas pelas seguintes abreviaes:

DE COMPRIMENTO

Metro m
Decmetro dm = 10
-1
m
Centmetro cm = 10
-2
m
Milmetro mm = 10
-3
m
Micrometro* m = 10
-6
m
Nanmetro** nm = 10
-9
m

* ou microm
** ou milimicron

DE VOLUME

Litro l
Decilitro dl = 10
-1
I
Mililitro ml =10
-3
I
Microlitro l = 10
-6
l

DA MASSA*

Quilograma kg
Grama g = 10
-3
kg
Decigrama dg = 10
-1
g
Vigilncia Sanitria Digital 23
Centigrama cg = 10
-2
g
Miligrama mg = 10
-3
g
Micrograma ** m = 10
-6
g
Nanograma ng = 10
-9
g
Picograma pg = 10
-12
g
Fentograma fg = 10
-15
g
Attograma ag = 10
-18
g

*As expresses massa e peso so adotadas indistintamentes nesta Farmacopia.
** Nas prescries e referncias relativas a doses teraputicas, g equivalente a mcg ou Y
(gama).

DE RATIOATIVIDADE

Becquerel Bq = 1 desintegrao nuclear por segundo
Curie Ci = 3,7 x 10
10
Bq
Milicurie mCi = 3,7 x 10
7 Bq
Bq
Microcurie Ci = 3,7 x 10
4
Bq
Gigabecquerel GBq = 27, 027 mCi
Megabecquerel MBq = 27, 027 Ci
Quilobecquerel KBq = 27, 027 nCi

PROCESSOS DE FABRICAO

A Farmacopia no fornece detalhes dos processos de fabricao de substncias
qumicas. A indicao de que uma substncia pode ser produzida por um mtodo determinado
no exclui a possibilidade de produzi-la por outros mtodos. Qualquer que seja o mtodo
utilizado, o produto final deve corresponder s especificaes da Farmacopia.
Na fabricao de produtos injetveis, comprimidos, cpsulas e outras preparaes
farmacopicas, permitido o uso de substncias adjuvantes devem ser incuas e no devem Ter
influncia adversa sobre a eficcia teraputica de substncia ativa contida na preparao nem
interferir com ensaios e determinaes.

DESCRO DE SUBSTNCIA

As informaes referentes descrio de uma substncia so genricas e destinam-se
avaliao preliminar da integridade da mesma.
A descrio, por si, no indicativa da pureza, devendo ser associada a outros testes
farmacopicos para assegurar que a substncia esteja de acordo com a monografia.

SOLUBILIDADE

A solubilidade indicada no deve ser tomada no sentido estrito de constante fsica, mas
como simples informao.
As indicaes sobre a solubilidade referem-se s determinaes feitas temperatura de 25
centgrados.
A no ser que a monografia especifique, diferentemente, a expresso solvente refere-se
gua.
A expresso partes refere-se dissolio de i g de um slido ou i ml de um lquido no
nmero de mililitros do solvente estabelecido no nmero de partes.
As solubilidades aproximadas constantes nas monografias so desingnadas por termo
descritivo, cujo significado figura na tabela abaixo.


TERMO DESCRITIVO SOLVENTE
Muito solvel Menos de 1 parte
Facilmente solvel De 1 a 10 partes
Solvel De 10 a 30 partes
Ligeiramente solvel De 30 a 100 partes
Pouco solvel De 100 a 1000 partes
Vigilncia Sanitria Digital 24
Muito pouco solvel De 1000 a 10000 partes
Praticamente insolvel ou insolvel Mais de 10000 partes

REAES DE IDENTIFICAO

So reaes usadas no auxlio de caracterizao de uma substncia. Embora especficos,
s sero suficientes para estabelecer ou confirmar a identidade da substncia guando
considerados em conjunto com outros testes e especificaes constantes da monografia.

DESIDADE DE MASSA E DENSIDADE RELATIVA

A densidade de massa(p) a massa de uma unidade de volume de uma substncia.
expressa em unidade de massa por volume.
A densidade relativa usualmente adotada (d
20
) definida como a relao entre a massa
de uma substncia ao ar a 20 graus centgrados e a massa de igual volume de gua na mesma
temperatura.

DETERMINAO DE AGUA E PERDA POR DESSECAO

Usa-se geralmente a expresso determinao de gua ou determinao de unidade
quando se determina, em condies especificadas, a gua de hidratao ou a gua de adsoro
de uma substncia.
A expresso perda por dessecao refere-se geralmente perda em massa, por
secagem, em condies especificadas, de gua e outros componentes residuais volveis.

IMPUREZAS

Os testes descritos nas monografias limitam as impurezas a quantidades tais que
assegurem qualidade ao frmaco. O fato de os ensaios no inclurem uma impureza pouco
freqente no significa que esta possa ser tolerada.

REAES QUMICAS E LIMPIDEZ DE SOLUES

A no ser que a monografia especifique diferentemente, as reaes qumicas so feitas
em tubos de ensaio de aproximadamente 15 mm de dimetro inteiro. Utilizam-se 5 ml do lquido
ou soluo a examinar, adicionando-se trs gotas de reagente ou de cada reagente.
O exame do contedo do tubo de ensaio deve ser feito sobre toda a camada lquida,
observando de cima para baixo, aps cinco minutos de repouso.

Soluo lmpida aquela que apresenta turvao menor que a de uma suspenso de
caulim a 0,00005% (p/v) em gua e cujas partculas tm, em mdia, dimetro inferior a 20 um.
No se considera sinal de turvao qualquer resduo bvio de material filtrante (fiapos).

Opalescncia turvao equivalente, no mximo, produzida pela adio de 5 ml da
diluio de i ml de cido clordrico 0,01 M em 99 ml de gua, a 0,5 ml de nitrato de prata 0,1 M. A
observao deve ser feita sobre fundo preto, com luz incidente, cinco minutos aps adio do
nitrato de prata.

Leve turvao aquela equivalente, no mximo, que se produz guando se adiciona 5
ml da diluio de 2 ml de cido clordrico 0,01 M em 98 ml de gua a 0,5 ml de nitrato de prata 0,1
M.
A observao deve ser feita como no caso precedente.

Turvao equivalente, no mximo, que se produz guando se adiciona 5 ml da
diluio de 4 ml de cido clordico 0,01 M em 96 ml de gua a 0,5 ml de nitrato de prata 0,1 M.
A observao deve ser feita como nos casos precedentes.

Precipitado a formao de depsito guando partculas em suspenso so deixadas
em repouso por 15 minutos.

Vigilncia Sanitria Digital 25
Lquido incolor aquele cuja tonalidade no ultrapassa a das solues padro para a
determinao de limite de impurezas. O ensaio deve ser comparativo e realizado em colunas
lquidas de 10cm de transparentes, sobre fundo branco.

ACIDEZ E ALCALINIDADE: ENSAIOS RPIDOS

Uma soluo considerada neutra guando no modifica a cor dos papis azul e vermelho
de tornassol, ou guando o papel indicador universal adquire as cores da escala neutra, ou guando
i ml da mesma soluo se cora de verde com uma gota de azul de bromotimol SI (pH 7,0).
considerada cida guando cora em vermelho o papel azul de tornassol ou 1 ml se cora
de amarelo por uma gota de vermelho de fenol SI (pH 1,0 a 6,6).
considerada fracamente cida guando cora levemente de vermelho o papel azul de
tornassol ou 1 ml se cora de alaranjado por uma gota de vermelho de metila SI (pH 4,0 a 6,6).
considerada fortemente cida guando cora de azul o papel de vermelho congo ou 1 ml
se cora de vermelho pela adio de uma gota de alaranjado metila SI (pH1,0 a 4,0).
considerada alcalina guando cora de azul o papel vermelho de tronassol ou 1 ml se
cora de azul de bromotimol SI (pH 7,6 a 13,0).
considerada fracamente alcalina guando cora de azul o papel vermelho de tornassol ou
1 ml se cora de rosa por gota de vermelho de cresol SI (pH 7,6 a 8,8).
considerada fortemente alcalina guando se cora de azul por uma gota de timolftalena
SI (pH 9,3 a 10,5) ou de vermelho por uma gota de fenolftalena SI (pH 10,0 a 13,0).

REAGENTES, INDICADORES, SOLUES REAGENTES, SOLUES INDICADORAS,
SOLUES COLORIMTRICAS E SOLUES VOLUMTRICAS

Reagentes so substncias utilizadas em testes, reaes, ensaios e dosamento
farmacopico quer como tais, quer em solues.

Indicadores so substncias utilizadas nos ensaios farmacopicos para determinar o
ponto final de uma reao qumica, avaliar a concentrao hidrognica ou assinalar uma
mudana de Ph desejada.

Solues reagentes so solues de reagentes solventes especficos e concentrado
definidas. So designadas por SR.

Solues indicadoras so solues de indicadores em solventes especficos e
concentraes definidas. so designadas por SI.

Solues colorimtricas so solues utilizadas na preparao de padres
colorimtricos para fins de comparao. So indicadas por SC.

Solues volumtricas so solues de reagentes de concentrao conhecida,
destinadas ao uso em determinaes quantitativas. Na F. Bras. IV as concentraes da solues
volumtricas so expressas em molaridade. So indicadas por SV.

Soluo molar a soluo que contm uma molcula-grama da substncia em 1000 ml
da soluo. Os mltiplos e submltiplos da soluo molar tambm so designados por nmeros
inteiros ou fraes decimais como: 2M, 0,5M, 0,1M, etc.

APARELHOS VOLUMTRICOS

Os aparelhos volumtricos so empregados nas medidas de volume nos testes, ensaios e
doseamento farmacopicos e devem ser aferidos temperatura padro de 25 graus centgrados.
Se o aparelho volumtrico no for aferido a 25 graus centgrado, as solues devem ser aferidas
temperatura de aferio indicada no aparelho.
Nas medies de volume, o nvel inferior do menisco do lquido contido nos aparelhos
volumtricos deve aflorar o trao de aferio. Nos casos de lquidos fartamente corados usa-se
como referncia a borda superior do menisco.
Os aparelhos volumtricos para a transparncia de lquidos (pipeta ou buretas), em
virtude de terem sido aferidos com gua s podero fornecer exatamente o volume indicado
Vigilncia Sanitria Digital 26
guando os lquidos a medir tiverem aproximadamente a viscosidade, a tenso superficial e a
densidade da gua.


TEMPERATURA

A menos que a monografia especifique que diferentemente, todas as temperaturas
constantes da F. Bras. IV so expressas so escala Celsius e todas as medidas so feitas a 25
graus centgrados.

GUA

A gua mencionada nos testes, reaes e ensaios gua purificada. Para preparaes
injetveis deve ser utilizada gua para injees, descrita na monografia. Quando for prescrito o
uso de gua isenta de dixido de carbono, utilizar gua purificada, fervida vigorosamente pelo
menos cinco minutos e protegida da ar atmosfrico durante o resfriamento e armazenagem.

BANHO-MARIA E BANHO A VAPOR

A expresso banho-maria significa o uso de um banho de gua fervente, a no ser que a
monografia especifique outra temperatura. As expresses gua quente e gua muito quente
indicam temperatura aproximadas entre 60-70 graus centgrados e entre 85-95 graus centgrados,
respectivamente.
Banho a vapor significa exposio ao vapor fluente ou outra forma de calor,
correspondendo em temperatura vapor fluente.

PRESSO REDUZIDA

A no ser que a monografia especifique diferentemente, a expresso presso reduzida
significa presso menor que 6,7 kPa (aproximadamente 50mm de mercrio). Quando a
monografia especificar dessecao presso reduzida sobre agente dessecante, a operao
deve ser feita presso reduzida em dessecador ou outro aparelho adequado.

DESSECADOR

Compreende-se por dessecador um recipiente perfeitamente fechado, de formato e
dimenses para manter atmosfera de baixo teor de umidade por meio de agentes dessecantes
nele introduzidos, tais como slica-gel, cloreto de clcio anidro, penotxido de fsforo, cido
sulfrico, dentre outros.
Dessecador presso reduzida o que permite manter atmosfera de baixa umidade
presso reduzida a no mais que 6,7 Kpa (aproximadamente 60 mm de mercrio), ou presso
indicada na monografia.

MEDIDAS DE PRESSO

A expresso pascal (Pa) usada para medidas de presso como a arterial, atmosfrica ou
a interna de um aparelho, refere-se a uso de manmetros ou barmetros calibrados em relao
presso exercida pela fora de 1 newton uniformemente distribuda sobre uma superfcie plana de
1 m
2
de rea perpendicular direo da fora; 1 pascal equivale a 7,5 x 10
-3
mm de mercrio.

PREPARAO DE SOLUES

A menos que a monografia especifique diferentemente, todas as solues em testes,
reaes e ensaios so preparadas com gua purificada.

ODOR

As expresses inodora, praticamente inodora, leve odor caracterstico, ou variao das
mesmas, so usadas examinando-se amostra aps exposio ao ar por 15 minutos, quando se
Vigilncia Sanitria Digital 27
trata de embalagens de at 25g recm-abertas. No caso de embalagens maiores, transferir
amostras de cerca de 25g para cpsula de 100 ml de capacidade.
A caracterstica do odor apenas descritiva e no pode ser considerada como padro de
pureza, exceto em casos em que um odor particular no seja permitido pela monografia.

PROVA EM BRANCO

As expresses executar branco paralelo ou fazer prova em branco ou efetuar ensaio em
branco significam repetir a determinao em condies idnticas de reagentes, omitindo-se,
apenas, a substncia em exame.

DESSECAO AT PESO CONSTANTE

Esta expresso significa que a secagem deve prosseguir at que duas pesagens
consecutivas no difiram em mais de 0,5 mg por grama da substncia em exame, sendo que a
Segunda pesagem deve ser efetuada aps uma hora de secagem adicional nas condies
especificadas.

INCINERAO AT PESO CONSTANTE

Esta expresso significa que a incinerao deve prosseguir a 800 graus centgrados mais
ou menos 25 graus centgrados (a menos que a monografia especifique diferentemente) at que
duas pesagens consecutivas no difiram em mais de 0,5 mg por grama da substncia em exame,
sendo que a segunda pesagem deve ser efetuada aps 15 minutos de incinerao adicional.

PORCENTAGTENS

As concentraes em porcentagem so expressas como segue:
Por cento p/p (peso em peso) ou % (p/p) expressa o nmero de g de componentes em 100g de
mistura.
Por cento p/V (peso em volume) ou % (p/V) expressa o nmero de g de um componente em
100 ml da soluo.
Por cento V/V (volume em volume) ou % (V/V) expressa o nmero de ml de componente em
100 ml de soluo.
Por cento V/p (volume em peso) ou % (V/p) expressa o nmero de ml de um componente em
100 g da mistura.
A expresso por cento usada sem outra atribuio significa para mistura de slidos e
semi-slidos, por cento p/p, para solues ou suspenses de slidos em lquidos, por cento p/V,
para solues de lquidos, por cento v/v, para solues de gases em lquidos, por cento p/v, para
expressar teor de leos essenciais em drogas vegetais, por cento V/p

INTERPRETAO DA PRECISO DOS DADOS NUMRICOS E LIMITES DE TOLERNCIA

A preciso desejada nos testes, reaes e ensaios farmacopicos indicada pelo nmero
de decimais que se apresenta no texto. Por exemplo, 20 indica valor no menor que 19,5 e no
maior que 20,5; 2,0 indica valor no menor que 1,95 e no maior que 2,05; 0,20 indica valor no
menor que 0,195 e no maior que 0,205.
Os limites de tolerncia, expressos numericamente por um valor mximo e mnimo,
indicam a pureza de uma substncia farmacopica. Estes valores podem ser expressos em
porcentagem ou nmeros absolutos.
A faixa de variao deve ser estritamente observada, no sendo tolerados valores fora
dos limites mximo e mnimo.

CONSERVAO

As substncias farmacopicas devem ser conservadas sob condies tais que evitem sua
contaminao ou deteriorizao. As condies de conservao de substncias farmacopicas
figuram nas respectivas monografia.
Proteger da luz significa que a substncia deve ser conservada em recipiente opaco ou
capaz de impedir a ao da luz.
Vigilncia Sanitria Digital 28
Proteger da poeira significa que a substncia deve ser mantida em frasco arrolhado e
munido de capuz protetor.
Quando a monografia define as condies de temperatura na qual o frmaco deve ser
conservado, so utilizados os seguintes termos:
em congelador em temperatura entre zero graus centgrados 20 graus centgrados.
em refrigerador em temperatura entre 2 graus centgrados 8 graus centgrados;
local fresco ambiente cuja temperatura permanece entre 8 graus centgrados e 15 graus
centgrados;
local frio o ambiente cuja temperatura no excede 8 graus centgrados.
A menos que a monografia especifique diferentemente, quando um frmaco necessita ser
conservado em local fresco, o mesmo pode ser conservado em refrigerador.
Temperatura ambiente a temperatura normalmente existente em um local de trabalho,
entre 15 graus centgrados e 30 graus centgrados.
Local quente o ambiente cuja temperatura permanece entre 30 graus centgrados e 40
graus centgrados.
Calor excessivo indica temperaturas acima de 40 graus centgrados.
Quando a monografia no especificar condies de conservao, estas incluem proteo
contra a umidade, congelamento e calor excessivo.

MATERIAL DE ACONDICIONAMENTO E EMBALAGEM

Compreende-se por material de acondicionamento e embalagem o recipiente, envoltrio,
invlucro ou qualquer outra forma de proteo, removvel ou no, destinado a envasar, proteger,
manter, cobrir e empacotar, especificamente ou no, matrias primas, reagentes e
medicamentos.
Material de acondicionamento propriamente dito o que est em contato direto com seu
contedo durante todo o tempo. Considera-se material de acondicionamento ampola, bisnaga,
envelope, estojo, flaconete, frasco de vidro ou de plstico, frasco-ampola, cartucho, lata, pote,
saco de papel e outros.
Embalagem a que se destina total proteo do material de acondicionamento nas
condies usuais de transporte, armazenagem e distribuio. Considera-se embalagem: caixas
de papelo, cartolina, madeira ou material plstico ou estojo de cartolina e outros.
No deve haver qualquer interao, entre o material de acondicionamento e o seu
contedo, capaz de alterar a concentrao, a qualidade ou pureza do material acondicionado.
As condies de acondicionamento so descritas nas monografias, utilizando-se os
termos abaixo.
Recipiente bem fechado aquele que protege o seu contedo de perdas e
contaminao por slidos estranhos, nas condies usuais de manipulao, transporte,
armazenagem e distribuio.
Recipiente perfeitamente fechado aquele que protege o seu contedo de perdas e
contaminao por slidos, lquidos e vapores estranhos, eflorescncia deliquescncia ou
evaporao nas condies usuais de manipulao, distribuio, armazenagem e transporte.
Recipiente hermtico aquele impermevel ao ar ou qualquer outro gs, nas condies
usuais de manipulao, transporte, armazenagem e distribuio.
Cilindro de gs recipiente metlica perfeitamente fechado, de paredes resistentes,
destinado a conter gs sob presso, obturado por vlvula regulvel, capaz de manter a sada do
gs em vazo determinada.
Recipiente para dose nica o recipiente hermtico e que contm determinada
quantidade do medicamento destinada a ser administrada de uma s vez, o qual, uma vez aberto,
no poder ser fechado com garantia de esterilidade.
Recipiente para doses mltiplas o recipiente hermtico que permite a retirada de
pores sucessivas de seu contedo, sem modificar a concentrao, a pureza e a esterilidade da
poro remanescente.

ROTULAGEM

O rtulo a impressa ou litografada, bem como dizeres pintados ou gravados a fogo,
presso ou decalque aplicados diretamente sobre recipientes, vasilhames, invlucros ou qualquer
outro material de acondicionamento. Os rtulos tero dimenses necessrias fcil leitura e
sero redigidos de modo a facilitar o entendimento ao consumidor.
Vigilncia Sanitria Digital 29
A confeco dos rtulos dever obedecer s normas vigentes do rgo federal de
Vigilncia Sanitria.

PRAZO DE VALIDADE

O prazo de validade limita o tempo durante o qual o produto poder ser usado. Os
produtos devero indicar nos rtulos, quando tecnicamente possvel, e embalagem a data do
trmino do prazo de validade. Esta data identifica o tempo durante o qual o frmaco estar de
acordo com as exigncias da farmacopia, quando mantido sob as condies de conservao
indicadas.
Quando o prazo de validade for indicado apenas pelo ms e ano entende-se como
vencimento do prazo o ltimo dia desse ms.

SUBSTNCIAS ADJUVANTES

Substncias adjuvantes tais como, conservantes estabilizantes, diluentes, desagregantes,
aglutinantes, deslizantes, anti-aderentes, entre outras, so aquelas empregadas para preparar a
forma farmacutica. Essas substncias devem ser incuas nas quantidades adicionais e no
devem prejudicar a eficcia teraputica do medicamento.
A presena de tais substncias e a proporo adicionada devem ser claramente indicadas
nos rtulos dos recipientes em que o produto entregue para consumo.
A no ser que haja contra-indicao expressa, o ar dos recipientes pode ser substitudo
por dixido de carbono ou nitrognio.

CORANTES

Nas preparaes farmacuticas tolerada a presena de substncia corantes
enumeradas em XI.

AO, USO E DOSES

So as constantes do relatrio para registro do produto no rgo sanitrio, atualizados
mediante reviso bibliogrfica internacional, quando for o caso.
Quando indicadas nas monografias, as doses representam a quantidade do medicamento
usualmente prescrita para pacientes adultos. O mdico, a seu critrio e sob sua exclusiva
responsabilidade, poder variar as quantidades e a freqncia de administrao de qualquer
medicamento. Entretanto, a prescrio de doses muito superiores s usuais obriga o farmacutico
a confirmar, com o mdico emissor da receita, as doses estabelecidas.

DOSES E MEDIDAS APROXIMADA

Na falta de dispositivos de medidas apropriadas (dosadores, colheres-medida, etc.), para
a dispensao de medicamento podem ser utilizadas medidas aproximadas. So, geralmente,
unidades para uso domstico, com freqncia adotadas para informar ao paciente a medida da
dose.
Tais medidas tm a seguinte indicao de capacidade:
Colher das de ch..........................................................5 ml
Colher das de sobremesa.............................................10 ml
Colher das de sopa.......................................................15 ml
As doses menores que 5 ml costumam ser administradas em fraes da colher de ch ou
em gotas.

PADRES E SUBSTNCIAS DE REFERNCIA

Sero adotadas padres e substncias de referncia estabelecidos pela Organizao
Mundial da Sade, pela Farmacopia Internacional, pela Farmacopia Europia e outras
Farmacopias de maior expresso tcnica, at que padres desenvolvidos por entidades
nacionais, aps estudos colaborativos, venham a receber aprovao e oficializao pela
Comisso Permanente de Reviso da Farmacopia Brasileira.
Vigilncia Sanitria Digital 30
Os padres primrios para Espectrofometria de Absoro Atmica forma listados atravs
da denominao do metal, seguido da sigla SRA (Soluo Reagente para Absoro Atmica).

PRECISO DOS ENSAIOS BIOLGICOS

Os resultados dos ensaios biolgicos so expressos como potncia mdia estimada e os
limites de confiana para uma probabilidade de erro determinada. As especificaes para as
estimativas de potncia e para os limites de confiana aceitvel so indicadas em cada
monografia. A probabilidade de erro utilizada p=0,005, a menos que outra probabilidade seja
referida na monografia.

EXTRATOS

So preparaes lquidas, slidas ou semi-slidas obtidas pela extrao de drogas
vegetais ou minerais, frescas ou secas, por meio de lquido extrator adequado, seguida de sua
evaporao total ou parcial e ajuste do concentrado a padro previamente estabelecido.

EXTRATOS FLUIDOS

So preparaes lquidas extrativas obtidas de drogas vegetais ou animais por extrao
com lquidos apropriado ou por dissoluo do extrato seco correspondente. Devem apresentar
teor de princpios ativos e resduo seco prescritos na monografia.

EXTRATOS MOLES

So preparaes semi-slidas obtidas por evaporao parcial de extratos de drogas
vegetais ou animais, adicionadas ou no de adjuvantes e apresentando teor de princpios ativos
seco prescritos na monografia.

EXTRATOS SECOS

So preparaes slidas, pulverulentas ou granuladas obtidas por evaporao de
extratos de drogas medicamentosas, adicionadas ou no de adjuvantes, apresentando teor de
princpios ativos indicados na respectiva monografia.

ELIXIRES

So preparaes lquidas, lmpidas hidroalcolicas apresentando teor alcolico na faixa
de 20 a 50%.
Os elixires so preparados por dissoluo simples e devem ser envasados em frascos de
cr mbar e mantidos em lugar fresco e ao abrigo da luz.

XAROPES

So solues aquosas concentradas de sacarose ou outros acares.
Quando no se destinam ao consumo imediato, devem ser adicionados de conservadores
antimicrobianos autorizados.

TINTURAS

So preparaes alcolicas ou hidroalcolicas resultantes da extrao de drogas vegetais
ou animais da diluio dos respectivos extratos. So classificadas em simples e compostas,
conforme preparadas com uma ou mais matrias-primas.
Exceto quando prescrito diferentemente, 10 ml de tintura simples correspondem a 1 g de
droga seca.

LOES

So preparaes lquidas aquosas ou hidroalcolicas destinadas ao uso externo atravs
de aplicaes sobre a pele.
Vigilncia Sanitria Digital 31

ESPRITOS

So preparaes lquidas alcolicas ou hidroalcolicas, contendo princpios aromticos ou
medicamentosos e classificados em simples e compostos.
Os espritos so obtidos pela dissoluo de substncias aromticas no lcool, geralmente
na proporo de 5% (p/V).

GUAS AROMTICAS

So solues saturadas de leos essenciais ou outras substncias aromticas em gua.
Possuem odor caracterstico das drogas com as quais so preparadas, recebendo tambm o
nome das mesmas.

EMULSES

So preparaes farmacuticas obtidas pela disperso de duas fases lquidas imicveis ou
praticamente imiscveis. De acordo com a hidrofilia ou lipofilia da fase dispersante classifica-se os
sistemas em leo em gua (O/A) ou gua em leo (A/O).
Quando so para uso injetvel, devem atender s exigncias de esterilidade (V.5.1.1) e
pirognios (V.5.1.2).

SUSPENSES

So preparaes farmacuticas obtidas pela disperso de uma fase slida insolvel ou
praticamente insolvel em uma fase lquida.
Quando se destinam a uso injetvel, as suspenses devem satisfazer s exigncias de
esterilidade (V.5.1.1) e no apresentar partculas maiores que 100 um.

CPSULAS

So formas farmacuticas slidas que encerram a frmaco em invlucro mais ou menos
elstico. O invlucro mais ou menos elstico. O invlucro pode ser constitudo de amido ou de
gelatina.
As cpsulas devem atender s exigncias de variao de peso, tempo de desintegrao e
teor de princpios ativos descritos na monografia.

SUPOSITRIOS

So preparaes farmacuticas slidas com formato adequado para introduo do reto.
Devem fundir temperatura do organismo ou dispersar em meio aquoso.
Os supositrios devem atender s exigncias contidas nas monografias especficas, bem
como ao teste de desintegrao (V.1.4.2).

VULOS

So preparaes farmacuticas slidas, com formato adequado, para aplicao vaginal.
Devem dispersar ou fundir temperatura do organismo. Estas preparaes devem atender o
teste de desintegrao (V.1.4.2).

COLRIOS

So preparaes farmacuticas lquidas destinadas aplicao sobre a mucosa ocular.
Devem atender s exigncias especficas nas respectivas monogrfias. Devem satisfazer
s exigncias de esterilidade (V.5.1.1).

MEDICAMENTOS PRESSURIZADOS

So medicamentos mantidos sob presso em frasco e sistema de aplicao apropriados.
Devem atender s exigncias das respectivas monografias.
Vigilncia Sanitria Digital 32

COMPRIMIDOS

So formas farmacuticas slidas obtidas por compresso.
Esta forma farmacutica deve atender s exigncias de desintegrao (V.1.4.1),
dissoluo (V.1.5), dureza (V.1.3.1) e friabilidade (V.1.3.2) descritas nos mtodos gerais e
previstas nas monografias especficas.

PREPARAES TPICAS SEMI-SLIDAS

Preparaes tpicas semi-slidas so aquelas previstas para aplicao na pele ou em
certas mucosas para ao local ou penetrao percutnea de medicamentos, ou ainda por sua
ao emoliente ou protetora. As preparaes destinadas ao uso oftlmico, ao tratamento de
feridas ou aplicao sobre leses extensas da pele devem satisfazer s exigncias do teste de
esterelidade (V.5.1.1.).
Distinguem-se 4 categorias de preparaes semi-slidas:
- Pomadas
- Cremes
- Gis
- Pastas

POMADAS

Pomadas so preparaes tpicas constitudas de base monofsica na qual podem
dispersas substncias ou lquidas.

CREMES

So preparaes plsticas obtidas pela disperso de duas fases lquidas no miscveis ou
praticamente imiscveis.

GIS

Gis so preparaes farmacuticas constitudas por uma disperso bicoerente de fase
slida em fase lquida. Gis hidrofbicos consistem usualmente de parafina lquida com polietileno
ou leos gordurosos com slica coloidal ou sabes de alumnio ou zinco.
Gis hidroflicos so preparaes obtida pela incorporao de agentes gelificantes
tragacanta, amido, derivados de celulose, polmeros carboxivinlicos e silicatos duplos de
magnsio e alumnio gua, glicerol ou propilenoglicol.

PASTAS

Pastas so pomadas contendo grande quantidade de slidos em disperso.

INJETVEIS

Injetveis so preparaes estreis destinadas administrao parental, apresentadas
como soluo, suspenses, ou emulses. Devem atender as exigncias de volume (V.1.2),
esterilidade (V.5.1.1) e pirognios (V.5.1.2).

VECULOS AQUOSOS

Usam-se geralmente gua para injeo como veculo para injetveis aquosos. Solues
de cloreto de sdio ou soluo de Ringer ou outras solues adequadas, preparadas com gua
para injeo, podem ser usadas em parte ou totalmente ao invs de somente gua para injeo,
amenos que a monografia especifique de outra forma. Todos os veculos aquosos devem
satisfazer s exigncias especificadas nas provas de pirognios (V.5.1.2) e esterilidade (V.5.1.1).

VECULOS NO-AQUOSOS

Vigilncia Sanitria Digital 33
Veculos no-aquosos utilizados parcial ou totalmente na obteno de preparaes
injetveis podem ser miscveis ou no miscveis com gua. Entre os veculos miscveis com gua,
os mais usados so os leos fixos de origem vegetal e os mono e diglicerdeos de cidos graxos.
Os leos fixos so inodoros ou quase inodoros e seu odor e sabor no devem lembrar os
de rano. Devem satisfazer s exigncias especificadas nas monografias e apresentar as
caractersticas a seguir:

a) teste de resfriamento transferir quantidade de leo fixo, previamente dessecado a 105 graus
centgrados por duas horas e resfriado temperatura ambiente em dessecador contendo
slica-gel, para recipiente de vidro incolor cilndrico, com dimetro interno de
aproximadamente 25m. Fechar o recipiente e mergulhar durante quatro horas em gua
mantida a 10 graus centgrados. O lquido deve permanecer suficientemente claro, para que
possa facilmente ser vista uma linha negra de 0,5 mm de espessura, quando mantida
verticalmente atrs do cilindro e contra fundo branco.
b) ndice de saponificao Entre 185 e 200 (V.3.3.8);
c) ndice de iodo Entre 79 e 128 (V.3.3.10);
d) Substncias insaponificveis refluxar em banho-maria 10 ml de leo com 15 ml de hidrxido
de sdio (1:16) e 30 ml de lcool etlico, agitando ocasionalmente at que a mistura se torne
clara. Transferir a soluo para cpsula de porcelana, evaporar o lcool etlico em banho-
maria e misturar o resduo com 100 ml de gua. Deve resultar soluo clara;
e) cido graxos livres Os cidos graxos livres em 10 g do leo devem consumir, no mximo, 2
ml de hidrxido de sdio 0,02 M;

Os mono ou diglecirdeos de cido graxos devem obedecer s seguintes exigncias:
a) so lquidos e permanecem claros quando resfriados a 10 graus centgrados;
b) ndice de iodo no maior que 140 (V>5.3.10)
Os veculos no-aquosos devem ser selecionados com especial cuidado, pois no podem
ser irritantes, txicos ou sensibilizantes e no devem interferir na eficcia teraputica da
preparao.

SUBSTNCIAS ADJUVANTES

Adjuvantes so substncias com finalidade especficas adicionadas s injetveis. Estas
substncias devem ser selecionadas tendo em vista o aumento da estabilidade do produto, no
interferncia na eficcia teraputica nem no dosamento do princpio ativo, tampouco causar
toxidade na quantidade administrada ao paciente. Dentre tais substncias incluem-se os
solubilizantes, os antioxidantes, os agentes quelantes, os tampes, os agentes anti-espumante e
outros, quando especificados nas monografias. No permitida a adio de substncia corantes.
So os seguintes os limites mximos para alguns adjuvantes, a menos que a monografia
especifique de outra forma:
a) para agentes contendo mercrio ou compostos tensoativos catinicos 0,01%;
b) para agentes do tipo clorobutanol, cressol e fenol 0,5%;
c) para dixido de enxofre, ou quantidade equivalente de sulfito, bissulfito ou metabissulfito de
potssio ou sdio 0,2%.

Recipientes para preparaes injetveis devem ser fabricados com materiais que no
provoquem interao com o contedo e possuam transparncia suficiente para permitir inspeo
visual. As tampas, quando usadas, tampouco podem influir na composio ou na conservao do
medicamento, oferecendo perfeita vedao, mesmo aps perfuradas vria vezes.
Os recipientes para preparao injetveis so classificados em:
Recipientes para dose nica;
Recipientes para dose mltipla;
Recipientes para perfuso.

Os recipientes para dose nica, ampolas e cartuchos de uso odontolgico, so frascos de
vidro ou de material plstico adequado, fechados pela fuso do vidro ou com a utilizao de
oprculos fixos ou mveis. O contedo s deve ser utilizado em uma nica dose, no podendo
ser reaproveitado.
Vigilncia Sanitria Digital 34
Os recipientes para dose mltipla so frascos de vidro de paredes resistentes que, aps
cheios com preparaes lquidas ou com slidos para serem dissolvidos ou suspensos, so
selados com tampa de outro material. O contedo destes frascos pode ser removido para
administrao em uma nica ou vrias doses.

Os recipientes para perfuso sos frascos com mais de 50 ml de capacidade, podendo
atingir 1000 ml, selados com tampa de outro material ou no, fabricados de vidro ou de plstico.
Os medicamentos envasados nestes tipos de recipientes devem ser administrado em uma nica
vez, com a utilizao de equipos estreis, e no podem conter agentes bactericidas ou
antifngicos. O uso de outros tipos de adjuvantes deve ser considerado cuidadosamente.

CONTROLE DE VOLUME EM RECIPIENTE

Proceder como descrito em V.1.2. Determinao de volume em produtos com dose nica
e injetveis.

ESTERILIDADE

As preparaes injetveis devem satisfazer s exigncias especificadas na monografia
para o teste de esterilidade (V.5.1.1).

PIROGNIOS

As preparaes injetveis devem satisfazer s exigncias especificadas na monografia
para o teste de pirognios (V.5.1.2).

V. MTODOS DE ANLISE

V.1. PROCEDEIMENTOS TCNICOS APLICADOS A MEDICAMENTOS

V.1.1. DETERMINAO DE PESO EM FORMAS FARMACUTICAS

GENERALIDADES

Efetua-se a determinao de peso em produtos com dose individual e outras formas de
apresentao, acondicionados em recipientes de dose mltiplas. As pesagens so feitas em
balanas de sensibilidade adequada.

PRODUTOS COM DOSE INDIVIDUAL

A dose individual depende do tamanho ou da quantidade de formas de apresentao.
Mediante a determinao do peso individual obtm-se a informao sobre a homogeneidade por
unidade.

PRODUTOS COM DOSES MLTIPLAS

Em contraposio aos produtos com dose individual, as divergncias de peso do
contedo so determinadas a partir da quantidade nominal de enchimento. Deste modo obtm-se
informaes sobre a homogeneidade do envase.

COMPRIMIDOS

Pesar individualmente 20 comprimidos e determinar o peso mdio.
Pode-se tolerar no mais que duas unidades fora dos limites especificados na tabela, em
relao ao peso mdio, porm nenhuma poder estar acima ou abaixo do dobro das
porcentagens indicadas.

DRGEAS

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Pesar individualmente 20 drgeas e determinar o peso mdio. Pode-se tolerar no mais
que cinco unidades fora dos limites especificados na Tabela I, em relao ao peso mdio, porm
nenhuma poder estar acima ou abaixo do dobro das porcentagens indicadas.

CPSULAS DURAS

Pesar individualmente 20 cpsulas e determinar o peso mdio.
Pode-se tolerar variao dos pesos individuais em relao ao peso mdio, conforme
indicado na tabela.
Se uma ou mais cpsulas estiverem fora dos limites indicados, pesar individualmente 20
unidades, remover o contedo de cada uma e pesar novamente. Determinar o peso mdio do
contedo pela diferena dos valores individuais obtidos entre a cpsula cheia e a vazia. Pode-se
tolerar, no mximo, duas unidades fora dos limites especificados na tabela, em relao ao peso
mdio, porm nenhuma poder estar acima ou abaixo do dobro das porcentagens indicadas.
Se mais que duas, porm no mais seis, cpsulas, estiverem com variao entre uma e
duas vezes o ndice da tabela, em relao ao peso mdio, determinar o peso do contedo em
mais 40 unidades e calcular o peso mdio das 60. Determinar as diferenas, em relao ao novo
peso mdio. Pode-se tolerar, no mximo, 6 unidades em 60 cpsulas cuja diferena exceda os
limites da tabela, em relao ao peso mdio, porm nenhuma cuja diferena exceda o dobro dos
mesmos.

CPSULAS MOLES

Proceder como descrito sob o item cpsulas duras, utilizando a seguinte tcnica para
remoo do contedo.
- cortar as cpsulas previamente pesadas e lav-las com auxlio de ter etlico ou outro
solvente adequado. Deixar em repouso temperatura ambiente at completa
evaporao do solvente e
- seguir os conceitos de variao de peso estabelecidos para cpsulas duras.

SUPOSITRIOS E VULOS

Pesar individualmente 20 supositrios ou vulos e determinar peso mdio.
Pode-se tolerar no mais que duas unidades fora dos limites especificados na tabela, em
relao ao peso mdio, porm nenhuma poder estar acima ou abaixo do dobro das
porcentagens indicadas.

PS GRANULADOS, CREMES E POMADAS

Pesar individualmente 10 embalagens. Remover o contedo e lavar os respectivos
recipientes utilizando solvente adequado; secar, esfriar temperatura ambiente e pesar
novamente. A diferena entre as duas pesagens representa o peso do contedo.
Determinar o peso mdio do contedo, o qual no dever ser inferior ao valor nominal
declarado. Os pesos individuais podem divergir do mesmo, de acordo com a porcentagem
indicada na tabela.
Caso no seja cumprida essa exig6encia, determinar o peso individual do contedo de 20
embalagens adicionais. O peso mdio das 30 embalagens no deve ser inferior ao valor nominal
declarado e os pesos individuais podem divergir de acordo com a porcentagem indicada na
tabela, sendo que somente 1 embalagem em 30 pode divergir dos limites de variao indicados
na tabela.

PS ESTREIS E LIOFILIZADOS

Pesar individualmente 20 unidades, remover o contedo e lavar os respectivos recipientes
utilizando gua e em seguida lcool etlico.
Secar em estufa a 105 graus centgrados por 1 hora (ou temperatura mais baixa, at
peso constante), esfriar em dessecador e pesar novamente, recolocando a tampa livre de cpsula
metlica, no caso de frascos-ampola. A diferena entre as duas pesagens representa o peso do
contedo. Determinar o peso mdio das 20 unidades. Somente duas podem divergir do limite
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especificado na Tabela I, em relao ao peso mdio, porm nenhuma pode divergir de mais ou
menos 15% mesmo.
Se mais que duas, porm no mais que sete, estiverem com variao entre mais ou
menos 10% e mais ou menos 15% e se mais que 1 divergir mais que mais ou menos 15% do
peso mdio do contedo, determinar o peso individual de 40 unidades adicionais e calcular o
peso mdio das 60. Somente 6 entre os 60 pesos individuais podem divergir mais que mais ou
menos 10% do peso mdio do contedo, porm no mais que 1 pode divergir mais que mais ou
menos 15% do mesmo.

TABELA I VARIAO DO PESO EM FORMAS FARMACUTICAS

FORMAS FARMACUTICAS
PESO MDIO OU VALOR
NOMINAL DECLARADO
LIMITES DE VARIAO
Comprimidos, ncleos para drgeas,
comprimidos efervescentes,
comprimidos sublinguais, comprimidos
vaginais e pastilhas
At 80,0 mg
Entre 80,0 e 250,0 mg
Acima de 250,0 mg
+/- 10,0 %
+/- 7,5%
+/- 5,0 %
Drgeas e comprimidos revestidos
At 25,0 mg
Entre 25,0 e 150,0 mg
Entre 150,0 e 300,0 mg
Acima de 300,0 mg
+/- 15,0 %
+/- 10,0 %
+/- 7,5 %
+/- 5,0 %
Cpsulas duras e moles, cpsulas
vaginais
At 300,0 mg
Acima de 300,0 mg
+/- 10,0 %
+/- 7,5 %
Supositrios e vulos Para todos os pesos +/- 5,0 %
Cremes, pomadas, ps e granulados
At 60,0 g
Entre 60,0 a 150,0 g
+/- 10,0 %
+/- 5,0 %
Ps estreis e liofilizados
Abaixo de 40,0 mg
Acima de 40,0 mg
*
+/- 10,0 %
(*) Se o peso declarado for de 40 mg ou menos, a determinao feita segundo mtodo adequado de doseamento. O
valor do contedo pode divergir acima ou abaixo de 15% menos.

INJETVEIS

Controle de peso contido em recipientes.
Os recipientes que contm slidos destinados a solues ou suspenses injetveis
devem ser examinados quanto ao peso de slidos dispensados a satisfazer s exigncias
especificadas na monografia.
Uniformidade de peso Os slidos destinados a solues ou suspenses injetveis, cujos
pesos mdios so menores ou iguais a 40 mg, no esto sujeitos a este teste, mas devem ser
submetidos a dosamento apropriado.
Os slidos, cujos pesos mdios so maiores que 40 mg, devem satisfazer s exigncias
do teste descrito a seguir, quando o mesmo realizado sobre 20 unidades.
Remover o rtulo do recipiente. Lavar e secar o recipiente externamente, abrir e pesar
imediatamente com o seu contedo. Esvaziar o recipiente o mais completamente possvel por
meio de leves batidas e enxaguar com gua, se necessrio, e a seguir com lcool etlico. Secar o
recipiente a 105 graus centgrados por uma hora ou, conforme a natureza do contedo,
temperatura mais baixa, at peso constante. Esfriar em dessecador e pesar. A diferena entre o
peso do recipiente com o contedo e o peso do recipiente vazio representa o peso do contedo.
Repetir este procedimento com os outros dezenove recipientes.
No mais do que dois pesos individuais podem desviar mais que 10% do peso mdio
determinado sobre os vinte recipientes e nenhum deve desviar em mais que 20%.
Teor declarado Para a determinao do teor declarado em um recipiente, proceder a um
dos testes que seguem dependendo da exigncia da monografia.
Teste A Determinar o peso do contedo de dez recipientes seguindo o teste descrito
para Uniformidade de peso. O peso do contedo de cada recipiente no deve desviar do peso
declarado no rtulo, em percentual maior que o indicado na Coluna A da Tabela II. Apenas um
recipiente pode Ter o peso de seu contedo desviado em percentual no maior que o indicado na
coluna B da referida tabela.
Teste B Determinar o peso do contedo de dez recipientes seguindo o teste descrito
para uniformidade de peso. Misturar o contedo de dez recipientes e proceder ao doseamento
indicado na monografia. Aps o resultado do ensaio, calcular a quantidade proporcional do
principio ativo contido em cada recipiente. Esta quantidade deve estar de acordo com o
estabelecido na variao permitida na monografia e apenas um recipiente pode desviar mais que
duas vezes do grau de tolerncia permitido na monografia. Quando um ensaio biolgico
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especificado, calcular, do resultado do ensaio, a potncia do contedo dos recipientes. A potncia
deve estar entre os limites fiduciais estabelecidos na monografia.

TABELA 2 DESVIOS PORCENTUAIAS


Peso declarado no rtulo
(em g)
Desvio de porcentual
A B
0,12 +/- 10,0 % +/- 15,0 %
0,12 < 0,3 +/- 7,5 % +/- 12,5 %
> 0,3 +/- 5,0 % +/- 10,0 %

V.1.2. DETERMINAO DE VOLUME EM FORMAS FARMACUTICAS

GENERALIDADES

A determinao do volume nominal em produtos lquidos com dose mltipla efetuada
atravs do peso do seu contedo. As pesagens so realizadas em balanas de sensibilidade
adequada. Para produtos lquidos com dose nica e para injetveis, a determinao realizada
atravs de seringa de vidro previamente calibrada.

TCNICA

Produtos lquidos com dose mltipla

Pesar individualmente o nmero de unidades indicadas na Tabela I, remover o contedo e
lavar os recipientes utilizando gua e em seguida lcool etlico. Secar em estufa a 105 graus
centgrados por 1 hora ou a temperatura mais baixas at peso constante, conforme o material do
recipiente. Esfriar temperatura ambiente e pesar novamente, recolocando a tampa e outras
partes correspondentes a cada recipiente. A diferena entre as duas pesagens representa o peso
do contedo. Determinar o peso mdio das unidades testadas e anotar os valores mnimo e
mximo individuais encontrados.
Para se obter os volumes correspondentes, efetuar o seguinte clculo:
m
em que V =
d

v = volume em ml
m = peso do contedo em g
d = densidade do produto em g/ml, determinada a 25 graus centgrados ou conforme descrito na
monografia.

O volume mdio das terminaes no pode ser inferior ao declarado. Nenhuma unidade
poder ultrapassar o ndice do desvio mximo citado na Tabela I.

Tabela 1

Volume declarado
ml
Unidades a serem testadas Desvio mximo tolerado
At 10 ml 12 3,0 %
Entre 10 ml e 30 ml 10 2,5 %
Entre 30 ml e 100 ml 6 2,0 %
Entre 100 ml e 250 ml 3 1,5 %
Acima de 250 ml 2 1,0 %

Produtos lquidos com dose nica e injetveis

Testar o nmero de unidades indicadas na Tabela II. Remover o contedo total de cada
unidade, com auxlio de seringa, e efetuar a medio. Determinar o volume mdio das unidades
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testadas e anotar os valores mnimo e mximo individuais encontrados. O volume no deve ser
inferior ao indicado na Tabela III.

Tabela 2

Volume declarado ml Unidades a serem testadas
De 0,5 a 3,0 12
De 0,3 a 10,0 10
Maior que 10 6

Tabela 3

Volume declarado ml
Excesso mnimo para lquidos
Mveis / ml Viscosos / ml
0,5 0,10 0,12
1,0 0,10 0,15
2,0 0,15 0,25
5,0 0,30 0,50
10,0 0,50 0,70
20,0 0,60 0,90
50,0 ou mais 2,00 % 3,00 %

V.1.3. DETERMINAO DE RESISTNCIA MECANICA EM COMPRIMIDOS

Os testes de resistncia mecnica, tais como friabilidade e dureza, so considerados
oficiais dentro do contexto legal desta Farmacopia e como tal constituem elementos teis na
avaliao da qualidade integral dos comprimidos com ou sem revestimento. Estes testes visam,
especificamente, a demonstrar a resistncia dos comprimidos ruptura provocada por golpes ou
frico durante os processos de revestimento, embalagem, transporte, armazenagem, etc.

V.1.3.1. DUREZA

Dureza a resistncia do comprimido ao esmagamento ou ruptura sob presso radial. A
dureza de um comprimido proporcional ao logartimo da fora de compresso e inversamente
proporcional sua porosidade.
O teste consiste em submeter o comprimido ao de um aparelho que mea a fora
aplicada diametralmente, necessria para esmag-lo. A fora medida em newton (n). Para teste
de comprimidos, o mnimo aceitvel 30 n ( aproximadamente 3 Kgf).

APARELHAGEM

Podem ser utilizados, essencialmente, dois tipos de aparelhos, os quais diferem
basicamente quanto ao mecanismo empregado para exercer a presso. A fora pode ser exercida
por mola espiral ou por bomba de ar operada manualmente. medida que a presso aumenta,
um mbolo ou pisto aplica determinada fora no comprimento apoiado em base fixa. Os valores
obtidos com o aparelho movido pela bomba de ar podem ser aproximadamente 1,5 vezes maiores
que os obtidos com a mola espiral. A dureza mnima aceitvel, neste caso, de 45 N
(aproximadamente 4,5 Kgf).

V.1.3.2. FRIABILIDADE

Friabilidade a falta de resistncia dos comprimidos abraso, quando submetidos
ao mecnica de aparelhagem especfica.
O teste consiste em pesar com exatido um mnimo de vinte comprimidos, introduzi-los na
aparelho e submet-lo ao do aparelho e retir-los aps efetuadas cem rotaes num perodo
de cinco minutos.
Aps remover qualquer resduo de poeira dos comprimidos, eles so novamente pesados.
A diferena entre o peso inicial e o final dos comprimidos representa a friabilidade em funo da
porcentagem de p perdido. Considera-se aceitveis os comprimidos com perda inferior a 1,5%
do seu peso ou a porcentagem estabelecida na monografia, quando submetidos ao teste descrito.
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Para clculo de porcentagem de friabilidade no so considerados os comprimidos
lascados ou que se separam em duas camadas.

APARELHAGEM

Consiste num cilindro, com 20 cm de dimetro e 4 cm de espessura, o qual gira em torno
de seu eixo, velocidade de rotao de 20 rpm. O cilindro contm vrias lminas que recolhem
os comprimidos em cada rotao, levando-os a uma altura pr-fixada, de onde caem
repetidamente, aps cada rotao.

V.1.4. TESTES DE DESINTEGRAO

V.1.4.1. DETERMINAO DO TEMPO DE DESINTEGRAO
PARA COMPRIMIDOS E CPSULAS

O teste de desintegrao determina se um comprimido ou cpsula desintegra-se dentro
do limite de tempo especificado na monografia de cada forma medicamentosa, quando unidades,
em nmero especificado, so submetidos s condies experimentais subseqentemente
descritas.
A desintegrao definida, para os fins deste teste, como o estado na qual nenhum
resduo da unidade (cpsula ou comprimido), salvo fragmentos de revestimento ou matriz de
cpsula insolveis, permanece na tela metlica do aparelho de desintegrao. Consideram-se
tambm como desintegradas as unidades que durante o teste se transformam em massa
pastosa que no apresente em seu interior nenhum ponto endurecido, mesmo que permanea
sobre a tela do aparelho.

APARELAGEM

Consiste de sistemas de cestas e tubos, de recipiente apropriado para lquido de imerso
(um bquer com capacidade de 1 l), de termostato para manter o lquido a 37 graus centgrados
mais ou menos 1 grau centgrado, e de mecanismo para movimentar verticalmente a cesta os
tubos no lquido de imerso, com freqncia constante e percurso especfico. O volume do lquido
de imerso dever ser suficiente para que ao atingir o ponto mais alto do percurso, a parte inferior
da cesta fique no mnimo a 25 mm abaixo da superfcie do lquido, e que no ponto mais baixo
fique a 25 mm do fundo do bquer. Os movimentos ascendente e descendente devero Ter a
mesma velocidade e a mudana do sentido do movimento deve ser suave.
A cesta consiste em seis tubos de vidro ou acrlico transparente, abertos em ambos os
lados. As dimenses do tubo so comprimento 77,5 mm, dimetro 21,5 mm e espessura das
paredes aproximadamente 2 mm.
Os tubos so mantidos verticalmente, adaptando-se em cada extremidade um disco de
material adequado transparente, com dimetro de 90 mm e espessura de 6 mm, possuindo seis
orifcios nos quais so introduzidos os tubos. Os seis orifcios eqidistam do centro de cada disco,
estando igualmente espaados. Na face externa do disco inferior encontra-se uma tela de arame
(dimetro de 0,635 mm) de ao inoxidvel, com abertura de 2 mm, presa atravs de trs
parafuso.
O disco superior possui tampa de ao inoxidvel ou acrlico, com dimetro de 90 mm, que
fixada mediante trs presilhas. A tampa possui orifcio central com dimetro de 32 mm que
encaixa nas presilhas e seis orifcios igualmente espaados e eqidistantes do centro, com
dimetro de 19 mm. No teste de desintegrao de cpsulas, utiliza-se tela de arame de ao
inoxidvel presa na face externa da tampa, semelhante tela adaptada ao disco inferior da cesta.
As partes que constituem a cesta so montadas e mantidas firmemente unidas mediante
parafuso metlico central, com dimetro de 5 mm, com porcas convenientemente situadas. A
extremidade superior do parafuso central deve Ter dispositivo para fixar a cesta ao mecanismo
que produz o movimento vertical do sistema.
Quando indicado, deve ser adicionado em cada tubo da cesta um disco cilndrico de
material adequado transparente, com densidade relativa entre 1,18 e 1,20, dimetro de 20,7 mm
mais ou menos 0,15 mm, e espessura de 9,5 mm mais ou menos 0,15 mm. Cada disco possui
cinco orifcios, cada um com 2 mm de dimetro, sendo um orifcio no eixo do cilindro e os outros
quatro eqidistantes , dispostos sobre um crculo de 6 mm de raio relativo ao centro do disco. A
superfcie lateral do disco possui quatro mossas eqidistantes, com profundidade de 2,55 mm, em
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forma de V, as quais, no lado superior do disco, sedem 9,5 mm de largura, e no lado inferior, 1,6
mm. Todas as superfcies do disco so lisas.
O desenho e montagem da cesta podem variar desde que as especificaes para os
tubos e abertura das telas sejam mantidas.



























Aparelho para desintegrao de comprimidos e cpsulas (dimenses em mm)

COMPRIMIDOS

Utilizar inicialmente 6 comprimidos no teste. Colocar 1 comprimido em cada um dos seis
tubos da cesta, adicionar um disco a cada tubo e acionar o aparelho, utilizando gua mantida a 37
graus centgrados mais ou menos 1 grau centgrado como lquido de imerso, a menos que outro
fluido seja especificado na monografia do medicamento. Ao final do intervalo de tempo
especificado, cessar o movimento da cesta e observar o material em cada um dos tubos: todos os
comprimidos devem estar completamente desintegrados. O limite de tempo estabelecido como
critrio geral para o teste de desintegrao de comprimidos de 30 minutos, a menos que outra
especificao se encontre na monografia do medicamento.

COMPRIMIDOS COM REVESTIMENTO AUCARADO OU FILME

Utilizar inicialmente 6 comprimidos. Colocar 1 comprimido em cada um dos seis tubos da
cesta. Se o comprimido possuir um revestimento externo solvel, mergulhar a cesta em gua,
temperatura ambiente, durante 5 minutos. Colocar um disco em cada tubo, e acionar o aparelho,
utilizando gua mantida a 37 graus centgrados mais ou menos 1 grau centgrado como lquido de
imerso. Decorridos 60 minutos, cessar o movimento da cesta e observar o material em cada um
dos tubos. Se os comprimidos no estiverem completamente desintegrados, testar outros 6
comprimidos, utilizando cido clordrico 0,1 M como lquido de imerso, mantido a 37 graus
centgrados mais ou menos 1 grau centgrado. Aps 60 minutos, cessar o movimento da cesta e
observar o material em cada um dos tubos: todos os comprimidos devem estar completamente
desintegrados.

COMPRIMIDOS COM REVESTIMENTO ENTRICO

Utilizar inicialmente 6 comprimidos no teste. Colocar 1 comprimido em cada um dos seis
tubos da cesta. Se o comprimido possuir um revestimento externo solvel, mergulhar a cesta em

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gua, temperatura ambiente, durante 5 minutos. Acionar o aparelho, sem adicionar os discos,
utilizando cido clordrico 0,1 M mantido a 37 graus centgrados mais ou menos 1 grau centgrado
como lquido de imerso. Decorridos 60 minutos, cessar o movimento da cesta e observar os
comprimidos: estes no devem estar desintegrados, rachados ou amolecidos. Colocar um disco
em cada tubo e acionar o aparelho, utilizando soluo tampo fostato pH 6,8 (para comprimidos
com revestimento de goma-laca recomenda-se ajustar o pH deste tampo para 7,5), mantida a 37
graus centgrados mais ou menos 1 grau centgrado, com lquido de imerso. Decorrido o tempo
especificado na monografia, ou 45 minutos, cessar o movimento da cesta e observar o material
em cada um dos tubos; todos os comprimidos devem estar completamente desintegrados,
podendo restar apenas fragmentos de revestimento insolveis.

CPSULAS GELATINOSAS

Aplicar o teste conforme descrito para comprimidos omitindo o uso dos discos. Utilizar
uma tecla com abertura de 2 mm, de arame de ao inoxidvel adaptada tampa da cesta,
conforme descrito no item Aparelhagem. Observar as cpsulas aps 45 minutos ou conforme
especificado na monografia do medicamento: todas as cpsulas devem estar completamente
desintegradas, ou restando apenas fragmentos insolveis de consistncia mole.

CPSULAS GASTRO-RESISTENTES

Utilizar a cesta conforme descrito para Cpsulas Gelatinosas e proceder conforme
descrito para Comprimidos com Revestimento Energtico.

CPSULAS SUBLINGUAIS

Aplicar o teste conforme descrito para Comprimidos, omitindo o uso de discos. Aps 5
minutos, todos os comprimidos devem estar completamente desintegrados.

V.1.4.2. DETERMINAO DO TEMPO DE DESINTEGRAO DE
SUPOSITRIOS, VULOS E COMPRIMIDOS VAGINAIS

Considera-se desintegrao completa quando o supositrio ou vulo apresentar:
a) dissoluo completa;
b) separao completa de seus componentes, acumulando-se substncias graxas
fundidas na superfcie do lquido, depositando-se os ps insolveis na fundo do recipiente e
dissolvendo-se os componentes solveis da mostra, sendo que a distribuio dos componentes
ocorre de um ou mais dos modos descritos acima;
c) amolecimento da amostra que pode ser acompanhado pela mudana da sua forma
sem que ocorra separao completa de seus componentes; o amolecimento deve ser tal que, ao
pressionar a mostra amolecida com basto de vidro, no se perceba existncia de camada mais
dura na sua superfcie.
d) ruptura da cpsula gelatinosa de vulos, permitindo liberao de seus componentes;
e) ausncia de resduo sobre o disco perfurado ou, quando houver, tenha a consistncia
de massa mole que no oferea resistncia presso de basto de vidro.

APARELHO

O aparelho (figura 1) consiste de cilindro de vidro ou plstico transparente, com paredes
de espessura apropriada, em cujo interior se encontra preso, por trs ganchos de metal, um
dispositivo metlico que consiste de dois discos perfurados de ao inoxidvel, contendo cada um
39 orifcios de 4 mm de dimetro cada. O dimetro de cada disco tal que permite a sua
introduo no cilindro transparente ficando os discos afastados de, aproximadamente, 30 cm. A
determinao levada a efeito utilizando-se trs aparelhos, contendo cada um uma nica
amostra. Cada aparelho introduzido no interior de bquer de, pelo menos 4 litros de capacidade,
contendo gua temperatura de 36 37 graus centgrados (a no ser que a monografia
especifique diferentemente). O bquer provido de agitador que opere em velocidade lenta e
dispositivo que permita inverter o cilindro sem retir-lo da gua.



Vigilncia Sanitria Digital 42



















Fig. 1 Aparelho para desintegrao de supositrio, vulos e comprimidos vaginais, (dimenses em mm).

PROCEDIMENTO

Usar trs supositrios ou vulos. Colocar cada um deles sobre o disco inferior do
dispositivo, introduzir e fixar o disco no interior do cilindro. Inverter o aparelho cada 10 minutos.
Examinar as amostras aps decorrido o tempo prescrito na monografia. O teste considerado
satisfatrio se todas as amostras se apresentam desintegradas.













Fig. 2 Aparelho para desintegrao de supositrio, vulos e comprimidos vaginais.

PROCEDIMENTO PARA COMPRIMIDOS VAGINAIS

Usar o aparelho descrito em desintegrao de supositrios e vulos, montado conforme
Figura 2. Introduzir o cilindro em bquer de dimetro adequado contendo gua a 36 37 graus
centgrados que deve cobrir uniformemente as perfuraes do disco. Utilizar trs aparelhos,
colocando em cada um deles um comprimido vaginal sobre o disco superior. Cobrir o aparelho
com uma placa de vidro para assegurar a umidade adequada. Examinar o estado de cada
amostra aps decorrido o tempo prescrito na monografia. O teste considerado satisfatrio se
todas as amostras se apresentam desintegradas.

V.1.5. DETERMINAO DO TEMPO DE DISSOLUO
PARA COMPRIMIDOS E CPSULAS

O teste de dissoluo determina a porcentagem da quantidade de princpio ativo,
declarado no rtulo do produto, liberado no meio de dissoluo, dentro do perodo de tempo
especificado na monografia de cada produto, quando o mesmo submetido ao de
aparelhagem especfica, sob condies experimentais descrita. O teste visa a demonstrar se o
produto atende s exigncias constantes da monografia do medicamento para comprimidos e
cpsulas.

Vigilncia Sanitria Digital 43

APARELHAGEM

O aparelho de dissoluo consiste de sistema contendo as seguintes partes (1) um
recipiente de forma cilndrica e fundo arredondado com aparte superior achatada, de vidro,
plstico ou qualquer outro material transparente e inerte, que no reaja, absorva ou interfira com o
medicamento a ser testado. Sua capacidade de um litro e suas dimenses so: altura de 160 a
175 mm e dimetro interno de 100 a 105 mm. Pode ser adaptada tampa de material transparente
com um furo central, poder permitir a colocao de agitadores e um outro para permitir as
coletas de amostras e a insero do termmetro; (2) uma haste metlica (de ao inoxidvel) para
agitar o meio de dissoluo, podendo ter em seus extremos dois tipos de agitadores: ps ou
cestas (vide Figs. 1 e 2 ). A haste deve ser centralizada em relao ao fundo do recipiente que
contm o meio de dissoluo, e ao rodar suavemente, seu eixo no deve ser desviado mais que
0,2 mm em relao ao eixo vertical do recipiente; (3) um dispositivo com selecionador de
velocidade que imprima haste a velocidade de rotao especificada na monografia do produto e
capaz de manter essa velocidade dentro dos limites de mais ou menos 2%. A rotao no deve
produzir efeitos indesejveis na dinmica do sistema.
Os recipientes so submergidos em banho de material transparente e tamanho adequado,
o qual deve possuir dispositivo capaz de manter temperatura homognea de 37 graus centgrados
mais ou menos 0,5 graus centgrados durante o perodo de teste. Deve-se Ter cuidado especial
para excluir, da montagem e suas vizinhanas, qualquer vibrao, agitao ou movimento externo
que altere de forma significativa a dinmica do sistema. De preferncia, a montagem da
aparelhagem deve permitir a visualizao das amostras testadas e dos agitadores durante o
teste.

PS

Quando especificado na monografia utiliza-se como agitador haste de ao inoxidvel,
contendo uma p em sua extremidade, sendo que a haste e a p formam um conjunto nico,
podendo ser revestido de material inerte. As ps devem obedecer s especificaes da Fig. 1.
Durante o teste, deve ser mantida distncia de 25 mm mais ou menos 2 mm entre o
extremo inferior da p e o fundo interno do recipiente que contm o meio de dissoluo. Logo
aps adicionar a amostra ao meio de dissoluo, inicia-se a agitao (tempo zero) com
velocidade pr-fixada e durante o tempo especificado na monografia correspondente.
importante que as amostras se depositem no centro do fundo do recipiente que contm
o meio de dissoluo. Caso a amostra flutue, possvel envolv-la com um pequeno pedao de
arame em espiral, de material inerte, com poucas voltas, tendo o cuidado especial para que a
mesma fique folgada e que no seja danificada durante a operao.

CESTA

Quando especificado na monografia, utiliza-se como agitador uma haste de ao
inoxidvel, que possui em sua extremidade uma cesta desmontvel, do mesmo material,
conforme especificaes na Fig. 2. A tela utilizada na confeco da cesta deve Ter uma abertura
de 0,250 mm, a menos que outra especificao seja dada na monografia. A amostra deve ser
colocada dentro da cesta seca, no incio do teste. Durante o teste deve ser mantida distncia de
25 mm mais ou menos 2 mm entre a parte inferior da cesta e o fundo interno do recipiente que
contm o meio de dissoluo.

MEIO DE DISSOLUO

Utiliza-se o meio de dissoluo especificado na monografia do produto. Os gases
naturalmente dissolvidos no meio de dissoluo devem e retirados antes do incio do teste, pois
ao serem liberados a forma de pequena bolhas durante o teste causam certa turbulncia no meio,
alterando significativamente os resultados. Quando o meio de dissoluo for soluo tampo, o
pH deve ser ajustado a mais ou menos 0,05 unidades do valor do pH especificado na monografia
do produto.

TEMPO DE DISSOLUO

Vigilncia Sanitria Digital 44
Quando um nico tempo for especificado na monografia do produto, o mesmo representa
o tempo mximo dentro do qual deve ser dissolvida a quantidade mnima, em porcentagem, de
princpio ativo estabelecida na mesma. No obstante, se esta quantidade for obtida em tempo
menor que especificado, o teste pode ser dado por terminado ao final deste tempo. Quando mais
de um tempo for especificado na monografia, devem ser tomadas alquotas ao final de cada
tempo indicado.

























Fig. 1. Ps para agitao do menu de dissoluo. A tolerncia em excentricidade do aplicador ao parar em torno do eixo
de rotao (E.R) de 0,1 mm, mudando-se nas duas extremidades indicadas pela letra A.























Fig. 2. Cesta para agitao do meio de dissoluo. A tolerncia em excentricidade do agitador ao parar em torno do eixo
de rotao (E.R) e de 0,2 mm, medindo-se na base da cesta montada.

PROCEDIMENTO



Vigilncia Sanitria Digital 45
Montar e calibrar a aparelhagem conforme especificaes do fabricante, a fim de reduzir
ao mnimo fatores que alterem significantemente a dinmica do sistema (excentricidade, vibrao,
etc.). Adicionar o volume medido do Meio de Dissoluo especificado na monografia do produto,
convenientemente desaerado, ao recipiente da aparelhagem de dissoluo. Manter a temperatura
do meio a 37 graus centgrados mais ou menos 0,5 graus centgrados, retirando-se o termmetro
antes de iniciar a agitao. Caso se use ps como dispositivos de agitao colocar a amostra
(comprimido ou cpsula) no recipiente de dissoluo. Caso se use a cesta, colocar a amostra
dentro da cesta. Em ambos os casos, retirar cuidadosamente, quando presentes, as bolhas de ar
formadas na superfcie das amostras, ao entrarem em contato com o meio de dissoluo. Caso
no seja possvel retirar as bolhas nos primeiros minutos do teste, desprezar o resultado se este
diferir significantemente da mdia dos demais resultados, realizando novo teste. Imediatamente,
dar incio agitao, conforme velocidade pr-fixada. Em intervalos de tempo especificados na
monografia do produto. Retirar da zona mdia, entre a superfcie do meio de dissoluo e a parte
superior do cesto ou ps, amostra para anlise veja (Figs. 1 e 2). A menos que especificado na
monografia do produto, reponha o volume de amostra retirada com lquido de dissoluo. Ao final
de cada tempo especificado, colocar alquotas do meio de dissoluo no local correto da coleta da
amostra (ver Figs. 1 e 2). Aps filtrao e diluio (caso necessrio) da alquota, a anlise do
medicamento efetuada mediante a tcnica de deteco indicada na monografia do produto.
Repetir o teste com doses unitrias adicionais, conforme necessrio, considerando os critrios de
aceitao.

NOTA Caso o material da cpsula interfira na anlise, testar a cpsula vazia, isenta de traos
de seu contedo, no mesmo volume de meio de dissoluo especificado, e efetuar a
anlise conforme as exigncias descritas na monografia do produto. Considerar as
possveis interferncias nos clculos dos resultados e efetuar as correes necessrias.
Fatores de correo acima de 25% do valor declarado no rtulo invalidam o teste.

CRITRIOS DE ACEITAO

A menos que a monografia do produto especifique diversamente, a amostra ser
satisfatria quando os resultados preencherem s seguintes exigncias:

Estgio Nmero Amostras Testadas Critrio de Aceitao
E 1 06 Cada unidade apresenta
resultados maiores ou iguais a
T + 5 %
E 2 06 Mdia de 12 unidade (E1 + E2)
igual ou maior do que T e
nenhuma unidade apresenta
resultados inferiores a T 15%
E 3 12 Mdia de 24 unidades (E1 +
E2 + E3) igual ou maior do
que T e no mais que 2
unidades apresentam
resultados inferiores a T 15%

* O termo T (T ou Tr) pode ser expresso por uma das seguintes maneiras, conforme especificado
nas monografias:
a) Como teor real das unidades do produto, (T = T), - determinada para cada amostra e que
estabelea condies assegurando que esta foi completamente dissolvida, por exemplo, aps
a concluso da prova elevar a velocidade de rotao a pelo menos 150 rpm, at que no seja
detectado aumento no teor da amostra dissolvida, em quantidade superior a dois por cento,
observado em perodos no menores que 10 minutos.
b) Como teor rotulado (T =Tr), quando este se encontra dentro dos limites especificados na
monografia. Os valores 5% e 15% representam porcentagens de T ou Tr, conforme o caso.

Estgio E1

Vigilncia Sanitria Digital 46
Num primeiro estgio (E1) so testadas seis unidades. Se cada unidade individualmente
apresentar resultado igual ou maior do que T + 5%, o produto ser aprovado, no sendo
necessrio efetuar o segundo.

Estgio E2

Caso o critrio para o primeiro estgio no for atendido, repete-se o teste com mais seis
comprimidos (E2). Se a mdia das doze unidades testadas (E1 + E2) for maior ou igual a T e se
nenhuma das unidades testadas apresentar resultados inferiores a T 15%, o resultado do teste
ser considerado satisfatrio.

Estgio E3

Caso o critrio para o segundo estgio ainda no for satisfatrio, repete-se o teste com
mais 12 unidades. Se a mdia das 24 unidades testadas (E1 + E2 + E3) for maior ou igual a T e
se no mximo duas unidades apresentarem resultados inferiores a T 15%, o produto
aprovado. Se a amostra ainda no satisfizer a este terceiro critrio, o produto reprovado.

V.2. MTODOS FSICOS E FSICO QUMICO

V.2.1. DETERMINAO DA MASSA

Para se efetuar a medio da massa, as balanas devem apresentar capacidade e
sensibilidade de acordo com o grau de preciso requerido.
Tratando-se de atividade que exijam pesagens exatas, na determinao de massas iguais
ou maiores que 50 mg, utilizar balana analtica de 100-200 g de capacidade de 0,1 mg de
sensibilidade e para quantidades inferiores a 50 mg, microbalana analtica de 20 g de
capacidade e 0,01 mg de sensibilidade.

APARELHAGEM

As balanas analticas podem ser de dois tipos principais: de braos iguais (dois pratos)
ou de prato nico. Ambas necessitam de jogo de massas calibradas ou devem possuir dispositivo
adequado que possibilite a verificao da carga aplicada (por exemplo: microbalanas que
utilizam medio magntica), desde que sejam calibradas periodicamente por meio de massas de
referncia aferidas.
As balanas analticas devem apresentar as seguintes caractersticas:
- Armrio ou caixa de proteo, com aberturas apropriadas para permitir operaes em
seu interior e excluir correntes de ar,
- Base de material pesado e resistente (mrmore ou metal, por exemplo);
- Indicador de nvel (gravimtrico ou hidrulico) e dispositivo que possibilite seu
nivelamento;
- Sistema amortecedor (magntico, pneumtico ou hidrulico) para restabelecer
prontamente o equilbrio;
- Dispositivo que possibilite a leitura da mesma (por intermdio de mostradores e/ou
projeo ptica de escala etc.) quando se tratar de balana de prato nico.

Devem, tambm, suportar sua carga total sem sofrer tenses inadequadas que possam
comprometer sua sensibilidade em passagens sucessivas nestas condies. A balana analtica
de um s prato a que melhor se adapta a estas exigncias.
A balana no deve ser sobrecarregada.

Localizao da balana

A balana analtica deve assentar-se nivelada sobre mesa ou prateleira firme e pesada,
protegida por amortecedores de choque, como esteiras de cortia ou lminas de borracha, ou
ainda sobre bancada de concreto, apoiada a pilares que estejam fixos no cho ou conectados aos
elementos de construo do prdio a fim de impedir vibraes. Deve estar em local isolado,
preferencialmente separado do laboratrio, isento de umidade e do ataque de gases e vapores
Vigilncia Sanitria Digital 47
cidos, distncia de fontes de calor (luz solar direta, fornos, estufas, muflas etc.) e de correntes
de ar.

Conservao e limpeza

Os pratos e demais partes da balana, inclusive sua caixa de proteo, devem
permanecer limpos, isentos de p e substncias acidentalmente cadas no prato da balana ou no
piso da caixa. Tais materiais devem ser removidos imediatamente.
Os corpos a serem pesados no devem ser colocados diretamente sobre os pratos. Para
tanto, utiliza-se papis ou recipientes adequados como bqueres, vidros de relgios, cadinhos,
cpsulas de porcelana e pesa-filtros com ou sem tampa.
As partes mveis da balana e os pesos no devem ser tocados com as mos. Usa-se,
para este fim, pina apropriada, que deve ser guardada na caixa de pesos.
Agentes dessecantes, tais como slica-gel ou cloreto de clcio, podem ser colocados no
interior da caixa de proteo, para manuteno de atmosfera relativamente seca.
Quando a balana no estiver em uso, suas partes devero permanecer fechadas e o
travesso elevado.
A sensibilidade da balana deve ser periodicamente inspecionada por tcnico habilitado.

Utilizao da balana

O material a ser pesado deve estar em equilbrio trmico com o ar do interior da caixa de
proteo da balana a fim de evitar erros devidos s correntes de conveco, alm da umidade
sobre os corpos frios.
A balana deve estar nivelada na ocasio de seu uso. A posio de equilbrio com ou sem
carga deve ser conferida vrias vezes com 1/10 da carga total e com a carga total. A diferena de
equilbrio encontrada em duas determinaes sucessivas, feitas com pesos iguais, no deve
exceder a 0,1 mg, para balanas analticas e 0,01 mg, para microanalticas.

Tanto os pesos quanto o material a ser pesado devem ser depositados no centro do
prato. Durante as operaes e pesagem, o travesso e o suporte devem estar elevados e as
portas da caixa de proteo fechadas.
A balana deve ser travada antes cada operao.

V.2.2. DETERMINAO DA TEMPERATURA E FAIXA DE FUSO

Temperatura ou ponto de fuso de uma substncia a temperatura corrigida na qual esta
se encontra completamente fundida.
Faixa de fuso de uma substncia aquela compreendida entre a temperatura corrigida
na qual a substncia comea a fluidificar-se ou a formar gotculas na parede do tubo capilar e a
temperatura corrigida na qual est completamente fundida, o que evidenciado pelo
desaparecimento da fase slida.
Existem, basicamente, trs mtodos para determinao da temperatura e da faixa de
fuso.

MTODO CAPILAR

APARELHAGEM

Consiste do aparelho apresentado na Figura.











Vigilncia Sanitria Digital 48












Aparelho para determinao do ponto de fuso
pelo mtodo do capilar. A, termmetro; B, tubo capilar;
C, bquer; D, agitador.

O bquer deve Ter capacidade de 150 ml e conter lquido apropriado para o banho de
imerso de acordo com a temperatura desejada. Esses lquidos podem ser: parafina lquida de
alto ponto de ebulio, silicona fluida de alto ponto de ebulio, cido sulfrico concentrado,
etilenoglicol e gua.
O agitador deve misturar o lquido rapidamente, mantendo homognea a temperatura do
meio. O termmetro, calibrado at sua marca de imerso, deve abranger uma faixa de 10 a 360
graus centgrados, com divises de 1 grau centgrado e colocado a 2 cm do fundo do bquer.
O capilar de vidro borossilicato deve ser fechado em uma das extremidades e Ter
aproximadamente 8 cm de comprimento, 0,9 a 1,1 mm, de dimetro interno e paredes com 0,10 a
0,18 mm de espessura. Para observar o tubo capilar deve-se empregar lente de aumento. Como
fonte de calor, utilizar bico de gs ou chapa eltrica.

PROCEDIMENTO

Pulverizar a substncia em anlise e dessecar em estufa a vcuo sobre slica-gel,
pentxido de fsforo ou outro agente dessecante durante 24 horas.
Introduzir poro do p no tubo capilar seco e compact-lo batendo o capilar sobre
superfcie dura de modo a formar coluna aproximadamente 4 mm de altura.

Aquecer o banho rapidamente, sob agitao constante. Quando a temperatura atingir 10
graus centgrados abaixo da pressuposta faixa de fuso, regular a velocidade de aumento da
temperatura para 1 grau centgrado por minuto.
Quando o banho estiver 5 graus centgrados abaixo da faixa de fuso, introduzir o capilar
no banho, de forma que sua parte interior esteja bem prxima do meio do bulbo do termmetro.
As temperaturas obtidas so corrigidas mediante adaptao de termmetro auxiliar ao
dispositivo anterior, de forma que seu bulbo encoste no termmetro do banho, na zona mdia da
coluna emergente de mercrio, quando a substncia funde, lendo-se nesta altura a temperatura t
marcada no termmetro auxiliar.
O clculo da correo a ser adicionada a cada uma das temperaturas, que definem o
ponto de fuso, efetuado atravs da expresso


0,00015 N (T t)
em que

N = nmero de graus correspondentes a coluna emergente,
T = temperatura lida no termmetro padro,
T = temperatura lida no termmetro auxiliar.

MTODO DO BLOCO METLICO AQUECIDO

APARELHAGEM

Consiste de bloco de elevada condutividade trmica, resistente s substncias sob
anlise e de superfcie plana e polida, como bronze, ao inoxidvel e similares.
Vigilncia Sanitria Digital 49
O bloco deve conter cavidade cilndrica interna, paralela sua superfcie superior e a
cerca de 3 mm desta, com dimenses adequadas para acomodar termmetro calibrado.
O bloco deve ser uniforme aquecido atravs de resistncia eltrica ou chama
microajustvel. O aparelho deve ser calibrado constantemente com substncias apropriadas e de
comprovado grau de pureza.

PROCEDIMENTO

Aquecer o bloco rapidamente at temperatura de 10 graus centgrados abaixo do ponto
de fuso previsto e, ento, ajustar o aquecimento para incrementos de temperatura de ordem de
1 grau centgrado por minuto.
A intervalos regulares, colocar algumas partculas da amostra, previamente pulverizada e
seca, sobre a superfcie metlica, na regio imediatamente acima do bulbo do termmetro. Limpar
a superfcie aps cada ensaio. Anotar a temperatura t
1
, na qual a substncia funde imediatamente
aps o contato com o metal. Interromper o aquecimento. Durante o resfriamento, colocar
novamente algumas partculas da amostra, a intervalos regulares, no mesmo local do bloco.
Limpando a superfcie aps cada ensaio. Anotar a temperatura t2 na qual a substncia solidifica
instantaneamente ao contato com o metal.
O ponto de fuso instantneo da amostra calculado mediante a seguinte expresso.

t1 + t2

2

MTODO CAPILAR ABERTO

Este mtodo empregado para determinao do ponto de fuso de substncias graxas
de consistncia pastosa.

APARELHAGEM

Deve-se empregar aparelho semelhante ao descrito no mtodo I, com as seguintes
modificaes:

- o banho de aquecimento deve ser a gua;
- o termmetro deve ser graduado em 0,2 graus centgrados, abrangendo faixa de 10 a
100 graus centgrados e
- o tubo capilar, semelhante quele empregado no mtodo I, deve ser aberto em ambas
as extremidades.

PROCEDIMENTO

Fundir a substncia rapidamente temperatura no superior a 10 graus centgrados
acima do ponto de fuso completo. Agitar e, se necessrio, filtrar atravs de filtro de papel seco.
Inserir a substncia fundida na extremidade do capilar at formar coluna de 8 a 12 mm de
altura. Esfriar o capilar contendo a amostra temperatura de 15 graus centgrados, mantendo-a,
no mnimo, por 16 horas. Prender o tubo capilar no termmetro de forma tal que a coluna de
substncia se localize na parte mdia do bulbo de mercrio.
Colocar o sistema em banho de gua a 15 graus centgrados, profundidade de 3 cm da
superfcie da gua. Aquecer com agitao constante para que a temperatura aumente 2 graus
centgrados por minuto. A temperatura na qual a substncia comea a ascender no capilar o
ponto de fuso.

V.2.3. DETERMINAO DA TEMPERATURA DE EBULIO
E FAIXA DE DESTILAO

Temperatura ou ponto de ebulio de um lquido a temperatura corrigida na qual o
lquido ferve sob presso de vapor de 100/kPa (760 mm de Hg).
Faixa de destilao o intervalo de temperatura corrigida para a presso de 100/kPa (760
mm Hg), dentro do qual o lquido ou frao especfica do lquido, destila inteiramente.
Vigilncia Sanitria Digital 50

APARELHAGEM

Usar aparelho como sugerido na Figura, em que A balo de destilao com capacidade de 100
ml, conectado a condensador B, na extremidade do qual se introduz o adaptador C, ligado a uma
proveta de 50 ml graduada em 0,2 ml. O termmetro deve ser adaptado ao balo de forma que o
bulbo de mercrio fique no centro do gargalo e a cerca de 5 mm abaixo do nvel do tubo lateral. O
aquecimento (a gs, eltrico ou atravs de banho) deve ser selecionado de acordo com a
natureza da substncia.


























Aparelho para determinao da faixa de destilao (dimenses em mm).
A, balo de destilao; B, condensador; C, adaptador.


PROCEDIMENTO

Introduzir no balo cerca de 50 ml da amostra de modo a no penetrar no tubo lateral.
Adicionar prolas de vidro ou outro material poroso adequado. Adaptar o termmetro no balo e
aquecer, lentamente, protegendo o sistema contra a corrente de ar.
Registar a temperatura na qual forem coletadas as cinco primeiras gotas do destilado.
Ajustar o aquecimento para obter o destilado vazo de 3 a 4 ml por minuto. Anotar a
temperatura quando todo o lquido ou frao prescrita estiverem totalmente destilados. Manter o
destilado mesma temperatura na qual o lquido foi originalmente medido e anotar o volume do
destilado.
Quando o lquido puro, a maior parte destila temperatura constante (dentro de uma
faixa de 0,5 graus centgrados), que o ponto de ebulio do lquido.
Lquidos que destilam abaixo de 80 graus centgrados devem ser resfriados a 10 15
graus centgrados antes de se medir o volume e a proveta que recebe o destilado deve estar
mergulhada em banho de gelo.
Quando o ponto de ebulio est acima de 140 150 graus centgrados, pode-se
substituir o condensador de gua por condensador de ar.
Corrigir as temperaturas observadas de acordo com o tipo de termmetro utilizado e com
a diferena na presso baromtrica normal 100 kPa (760 mm de Hg), considerando 0,1 grau
centgrado para cada 0,36 kPa (2,7 mm de Hg) de variao, adicionando ao resultado se a
presso real for mais baixa, ou subtraindo se for maior que 100 kPa (760 mm Hg).

Vigilncia Sanitria Digital 51
Comparar os valores obtidos do ponto de ebulio, faixa de destilao e volume do
destilado com as especificaes das monografias.

V.2.4. DETERMINAO DA TEMPERATURA DE CONGELAMENTO

Temperatura ou ponto de congelamento de lquido ou de slido fundido a mais, alta
temperatura na qual ele se solidifica.
Para substncias puras que fundem sem decomposio, o ponto de congelamento do
lquido igual a seu ponto de fuso.

APARELHAGEM

O aparelho da Figura consiste em tubo de ensaio de aproximadamente 25 mm de
dimetro interno e 150 mm de comprimento, suspenso por intermdio de rolha adequada dentro
de segundo tubo maior, de 60 mm de dimetro interno e 140 mm de comprimento, formando,
assim, camisa de ar que evita mudana brusca de temperatura. O sistema acima fixo por garra
no centro de bquer com capacidade de 1000 ml, contendo gua ou soluo refrigerante.
O tubo interior vedado com rolha de modo a conter haste agitadora e termmetro com
divises de 0,2 graus centgrados. O bulbo do termmetro deve estar fixo a aproximadamente 15
mm do fundo do balo. O agitador basto de vidro adaptado, com anel em sua extremidade
inferior como indicado na Figura.























Aparelho para determinao do ponto de congelamento (dimenses em mm).


PROCEDIMENTO

Colocar a amostra no tubo interno em quantidade suficiente para cobrir o bulbo do
termmetro. Esfriar o tubo interior, mantido na camisa de ar, em mistura refrigerante adequada a
5 graus centgrados abaixo do ponto de congelamento esperado. Quando a amostra estiver
resfriada a cerca de 5 graus centgrados acima do ponto de congelamento, mover verticalmente o
agitador, entre o topo e o fundo, razo de aproximadamente 20 ciclo por minuto e registrar a
temperatura do termmetro de 30 em 30 segundos. Interromper a agitao quando a temperatura
permanecer constante ou aumentar, antes de permanecer constante, o que acontece enquanto
ocorre a solidificao.
Continuar registrando a temperatura, no mnimo, at 3 minutos aps a temperatura
comear a cair novamente. A maior temperatura observada durante a solidificao da substncia
correspondente ao seu ponto de congelamento.


Vigilncia Sanitria Digital 52
V.2.5. DETERMINAO DA DENSIDADE DE MASSA E DENSIDADE RELATIVA

Densidade de massa (p) de uma substncia a razo de sua massa por seu volume a 20
graus centgrados. A densidade de massa da substncia calculada a partir de sua densidade
relativa pela frmula:
P
20
= 0,99703 d
20
+ 0,0012

expressa em g/ml ou Kg/l.
Densidade relativa de uma substncia a razo de sua massa, pela massa de igual volume de
gua, ambas a 20 graus centgrados


(d
20
), ou por massa de igual volume de gua a 4 graus centgrados

(d
4
):

d
4
= 0,998234 d
20



PROCEDIMENTO

A densidade relativa da substncia pode ser determinada atravs de picnmetro, balana
hidrosttica ou densmetro. O uso desses dois ltimos condicionado ao tipo de aparelhagem
disponvel.

MTODO DO PICNMETRO

Utilizar picnmetro limpo e seco, com capacidade de, no mnimo, 5 ml, que tenha sido
previamente calibrado. A calibrao consiste na determinao de massa do picnmetro vazio e da
massa de seu contedo com gua, recentemente destilada e fervida, a 20 graus centgrados.
Colocar a amostra no picnmetro. Ajustar a temperatura para 20 graus centgrados,
remover excesso da substncia, se necessrio, e pesar. Obter o peso da amostra atravs da
diferena de massa do picnmetro cheio e vazio.
O quociente entre a massa da amostra lquida e a massa da gua, ambas a 20 graus
centgrados, a densidade relativa (d
20
).

V.2.6. DETERMINAODO NDICE DE REFRAO

ndice de refrao (n) de uma substncia a relao entre a velocidade da luz no vcuo e
sua velocidade no interior da substncia.
Quando um raio de luz monocromtica passa de um meio transparente para outro de
densidade ptica diferente, refletido ou refratado, exceto quando incide perpendicularmente
superfcie de contato entre os meios. A relao entre o seno do ngulo de incidncia, sem i, e o
seno do ngulo de refrao sem r, constante no variando com o ngulo de incidncia. Essa
relao equivale ao ndice de refrao. Pode-se, pois, definir o ndice de refrao como a relao
entre o seno do ngulo do ngulo de incidncia e o seno do ngulo de refrao, isto , n = sem
i/sem r. Para fins prticos mede-se a refrao com referncia ao ar e substncia e no com
referncia ao vcuo e substncia, porquanto as diferenas entre os valores obtidos com ambas
as medidas no so significativas para fins farmacopicos.
Em substncias isotrpicas, o ndice de relao caracterstica constante em
determinado comprimento de onda, temperatura e presso. Por esta razo, este ndice til no
s para identificar a substncia, mas tambm para detectar a presena de impurezas.
empregado para caracterizar principalmente gorduras, leos graxos, ceras, aucares e solventes
orgnicos, bem como para identificar certos frmacos. igualmente usado para determinar a
pureza de leos volteis.
Geralmente determina-se o ndice de refrao em funo da luz de sdio no comprimento
de onda 589,3 na (raia D) e temperatura de 20 mais ou menos 0,5 graus centgrados. Da
expressa-se o valor do ndice de refrao como n
D


REFRATMETROS
20
20
20
20 20
20
20
Vigilncia Sanitria Digital 53

Os refratmetros utilizados normalmente em anlise farmacopica usam luz branca mas
so calibrados de modo a dar o ndice de refrao em termos de comprimento de onda 589,3 nm,
correspondente ao da luz da raia D de sdio.
Visto que o ndice de refrao varia significantemente com a temperatura, durante a
leitura deve-se ajustar e manter a temperatura a 20 graus centgrados. Quando no for possvel,
deve-se corrigir o valor obtido consultando a tabela de correo.
A calibrao do aparelho faz-se com gua destilada, cujo ndice de relao 1.3330 a 20
graus centgrados e 1.3325 a 25 graus centgrados. Antes de oper-lo, convm verificar se
apresenta erro inicial, que dever ser descontado da leitura.

V.2.7. DETERMINAO DA VISCOSIDADE

Viscosidade expresso de resistncia de lquidos ao escoamento, ou seja, ao
deslocamento de parte de suas molculas sobre molculas vizinhas. A propriedade oposta
viscosidade denominada fluidez.
A unidade dinmica (sistema CGS) de viscosidade o poise. , por definio, a fora em
dinas, necessria ao deslocamento de camada plana de lquido, com gua de 1 centmetro
quadrado, sobre camada idntica, paralela e distanciada da primeira em 1 centmetro,
velocidade de 1 centmetro por segundo. O poise , contudo, demasiado grande para a maior das
aplicaes, recorrendo-se da ao centipoise, cP, correspondente a um centsimo de poise. s
vezes conveniente utilizar-se a viscosidade cinemtica, que consiste na relao entre a
viscosidade dinmica e a densidade, neste caso, no sistema CGS, a unidade o stoke. A
exemplo do que ocorre com viscosidade absoluta (medida em poise), mais conveniente exprimir
se viscosidade cinestica em centistokes (100 centistokes = 1 stoke) para caracterizar a maioria
dos lquidos usuais em Farmcia e Qumica.
A determinao da viscosidade ensaio para o qual a especificao da temperatura
imprescindvel devido sua influncia decisiva sobre o resultado (em geral), a viscosidade
inversamente proporcional temperatura efetuada com base em propriedades diversas. O
mtodo mais freqente baseia-se no termo de escoamento de lquidos atravs de capilares
(viscosmetro de Ostwald, Ubbelohde, Baum e Engler) devido simplicidade e ao preo
acessvel dos aparelhos. Viscosmetros que tem como princpios de funcionamento a
determinao do tempo de queda livre de esfera atravs de tubos contendo o lquido sob ensaio
(Hoppler) ou a velocidade de rotao de eixos metlicos imersos no lquido (Brookfield, entre
outros) so igualmente empregados.
Embora seja possvel a determinao de viscosidade absoluta, com base nas dimenses
exatas do viscosmetro empregado, mais freqente a prtica da calibrao prvia do aparelho
com lquido de viscosidade conhecida, permitindo, por comparao, avaliao relativada
viscosidade do lquido sob ensaio. Assim, empregando-se viscosmetro de Ostwald ou similar,
determina-se os tempos de escoamento t
1
e t
2
de volumes iguais dos lquidos de referncia e
amostra, de densidade d
1
e d
2
, respectivamente. Sendo n
2
a viscosidade do lquido de referncia,
a viscosidade absoluta (cP) do lquido amostra pode ser calculada pela equao:

n
1
t
1
d
1
t
1
d
1

= , ou melhor n
1
= n
2

n
2
t
2
d
2
t
2
d
2


O quociente n
2
/ t
2
d
2
possui valor constante, K, para cada lquido de referncia, no
mesmo viscosmetro. Assim, conhecido este valor (geralmente encontrado no manual do
aparelho), simplifica-se a equao:

n = k t d

O valor de k pode tambm ser determinado experimentalmente, medindo-se o tempo de
esgotamento de lquido padro, puro, e aplicando-se a equao:

k = n / td

Empregando-se gua como padro usual para determinao de lquidos de baixa
viscosidade adotam-se os valores de viscosidade abaixo, conforme a temperatura do ensaio:
Vigilncia Sanitria Digital 54

C n (cP)
15 1,140
16 1,110
17 1,082
18 1,055
19 1,029
20 1,004
21 0,980
22 0,957
23 0,936
24 0,915
25 0,895

Viscosidade de Ostwald

O viscosmetro de Ostwald mais simples e popular dentre os aparelhos disponveis.
Consta de tubo dobrado em U (Figura), com um dos ramos munido de ampola terminada em
capilar. H dois de referncia, um imediatamente acima da ampola e outro sobre o capilar. O
outro ramo suficientemente largo para permitir seu enchimento com o lquido sob ensaio at a
altura de cerca de 5 mm abaixo do trao de referncia inferior. Para possibilitar maior gama de
viscosidades passveis de determinao, emprega-se colees de viscosmetros, com diferentes
calibres. O aparelho indicado para determinada avaliao o que permite escoamento de
amostras em perodo no inferior a 60 segundos.
Para a determinao propriamente dita, transferir para o viscosmetro escolhido, lavado e
seco, quantidade suficiente de lquido inferior. Fixar o aparelho em termostato (20 graus
centgrados) e, aps aguardar que o lquido no interior do aparelho adquira a temperatura
controlada, aspirar o lquido pelo tubo capilar / ampola (por meio de tubo de borracha fixado na
extremidade) at que o nvel do lquido exceda ligeiramente o trao de referncia superior. Soltar
ento o tubo e, no instante em que o menisco atingir o trao de referncia superior, acionar
cronmetro de preciso, retravando-o quando o menisco passar pelo trao de referncia inferior.
Registrar o tempo decorrido e repetir o ensaio diversas vezes com intervalos de alguns minutos
at que tempos sucessivos no difiram em mais de 0,5 segundos. Determinar a densidade do
lquido sob ensaio (V.2.5.), corrigindo o valor para a densidade relativa gua, a 20 graus
centgrados, e calcular a viscosidade do lquido amostra pela frmula indicada, empregando a
constante K fornecida ou determinada por procedimento similar.

Vigilncia Sanitria Digital 55




















Viscosmetros de Oswald (dimenses em mm).


V.2.8. DETERMINAO DO PODER ROTATRIO E
DO PODER ROTATRIO ESPECFICO

Muitas substncias orgnicas tm a propriedade de desviar o plano de luz polarizada
quando esta passa atravs delas (no caso de serem lquidas) ou solues que as contm
(quando se trata de slidas). Estas substncias so chamadas opticamente ativas e podem ser
dextrogiras ou levogiras. O carter destrogiro indicado pelo sinal (+) e o levogiro pelo sinal (-).
A atividade ptica funo da estrutura qumica da substncia e de sua concentrao. A
determinao do poder rotatrio serve para estabelecer tanto a identidade quanto a pureza da
substncia. Alm disso, s vezes, a atividade ptica presta-se para indicar o valor teraputico de
uma substncia.
O poder rotatrio varia com a temperatura, o comprimento de onda (quanto mais curto,
maior o ngulo de desvio), a natureza da substncia e sua concentrao. Se a soluo contiver
duas substncias opticamente ativas e estas no reagirem entre si, o ngulo de desvio ser a
soma algbrica dos ngulos de desvio de ambas.
O poder varia de 0,01 a 0,05 graus de rotao angular. Os mais usados trabalham com a
luz de sdio ou lmpada de vapor de mercrio. Determina-se o ponto zero do polarmetro com
tubo vazio e fechado para as substncias lquidas ou cheio com o solvente para as solues de
substncias slidas.

Poder rotatrio

Poder rotatrio de uma substncia o ngulo que a luz polarizada forma com o plano de
polarizao ao atravessar a substncia, caso seja lquida, ou soluo, se for slida. Mede-se o
poder rotatrio (o) em uma camada de espessura apropriada, temperatura indicada e no
comprimento de onda especificado na monografia. Geralmente, usa-se camada de 1 dm de
espessura, temperatura de 20 graus centgrados mais ou menos 0,5 graus centgrados e
comprimento de onda da raia D de sdio (589,3 rm).

Poder rotatrio especfico

O poder rotatrio especfico, I o I D
20
, de uma substncia lquida o ngulo de rotao,
medido no comprimento de onda da raia D de sdio, temperatura de 20 graus centgrados mais
ou menos 0,5 graus centgrados, calculado em funo de uma camada de 1 dm de espessura e
divido pela densidade relativa a 20 graus centgrados. dado pela expresso:

o

Vigilncia Sanitria Digital 56
I o I D
20
=
1d


em que
I = comprimento, em dm, do tubo do polarmetro
d = densidade relativa da substncia

O poder rotatrio especfico, I o I D
20
, de uma substncia slida o ngulo de rotao,
medido no comprimento de onda da raia D de sdio. = 589,3 nm, temperatura de 20 graus
centgrados mais ou menos 0,5 graus centgrados, calculado em funo de uma camada de 1 dm
de espessura de uma soluo que contm 1 g da substncia por ml. dado pela expresso

100o
I o I D
20
=
Ic

Em que
I = comprimento, em dm, do tubo do polarmetro,
c = concentrao da substncia expressa em porcentagem p/V

As vezes a medida do poder rotatrio especfico realizada em outras condies
especificadas nas monografias. Em qualquer caso, porm, devem ser feitas pelo menos cinco
medidas o valor procurado ser a mdia dos valores obtidos. Outrossim, a menos que se indique
diferentemente, o poder rotatrio e o poder rotatrio especfico referem-se substncia seca,
anidra ou isenta de solvente em todas as monografias em que se fornecem os valores de
umidade, perda por dessecao ou contedo de solvente.

V.2.9. DETERMINAO DA PERDA POR DESSECAO

Este ensaio visa a quantidade de substncia voltil de qualquer natureza eliminada nas
condies especificadas na monografia. No caso de ser a gua a nica substncia voltil, basta
determinar seu teor segundo um dos mtodos descritos sob o ttulo DETERMINAO DE GUA
(V.2.20). Para os demais casos, o procedimento adotado descrito abaixo, sendo a opo de
mtodo a ser adotado especificada nas monografias.

PROCEDIMENTO

Reduzir a substncia a p fino caso se apresente na forma de cristais volumosos. Pesar
exatamente cerca de 1 a 2 g e transferir para pesa-filtro chato previamente dessecado durante 30
minutos nas mesmas condies a serem empregadas na determinao. Pesar o pesa-filtro,
tampado, contendo a amostra. Agitar o pesa-filtro brandamente para distribuir a amostra da
maneira mais uniforme possvel, a uma profundidade ideal de 5 mm. Colocar o pesa-filtro na
estufa, retirar a tampa, deixando-a tambm na estufa. Secar a amostra (geralmente a 105 graus
centgrados) e por um determinado prazo (geralmente 2 horas) especificado na monografia.
Esfriar temperatura ambiente em dessecador. Pesar.
Repetir a operao at peso constante.
Observao: No caso de a substncia fundir a uma temperatura mais baixa que a
especificada para a determinao, manter o pesa-filtro com seu contedo por 1 a 2 horas
temperatura de 5 a 10 graus centgrados abaixo do ponto de fuso, antes de sec-la
temperatura especificada. Quando a substncia se decompem temperatura de 105 graus
centgrados ela deve ser dessecada a uma temperatura mais baixa. Em ambos os casos, pode-se
realizar a secagem presso reduzida, em dessecador.

Clculo

A porcentagem de perda por dessecao dada pela equao

Pu - Ps
X 100
Vigilncia Sanitria Digital 57
Pa

em que
Pa = peso da amostra
Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecao
Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra aps a dessecao

V.2.10. DETERMINAO DE CINZAS SUFATADAS
(RESDUO POR INCINERAO)

Cinzas sulfatadas compreendem o resduo no voltil incinerao na presena de cido
sulfrico, conforme a tcnica especificada. Em geral, o ensaio visa a determinar o teor de
constituintes ou impurezas inorgnicas contidos em substncias orgnicas. Tambm se destina
determinao de componentes inorgnicos em misturas e da quantidade de impurezas contidas
em substncias inorgnicas termolbeis.


PROCEDIMENTO

Pesar exatamente cerca de 1 g ou a quantidade especificada na monografia de
substncia pulverizada, transferir para cadinho (preferivelmente de platina) previamente
calcinado, esfriado em dessecador e tarado, e juntar cerca de 2 ml de cido sulfrico SR. Aquecer
brandamente sobre chapa quente at carbonizao e incinerar cuidadosamente a cerca de 800
graus centgrados at desaparecimento do carvo. Resfriar e juntar cerca de 1 ml de cido
sulfrico SR para umedecer o resduo, aquecer sobre chapa quente e incinerar novamente.
Acrescentar pequena quantidade de carbonato de amnio (neutralizao do cido residual) e
incinerar at peso constante. Calcular a porcentagem de cinzas sulfatadas em relao
substncia sob ensaio.

V.2.11. DETERMINAO DA GRANULOMETRIA DOS PS

O grau de diviso ou a granulometria de ps expresso pela referncia abertura
nominal da malha de tamis utilizado.
Ao determinar a granulometria de p resultante de reduo de drogas vegetais, nenhuma
poro da droga pode ser rejeitada durante o processo de reduo, moagem ou peneiramento,
exceto nos casos em que tal procedimento seja indicado na respectiva monografia.
Os tamises empregados so de ao inoxidvel, lato, crina ou seda, no sendo permitido o
revestimento dos fios.
Na descrio dos ps so utilizados os termos abaixo:

P grosso aquele cujas partculas passam em sua totalidade pelo tamis com abertura
nominal de malha de 1.70 mm e, no mximo, 40% pelo tamis com abertura
nominal de malha de 355 m.

P moderadamente
Grosso aquele cujas partculas passam em sua totalidade pelo tamis com abertura
nominal de malha de 710 m e, no mximo, 40% pelo tamis com abertura
nominal de malha de 250 m.

P semi-fino aquele cujas partculas passam em sua totalidade pelo tamis de abertura
nominal de malha de 355 m e, no mximo 40% pelo tamis com abertura
nominal de malha de 180 m.

P fino aquele cujas partculas passam em sua totalidade pelo tamis com abertura
nominal de malha de 180 m.

P finssimo aquele cujas partculas passam em sua totalidade pelo tamis com abertura
nominal de malha de 125 m.

Vigilncia Sanitria Digital 58
A determinao da granulometria de ps resultantes de drogas vegetais e produtos
qumicos pulverizados feita pelo processo descrito abaixo, com o auxlio de tamises, cujas
caractersticas esto padronizadas na tabela anexa.

PROCEDIMENTO

Para ps grosso, moderadamente grosso e semi-finos utilizar amostras de 25 a 100g de
p. Colocar a amostra sobre o tamis de malha apropriada, provido de tampa e recipiente para a
coleta do p. Agitar o tamis em movimentos horizontais rotativos e movimentos verticais por 20
minutos no mnimo, ou at que a operao esteja completa. Pesar cuidadosamente o p recolhido
e a frao remanescente sobre o tamis.
Para ps finos e muito finos proceder como descrito acima, porm utilizando amostras
superiores a 25g. agitar o tamis por 30 minutos, no mnimo, ou at que a operao esteja
completa.
No caso de ps oleosos ou ps tendentes a obstruir as aberturas do tamis, a tela do
mesmo deve ser escovada periodicamente.
Pode-se determinar tambm a granulometria com o auxlio de tamises operados por
dispositivos mecnicos. Estes dispositivos reproduzem os movimentos horizontais e verticais da
operao manual, atravs de ao mecnica uniforme. A operao mecnica deve ser executada
de acordo com as instrues do fabricante do equipamento.

Abertura de malha dos tamises

Abertura nominal da
malha
Dimetro
recomendado de fios
Tolerncia da Abertura
Mdia
rea de peneiramento
% (aproximada)
N de tamis
(aproximado) *
mm
4.00
3.35
2.80
2.00
1.70
1.40
1.18
1.00

m
710
600
500
425
355
300
250
180
150
125
106
90
75
63
53
45
mm
1.4
1.25
1.12
0.90
0.80
0.71
0.63
0.56

m
450
400
315
280
224
200
160
125
100
90
71
63
50
45
36
32
mm
0.13
0.10
0.09
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03

m
26
21
18
15
13
15
13
11
9.4
8.1
7.4
6.6
6.1
5.3
4.8
4.8

55
53
51
48
46
44
43
41


37
36
38
36
38
36
37
35
36
34
36
35
36
34
35
34

4
5
6
8
10
12
14
16


22
25
30
34
44
52
60
85
100
120
150
170
200
240
300
350
* O nmero correspondente classificao da Associao Brasileira de Normas Tcnicas ABNT (1972).

V.2.12. COR DE LQUIDOS

A avaliao da cor de lquidos executada por comparao da soluo sob anlise
preparada conforme instrues da monografia e solues padro de cor (SC). Tais solues
encontram emprego como referncia para alguns frmacos e em testes de carbonizao com
cido sulfrico especificados em diversas monografias.
O processo comparativo, salvo especificaes em contrrio deve ser executado em tubos
de ensaio de vidro transparente e fundo chato, com dimetro da ordem de 16 mm, do tipo
empregado em ensaio-limite de impurezas. Os tubos devem ser os mais uniformes possveis.
Para a avaliao, utilizar volumes de 10 ml tanto para a amostra quanto para o padro,
assegurando altura aproximada de 50 mm para os lquidos nos tubos. Observar os tubos
Vigilncia Sanitria Digital 59
transversalmente contra fundos branco, sob luz difusa. importante comparar as solues nas
mesmas condies, inclusive de temperatura (25 graus centgrados).
As solues-amostra so preparadas de modo a apresentarem colorao semelhante da
soluo de referncia especificada.

PADRES BSICOS

As solues de referncia de cor (SC) so obtidas a partir de 3 solues bsicas, a serem
preparadas e armazenadas em frascos hermticos. Destas com base na Tabela anexa,
contendo instrues de preparao de 20 solues-padro de cor (SC) designadas com as letras
do alfabeto, de A a T preparar a soluo ou as solues especificadas para a comparao.
Transferir os valores indicados (deixar a gua por ltimo) e homogeneizar diretamente nos tubos
de comparao.


Soluo base de cloreto cobaltoso

Preparar mistura de 25 ml de cido clordrico e 975 ml de gua. Dissolver 85g de cloreto
de cobalto (II) em aproximadamente 900 ml desta mistura e completar o volume para 1000 ml
com a mesma. Transferir, com auxlio de pipeta, 5 ml desta soluo para frasco de iodo de 250
ml, juntar 5 ml de perxido de hidrognio SR e 15 ml de hidrxido de sdio 5M. ferver durante 10
minutos, resfriar e adicionar 2g de iodeto de potssio e 20 ml de cido sulfrico 0,26M. dissolver
com tiossulfato de sdio 0,1M SV, juntando 3 ml de amido SI como indicador. Corrigir o volume de
titulante consumido por determinao em branco. Cada ml de tiossulfato de sdio 0,1M SV
equivalente a 23,79 mg de CoC12 . 6H20. Ajustar o volume de soluo adicionando quantidade
suficiente de mistura de cido clordrico e gua para obter soluo contendo exatamente 59,5 mg
de CoC12 . 6H20 por ml de soluo.

Soluo base de sulfato cpico

Preparar mistura de 25 ml de cido clordrico e 975 ml de gua. Dissolver 65g de sulfato
cpico (CuSO4) em 900 ml desta mistura e completar o volume para 1000 ml com a mesma
mistura. Transferir, com auxlio de pipeta, 10 ml desta soluo para frasco de iodo de 250 ml,
juntar 40 ml de gua, 4 ml de cido actico glacial, 3 g de iodeto de potssio e 5 ml de cido
clordrico. Titular o iodo liberado com tiossulfato de sdio 0,1 M SV, juntando 3 ml de amido SI
como indicador. Corrigir o volume de titulante consumido por determinao em branco. Cada ml
de tiossulfato de sdio 0,1M SV equivalente a 24,97 mg de CuSO4 . 5H20. Ajustar o volume de
soluo adicionando quantidade suficiente de mistura de cido clordrico e gua para obter
soluo contendo exatamente 62,4 mg de CuSO4 . 5H20 por ml de soluo.

Soluo base de cloreto frrico

Preparar mistura de 25 ml de cido clordrico e 975 ml de gua. Dissolver 55 g de cloreto
frrico (FeC13 . 6H20) em aproximadamente 900ml desta mistura e completar o volume para
1000ml com a mesma mistura. Transferir, com auxlio de pipeta, 10 ml desta soluo para frasco
de iodo de 250 ml, adicionar 15 ml de gua, 3 g de iodeto de potssio e 5 ml de cido clordrico.
Deixar em repouso durante 15 minutos. Completar o volume da soluo para 100 ml com gua e
titular o iodo liberado com tiossulfato de sdio 0,1 M SV, juntando 3 ml de amido SI como
indicador. Corrigir o volume de titulante consumido por determinao em branco. Cada ml de
tiossulfato de sdio 0,1M SV equivalente a 27,3 mg de FeC13 . 6H20. Ajustar o volume de
soluo adicionando quantidade suficiente de mistura de cido clordrico e gua para obter
soluo contendo exatamente 45,0 mg de FeC13 . 6H20 por ml de soluo.

Composio das solues padro de cor (SC)

SC
Partes de
Soluo base de
cloreto cobaltoso
Soluo base de
cloreto frrico
Soluo base de
sulfato cprico
gua
A
B
C
0.1
0.3
0.1
0.4
0.9
0.6
0.1
0.3
0.1
4.4
8.5
4.2
Vigilncia Sanitria Digital 60
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
T
0.3
0.4
0.3
0.5
0.2
0.4
0.4
0.5
0.8
0.1
0.0
0.1
0.2
0.2
0.3
0.2
0.5
0.6
1.2
1.2
1.2
1.5
2.2
3.5
4.5
3.8
2.0
4.9
4.8
0.4
0.3
0.4
0.1
0.5
0.4
0.3
0.0
0.2
0.0
0.1
0.1
0.0
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.2
0.0
0.4
3.7
3.1
3.5
3.1
3.3
2.3
1.0
0.0
0.3
2.8
0.0
0.0
4.3
4.4
4.1
4.7
3.6

V.2.13. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO ATMICA

Espectrofotometria de absoro atmica destina-se ao doseamento de quase todos os
elementos qumicos, exceo de gases raros, halogneos, oxignio, enxofre, nitrognio, fsforo
e carbono. , pois, essencialmente mtodo de alta sensibilidade para o doseamento de tomos,
ons ou complexos inicos de elementos metlicos. Compreende a medida da intensidade de luz
absorvida em dado comprimento de onda pelos tomos na promoo eletrnica ao estado
excitado, ao serem atomizados em uma chama. Se o processo de absoro efetuado em
chama sob condies controladas e reprodutveis, a absorvncia (logaritmo do inverso da
transmitncia) proporcional ao nmero de tomos do elemento dosado, permitindo o
estabelecimento de retas de calibrao que, por sua vez, permitem a determinao de
concentraes desconhecidas em funo da absorvncia observada.

Equipamento

O espectofotometro de absoro atmica consta de fonte emissora de luz, sistema de
nebulizao- combusto e de sistema fotodetector.
A fonte emissora de luz compreende lmpada, cujo elemento emissor idntico ao que
se deseja dosar. Assim, para a anlise de amostra de zinco, por exemplo, emprega-se * lmpada
de catodo oco* em que o catodo contm zinco. A aplicao de potencial aos eletrodos da
lmpada excita os tomos de zinco do catodo e estes, ao reverterem ao estado fundamental,
emitem radiao precisamente no comprimento de onda (linha espectral) do zinco.
No sistema de nebulizao-combusto - compreendendo atomizador e chama o
elemento sob anlise liberado no seu estado atmico ou elementar. A soluo contendo a
amostra introduzida na chama, geralmente alimentada com mistura ar-hidrognio ou ar-
acetileno, esta ltima permitindo temperaturas de chama da ordem de 2300 graus centgrados.
Existem espectrofotometros de absoro em que a chama substituda por forno de alta
temperatura. Tais equipamentos so mais eficientes na reduo da amostra ao estado atmico e,
por conseguinte, mais sensveis.
O sistema fotodetector, por sua vez, destina-se leitura e quantificao da radiao
incidente. Compreende dispositivo ptico de disperso (monocromador) ou filtro), capaz de isolar
a luz no comprimento de onda da linha espectral ou elemento sob anlise, e detector
propriamente dito (fotomultiplicador) acoplado a instrumento de leitura digital ou analgico.
A radiao interferente emitida pela chama pode ser eliminada por meio de modulao da
fonte, o que significa empregar radiao cuja intensidade variam com determinada freqncia.
Dessa forma, o detector recebe dois tipos de sinais: um sinal alternado, proveniente da fonte, e
um contnuo, emitido pela chama. O sistema de deteco reconhece apenas o sinal alternado,
ignorando o sinal contnuo, no modulado.

Solventes

O solvente ideal para a espectrofotometria de absoro atmica interfere o menos
possvel nos processos de absoro e produz tomos neutros na chama. Se existir diferena
significativa de tenso superficial ou viscosidade entre soluo amostra e soluo de referncia,
ocorrero variaes nas velocidades de aspirao e nebulizao e, em conseqncia, diferenas
significativas nos sinais produzidos. A acidez das solues tambm influi sobre o processo de
Vigilncia Sanitria Digital 61
absoro. Da a importncia de os solventes empregados no preparo da soluo-amostra e
soluo de referncia serem os mesmos ou, ao menos, os mais similares possveis com relao a
estes aspectos, devendo tambm permitir o preparo de solues facilmente aspirveis pelo tubo
de eliminao da chama. A presena de slidos nas solues pode provocar interferncias, razo
pela qual recomenda-se manter o seu nvel abaixo de 2%, sempre que possvel.

OPERAO

Para operar o espectofotometro de absoro atmica, recomenda-se obedincia s
instrues do fabricante. A calibrao do aparelho executada pela introduo de solvente
(geralmente gua) na chama e acerto de 100% da transmitncia (zero de absorvncia). Para a
execuo da anlise h dois mtodos, recomendando-se o primeiro, salvo instrues em
contrrio.

Mtodo I (calibrao direta)

Preparar ao menos trs solues referncia do elemento a ser dosado, abrangendo a
faixa de concentraes recomendadas pelo fabricante do aparelho para o elemento sob anlise.
Todos reagentes empregados no preparo da soluo-amostra devem ser igualmente includos,
nas mesmas concentraes, s solues de referncia. Aps a calibrao do aparelho com
solvente, conforme indicado acima, introduzir na chama, trs vezes, cada uma das solues de
referncia e, aps estabilizao da leitura, registrar o resultado, levando o nebulizador com gua
aps cada operao de introduo. Traar curva de calibrao plotando a mdia de absorvncias
(ou transmitncias) de cada grupo de trs leituras com a respectiva concentrao. Preparar a
soluo da substncia a ser dosada conforme indicado na monografia, ajustando sua
concentrao para que esta fique situada dentro da faixa de concentrao das solues de
referncia. Introduzir a referida soluo amostra na chama, registrar a leitura e levar o
nebulizador-combustor com gua. Repetir esta seqncia duas vezes e, adotando a mdia das
trs leituras, determinar a concentrao do elemento pela curva de calibrao.

Mtodo II (adio padro)

Adicionar a cada um de, ao menos, trs bales volumtricos similares, volumes iguais de
soluo da substncia a ser dosada, preparada conforme indicado na monografia. Juntar a todos
os bales, com exceo de um, volumes medidos da soluo de referncia especificada, de modo
a obter uma srie de solues contendo quantidades crescentes do elemento sob anlise. Diluir
convenientemente o volume de cada balo com gua. Aps calibrar o espectrfotometro com
gua, como indicado acima, registrar trs vezes as leituras de cada soluo. Transferir os
resultados das leituras de absorvncia (ou transmitncia) e as concentraes correspondentes
para grficos cujos eixos interceptem em zero de elemento adicionado e zero de leitura.
Extrapolar a linha reta que une os pontos at a interceptao do eixo de concentraes. A
distncia entre este ponto e a interseco dos eixos representa a concentrao do elemento
dosado na soluo amostra.

V.2.14. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO NO
ULTRAVIOLETA, VISVEL E INFRAVERMELHO

Quando a energia eletromagntica luminosa atravessa uma soluo contendo tomos e
molculas, parte desta radiao absorvida e o restante transmitido. A radiao absorvida , por
sua vez, depende da quantidade de molculas presente (vale dizer, da concentrao da soluo)
e da estrutura destas molculas. Ao estudo desta dependncia entre tomos e molculas de
substncias e a natureza e quantidade de radiao eletromagntica absorvida por elas denomina-
se espectrofotometria de absoro.
De acordo com peculiaridade de tcnica e equipamentos e, principalmente, o intervalo de
freqncia da energia eletromagntica aplicada, a espectrofotometria de absoro enquadra-se
nas regies ultravioleta, visvel ou infravermelho do espectro da luz. Espectrofotometria de
absoro atmica tambm includa na categoria.
utilizada como tcnica de identificao e quantificao e qualificao das substncias
farmacopicas.

Vigilncia Sanitria Digital 62
RADIAO ELETROMAGNTICA

Radiao eletromagntica consiste de energia propagada na forma de ondas. Como tal,
apresenta comprimento de onda caracterstico (a distncia linear entre dois pontos
correspondentes localizados sobre duas ondas adjacentes). Na regio luminosa do espectro
eletromagntico, o comprimento de onda, (lambda), geralmente especificado em nanmetros,
nm, correspondendo a unidade a 10
-9
m e, mais raramente, em micrmetros, um (10
-6
m) ou em
angstrons A
o
(10
-10
m).
As faixas de comprimento de onda de energia eletromagntica de interesse para a
espectrofotometria de absoro so as seguintes

Regio Faixa de comprimento de onda
Ultravioleta distante 100 200nm
Ultravioleta 200 380nm
Visvel 380 780nm
Infravermelho prximo 780 3000nm
Infravermelho 3.0 - 15m
Infravermelho 15 - 300m

Outras formas de caracterizao das ondas eletromagnticas so o nmero de ondas V
correspondendo ao nmero de ondas por cm (V(cm 1)=1/(cm) ) e freqncia, V (nu), nmero de
ciclos completos irradiados por segundo, especificada em Hertz (1Hz = 1 ciclo/s).
A energia eletromagntica melhor compreendida se considerar fluxo de partculas
denominadas ftons (ou quanta). Cada fton contm determinada energia cuja magnitude
proporcional freqncia (E = hv, em que h corresponde universal de planck), vale dizer,
inversamente proporcional ao comprimento de onda (v c/a, em que c corresponde velocidade
da luz).

INTERAO ENERGIA-MATRIA

Molculas, que constituem a matria, tambm so dotadas de energia, sendo esta
relacionada sua capacidade de movimento. Participam da energia total da molcula a energia
derivada de translao (energia translacional devida a movimentao da molcula como um
todo), de vibrao (energia vibracional, devida ao movimento relativo de tomos ou grupos de
tomos constituintes da molcula), de rotao (energia rotacional, devida rotao da molcula
em torno de um eixo) e finalmente, a energia eletrnica, gerada pela configurao de eltrons na
molcula. Destes quatro componentes, apenas a energia translacional no se relaciona com
fenmenos espectrofotomtricos.
Admite-se que molculas podem absorver energia, elevando seu estado energtico. Tal
elevao, contudo, no de natureza contnua realiza-se necessariamente em etapas (degraus)
levando s chamadas transies energticas do estado fundamental para outros, mais altos.
Transies na energia eletrnica so caractersticas da regio ultravioleta e visvel enquanto as
energias vibracional e rotacional ocorrem na regio infravermelho do espectro.
As transies eletrnicas ocorrem em pores da molcula denominadas cromforos,
caracterizados principalmente por insaturaes e grupos carbonlicos. Compreendem promoes
de eltrons de orbitais moleculares ocupados, geralmente o e H ligantes, para os orbitais de
energia imediatamente superiores, antiligantes H * ou o * (orbitais antiligantes se representados
com asteriscos).
Na regio do infravermelho ocorrem transies de energia vibracional por ser a radiao
neste regio insuficientemente energtica para promover transies e eletrnicas. As vibraes
induzidas por infravermelha compreendem estiramentos e tensionamentos de ligaes inter-
atmicas (simtricos e assimtricos) e modificaes de ngulos de ligaes (vibraes de
deformao no plano e fora do plano).

USOS QUANTITATIVOS DA
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO

A anlise espectrofotomtrica quantitativa tem como princpio a relao proporcional
existente entre a quantidade de luz absorvida e a concentrao da substncia.
Vigilncia Sanitria Digital 63
Considerando uma soluo diluda de substncia capaz de absorver luz de dado
comprimento de onda (luz monocromtica) em solvente transparente (no absorvente neste
comprimento de onda), verifica-se que o decrscimo na intensidade da luz ao atravessar a
soluo diretamente proporcional intensidade da radiao incidente, concentrao da
substncia absorvente e espessura da camada de soluo (distncia percorrida pela luz na
soluo).
Estabelecido ainda o conceito de transmitncia, T, como quociente entre a intensidade de
radiao transmitida pela soluo, I
o
, e a intensidade da radiao incidente, I, teremos para o
princpio do pargrafo anterior a lei de Beer a seguinte formulao:

log(I
o
/I) = A = kbc .

em que
A = absorvncia, logaritmo do inverso da transmitncia (A = 10 1/T), antigamente
conhecido por densidade ptica ou extino;
k = constante de proporcionalidade, caracterstica do soluto (substncia absorvente de
radiao);
b = distncia percorrida pela luz na soluo (espessura)
c = concentrao da soluo.

Quando a concentrao, c, expressa em mol/l e a espessura, b, em centmetros, a
equao torna-se:

A = ebc

em que e (psilon) corresponde absortividade molar (antigamente, coeficiente de extino
molar). Se, por outro lado, a concentrao, c, for expressa em g/litro temos:

A = abc

em que a corresponde absortividade, relacionada com a absortividade molar pela igualdade
e = aM, em que M o peso molecular da substncia.
A intensidade da absoro de luz ultravioleta por substncias cromforas e, em geral,
expressa como absortividade molar, nas condies de mxima absoro, e mox. Se o peso da
substncia no for conhecido, possvel expressar a intensidade de absoro pela equao
1%
E = A/bc
1 cm
1%

em que E
1 cm
corresponde absorvncia de soluo a 1% da substncia quando o caminho ptico
(distncia percorrida pela luz na soluo) 1 cm, ou seja, quando se empregam cubetas
espectrofotomtricas com espessura de 1 cm.
A proporcionalidade entre absorvncia e concentrao prevista na lei de Beer , por
vezes, desobedecida. Desvios de proporcionalidade devem-se principalmente a alteraes de
concentrao de solutos por causa da associaes entre molculas de soluto ou molculas de
soluto e solvente ou ainda pela ocorrncia de dissociaes ou ionizaes. Outra causa possvel
para desvios a chamada radiao policromtica (falta de monocromaticidade da radiao
incidente).
Desvios reais da lei de Beer insignificantes a concentraes at 0,01 M podem ocorrer
em funo de a constante da lei estar relacionada no apenas absortividade mas tambm ao
ndice de refrao. Outrossim, quando a concentrao do soluto elevada, pode ocorrer
alteraes na distribuio de carga das partculas de soluto, modificando sua absoro em dado
comprimento de onda.

EQUIPAMENTO ESPECTROFOTOMTRICO

Espectrofotmetros so dotados fundamentalmente de (1) fonte de luz (lmpada de
tungstnio para luz visvel e de hidrognio ou deutrio para luz ultravioleta); (2) dispositivo
monocromador compreendendo filtro (colormetros de espectrocolormetros) ou dispersor de luz
(prisma ou, mais freqentemente, grade de difrao) equipado com seletor de comprimento de
Vigilncia Sanitria Digital 64
onda, (3) compartimento de cubetas, para insero de solues de amostras no feixe de luz
monocromtica e (4) fotodetector associado a conversor-amplificador e instrumento para medida
da luz transmitida pela amostra (analgico ou digital).
Espectrofotmetros podem dispor de registradores grficos que permitem a obteno de
espectros de absoro. Tal recurso importante para fins de identificao; em espectrofotmetros
de infravermelho quesito indispensvel e em aparelhos de ultravioleta e visvel permite, a par de
eventual caracterizao de substncia, a determinao simplificada de parmetros como os
comprimentos de onda de mxima e mnima absoro (max e min, respectivamente). O
primeiro usualmente o escolhido para a determinao da substncia em anlise.
Espectrofotmetros adequados elaborao de espectros so dotados de mecanismos
de feixe duplo em lugar do mais tradicional feixe nico. Permitem que amostra e branco (solvente
empregado no preparo da soluo de amostra, necessrio ao acerto do zero de absorvncia ou
100% de transmitncia da escala do instrumento do espectrofotmetro) sejam lidos
simultaneamente e continuamente, assegurando manuteno da calibrao de zero ao longo da
varredura de comprimento de onda. Aparelhos de feixe nico exigem ajuste inicial do zero, sendo
este vlido apenas no comprimento de onda selecionado para a leitura.
As cubetas utilizadas para as solues espectrofotomtricas apresentam janelas para
passagem da luz incidente e transmitida de material transparente radiao empregada. Na
regio do visvel empregam-se cubetas de slica enquanto o ultravioleta requer cubetas de
quartzo. No infravermelho so necessrias celas de NaCl, kBr, LiF, CaF2, entre outros sais.
fundamental que as cubetas normalmente com espessura de 1cm (tolerncia de 0,005 cm)
sejam as mais idnticas possveis, vale dizer, apresentem a mesma transmitncia espectral
quando preenchidas com o mesmo solvente. As cubetas dever ser manipuladas com cautela,
evitando-se toc-las na superfcie das janelas, e lavadas com soluo de detergentes suaves,
enxaguadas com gua destilada e a seguir, com solvente orgnico voltil, que no deixe resduo
ao evaporar.

CALIBRAO DE ESPECTROFOTMETROS

A calibrao dos aparelhos deve ser realizada periodicamente, a escala de comprimento
de onda pode ser calibrada empregando-se determinadas fontes de luz que apresentem raias de
intensidade conveniente, distribudas de maneira adequada na regio do espectro a ser
verificada. Os valores exatos das posies das linhas caractersticas da lmpada de quartzo de
arco de mercrio so os seguintes: 252,70; 302,25; 313,16; 334,15; 365,48; 404,66 e 453,83 nm.
A escala de comprimentos de onda tambm pode ser testada por meio de filtros de vidro
adequados, que apresentam bandas de absoro na regio do visvel e do ultravioleta. So
bastante utilizados os filtros-padro de vidro contendo didmio mistura de praseodmio e
neodmio ou hlmio. Os valores exatos para a posio das raias caractersticas dos filtros de
vidro contendo hlmio so os seguintes: 241,5 mais ou menos 1; 287,5 mais ou menos 1; 360,9
mais ou menos 1 e 536,2 mais ou menos 3 nm. A escala de comprimento de onda pode,
opcionalmente, ser calibrada com soluo de perclorato de hlmio SR, que apresentem as
seguintes absores caractersticas: 241,2; 278,2; 361,5 e 536,3 nm. As tolerncias admissveis
so de 1nm na regio do ultravioleta e de mais ou menos 3 nm na regio do visvel.
A calibrao da escala de comprimento de onda em espectrofotmetros de infravermelho
efetuado mediante conferncia dos picos de absoro de poliestireno (filme), dixido de
carbono, vapor de gua ou amnia.
A escala de absorvncia, por sua vez, pode ser calibrada empregando-se soluo de
dicromato de potssio, grau espectrofotomtrico. Os valores de absortividade especfica e a
tolerncia mxima para os comprimentos de onda correspondentes so os seguintes:

(nm) E
1%
faixa admissvel

1cm
235 124.5 122.9 a 126.2
257 144.0 142.4 a 145.7
313 48.6 47.0 a 50.3
350 106.6 104.9 a 108.2

IDENTIFICAO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

Vigilncia Sanitria Digital 65
Diversas monografias incluem espectros de absoro no ultravioleta como prova de identificao.
Nestes casos, haver especificao da extenso de varredura, solvente, concentrao da soluo
e espessura de cubeta a empregar. Alguns farmcos requerem o uso de padres de referncia.
Nestes casos, fica subentendido que as leituras de padro e amostra so efetuadas
simultaneamente (em sucesso imediata) e em condies idnticas quanto a comprimento de
onda, largura de fenda, posio das cubetas, etc.
O preparo das solues-padro em geral compreende a elaborao de solues com at
10% de tolerncia na concentrao especificada. Entretanto, cabe corrigir exatamente a
concentrao com base na tomada de ensaio. Se o padro de referncia utilizado no tiver sido
previamente dessecado, calcular a absortividade com base na concentrao da substncia
anidra.

DETERMINAES QUANTITATIVAS NO ULTRAVIOLETA E NO VISVEL

Doseamentos espectrofotomtricos na regio ultravioleta em geral requerem comparao
da soluo de amostra preparada na concentrao especificada na monografia com padres
de concentrao conhecida. Procede-se inicialmente leitura das solues-padro e, em
seguida, da amostra, com o menor intervalo de tempo possvel entre as duas etapas e em
condies experimentais idnticas.
As solues de referncia so preparadas a partir dos padres de referncia de forma
similar descrita na Identificao por espectrofotometria no ultravioleta.
Quando os doseamentos forem executados com elevada freqncia, dispensvel o
emprego de padres de referncia para cada determinao. Nestes casos, admissvel recorrer
a curvas de calibrao grficos de absorvncia versos concentrao preparadas pela leitura
em comprimento de onda de mxima absorvncia ( ) de solues de concentrao crescente de
padres de referncia. A determinao da concentrao da soluo-amostra ento obtida por
interpolao. A restrio a este procedimento reside na ocorrncia de desvios da lei de Beer,
tornando-o recomendvel somente quando a manuteno da proporcionalidade for confirmada
dentro do intervalo de 75 125% da concentrao de trabalho (soluo-amostra). Curvas de
calibrao devem ser conferidas com freqncia, em especial se o espectrofotmetro empregado
no for o rotineiro ou quando os reagentes tiverem sido preparados a partir de lotes novos. Em
caso de dvida, recorrer tcnica primria de comparao direta com padres de referncia.
Doseamentos colorimtricos (na regio visvel do espectro eletromagntico) seguem o
mesmo esquema dos doseamentos na regio do ultravioleta, inclusive o referente a curvas de
calibrao. Admite-se, conduto, maior tolerncia quanto aos comprimentos de onda de absoro
mxima ( ) especificados na monografia em relao aos observados experimentalmente.
Recomenda-se que a determinao quantitativa seja efetuada no observado quando este no
diferir mais ou menos 0,5 nm (200 e 280 nm); mais ou menos 2 nm (280 e 320 nm); e mais ou
menos 5 nm (320 e 780 nm) em relao ao valor especificado na monografia,. Desvios mais
pronunciados tornam necessria a calibrao do espectrofotmetro.
O calculo para determinao de concentrao da soluo-amostra em referncia
soluo-padro baseia-se na equao da lei de Beer, igualmente vlida para ambas:

A
P
= abc
P


A
a
= abc
a


em que A
P
e C
P
representam, respectivamente, absorvncia e concentrao da soluo-padro e
A
a
e C
A
, absorvncia e concentrao da soluo-amostra. Se as concentraes so expressas na
mesma unidade e as cubetas no diferem nas dimenses, absortividade, a, e caminho ptico, b,
assumem o mesmo valor nas duas equaes que podem, portanto, ser combinadas.

C
A
= c
P
(A
a
/A
P
)

IDENTIFICAO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO INFRAVERMELHO

Capaz de diferenciar substncias por menores que sejam as diferenas estruturais (salvo
ismeros pticos), a espectrofotometria no infravermelho ensaio de identificao por excelncia.
Algumas monografias especificam a execuo de espectros para comparao com espectros de
Vigilncia Sanitria Digital 66
referncia. Como opo havendo disponibilidade de padro de referncia pode-se efetuar os
dois espectros simultaneamente (padro e amostra) para comparao por superposio.
Pequenas quantidades de impurezas no afetam significativamente o espectro, mas
alguns fatores, como polimorfismo, variao no tamanho e orientao dos cristais, tcnica de
triturao e formao de hidrato, podem originar diferenas.
Das trs regies de infravermelho do espectro eletromagntico, a regio intermediria
(3,0 a 15,0 m) mais empregada fins de identificao. Nesta regio do espectro, tetracloreto de
carbono praticamente transparente (em pelcula de at 1 mm de espessura) entre 4000 e 1700
-1

cm (2,5 a 6 m). Alternativas usuais so clorofrmio, o diclorometano e o dibromoetano.
Dissulfeto de carbono adequado como solvente at 250
-1
cm (40 m), exceto nas zonas de
2400 2000
-1
cm (4,2 5,0 m) e 1800 1300
-1
cm (5,5 7,5 m), em que apresenta forte
absoro.
leo mineral que absorve nas regies entre 3000 2800
-1
cm e 1500 1350
-1
cm
alternativamente freqente aos solventes orgnicos. Disperses de amostra no leo so
preparadas triturando-se cerca de 2 a 5 mg de substncia com quantidade suficiente de leo para
se obter pasta fina e cremosa, que intercalada, para leitura, entre duas placas de cloreto de
sdio ou de outro sal apropriado. Igualmente aceita a preparao de pastilhas de haletos e
potssio. A amostra slida (1 a 15 mg) triturada com cerca de 300 mg de sal (geralmente
brometo de potssio, grau espectrfotomtrico, seco e bem pulverizado) e a mistura, homognea,
introduzida em molde e comprimida a vcuo. Forma-se disco, que fixado em suporte
apropriado, submetido leitura.
Amostra e substncia de referncia, quando for o caso, devem ser preparadas
simultaneamente, em condies idnticas. Consideram-se aceitveis espectros em que os picos
de absoro mxima apresentem transmitncia entre 5 e 25%. Se o espectro da substncia
analisada apresentar alguma diferena em relao ao espectro de referncia, cabe dissolver
iguais pores de ambas substncias (ou somente a amostra) se a comparao estiver sendo
feita em relao aos espectros de referncia em solvente apropriado, evaporar as solues at
secura sob as mesmas condies e repetir a execuo dos espectros com os resduos. Se a
diferena notada for devida a polimorfismo, deixar de existir.

V.2.15. ESPECTROFOTOMETRIA DE FLUORESCNCIA

Algumas substncias podem ser analisada com maior sensibilidade e especificidade por
meio de mtodos fluoromtricos do que por tcnicas espectrofotomtricas. A espectrofotometria
de fluorescncia, ou espectrofluorimetria, compreende a medida da fluorescncia emitida quando
estas substncias ditas fluorescentes so expostas radiao ultravioleta, visvel ou outras
tambm de natureza eletromagntica. Tais radiaes promovem a excitao de eltrons da
molcula por nveis energticos mais elevados. Aps curta permanncia no estado excitado
cerca de 10
-8
a 10
-4
segundos os eltrons revertem ao estado fundamental por meio de
processo no radiativo, denominado desativao por coliso, aliado a processo radiativo
chamado luminescncia (fluorescncia ou fosforescncia), ao contrrio do que ocorre com a
maioria das substncias em que a reverso no compreende emisso de luz. Na desativao por
coliso, a energia se perde como calor nos choques entre as molculas. No processo radiante, o
excesso de energia reemitido com intensidade mxima em comprimento de onda maior (em 20
a 30 nm) que o da excitatria absorvida devido perda energtica compreendida no processo.
Sendo de natureza fluorescente, a radiao emitida pela substncia cessa quando a fonte
de energia retirada e esta caracterstica a distingue da fosforescncia, que prossegue por algum
tempo aps o trmino da excitao.
A intensidade da luz emitida por uma soluo fluorescente , em determinadas condies,
proporcional concentrao do soluto e, em conseqncia, aproveitvel para fins analticos. No
sendo praticvel a determinao absoluta da intensidade de fluorescncia, recorre-se a
determinaes referenciadas a solues-padro. O fundamento da espectrofluorescncia
consiste, pois, em excitar a substncia com radiao no comprimento de onda de mxima
absoro e medir comparativamente a intensidade da luz fluorescente emitida frente a um padro.

DEFINIES

Intensidade de fluorescncia Expresso emprica da atividade fluorescente, em unidade
arbitrrias proporcionais resposta do detector.
Vigilncia Sanitria Digital 67
Espectro da excitao de fluorescncia Representao grfica do espectro da ativao,
apresentando a intensidade da radiao emitida por substncia ativa (ordenada) e o comprimento
de onda radiao incidente excitatria (abcissa).
Espectro de emisso de fluorescncia Representao grfica da distribuio espectral
da radiao emitida por substncia ativada, apresentando a intensidade de radiao emitida como
ordenada e o comprimento de onda como abcissa.

APARELHO

A determinao da intensidade de fluorescncia pode ser efetuada em simples fluormetro
de filtro (fluormetro), em espectrofotometros de absoro adaptados ou em espectrofotmetro de
fluorescncia (espectrofluormetro).
O fluormetro de filtro compreende fonte de luz, filtro primrio, cmara de amostra, filtro
secundrio e sistema de deteco. Nos fluormetros deste tipo, o detector encontra-se disposto a
90 graus em relao luz incidente. Tal disposio em ngulo reto permite que a luz incidente
atravesse a soluo da amostra sem interferir com o sinal fluorescente captado pelo detector.
Claro est que tal mecanismo no impede que parte da luz difusa atinja o detector devido s
propriedades difusoras inerentes s solues ou em funo da presena de partculas slidas
suspensas. Esta disperso residual controlada com emprego de filtros. O filtro primrio
seleciona a radiao de comprimento de onda apropriado excitao da amostra enquanto o filtro
secundrio seleciona a radiao fluorescente de comprimento de onda maior, bloqueando o
acesso da radiao dispersa ao detector.
Em sua maioria, os detectores de fluormetros de filtro so equipados com vlvulas
fotomultiplicadoras, havendo, contudo diferenas entre tipos de equipamentos quanto regio
especial de mxima sensibilidade. Amplificada a corrente eltrica gerada no fotomultiplicador,
obtm-se leitura correspondente em instrumento analgico ou digital.
Espectrofotmetros de fluorescncia, por sua vez, diferenciam-se de fluormetros por no
disporem de monocromadores de prisma ou de grade de difrao, proporcionando a esperada
superioridade em seletividade de comprimento de onda e flexibilidade.
Tanto fluormetros como espectrofotmetros de fluorescncia permitem emprego de
diversas fontes de luz. Lmpadas de mercrio ou tungstnio, embora comuns, so substitudas
com vantagens pela lmpada de arco de xennio alta presso, pois esta proporciona, ao
contrrio das demais, espectro contnuo desde o ultravioleta at o infravermelho. De qualquer
forma, a radiao muito intensa e no deve jamais ser observada com os olhos desprotegidos,
sob risco de leses permanentes.
Os monocromadores, por sua vez, dispem de ajuste de leitura de fenda. Fendas
estreitas propiciam maior resoluo e pureza espectral enquanto fendas largas assegura maior
intensidade de luz em detrimento destas caractersticas. A largura de fenda a ser adotada
funo de diferena entre os comprimentos de onda da luz incidente e emitida, assim como do
nvel de sensibilidade necessrio anlise.
A cmara de amostra geralmente permite uso de tubos redondos e cubetas quadradas,
do tipo empregado em espectrofotometria de absoro, salvo pela necessidade de as quatro
paredes verticais serem polidas. Volume de amostra da ordem de 2 a 3 ml so adequados
embora alguns instrumentos possam estar dotados de cubetas pequenas, com capacidade para
0,1 a 0,3 ml ou ainda de suportes para capilares que requerem volumes ainda menores.

CALIBRAO DO APARELHO

Fluormetros e espectrofluormetros devem ser calibrados com substncias fluorforas
estveis de modo a assegurar resultados reprodutveis. As variaes so, em geral, devidas a
alteraes na intensidade das lmpadas ou na sensibilidade do fotomultiplicador. O fluorforo
pode ser amostra pura da substncia a analisar ou qualquer outra substncia fluorescente de fcil
purificao, cujos comprimentos de onda de absoro e fluorescncia sejam semelhantes aos da
substncia em anlise. Quinina em cido sulfrico 0,05 M padro adequado para fluorescncia
em hidrxido de sdio 0,1 M apropriado para fluorescncia verde e rodamina fluorforo de
escolha na fluorescncia vermelha.
A escala de comprimento de onda do espectrofotmetro de fluorescncia tambm requer
calibrao peridica.

PREPARO DAS SOLUES
Vigilncia Sanitria Digital 68

A escolha do solvente utilizado na preparao de solues fluorescentes requer
precaues. Natureza, pureza e pH do solvente so parmetros relevantes na intensidade e
distribuio espectral da fluorescncia. Em conseqncia, recomendvel ater-se ao volume
especificado em mtodos estabelecidos. Muitas apresentam fluorescncia em solvente orgnicos,
mas so praticamente no fluorescentes quando dissolvidas em gua. Assim, cabe a
experimentao em diversos solventes para determinar a propriedade fluorescente de uma
substncia. Solues destinadas espectrofotometria de fluorescncia so 10 a 100 vezes
menos concentradas que as empregadas em espectrofotometria de absoro. Para fins
quantitativos, fundamental que a intensidade da fluorescncia guarde relao linear com a
concentrao da amostra dentro de limites comparativos com a tcnica. Se a soluo for muito
concentrada, parte significativa da luz incidente ser absorvida na periferia da cubeta e menor
ser a quantidade de radiao a alcanar a regio central. Isto significa que a prpria substncia
atuar como filtro interno. Todavia, tal fenmeno raro, considerando-se que a
espectrofotometria de fluorescncia tcnica de elevada sensibilidade, permitindo o emprego de
solues de concentrao da ordem de 10
-5
a 10
-7
M.
Devido aos limites de concentrao usualmente estreitos nos quais a fluorescncia
proporcional concentrao da substncia, tem-se como regra a obedincia relao (c-d)/(a-b)
= 0,40 a 2,50. Nesta, a a intensidade de fluorescncia da soluo de referncia ; b, a
intensidade do branco correspondente; c, a intensidade da soluo amostra e d, a intensidade
do branco correspondente.
As determinaes de fluorescncia so sensveis presena de partculas slidas na
solues. Tais impurezas reduzem a intensidade do feixe incidente, produzindo falsas leituras
elevadas devidos a reflexes mltiplas na cubeta. , portanto, necessrio eliminar estes slidos
por centrifugao ou filtragem antes da leitura, tendo em mente, contudo, que alguns papis de
filtro podem conter impurezas fluorescentes.
A presena de oxignio dissolvido no solvente exerce efeito atenuador sobre a
intensidade da fluorescncia e cabe elimin-lo usando, por exemplo, passagem de corrente de
nitrognio, hlio ou qualquer gs inerente na soluo, previamente leitura.
Controle de temperatura tambm relevante. Em algumas substncia, a emisso
fluorescente pode cair de 1 a 25% por grau de temperatura aumentado. Da se o objetivo for
mxima preciso ser recomendado emprego de cubetas termostatizadas. Entretanto, para
anlise de rotina, no h necessidade deste recurso desde que as determinaes sejam
realizadas com rapidez suficiente para evitar aquecimento devido exposio da soluo luz
intensa.
Algumas substncias fluorescentes so sensveis luz e, quando expostas radiao
luminosa intensa do espectrofotmetro de fluorescncia, podem se decompor em produtos mais
ou menos fluorescentes. Tal efeito pode ser detectado observando-se a resposta do detector em
relao ao tempo e atenuado com a reduo da intensidade luminosa incidente pela utilizao de
filtros.

V.2.16. TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA

Turbidimetria e nefelometria variantes de espectrofotometria destina-se quantidade
de substncias em funo da turbidez de suas suspenses, proporcional a seu poder de difrao
sobre luz incidente (efeito Tyndall).
Na turbidimetria, tambm conhecida por opacimetria, mede-se a intensidade da luz
transmitida no mesmo sentido de direo da luz incidente. Embora haja turbidmetros
destinados especificamente aplicao colormetros e espectrofotmetros convencionais so
satisfatrios medida da luz transmitida desde que ajustados para comprimento de onda
apropriado.
A nefelometria (ou difusimetria), por sua vez, compreende a medida da intensidade de luz
difundida (refletida) pelas partculas em suspenso em ngulo reto ao feixe de luz incidente. Mais
uma vez, a par de nefelmetros, possvel empregar-se colormetros e espectrofmetros na
medida nefelomtrica. Para tanto, cabe modific-los de forma a permitir a captao perpendicular
ao ngulo da luz incidente, seja por transferncia da fonte de luz, seja por alterao de posio do
fotossensor. Fluormetros a exemplo de nefelmetros destinam-se medida de luz dispersa
(posicionamento do fotossensor em ngulo de 90 graus em relao luz incidente), sendo,
portanto, compatveis com a nefelometria . Colormetros e espectrofotmetros comerciais
Vigilncia Sanitria Digital 69
freqentemente dispem de acessrios para adaptao dos instrumentos medida
nefelomtrica.

Turbidncia

Turbidncia (S) em analogia transmitncia (T), definida em V.2.14. a expresso
oficial de disperso da luz produzida por partculas suspensas. determinvel por turbidimetria
ou nefelometria, correspondendo equao

Po bd
3

S = = k C
P d
4
+
4

em que

Po = intensidade da radiao incidente,
P = intensidade da radiao transmitida,
b = espessura da camada de amostra (cubeta).
c = concentrao da amostra,
d = dimetro mdio das partculas,
= comprimento de onda,
k = constante de proporcionalidade, dependente da natureza da suspenso e do mtodo de
medida.

Uma suspenso avaliada em dado instrumento, sob luz monocromtica, apresenta
turbidncia que corresponde ao produto da concentrao C por uma constante de
proporcionalidade k, que combina os demais parmetros da equao acima. Tem-se, portanto,
S=k.C, expresso da lei de lambert-Beer, permitindo que procedimentos turbidimtricos e
nefelomtricos sejam anlogos aos adotados em espectrofotometria. , contudo, relevante
observar que a proporcionalidade s verdadeira para suspenses muito diludas, pois reflexes
secundrias provocam excessivo desvio de linearidade quando o nmero de partculas em
suspenso ultrapassa determinado limite.
Outra fonte de erro em medidas turbidimtricas e nefelomtricas a decantao das
partculas em suspenso. Tal ocorrncia pode ser minimizada com o aumento da viscosidade,
com a incorporao de colide protetor gelatina, goma arbica ou amido ao meio lquido da
suspenso.

Procedimento

O procedimento bsico para o emprego de tcnicas turbidimtricas obedece aos
princpios da metodologia espectrofotomtrica, compreendendo elaborao de reta de calibrao
com suspenso de concentrao conhecida. Na prtica, permissvel a plotagem contra valores
de transmitncia em vez de turbidncia.
As etapas de procedimento compreendem, em resumo: (1) ajustar o instrumento no
comprimento de onda especificado na monografia (para colormetros, na falta de especificao,
empregar filtro que fornea luz na faixa azul), (2) preencher a cubeta com a suspenso mais
concentrada e ajustar a leitura de transmitncia para 100% (transmitncia oferece mais
linearidade que absorvncia), (3) medir a transmitncia das demais suspenso-padro e traar
reta de calibrao e (4) medir a transmitncia da amostra determinando sua concentrao pela
reta de calibrao.

Comparao visual

Medidas de turbidez podem ser executadas por comparao visual, tcnica pela qual a
suspenso de amostra confrontada com suspenso ou suspenses-padro. Para tanto,
empregar tubos de ensaio idnticos, de fundo plano com 70 ml de capacidade e cerca de 23 mm
de dimetro interno. Os tubos devem ser comparados horizontalmente sobre fundo escuro, com
fonte de luz lateral.

V.2.17. CROMATOGRAFIA

Vigilncia Sanitria Digital 70
Mtodos cromatogrficos compreendem a distribuio de um soluto entre duas fases
mvel e fixa atuando a fase fixa por absoro, partio, filtrao em gel ou troca inica. A
cromatografia constitui processo de separao. Identificao ou determinao quantitativa dos
componentes de uma amostra s possvel quando os mtodos cromatogrficos so combinados
com tcnicas apropriadas de deteco e medida.
Os principais tipos de cromatografia so: em camada delgada, em papel, em coluna
lquida de alta presso e de gs.

V.2.17.1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

EQUIPAMENTO

Consiste em placas de vidro, alumnio ou outro material rgido e inerte, recoberto com fina
camada de adsorvente ou suporte, disponveis comercialmente ou preparadas segundo
procedimento descrito a seguir, e cuba de vidro (ou outro material transparente e inerte) provida
de bordos e tampas esmerilhados, de modo a promover vedao completa.

PREPARAO DAS CROMATOPLACAS

Preparar suspenso de absorvente ou suporte e, com auxlio de aparelho apropriado,
espalhar camada uniforme (geralmente 250 a 500 m de espessura) sobre as placas,
previamente limpas e desengorduradas. Utilizar placas de 20 cm de comprimento e largura
varivel (20, 10 ou 5 cm). Deixar secar ao ar e, em seguida, colocar na estufa a 100 105 graus
centgrados por 1 hora. Guardar ao abrigo da unidade. Quando a monografia assim especificar,
ativar as cromatolacas, aquecendo-as em estufa, a 100 105 graus centgrados, por 1 hora. As
placas de celulose constituem exceo, no devendo ser dessecadas nem ativadas.

PROCEDIMENTO

A no ser que a monografia prescreva diferentemente, desenvolver as cromatoplacas em
cuba saturada. Para isso, forrar as paredes da cuba internamente com papel de filtro introduzindo
o eluente em quantidade suficiente para impregn-lo. Deixar, no fundo, camada de 5 a 10 mm de
eluente. Fechar a cuba, deixando-a em repouso por 1 hora, temperatura ambiente.
Aplicar as solues em exame na forma de manchas circulares ou bandas de cerca de 1
cm de largura sobre a placa, distncia no inferior a 1,5 cm das bordas laterais e inferior. A
distncia entre os pontos de aplicao no deve ser inferior a 1,5 cm. Deixar evaporar o solvente,
marcar distncia de 10 a 15 cm a partir do ponto de aplicao das amostras e introduzir a
cromatoplaca na cuba, colocando-a na posio to prxima da vertical quando possvel, de modo
tal que os pontos de aplicao fiquem acima do nvel do eluente. Fechar a cuba e deixar
desenvolver o cromatograma at que o eluente atinja o limite marcado. Remover a cromatoplaca,
deixar secar, e visualizar de acordo com prescrito na monografia.

V.2.17.2. CROMATOGRAFIA EM PAPEL

EQUIPAMENTO

Consiste em cuba de vidro, provida de bordas e tampa esmerilhada e de dimenses
adequada para conter o papel cromatogrfico, que pode ser adaptado para cromatografia
ascendente ou descendente.
Utilizar papel para cromatografia, cortado no sentido das fibras em tiras de comprimento
varivel e largura no inferior a 4,5 cm.
Para cromatografia descendente, utilizar cuba com tampa provida de orifcio central,
fechado por folha de vidro ou outro material inerente. Na parte superior da cuba suspensas, que
contm dispositivo para prender o papel (geralmente vareta de vidro). De cada lado da cubeta h
guias de vidro, que sustentaro o papel de modo a no tocar nas paredes da cuba
cromatogrfica.
Para a cromatografia ascendente, na parte superior da cuba h dispositivo que permite
sustentar o papel cromatogrfico e que pode ser baixado sem abrir a cuba.

PROCEDIMENTO
Vigilncia Sanitria Digital 71

Quando a tcnica utilizada for a de cromatografia ascendente, traar linha fina com lpis a
3 cm da borda inferior do papel; se a cromatogrfia descendente, traar linha a distncia tal que
a mesma fique poucos centmetros abaixo da vareta que prende o papel na cubeta do eluente.
Aplicar as amostras na forma de manchas circulares ou bandas de 1 cm de largura sobre a linha
traada com lpis. Se o volume total a ser aplicado produzir mancha de dimetro superior a 1 cm,
aplicar a amostra em pores, deixando-se evaporar o solvente antes de aplicar a poro
seguinte. Quando mais de uma amostra for cromatografada sobre o mesmo papel, distanciar os
pontos de aplicao, no mnimo, 3 cm.

CROMATOGRAFIA DESCENDENTE

Introduzir na cubeta camada de eluente especificado na monografia, tampar e deixar em
repouso por 24 horas. Aplicar a amostra no papel, colocando-o adequadamente sobre as guias de
maneira que a extremidade superior permanea dentro da cubeta suspensa e prend-lo com
vareta de vidro. Fechar a cuba e deixar em repouso por 1 hora e meia, em seguida, atravs do
orifcio na tampa introduzir o eluente na cubeta. Desenvolver o cromatograma at a distncia ou
tempo prescritos, protegendo o papel da incidncia de luz direta. Remover o papel, marcar o
percurso da fase mvel, secar e visualizar da maneira prescrita na monografia.

CROMATOGRAFIA ASCENDENTE

Colocar no fundo da cuba recipiente contendo eluente, fechar a cuba e mant-la em
repouso por 24 horas. Aplicar a amostra sobre o papel introduzindo-o na cuba e deixar em
repouso por 1 hora e meia. Sem abrir a cuba, baixar o papel de modo a colocar sua extremidade
inferior em contato com o eluente e desenvolver o cromatograma at a distncia ou tempo
prescritos. Retirar o papel, marcar o percurso do eluente, secar e visualizar da maneira prescrita
na monografia.

V.2.17.3. CROMATOGRAFIA EM COLUNA

EQUIPAMENTO

Colunas cromatogrficas so constitudas de tubos de vidro ou outro material inerte e
transparente, e de comprimento e dimetro variveis, em cuja parte inferior h estrangulamento e
torneira para regulagem do fluxo do eluente. Em algumas colunas, a parte inferior apresenta uma
placa porosa, cuja finalidade evitar a sada da fase fixa. Na parte superior da coluna poder
haver dilatao de forma esfrica destinada a conter volume maior de solvente, os tipos de
cromatografias em coluna podem ser: por adsoro, partio ou troca inica.

PROCEDIMENTO

Cromatografia em coluna por adsoro Suspender a fase fixa na fase mvel
introduzindo, a seguir, o tubo de vidro, cuja parte basal foi previamente obturada por chumao de
algodo, de modo a formar coluna de adsorvente isenta de bolhas de ar. Deixar sedimentar o
adsorvente, retirar o excesso de eluente e colocar a amostra no topo da coluna. Em seguida,
adicionar fase mvel e deix-la fluir pela ao da gravidade ou pela aplicao de presso positiva
no topo da coluna. O eluente controlado, recolhendo-se fraes conforme especificado na
monografia e examinando-se cada frao por mtodo adequado.
Cromatografia em coluna por partio utilizar fase lquida miscvel com fase mvel para
ser adsorvida na superfcie de suporte slido. Desenvolver a cromatografia da maneira que a
cromatografia de adsoro. De modo com a monografia, saturar a fase mvel com a fase fixa,
antes de ser usada a eluio. Geralmente o adsolvente e a fase fixa so mais polares do que a
fase mvel. Em alguns casos utiliza-se a cromatografia de partio de fase reversa, em que o
adsorvente polar se transforma em no polar pela silanizao ou outros meios (tratamento com
parafinas, por exemplo), e a fase fixa menos do que a fase mvel. Proceder coleta e ao
controle de frao conforme a monografia.
Cromatografia em coluna por troca inica utilizar como fase fixa resina de troca inica.
Troca de ions consiste em intercmbio reversvel de ions presentes na soluo com ions do
polmero resinoso, celulose modificada ou suporte de slica-gel. A escolha da resina, forte ou
Vigilncia Sanitria Digital 72
fraca, aninica ou catinica , depender em grande parte do pH no qual dever ocorrer a troca
inica e da natureza de nions ou ctions a serem trocados. As resinas fortemente cidas e
fortemente bsicas so convenientes para a maioria das aplicaes analticas. Emprega-se, na
prtica, grande excesso (200 300%) de resina sobre a quantidade da amostra
estequiometricamente calculada; a capacidade das resinas varia de 2 a 5 milimoles por g (peso
seco).
Tratamento da resina e preparo da coluna Suspender a resina de troca inica em gua
e deixar em repouso por 24 horas. Introduzi-la em coluna adequada e, tratando-se de resina
aninica, convert-la em bsica passando atravs da coluna soluo de hidrxido de sdio SR,
velocidade de 3ml por minuto, at que o eluente fornea reao negativa para cloreto. Passar, em
seguida, gua isenta de dixido de carbono. Em caso de resina catinica, a converso para a
forma cida d-se pela passagem de cido clordrico SR atravs da coluna, seguida de lavagem
com gua isenta de dixido de carbono at que o eluente fornea reao neutra.
Desenvolve-se coluna de troca inica de maneira anloga descrita para cromatografia
de adsoro. Terminada a operao regenera-se a resina lavando-a com hidrxido de sdio SR
(coluna aninicas) ou com cido clordrico SR (coluna catinicas) e, em seguida, com gua isenta
de dixido de carbono at reao neutra.

V.2.17.4. CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA PRESSO

EQUIPAMENTO

constitudo por uma ou mais bombas, sistema injetor de amostra, coluna cromatogrfica
e sistema que permite determinar presena e concentraes dos componentes da amostra.
O comprimento, o dimetro interno da coluna, a temperatura da operao, a composio
e a vazo do eluente, a natureza da fase estacionria e os meios de deteco so descritos nas
monografias.
Quando a monografia estabelecer a eficincia mnima da coluna, esta definida em
termos do nmero de pratos tericos por metro, pela expresso
Vigilncia Sanitria Digital 73

5,54 D
R

N = -------- x (--------)
2

C I
h


em que

N = nmero de pratos tericos por metro,
D
R
= distncia, ao longo da linha-base, entre o ponto de injeo da amostra e a perpendicular
linha-base traada do mximo do pico de interesse,
C = comprimento da coluna em metros,
I
h
= largura do pico de interesse metade da leitura, expressa na mesma unidade de medida
que D
R
.

O fator de resoluo (R) entre picos medidos no cromatograma , no mnimo, 1,0 (exceto
se a monografia estabelecer diferentemente). O fator de resoluo definido pela expresso

R = 2 (D
Rb
- D
Ra
) /(I
a
+ I
b
)

em que

R = fator de resoluo,
D
Ra
e D
Rb
= distncias medidas ao longo da linha-base, entre os pontos de injeo e a
perpendicular linha-base, traada dos respectivos mximos de dois picos
adjacentes,
I
a
e I
b
= largura dos respectivos picos na linha-base.

Os valores de I
a
, I
b
, D
Ra
, D
Rb
devem ser expressos nas mesmas unidades de medida.

PROCEDIMENTO

A apresentao das solues descritas na monografia. Registrar o cromatograma e
repetir a determinao para assegurar-se da reprodutibilidade. Determinar as reas dos picos ou,
alternativamente, quando a simetria o permitir, a altura dos picos produzidos por componentes de
interesse. A partir dos valores obtidos, calcular o teor destes componentes em relao a padres
internos.

V.2.17.5. CROMATOGRAFIA A GS

EQUIPAMENTO

Consiste em bloco injetor conectado a coluna de material apropriado, contendo fase fixa
que recobre suporte slido, medidor de fluxo para gs de arraste, e sistema de deteco que
permite determinar presena e concentraes de componentes da amostra. As especificaes do
equipamento e as condies de operaes so descritas nas monografias.
Quando a monografia estabelecer * eficincia mnima da coluna * , esta definida em
termos do nmero de pratos tericos por metro, pela expresso citada em V.2.17.4.
O fator de resoluo (R) entre picos medidos no cromatograma , no mnimo, 1,0 (exceto
se a cromatografia estabelecer diferentemente). O fator de resoluo definido pela expresso

R = 2(D
Ra
- D
Rb
)/(I
a
+ I
b
)

em que

R = fator de resoluo,
D
Ra
e D
Rb
= distncias medidas ao longo da linha-base, entre os pontos de injeo e a
perpendicular linha-base, traada dos respectivos mximos de dois picos
adjacentes,
I
a
e I
b
= largura dos respectivos picos na linha-base.

Vigilncia Sanitria Digital 74
Os valores de I
a
, I
b
, D
Ra
, D
Rb
devem ser expressos nas mesmas unidades de medida.

PROCEDIMENTO

O preparo das amostras descrito na monografia. Determinar o ajuste do aparelho e os
volumes a serem injetados, de modo a produzir resposta adequada. Ajustar a vazo do gs de
arraste para otimizar a qualidade e a velocidade do desenvolvimento do cromatograma. Nos
casos em que se utiliza padro interno, procede-se injeo de amostra para determinar se h
presena de picos interferentes com o pico do padro interno. Observada a presena de picos
interferentes, proceder correo das condies de operao.
Injetar os volumes selecionados das solues descritas na monografia e registrar os
cromatogramas resultantes. Repetir a determinao para assegurar-se de resposta consistente.
Determinar as reas dos picos ou, quando a simetria dos mesmos permitir, suas alturas. A partir
dos valores obtidos calcular o teor dos componentes em exame.

V.2.17.6. MATERIAL PARA CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Os materiais abaixo relacionados so utilizados na preparao de cromatoplacas, de
acordo com o mtodo geral de cromatografia em camada delgada. Podem ser utilizadas
cromatoplacas prontas, disponveis comercialmente, desde que correspondam ao teste de
verificao do poder de separao ou qualquer outro teste adicional especificado na monografia.

CELULOSE

P fino homogneo, com tamanho mdio das partculas inferior a 30 m e que
correspondem ao teste de verificao do poder de separao.

Teste de verificao do poder de separao

Preparar cromoplacas utilizando suspenso de 15g de celulose em 100 ml de gua com
auxlio de agitador mecnico. Preparar soluo a 0,025% (p/v) de cada um dos seguintes
corantes: preto brilhante BN, amarelo rpido AB e tropeolina O em mistura de volumes iguais de
gua e metanol. Aplicar 10 l desta soluo sobre a cromatoplaca e desenvolver usando como
fase mvel a mistura de 50 volumes de 1 propanol 10 volumes de acetato de atila e 40 volumes
de gua. Deixar o solvente subir 10 cm. O cromatograma dever mostrar quatro manchas
distintas e bem separadas, sendo, pela ordem, uma preta, uma vermelha e duas amarelas,
contando a partir do ponto de aplicao.

CELULOSE F 254

P fino, homogneo, com tamanho mdio das partculas inferior a 30 m, contendo
indicador fluorescente com intensidade tima a 254 nm. Corresponde ao teste de verificao do
poder de separao descrito para celulose. Para o preparo da cromatoplaca utilizar a suspenso
de 25g em 100 ml de gua.

CELULOSE G

P fino homogneo, com tamanho mdio das partculas inferior a 30 m, contendo agente
adesivo. Corresponde ao teste de verificao do poder de separao descrito para celulose.

SLICA-GEL G

P fino, homogneo. O tamanho de partculas varia entre 10 e 40 m. Contm cerca de
13% (p/p) de sulfato de clcio hemiidratado. Corresponde aos seguintes testes:

Teor de sulfato de clcio

Vigilncia Sanitria Digital 75
Misturar 0,25 g de slica-gel G, 3 ml de cido clordrico 2 M e 100 ml de gua e agitar
vigorosamente por 30 minutos. Filtrar, lavar o resduo com gua e proceder com a titulao
complexomtrica de clcio no filtrado combinado com guas de lavagem. Cada ml de edetato
dissdico 0,05 M eqivale a 7,255 mg de sulfato de clcio hemiidratado.

Alcalinidade

O pH da suspenso preparada pela agitao de 1 g de slica-gel G com 10 ml de gua
isenta de dixido de carbono por cinco minutos , aproximadamente, 7,0.

Verificao do poder de separao

Preparar cromatoplaca conforme indicado em mtodo geral para cromatografia em
camada delgada. Preparar soluo a 0,01% (p/v) de cada um dos seguintes corantes: azul de
indofenol, vermelho Sudan G e amarelo de dimetila em tolueno. Aplicar 10 l sobre a
cromatoplaca e desenvolver utilizando tolueno como fase mvel. Deixar o solvente subir 10 cm. O
cromatograma dever mostrar 3 manchas separadas: a mancha correspondente no azul de
indofenol junto do ponto de aplicao, a mancha correspondente ao amarelo de dimetila, no meio
do cromatograma e a mancha correspondente ao vermelho Sudan G, entre as duas primeiras.

SLICA-GEL GF 254

P fino, homogneo, branco, com tamanho mdio das partculas variando de 10 a 40 m,
contendo cerca de 13% (p/p) de sulfato de clcio hemiidratado e indicador fluorescente, com
intensidade mxima a 254 nm. Corresponde a testes de teor de sulfato de clcio, alcalinidade e
verificao do poder de separao descrito para slica-gel G. Corresponde ainda a teste de
fluorescncia.

Fluorescncia

Preparar cromatoplacas segundo descrito em mtodo geral para cromatografia em
camada delgada. Preparar soluo de cido benzico a 0,1% (p/v) em mistura de 9 partes de 2
propanol e 1 parte de cido frmico anidro. Aplicar sobre a cromatoplaca, separadamente, 2, 4, 6,
8 e 10 l desta soluo e desenvolver o cromatograma usando como eluente mistura de 9 partes
de 2-propanol e 1 parte de cido frmico anidro. Aps desenvolvimento e secagem verificar a
mancha escura de cido benzico sobre fundo fluorescente verde amarelo, no tero superior do
cromatograma.

CELULOSE MICROCRISTALINA

P fino homogneo, com tamanho mdio das partculas inferior a 30 m. Corresponde ao
teste de verificao do poder de separao descrito para celulose. Para o preparo da placa utilizar
suspenso de 15g em 100 ml de gua.

KIESELGUHR G (Terra de diatomceas G)

P fino, acinzentado, aparecendo colorao cinzenta mais pronunciada quando misturado
com gua. O tamanho mdio das partculas varia de 10 a 40 m. Trata-se de terra de
diatomceas natural, extrada com cido clordrico e calcinada, a qual se adicionou cerca de 15%
de sulfato de clcio hemiidratado. Corresponde aos testes:

Teste de verificao do poder de separao

Preparar cromatoplacas usando suspenso da amostra em soluo 0,02 M de acetato de
sdio anidro. Preparar soluo contendo 0,1% (p/v) de cada um dos seguintes acares: lactose,
sacarose, frutose, D-glicose e em piridina. Aplicar 10 l da soluo sobre a cromatoplaca e
desenvolver o cromatograma utilizando como fase mvel a mistura de 65 volumes de acetato de
etila, 23 volumes de 2-propanol e 12 volumes de gua. Deixar secar em estufa a 110 graus
centgrados e esfriar. Nebulizar a cromatoplaca com cerca de 10 ml da soluo de anisaldedo e
Vigilncia Sanitria Digital 76
aquecer a 110 graus centgrados por 10 minutos. O cromatograma dever mostrar cinco manchas
separadas e bem definidas.

Alcalinidade

O pH de suspenso preparada pela agitao de 1 g de Kieselguhr G com 10 ml de gua
isenta de dixido de carbono por 5 minutos dever situar-se entre 7,0 e 8,0.

KIESELGUHR H ( Terra de diatomceas H)

P fino, acinzentado, aparecendo colorao cinzenta mais pronunciada quando misturado
com gua. O tamanho mdio das partculas varia de 10 a 40 m. Corresponde ao teste de
verificao do poder de separao descrito para Kieselguhr G e a alcalinidade.

Alcalinidade

O pH de suspenso preparada pela agitao, por 5 minutos, de 1g de Kieselguhr H com
10 ml de gua isenta de dixido de carbono situa-se entre 6,4 e 8,0.

Slica-gel H

P fino homogneo, com tamanho de partculas variando entre 10 e 40. Corresponde a
teste de verificao do poder de separao descrito para slica-gel G.

SLICA-GEL HF 254

P fino, homogneo, branco, com tamanho mdio das partculas variando de 10 a 40 m,
contendo cerca de 1,5% (p/p) de indicador fluorescente com absoro mxima a 254 nm.
Corresponde a teste de verificao do poder de separao e alcalinidade descrito para slica-gel
G e a teste para fluorescncia descrito para slica-gel GF 254.

SLICA-GEL SILANIZADA HF 254

P branco, fino e homogneo. Possui propriedade de repelir a gua; quando agitado com
gua permanente na superfcie do lquido. Corresponde ao teste de verificao do poder de
separao.

Verificao do poder de verificao

Proceder cromatografia em camada delgada, utilizando cromatoplacas preparadas da
maneira descrita a seguir:
Agitar vigorosamente, durante 2 minutos, 30g de slica-gel silanizada HF 254 com 60 ml
de mistura de gua e metanol 2:1.
Utilizando dispositivo apropriado, espalhar camada uniforme da suspenso de
aproximadamente 250 m sobre placas de vidro, medindo 20 por 5 cm, cuidadosamente limpas e
desengorduradas. Deixar secar ao ar e em seguida, aquecer em estufa a 110 graus centgrados
por 30 minutos. Preparar mistura de laurato de metila, miristato de metila, permitato de metila e
estereato de metila, 0,1g cada. Adicionar a esta mistura 40 ml de soluo de hidrxido de
potssio a 3,0% (p/v) em etanol a 90%, previamente decantada e aquecer por 1 hora em banho-
maria, sob refluxo. Esfriar adicionar 100 ml de gua, acidificar a mistura com cido clordrico 2 M
e extrair com 3 pores, de 10 ml cada, de clorofrmio. Reunir os extratos clorofrmicos, sec-los
com sulfato de sdio anidro, filtrar e evaporar at secura. Dissolver o resduo em 50 ml de
clorofrmio.
Aplicar sobre a cromatoplaca 3 pores de 10 l cada, desenvolver o cromatograma
usando como fase mvel mistura de 1,4-dioxana, gua e cido actico glacial (65:25:10). Retirar a
cromatoplaca da cuba, aquecer a 120 graus centgrados em estufa por 30 minutos, deixar esfriar
e nebulizar com soluo a 3,5% (p/v) de cidofosfomolbdico em 2-propanol. Aquecer a 150graus
centgrados em estufa at que as manchas sejam visveis. Expor a cromatoplaca a vapores de
amnia at que o fundo se torne branco; cada cromatograma mostra 4 manchas distintas, bem
separadas.
Vigilncia Sanitria Digital 77

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

xido de alumnio anidro

xido de alumnio neutro ou bsico, desidratado e ativado pelo tratamento com calor,
consistindo em o - Al
2
O
3
. Todo o xido de alumnio neutro deve passar pelo tamis de 150 m e
ser retido no tamis de 75 m.

xido de alumnio bsico

Grau bsico de xido de alumnio comercial ativado, adequado para cromatografia em
coluna. Corresponde aos testes arrolados a seguir.
Alcalinidade o pH de suspenso a 10% (p/v) em gua isenta de dixido de carbono e
agitada durante 5 minutos situa-se entre 9.0 e 10,0.
Atividade Empacotar, em coluna cromatogrfica medindo 1 cm de dimetro e
comprimento adequado, xido de alumnio bsico em quantidade suficiente para formar coluna de
5 cm de comprimento. Aplicar, sobre a mesma mistura de 5 ml de soluo de Amarelo Sudan e 5
ml de Sudan Vermelho G e eluir com 20 ml de mistura de 1 volume de benzeno e 4 volumes de
ter de petrleo 60 80 graus centgrados. O Sudan Vermelho G forma faixa de
aproximadamente 1 cm de profundidade na parte de cima da coluna, seguindo-se faixa incolor e,
abaixo desta, faixa amarela de amarelo Sudan.

xido de alumnio desativado

Adicionar 1,5 a 2,0 de gua ao xido bsico de alumnio, misturar bem e deixar em
repouso por uma noite em recipiente bem vedado. O xido de alumnio desativado corresponde
ao teste que segue:
- Empregar em coluna adequada de xido de alumnio desativado em quantidade
suficiente para formar coluna de 20 cm de altura e 1 cm de dimetro, usando hexano, como fase
mvel. Adicionar no topo da coluna soluo de 0,25 mg de calciferol em 10 ml de hexano.
Quando o nvel de soluo estiver atingindo o do suporte, comear a eluir com soluo a 17,5%
(v/v) de ter em hexano. Se necessrio, ajustar a velocidade de eluio para 1 a 2 ml por minuto.
Coletar 200 ml de eluato: no se verifica presena de calciferol. Coletar 100 ml seguintes do
eluato: verificar presena de, no mnimo, 95% do calciferol utilizado no teste. Para determinao
da soluo de calciferol, seguir prescrio da monografia.

xido de alumnio neutro

xido de alumnio neutro, comercial, adequado para a cromatografia de coluna.
Corresponde ao seguinte teste:
- Empacotar em coluna cromatogrfica, medindo 1 cm de dimetro e de comprimento
adequado, xido de alumnio neutro em quantidade suficiente para formar coluna de 5 cm de
altura. Aplicar, sobre a coluna, mistura de 5 ml de soluo de azobenzeno e 5 ml de soluo de
metoxiazobenzeno e eluir com mistura de 1 volume de benzeno e 4 volumes de ter de petrleo
60 80 graus centgrados. O metoxiazobenzeno forma faixa brilhante amarela, de 3 a 5 cm de
profundidade, na parte superior da coluna. Imediatamente abaixo forma-se faixa amarela, mais
plida, de aproximadamente 2 cm de largura: corresponde ao azobenzeno.

xido de alumnio com 7% de gua

Passar xido de alumnio neutro tridratado atravs de tamis de 106 m e, em seguida,
atravs de tamis de 53 m. Misturar 9 partes de material retido no tamis 53 m com 1 parte do
material que passou atravs do mesmo tamis. Aquecer a mistura em forno a 780 820 graus
centgrados por 7 horas, esfriar, evitando contato com umidade, e transferir para recipiente bem
vedado. Adicionar 7% de gua ao xido de alumnio anidro assim obtido, vedar o recipiente e
misturar bem seu contedo, fazendo rolar o recipiente vedado. Deixar em repouso por, no
mnimo, 12 horas, agitando ocasionalmente.

xido de alumnio com 4% de gua
Vigilncia Sanitria Digital 78

Proceder como descrito para xido de alumnio com 7% de gua, adicionando apenas 4%
de gua alumina anidra.

Carmelose

Substncia trocadora de ctions, fracamente cida, monofuncional na forma fibrosa.
Tratamento preliminar agitar parte de carmelose (carboximetilcelulose) com 15 volumes
de hidrxido de sdio 0,5 M e deixar em repouso por 30 minutos. Remover o lquido sobrenadante
e lavar o resduo com gua at que as guas de lavagem mostrem pH 8,0. Agitar o resduo
lavado com 15 volumes de cidoclordrico 0,5 M e deixar em repouso por 15 minutos. Repetir o
tratamento com cido e, finalmente, lavar com gua at que as guas de lavagem mostrem
reao praticamente neutra. Suspender em gua contendo 1% (p/v) de lcool benzlico e estocar
at o momento de uso.

Diatomita lavada (auxiliar de filtrao)

Pesar 500g de diatomita calcinada (tipo Celite 545) e adicionar 2000 ml de cido
clordrico. Misturar, deixar em repouso por 12 horas, agitando ocasionalmente. Filtrar e lavar o
resduo sobre o filtro com gua at reao neutra ao tornassol. Lavar com 500 ml de metanol e,
em seguida, com 1000 ml de mistura de volumes iguais de metanol e ter. Secar o resduo lavado
a 100 gruas centgrados at que no se perceba mais odor do solvente. Armazenar em
recipientes bem vedados.

CROMATOGRAFIA A GS

SUPORTES

Suporte de terra de diatomceas branco

Trata-se de grnulos brancos de slica constitudos, principalmente, de esqueletos de
diatomceas submetidos calcinao. Encontra-se no comrcio sob vrias formas. As mais
utilizadas so :
- suporte de diatomceas lavado com cido. Trata-se de suporte de diatomceas
lavado com cido clordrico para remover impurezas metlicas, reduzir atividade de
superfcie e prevenir formao de cauda nos picos.
- Suporte de diatomceas silanizado. Trata-se de suporte de diatamceas tratado com
dimetildiclorossiloxana ou qualquer outro agente silanizante, para a atividade de
superfcie e prevenir formao de cauda nos picos.
- Suporte de diatomceas com lcool. Trata-se de suporte de diatomceas lavado com
soluo de hidrxido de potssio para reduzir formao de cauda de compostos
bsicos.

Encontra-se disponveis comercialmente suportes de diatomceas de alto desempenho.
Tais suportes podem ser adequados para algumas determinaes. A monografia estabelecer,
quando necessrio, o grau do suporte considerado adequado para aquela determinao, assim
como o tamanho de partculas adequado.

Suporte de terra de diatomceas rseo

Trata-se de grnulos rseos, obtidos a partir da diatomita natural, moldada em tijolos, com
auxlio da argila, os quais so calcinados e quebrados em seguida. Este suporte mais denso do
que o suporte de terra de diatomceas branco e, como o anterior, tambm existe no comrcio
com vrios graus de desempenho.

Fases estacionrias

Grande variedade de substncias qumicas so utilizadas como fase estacionria,
incluindo macrogis, steres de alto peso molecular, amidas, hidrocarbonetos, polissiloxanas e
seus derivados e polmeros poliaromticos microporosos. A escolha de fase estacionria
Vigilncia Sanitria Digital 79
adequada para determinao cromatogrfica deve ser objeto de seleo criteriosa. As
monografias podero fazer referncia a tipos de fases estacionrias disponveis comercialmente.
No entanto, estas referncias no impedem o uso de produto de origem diferente, contanto que
apresentem caractersticas semelhantes.

Padres internos

Os reagentes utilizados como padres internos no devem conter impurezas que
produzam picos capazes de interferir com a determinao descrita na monografia.

V.2.18. POLAROGRAFIA

A polarografia, mtodo analtico eletroqumico, fundamenta-se na medida da corrente
eltrica resultante da eletrlise de substncias eletroativas (reduzveis ou oxidveis) sob
determinado potencial de eletrodo e condies controladas, em outras palavras, a tcnica implica
no registro do aumento da corrente em eletrodo polarizvel durante a eletrlise de substncias
dissolvida no meio eletroltico em funo do aumento da tenso aplicada do sistema. O grfico
desta evoluo da corrente em relao tenso o polarizaram fornece informaes qualidade
e quantitativas sobre constituintes eletro-redutveis ou eletro-oxidveis da amostra.
Dentre as variantes de metodologia polarogrfica, a mais simples a tcnica em corrente
contnua. Requer a exemplo da potenciometria o emprego de dois eletrodos, o de referncia
(geralmente eletrodo de calomelano saturado, ECS) e o microeletrodo indicador (geralmente
eletrodo de mercrio gotejante, EMG). Em alguns casos emprega-se um terceiro eletrodo,
auxiliar, O ECS de levada rea superficial fornece potencial constante durante o ensaio,
enquanto o EMG gotas de mercrio de dimenses reprodutveis fluindo periodicamente da
extremidade de capilar ligado ao reservatrio do metal assume o potencial que lhe conferido
pela fonte externa. O equipamento polarogrfico compreende alm dos eletrodos - a cuba de
eletrlise, fonte de alimentao varivel, dotada de voltmetro e microampermetro e registrador
grfico.
De forma simplificada, a tcnica consiste na dissoluo da amostra (o mtodo tem
sensibilidade para concentrao de espcie eletroativa na faixa de 10
-2
a 10
-4
M) em eletrlito de
suporte responsvel pela manuteno de pequena corrente residual, mas que se mostra inerte na
faixa de potencial de transformao da amostra. Inicialmente, o controle de tenso da fonte
(potencimetro de preciso) encontra-se totalmente fechado. Nesta condio, a tenso fornecida
ao microeletrodo nula e no haver indicao de corrente no microampermetro. A abertura
gradual do potencimetro far com que pequeno potencial alcance os eletrodos. Sob esta tenso,
ainda reduzida, gua e eventuais ons derivados de impurezas da amostra tendem a adquirir
eltrons no EMG (catodo, neste caso), reduzindo-se e provando a indicao de pequena
passagem de corrente. Elevao progressiva da tenso aplicada acentuar o processo de
reduo e o aumento quase proporcional da corrente. Atinge-se afinal o potencial necessrio
reduo da amostra, o que se reflete em elevao acentuada da corrente lida no
microampermetro e registrada no polarizaram. H, contudo, limite para a proporcionalidade da
elevao tenso-corrente. Enquanto a corrente se eleva (e a reduo se processa), ocorre
diminuio progressiva da concentrao da espcie eletroativa original junto superfcie do
eletrodo. Em dado momento a velocidade da eletrlise sendo constante tal concentrao
atinge nvel insuficiente para permitir elevao adicional da corrente e esta ltima passa a ser
limitada pela velocidade com a qual a espcie eletroativa consegue migrar da periferia da soluo
eletroltica para a superfcie do EMG. Surge o patamar observado no polarizaram (fig. 1). Sendo a
corrente medida ento denominada corrente de difuso parmetro proporcional
concentrao de espcie eletroativa na amostra (aspecto quantitativo da polarografia). Superado
determinado nvel de tenso, a corrente volta a se elevar. Esse aumento causado pela reao
do eletrlito de suporte. Sua presena, em elevadas concentraes, impede que as molculas
eletroativas da amostra alcancem o microeletrodo por migrao eltrica e assegura, por isso, que
a corrente limite seja efetivamente regulada apenas por difuso.
Ao se empregar microeletrodo de mercrio gotejante, a superfcie do eletrodo
constantemente renovada (forma-se gota nova a cada 3 5 segundos), ocorrendo, da, variao
na corrente medida de dado intervalo, a corrente mais baixa quando a gota se forma, chegando
ao mximo no instante de queda. O fenmeno explica a forma dente de serra caracterstica da
onda polarogrfica.


Vigilncia Sanitria Digital 80



















Fig. 1 Polarograma de espcie eletro-redutvel

Vigilncia Sanitria Digital 81

POLAROGRAMA

A Fig. 1 ilustra polarizaram tpico (EMG), caracterizado por 4 fases distintas. Na fase A
aparece a corrente capacitiva, i
c
, incorporada corrente fardica, i
f
, resultante da oxidao ou
reduo de impurezas do eletrlito suporte ou da amostra. O conjunto destas correntes
denomina-se corrente residual, i
r
(i
r
= i
c
+ i
f
). Na fase B do polarizaram ocorre a corrente fardica, i
r

, devida converso da substncia sob ensaio. A eletrodecomposio leva escassez desta
substncia junto ao microeletrodo, verificando-se o patamar (fase C) onde aparece a corrente
limite, i
l
. Esta compreende a soma das correntes residual e difuso (i
l
= i
r
+ i
d
) onde a corrente de
difuso proporcional concentrao da espcie eletroativa na amostra tem seu valor
determinado pela inverso da equao

i
d
= i
l
- i
r


Duas outras correntes indesejveis a de migrao e a de conveco podem
incorporar a corrente limite. A primeira suprimida pelo emprego de eletrlito de suporte inerte de
potencial empregada, em concentraes, no mnimo, 100 vezes maiores que as da espcie
eletroativa. A corrente de conveco, por sua vez, minimizada pela no agitao da soluo.
Finalmente, a fase D do polarizaram, no qual ocorre reverso da proporcionalidade
tenso-ocorre, corresponde reduo de outras espcies eletroativas, quando presentes, ou,
mais freqentemente, eletrlise do suporte.

Equao de Ilkovic

A equao de Ilkovic estabelece relaes entre vaiveis compreendidas na medida
polarogrfica e a corrente de difuso no EMG:

i
d
= 708nD
1/2
Cm
2/3
t
1/6


em que

i
d
= corrente de difuso, em uA, medida imediatamente antes da queda da gota de mercrio
do capilar.
708 = constante dependente de diversos parmetros, incluindo a unidade adotada para as
variveis, dimenso da gota de mercrio e instante da medida de i
d
,
n = nmero de eltrons necessrios reduo ou oxidao de uma molcula ou on de
substncia eletroativa,
D = coeficiente de difuso, em cm
2
/s,
C = concentrao de substncia eletroativa, em milimoles/litros,
m = massa do fluxo de mercrio, em mg/s,
t = tempo de vida da gota, em s.

A constante 708 englobando constante natural ao valor do faraday estabelecida
para operao a 25 graus centgrados e aplicvel polarografia de corrente contnua
amostrada, na qual, em vez do registro contnuo de corrente, efetua-se a leitura da corrente ao
trmino da vida da gota de mercrio, permitindo obteno de polarograma linear. Entretanto, ao
empregar-se instrumentos dotados de amortecedor de dente de serra no registrador, considera-se
a corrente mdia dos pulsos. A corrente de difuso obtida segundo a equao de Ilkovic passa a
ser a mdia para toda a vida da gota de mercrio. Neste caso a constante adquire o valor 607.
As variveis compreendidas na equao de Ilkovic devem ser controladas para que a
corrente de difuso seja efetivamente proporcional concentrao de espcie eletroativa na
amostra analisada. Alguns ons e molculas orgnicas em soluo aquosa modificam seu
coeficiente de difuso razo de 1 a 2% para cada grau centgrado aumentado, tornando
necessrio que a clula polarogrfica tenha sua temperatura controlada com tolerncia de mais
ou menos 0,5 graus centgrados. Os parmetros m e t , relacionados com dimenso e velocidade
de renovao da gota de mercrio, dependem da geometria do capilar, sendo a corrente de
difuso proporcional raiz quadrada da altura da coluna de mercrio. Alturas adequadas
medindo-se da extremidade do capilar at o nvel de mercrio no reservatrio situam-se entre
40 e 80 cm. O dimetro interno do capilar neste caso de 0,04 mm para comprimentos entre 6 a
Vigilncia Sanitria Digital 82
15 cm. A altura exata do capilar ajustada para permitir a formao de uma gota a cada 3 5
segundos, com circuito aberto e capilar imerso no eletrlito sob ensaio.
Assim, se durante um ensaio em particular todos os parmetros exceo da
concentrao da espcie eletroativa forem mantidos constante, a equao de Ilkovic pode ser
escrita como:

i
d
= KC

em que K representa o conjunto de variveis mantidas constantes.
Esta relao direta enter corrente de difuso e concentrao usualmente adotada
mediante a determinao prvia da corrente de difuso de soluo padro de referncia, de
concentrao conhecida. Em seguida, sob condies idnticas, determina-se a corrente de
difuso da amostra e, finalmente, sua concentrao:

(i
d
)
P
C
P

------------ = -------
(i
d
)
A
C
A


em que P e A correspondem, respectivamente, a padro e amostra.
Uma vez que polagrgrafos, em sua maioria, so dotados de registradores automticos,
mais fcil determinar graficamente correntes de difuso pela medida com auxlio de rgua da
altura da onda polarogrfica (ver Fig. 1). Os valores anotados, em cm, podem ser diretamente
aplicados frmula, sem necessidade de sua converso em unidades de corrente eltrica:

A
P
C
P

--------- = ----------
A
A
C
A


em que A
P
e A
A
correspondem s alturas das ondas polarogrficas do padro e da amostra,
respectivamente.

Potencial de meia-onda

A medida da altura da onda polarogrfica para fins de anlise quantitativa deve ser
efetuada traando-se linhas retas rentes aos picos das oscilaes da corrente residual e da
corrente limite e unindo-se, por meio de terceira resoluo ao paralela ao eixo das abcissas, os
prolongamentos das duas primeiras. A reta vertical traada passando pelo ponto de inflexo da
onda polarogrfica, correspondendo metade da distncia entre a corrente residual e a corrente
limite (I = 1/2i
d
).

A projeo desta reta sobre o eixo das ordenadas fornece o chamado potencial de meia-onda,
parmetro empregado para caracterizar substncias eletroativas (aspecto qualitativo da
polarografia). O potencial de meia-onda. E
1/2
, dado em volts versus ECS (eletrodo de
referencial), salvo quando houver especificao diferente , e seu valor como parmetro de
identificao decorre de sua independncia da concentrao e caractersticas do EMG.
Entretanto, varia em funo da composio, pH e temperatura do meio eletroltico.

Remoo de oxignio

O oxignio reduzido no EMG em duas etapas, convertendo-se inicialmente em perxido
de hidrognio e, em seguida, em gua. O fato de tais reaes ocorrerem em potenciais mais
negativos que zero volts, versus ECS, podendo assim interferir com a onda polarogrfica da
amostra, torna necessrio eliminar o gs dissolvido no soluo previamente determinao. A
melhor forma consiste em borbulhar nitrognio isento de oxignio atravs da soluo durante um
perodo de 10 a 15 minutos imediatamente antes do ensaio, tomando a precauo de
previamente saturar o nitrognio (para evitar alteraes na soluo eletroltica devidas
evaporao) borbulhando-o atravs de pequeno volume de soluo eletroltica em recipiente
separado.
importante manter a cuba eletroltica parada e sem vibraes durante o registro
polarogrfico com o intuito de se evitar a formao de correntes de conveco. Em conseqncia,
Vigilncia Sanitria Digital 83

necessrio retirar o tubo de nitrognio da soluo durante o registro. Solues alcalinas podem
ser desoxigenadas pela adio de bissulfito de sdio, desde que este no interaja com
integrantes da soluo eletroltica.

Mximo polarogrfico

Efetuada a reduo da espcie eletroativa (EMG catodizado), muitas vezes a onda
polarogrfica eleva-se acentuadamente antes de cair, de forma igualmente acentuada, at o valor
da corrente limite. O fenmeno denominado mximo polarogrfico e a corrente correspondente
recebe o nome de corrente de adsoro (i
a
). Traz o inconveniente de dificultar a medida da onda
polarogrfica (corrente de difuso) e suas causas, ainda pouco esclarecidas compreendem a
adsoro de eletrlito superfcie da gota de mercrio. A eliminao do mximo polarogrfico ,
contudo, facilmente efetuada mediante adio de quantidades diminutas de determinados
tensoativos (supressores de mximo) ao meio eletroltico. Sobressaem, para tal fim, soluo de
gelatina a 0,005% (p/V) e soluo de vermelho de metila a 0,01% (p/V), entre outras.

Advertncia

Vapores de mercrio so txicos. Ao manusear o metal, trabalhar em rea ventilada e
evitar derrames que, caso ocorram, devem ser imediatamente e cuidadosamente recolhidos.

POLAROGRFIA DE PULSO

Polarogrfia de pulso consiste em variante de tcnica, superior, pela preciso e
sensibilidade , polarogrfia de corrente contnua no doseamento e na identificao de elevado
nmero de substncias em baixas concentraes, incluindo elementos de trao, metablicos e,
evidentemente, frmacos. Sua sensibilidade, cerca de 10 vezes mais elevadas que a da
polarogrfia contnua, permite doseamentos na faixa de 10
-6
m.
Em lugar da aplicao linearmente progressiva de potencial e medida contnua da
corrente desenvolvida, a polarogrfia de pulso compreende a aplicao de pulsos de potencial
crescente ao EMG, coincidentes com o perodo final da vida das gotas de mercrio, cada pulso
apresentado potencial ligeiramente superior ao anterior. A corrente, por sua vez, amostrada no
instante final de durao do pulso de potencial, perodo no qual a corrente capacitiva adquire
valor praticamente nulo e a corrente residual se compe quase que exclusivamente de corrente
fardica. Por outro lado, a tcnica de pulsos no provoca diminuio acelerada da camada da
difuso (concentrao de espcie eletroativa junto ao eletrodo), propiciando a obteno de
correntes de difuso mais elevadas para concentraes equivalentes. Da o aumento de
sensibilidade inerente tcnica. Outro aspecto favorvel da polarografia de pulso a maior
facilidade na medida da corrente limite, isenta de oscilaes, no contrrio do que ocorre na
polarogrfia de corrente contnua.

Na polarogrfia de pulso diferencial, pulsos constantes, de pequena amplitude, so
sobrepostos a uma rampa de potencial de tenso linearmente crescente. A medida da corrente
efetuada duas vezes a cada pulso imediatamente antes da aplicao do pulso e, novamente,
em seu instante final registrando-se apenas a diferena entre os dois valores medidos (Fig. 2).
O registro grfico deste sistema de medida diferencial fornece curva semelhante derivada da
onda polarogrfica, mostrando pico caracterstico (Fig. 3). O potencial do pico polarogrfico
corresponde a E
1/2
- AE/2, em que AE representa a altura do pico. A polarogrfia de pulso
diferencial propicia, graas natureza do polarizaram, que apresenta picos em vez de ondas
polarogrficas tradicionais, resoluo mais elevada, a ponto de permitir doseamentos simultneos
de espcies eletroativas com potenciais de meia onda prximos entre si, em concentraes da
ordem de 10
-7
m.








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Fig. 3 Pico polarogrfico obtido na
polarografia de pulso diferencial
















Fig. 2 Medida de corrente em relao ao tempo na
polarografia de corrente contnua (A); na polarografia de
pulso (B) e na polarografia de pulso diferencial (C).


V.2.19. DETERMINACO DO pH

DETERMINAO POTENCIOMTRICA DO pH

A determinao potenciomtrica do pH feita pela medida da diferena de potencial entre
dois eletrodos adequados, imersos na soluo em exame. Um destes eletrodos sensvel aos
hidrogeniontes e o outro o eletrodo de referncia, de potencial constante.
A equao que expressa a medida potenciomtrica de uma clula :

pH = pH
t
+ (E - E
t
)/K

em que
E = potencial medido quando a clula contm a soluo problema,
E
t
= potencial medido quando a clula contm a soluo tampo,
PH = valor do pH da soluo problema,
pH
t
= valor do pH da soluo tampo, e
K = variao do potencial por unidade de variao de pH teoricamente eqivale a 0,0591631
+ 0,000198 (t 25), em que t corresponde temperatura na qual se opera.

Os aparelhos comercialmente utilizados para a determinao do pH so instrumentos
potenciomtricos, providos de amplificadores eletrnicos de corrente com clula de vidro
calomelano. Estes so capazes de reproduzir valores correspondentes a 0,02 de unidades de pH.
A escala de pH calibrada no s em milivoltz, como tambm em unidades correspondentes de
pH. Dessa forma, no h necessidade de se aplicar a equao acima, que traduz a medida
eletromtrica de pH. Uma vez que as medidas de atividades hidrogeninica so sensveis a
variaes de temperatura, todos os medidores de pH so equipados com ajuste eletrnico de
temperatura.

Solues tampo para calibrao do medidor de pH

So empregadas visando aferio do aparelho, permitindo linearidade nas respostas
em relao s alteraes de potencial observadas. As mais importantes so : tetraoxalato de
potssio 0,05 m, biftalato de potssio 0,05 m, fosfato equimolar 0,05 m, tetraborato de sdio 0,01
m e hidrxido de clcio saturado a 25 graus centgrados.
Vigilncia Sanitria Digital 85

Valores de pH das solues-tampo na padronizao

Temperatura
graus C
Tetraoxalato
de potssio
0,05 M
Biftalato de
potssio 0,05
M
Fosfato
equimolar
Tetraborato de
sdio 0,01 M
Hidrxido de
clcio
saturada a 25
graus C
10 1,67 4,00 6,92 9,33 13,00
15 1,67 4,00 6,90 9,28 12,81
20 1,68 4,00 6,88 9,23 12,63
25 1,68 4,01 6,86 9,18 12,45
30 1,68 4,02 6,85 9,14 12,29
35 1,69 4,02 6,84 9,10 12,13
40 1,69 4,04 6,84 9,07 11,98


So preparadas da seguinte maneira

Tetraoxalato de potssio, 0,5 M Dissolver 12,61 g de KH
3
(C
2
O
4
)2, 2H
2
O em gua para
perfazer 100 ml.
Biftalato de potssio, 0,05 M Dissolver 10,12 g de KHC
8
H
4
O
4
previamente dessecado a
100 graus centgrados durante 1 hora, em gua, para perfazer 1000 ml.
Fosfato equimolar, 0,05 M Dissolver 3,53 g de Na
2
HPO
4
e 3,39 g de KH
2
PO
4
cada qual
dessecado a 120 graus centgrados durante 2 horas, em gua, para perfazer 1000 ml.
Tetraborato de sdio, 0,01 M Dissolver 3,80 g de Na
2
B
4
O
7
. 10H
2
O, em gua, para
perfazer 1000ml. Evitar absoro de dixido de carbono.
Hidrxido de clcio, saturado a 25 graus centgrados Agitar excesso de hidrxido de
clcio com gua e decantar 25 graus centgrados antes de usar. Proteger de modo a evitar
absoro de dixido de carbono.
Tais solues devem ser recm preparadas com gua isenta de dixido de carbono e
empregadas em prazo de trs meses, tomando-se cautela para evitar o crescimento de fungos e
bactrias. Aceita-se o emprego de conservantes desde que no interfira na medio
potenciomtrica do pH.

MODO DE OPERAO

Aferio do aparelho

1. Retirar o bquer contendo soluo de KCI na qual est mergulhado eletrodo quando o
medidor no est em uso;
2. Lavar o eletrodo com jatos de gua destilada e enxug-lo com papel de filtro;
3. Imergir o eletrodo em soluo-tampo de referncia, verificando-se a temperatura em
que se vai operar;
4. Ajustar o valor de pH at o valor tabelado, mediante o boto de calibrao;
5. Lavar o eletrodo com vrias pores de um segundo tampo de referncia, imergir o
eletrodo neste e verificar o valor de pH registrado. Este no deve apresentar variaes que
superem 0,07 (mais ou menos 0,07) do valor tabelado para este segundo padro. Vale dizer que
existem determinados aparelhos que possuem aclopados frascos com detergentes aninicos,
empregados como solues de lavagem entre cada uma das operaes de determinao ou
aferio dos valores de pH. A gua tambm se presta a esta funo;
6. Se no houver preciso nas medidas, verificar possveis danos nos eletrodos e troc-
los.

Determinao do pH da soluo-problema

1. Aps aferio conveniente , lavar o eletrodo com gua (ou solues prprias) e com
vrias pores da soluo problema. Para diluio das amostras, usar gua destilada isenta de
dixido de carbono;
2. A primeira determinao fornece valor varivel, havendo necessidade de proceder a
novas leituras. Os valores encontrados posteriormente sero mais constantes. Em certas
Vigilncia Sanitria Digital 86
solues, bastam trs alquotas do material para que se obtenham valores confiveis, isto , com
variao de mais ou menos 0,04 de unidades. Para solues diludas, so necessrias seis
determinaes para que a variao no exceda mais ou menos 0,05 de unidades;
3. Para determinaes que exijam alta preciso, as temperaturas das solues-tampo e
problema, dos eletrodos e das guas de lavagem no devem diferir acima de 2 graus centgrados
entre si. Assim, para que se reduzam os efeitos de histerese trmica ou eltrica dos eletrodos, as
solues devem estar mesma temperatura por, no mnimo, duas horas antes do incio da
operao;
4. importante que, aps a utilizao do aparelho, se conserve o eletrodo em soluo
apropriada, normalmente de KCL.

DETERMINAO COLORIMTRICA DO pH

Baseia-se no emprego de solues indicadoras ou de papis indicadores, que tm a
propriedade de mudar de colorao conforme a variao do pH. Neste caso trata-se de medida
aproximada, indicando, apenas, uma faixa de valores, mais ou menos larga, conforme o indicador
empregado. A determinao levada a efeito adicionando-se gotas da soluo indicadora
soluo em exame ou umedecendo-se a com esta soluo papis indicadores e observando-se a
mudana de colorao. As cores desenvolvidas pelos indicadores em diversas faixas de pH
constam do anexo XII.1.

V.2.20. DETERMINAO DE GUA

Diversa substncias farmacopicas encontram-se na forma hidratada ou contm gua
absorvida, tornando relevante o estabelecimento de teores-limite e sua determinao em ensaio
de especificao. Trs mtodos so descritos volumtrico, destilao azeotrpica e gravimtrico
- , sendo recomendada para cada substncia a adoo do mtodo especificado na respectiva
monografia.

V.2.20.1. MTODO VOLUMTRICO

Baseia-se reao quantitativa entre a gua e soluo anidra de iodo e dixido de enxofre
dissolvidos em piridina e metanol. A amostra pode tanto ser titulada diretamente (mtodo direto)
como tanto por retorno (mtodo indireto). No ltimo caso, incorpora-se excesso de reagente
amostra e, aps guardar-se o tempo necessrio reao quantitativa, titula-se o excesso de
reagente com soluo padro de gua em metanol. Esta tcnica de uso irrestrito
especialmente recomendada para substncias que liberam lentamente seu contedo de gua.

APARELHO

Admite-se o emprego de qualquer equipamento que permita a excluso adequada da
umidade atmosfrica e a determinao do ponto final da titulao.
Para substncias incolores, possvel detectar-se o ponto de equivalncia pela mudana
de cor do reagente, de amarelo-canrio para mbar. Viragem inversa observada ao se adotar
atitulao por retorno. Todavia, mais freqente e preciso determinar-se o final da titulao
eletrometricamente. Compreende o uso de dispositivo eltrico capaz de gerar diferena de
potencial de 220 mV entre dois eletrodos de platina (rea e distanciamento da ordem de
5 mm
2
e 2,5 cm, respectivamente) imersos na soluo a titular. Ao ser atingido o ponto de
equivalncia, ligeiro excesso de reagente provoca elevao brusca do fluxo de corrente para 50 a
150 A durante 30 segundos a 30 minutos, substncia solvel no reagente).

Reagente de Karl Fisher

Adicionar 125 g de iodo mistura de 670 ml de metanol e 170 ml de piridina e resfriar.
Transferir 100 ml de piridina para proveta de 250 ml e, mantendo a piridina fria em banho de gelo,
passar corrente de dixido de enxofre atravs do solvente at que seu volume atinja 200 ml.
Juntar, lentamente e sob agitao, esta soluo mistura de iodo fria previamente preparada.
Misturar at dissoluo do iodo e aguardar 24 horas antes de padronizar. Quando recm-
preparada, a soluo reagente neutraliza cerca de 5 mg de gua/ml, mas deteriora-se com
rapidez. Da a convenincia de sua padronizao at uma hora antes de usar ou diariamente,
Vigilncia Sanitria Digital 87
quando em uso contnuo. Proteger da luz quando em uso. Armazenar o reagente sob refrigerao
em frasco mbar, provido de tampa esmerilhada hermtica. Como opo ao preparo do reagente,
pode-se recorrer a solues reagentes comerciais.

Padronizao do reagente

Colocar quantidade suficiente de metanol no frasco de titulao para cobrir os eletrodos e
adicionar quantidade suficiente de reagente para fornecer a cor caracterstica da viragem ou a
indicao de 100 150 A CC no microampermetro quando da aplicao de 200 mV entre
eletrodos.
Na determinao de traos de gua (menos de 1%), empregar tartarato de sdio
diidratado (C
4
H
4
Na
4
O
6
. 2H
2
O) cujo teor de gua aps secagem a 150 graus centgrados durante
3 horas corresponde a 15,66 % - como padro de referncia. Rapidamente, juntar 150 a 350 mg
de sal, exatamente pesados, ao frasco de titulao e titular at o ponto de equivalncia. O ttulo
do reagente, em mg de gua/ml de reagente, fornecido pela equao

2 (18,2 / 230,08) (P/V)

em que

18,2 = peso molecular da gua,
230,08 = peso molecular do tartarato de sdio diidratado,
P = massa, em mg, da tomada de ensaio de sal,
V = volume, em ml, de reagente consumido na titulao.

Para a determinao precisa de quantidades significativas de gua (mais de 1%), usar
gua como referncia. Rapidamente, transferir 25 a 250 mg de gua, exatamente pesados por
diferena, para o frasco de titulao e titular at o ponto de equivalncia. Calcular o ttulo do
reagente, T, em mg de gua e V o volume, em ml, de reagente consumido.

Padronizao de soluo padro de gua (mtodo indireto)

Preparar soluo de gua em metanol, diluindo 2 ml. Padronizar esta soluo titulando
alquota de 25 ml com reagente previamente padronizado conforme o procedimento acima.
Calcular o contedo de gua, em mg/ml de soluo, pela frmula

(V x T) / 25

em que

V = volume, em ml, de reagente consumido,
T = ttulo do reagente, em mg/ml.

PROCEDIMENTO

Determinar teores de gua pelo mtodo direto, salvo, quando houver especificao
diversa na monografia.

Mtodo direto. Salvo quando a monografia especificar de modo diverso, transferir 35 a 40
ml de metanol para frasco de titulao e titular com o reagente padronizado at viragem visual ou
eletromtrica, com o intuito de eliminar a gua presente como impureza no metanol
(desconsiderar o volume consumido, pois ele no entra nos clculos). Rapidamente, adicionar ao
frasco quantidade exatamente pesada de amostra, tal que contenha 10 a 250 mg de gua (ou a
quantidade especificada na monografia), misturar e titular at viragem visual ou eletromtrica.
Calcular o contedo de gua, em ml, na tomada de ensaio pela frmula (V x T) em que V o
volume, em ml, de reagente consumido e T o ttulo do reagente.
Mtodo indireto (por retorno). Quando a monografia assim especificar, transferir 35 a 40
ml de metanol ao frasco de titulao e titular com o reagente padronizado at viragem visual ou
eletromtrica, com o intuito de eliminar a gua presente como impureza no metanol
(desconsiderar o volume consumido, pois ele no entra nos clculos). Rapidamente, adicionar ao
Vigilncia Sanitria Digital 88
frasco quantidade exatamente pesada de amostra tal que contenha 10 a 250 mg de gua,
misturar e juntar volume exatamente medido de reagente, sendo este volume superior ao
necessrio para a neutralizao da gua presente na tomada de ensaio. Deixar em repouso pelo
tempo necessrio para que a reao se complete e titular o excesso de reagente com soluo-
padro de gua, at viragem visual ou eletromtrica. Calcular o contedo, em mg, de gua na
tomada de ensaio pela frmula.

T [V - (V x R)]

em que
T = ttulo do reagente
V = volume em ml, do reagente adicionado em excesso aps a incorporao da tomada de
ensaio,
V = volume, em ml, de soluo-padro de gua necessrio neutralizao do excesso de
reagente,
R = volume, em ml, de reagente por ml de soluo-padro de gua, determinado na
padronizao desta ltima.

Caso a monografia especifique, calcular o teor de gua em porcentagem.

V.2.20.2. MTODO DA DESTILAO AZEOTRPICA

A semelhana do mtodo volumtrico, o azeotrpico permite a determinao de gua
contida em amostras de natureza mltipla. A gua presente destilada com tolueno solvente
com o qual praticamente imiscvel e separada em tubo receptor apropriado aps resfriamento.
Convm, contudo, empregar tolueno previamente saturado com gua para evitar resultados
baixos devido dissoluo de gua residual no solvente anidro.

APARELHO

Empregar o aparelho proposto por Dean e Stark (Figura). Compreende balo de fundo
redondo. A, com 500 ml de capacidade, conectado pelo tubo cilndrico D ao tubo receptor B. Este
tem capacidade para 5 ml, graduado com subdivises de 0,1 ml, assegurando erro de leitura
no superior a 0,05 ml e pode, opcionalmente, ser provido de torneira. A parte superior do tubo D
liga-se sempre por meio de juntas esmerilhadas ao condensador de refluxo vertical C. Parte
do balo e do tubo D podem ser guarnecidas com tecido de amianto para maior isolamento
trmico. O calor para a destilao deve preferivelmente ser fornecido por aquecedor eltrico
dotado de controle por reostato ou banho de leo.























Vigilncia Sanitria Digital 89

Aparelho para determinao de gua pelo mtodo azotrpico


PROCEDIMENTO

Limpar o tubo receptor e condensador com mistura sulfocrmica, enxaguar com gua e
secar em estufa. Introduzir no balo seco 200 ml de tolueno e cerca de 2 ml de gua e destilar
durante 2 horas. Resfriar e, aps cerca de meia hora, medir o volume de gua acumulado no tubo
graduado. Adicionar ao balo quantidade de amostra tal que contenha 2 a 3 ml de gua.
Apresentando a substncia natureza pastosa, embrulh-la em folha de alumnio fazendo pacote
de dimenso apropriada sua passagem pelo gargalo do frasco. Se a substncia induzir
borbulhamento, juntar areia lavada e seca em quantidade suficiente para cobrir o fundo do frasco
(opcionalmente, juntar alguns cacos de material cermico poroso ou tubos capilares de vidro, do
tipo empregado para determinao de ponto de fuso, vedados em uma das extremidades por
fuso) com o intuito de regularizar e ebulio.
Aquecer moderadamente o frasco contendo tolueno e amostra durante 15 minutos e,
quando o tolueno comear a destilar, regular o aquecimento para que destilem 2 gotas por
segundo. Destilada praticamente toda a gua, acelerar a velocidade de destilao para 4 gotas
por segundo. Concluda a destilao da gua, verter cerca de 10 a 15 ml de tolueno pela boca do
condensador de refluxo e prosseguir a destilao durante 5 minutos adicionais. Remover, ento, a
fonte de energia, aguardar o resfriamento do tubo receptor temperatura ambiente e deslocar
eventuais gotculas de gua retidas na parede do tubo receptor com auxlio de arame de cobre
com extremidade envolta em ... . Uma vez concluda a separao das fases, ler o volume de gua
no tubo receptor (descontando o volume inicial)e calcular porcentagem de gua na tomada de
ensaio.

V.2.20.3. MTODO GRAVIOMTRICO

Para substncias qumicas, adotar as especificaes da monografia, seguindo o
procedimento descrito em V.2.9. Drogas vegetais devem ser preparadas e ensaiadas conforme as
instrues em V.4.2.3. Para substncias biolgicas, por sua vez, proceder conforme indicado na
monografia.

V.2.21. ANLISE DE SOLUBILIDADE POR FASES

A solubilidade de substncias puras em dado solvente, temperatura constante,
parmetro caracterstico da substncia, podendo, pois, servir para fins de identificao e
avaliao de grau de pureza. Neste princpio, baseia-se a anlise de solubilidade por fases. O
procedimento consiste na adio de pores crescentes de amostra a volumes constantes de
solvente no qual a substncia analisada mostra apenas ligeira solubilidade, visando obteno
de soluo saturada desta substncia. Uma vez promovido o equilbrio do sistema por agitao
prolongada, sob temperatura constante determina-se contedo total de soluto na soluo
sobrenadante (geralmente por tcnica gravimtrica) e traa-se diagrama de solubilidade por
fases, plotando a composio da soluo, em mg de soluto por g de solvente (ordenadas) pela
composio do sistema, em mg de amostra adicionada por g de solvente (abcissas).
A Fig. 1 ilustra diagrama deste tipo. Ao longo do segmento AB, a totalidade de slido
dissolve e encontrada na soluo (inclinao correspondente a unidade). No ponto B a amostra
satura a soluo e adies subsequentes no acarretam aumento de sua concentrao. A
inclinao do segmento de reta BC , portanto, nula e a interseco do prolongamento desta reta
com o eixo dos Y fornece o valor da solubilidade da substncia.











Vigilncia Sanitria Digital 90




Fig. 1 Diagrama de solubilidade por fases de amostra constituda por uma s substncia.


Se a amostra for constituda de duas substncias (uma delas impureza de outra, por
exemplo), o diagrama assume a forma ilustrada na Fig. 2. O segmento AB apresenta inclinao
unitria, o ponto B indica saturao da soluo com relao a um dos componentes da amostra
(geralmente aquele que est presente em maior proporo), o segmento BC indica a solubilizao
do segundo componente e o segmento CD a saturao da soluo com este ltimo (inclinao
nula).
O valor da inclinao do segmento BC fase em que somente o segundo componente
solubilizado corresponde proporo deste componente na amostra. A subtrao deste valor
da unidade fornece o contedo do primeiro componente na amostra, permitindo o emprego da
frmula (1 I) . 100 para a obteno do teor. A inclinao, I obtida pela frmula (Y
2
Y
1
) / (X
2

X
1
), em que Y
1
, Y
2
, X
1
, X
2
correspondem, respectivamente, as projees de pontos do segmento
de reta BC sobre a ordenada (composio da soluo) e a abcissa (composio do sistema). A
extrapolao do segmento BC fornece o limite de solubilidade, S
1
, em mg de soluto por g de
solvente, do primeiro componente, enquanto, o prolongamento da reta do segmento CD at o eixo
dos Y leva soma das solubilidades dos dois componentes, S
1
+ S
2
.















Fig. 2 Diagrama de solubilidade por fases de amostra contendo duas substncias.


A ocorrncia de desvios pronunciados nos pontos que constituem os segmentos de reta
do diagrama indica falta de equilbrio no sistema, embora estes tambm possam ser atribudos
existncia de soluo slida ou a desvios do comportamento terico. Se necessrio a inclinao I
pode ser calculada por aproximao grfica ou a partir do mtodo estatstico dos mnimos
quadrados.
Uma particularidade da na anlise de solubilidade por fases no ser tcnica aplicvel a
misturas cujos componentes esto presentes na amostra na proporo de suas solubilidades.
Neste caso particular, ambos os componentes promovem saturao no mesmo ponto,
fornecendo, como resultado, diagrama de fases equivalentes ao da substncia pura.

ESCOLHA DE SOLVENTE

A escolha de solvente para anlise de solubilidade por fases baseada na solubil idade
do componente presente em maior proporo na amostra e no mtodo de doseamento adotado
para a determinao da concentrao da soluo formada. Sendo mais usual a tcnica
gravimtrica, convm ao solvente apresentar volatilidade suficiente para permitir sua evaporao
a vcuo, mas insuficiente para dificultar operaes de transferncias e pesagens. Recomenda-se
solventes como ponto de ebulio entre 60 a 150 graus centgrados. Em termos de solubilidade,
conveniente que o solvente apresente capacidade de solubilizao de amostra em proporo no
inferior a 4 mg/g nem superior a 50 mg/g. A solubilidade tima compreende a faixa de 10 a 20 mg.

Vigilncia Sanitria Digital 91
Recomendaes adicionais incluem a inrcia do solvente frente aos componentes da
amostra (prevendo-se, inclusive a possibilidade de formao de solvatos ou sais) e o emprego de
solvente de pureza e concentrao conhecida (traos de impurezas afetam intensamente a
solubilidade), admitindo-se, contudo, o emprego de misturas.

APARELHAGEM

Compreende banho-maria termostatizado, frascos e ampolas apropriadas e balana
analtica, com preciso de mais ou menos 10 g.
O banho de gua provido de termostato com tolerncia de controle de temperatura no
superior a 0,1 graus centgrados, especialmente na faixa de 25 30 graus centgrados, usual
para os ensaios. O banho equipado com haste horizontal rotativa (25 rpm) provida de garras
fixadoras para as ampolas. Como alternativa, pode ser usado vibrador (100 a 120 vibraes /
segundo) igualmente provido de garras fixadoras de ampolas.
A ampola com capacidade para 15 ml , ao lado chamado frasco de solubilidade
tambm empregado nos ensaios, est ilustrada na Fig. 3. Recipientes de especializaes
diferentes so admissveis desde que hermticos e apropriados tcnica descrita.






















Fig. 3 Ampola utilizada na anlise de solubilidade por fases.

PROCEDIMENTO

Composio de sistema

Pesar com exatido um mnimo de 7 ampolas de 15 ml rigorosamente limpas. Transferir
quantidades crescentes exatamente pesadas de amostra para cada ampola, de modo que a
primeira contenha quantidade apenas ligeiramente menor que a solubilizvel em 5 ml de solvente
e a ltima contenha ligeiro excesso de amostra. Aps transferir 5,0 ml de solvente para cada
ampola, resfri-las em mistura de gelo seco e acetona e sel-las com maarico ar/gs, tomando a
precauo de guardar fragmentos de vidro resultantes do processo.
Permitir s ampolas atingir a temperatura ambiente e pes-las, juntamente com seus
respectivos fragmentos de vidro. Calcular a composio do sistema, em mg/g, para cada ampola,
pela frmula: 1000 (M
2
M
1
) / (M
3
M
2
), em que M
2
corresponde massa da ampola contendo
amostra, M
1
a massa da ampola vazia e M
3
a massa da ampola contendo amostra, solvente e
eventuais fragmentos de vidro.

Equilbrio

O perodo necessrio ao estabelecimento de equilbrio nos sistemas contidos nas
ampolas varivel de acordo com a natureza da amostra, mtodo de agitao (rotao ou

Vigilncia Sanitria Digital 92
vibrao) e temperatura. A experincia indica prazo mdio de 1 a 7 dias para agitao por
vibrao e 7 a 14 dias para o processo rotacional. Para confirmar a promoo de equilbrio,
aquecer a penltima ampola da srie a 40 graus centgrados com o intuito de obter
supersaturao. O resultado positivo se o ponto correspondente a esta ampola for coerente com
os demais no diagrama de fases. Todavia, resultado diverso no significa necessariamente no
ter sido atingido o equilbrio. H substncias com tendncia a permanecer em soluo
supersaturada e, sendo este o caso, cabe a e3xecuo de srie de anlises, variando-se o
perodo de espera com o fim de assegurar a coerncia dos pontos da curva de solubilidade.

Composio da soluo

Atingido o equilbrio, colocar as ampolas em suporte apropriado para que permaneam
em posio vertical, com os gargalos acima do nvel da gua do banho termostatizado. Aguardar
a decantao dos slidos nas ampolas, abri-las e coletar 2,0 ml de cada uma por meio de pipeta
provida de chumao de algodo ou de outro material capaz de atuar como filtro. Remover o
material filtrante da pipeta e transferir o lquido lmpido para frasco de solubilidade (Fig. 3) tarado
e devidamente identificado, pesando cada frasco aps a operao. Esfriar os frascos em banho
de gelo seco e acetona e, em seguida, evaporar o solvente sob presso reduzida. Aumentar
gradativamente a temperatura de evaporao, tomando a precauo de no exceder o limite
compatvel com a estabilidade da amostra e dessecar o resduo at o peso constante. Calcular a
composio da soluo em cada frasco, em mg/g, pela frmula 1000 (P
3
P
1
)/(P
2
P
3
), em que
P
3
corresponde massa do frasco contendo o resduo da evaporao , P
1
a massa do frasco de
solubilidade vazio (tara) e P
2
a massa do frasco contendo a soluo.
Traar diagrama de fases com base nos valores obtidos e determinar a pureza
percentual da amostra em funo da inclinao do segmento de reta.

Aplicao da anlise de solubilidade por fases na purificao de substncias

Enquanto as solues obtidas no processo analtico descrito contm essencialmente
todas as impurezas presentes na amostra em proporo aumentada em relao amostra
original, prestando-se aps evaporao do solvente determinao quantitativa das
impurezas, a fase adequada, pela elevada pureza, ao preparo de padres de referncia para
outros ensaios analticos.

PROCEDIMENTO

Pesar quantidade apropriada de amostra e suspend-la em solvente adequado de modo
a alcanado o equilbrio dissolver somente 10% do material. Fechar o frasco e aguardar
estabelecimento do equilbrio temperatura ambiente (em geral, 24 horas so suficientes). Em
seguida, recolher a soluo sobrenadante lmpida e evaporar, temperatura ambiente ou prxima
desta, at secura. Pelo fato de a soluo conter as impurezas da amostra original, obtm-se, por
este procedimento, material em que a proporo de impurezas encontra-se aumentada, sendo a
relao de enriquecimento aproximadamente igual razo da massa da amostra pela massa de
slidos dissolvidos no volume de solvente, empregado. Purificar o resduo no dissolvido por
lavagem e secagem (padro de referncia).

V.2.22. ELETROFORESE

Eletroforese consiste em tcnica de separao quantitativa para componentes de mistura
de vrias espcies inicas. Num campo eltrico unidirecional, cada on migra isoladamente,
independente dos outros ons, em direo ao plo de sinal de carga oposto ao seu, conservando
sua estrutura e suas propriedades. A mobilidade eletrofortica funo da carga eltrica do on,
do gradiente de tenso do campo e da viscosidade do meio.
A separao processa-se em suporte embebido em lquido tamponado de pH constante
ou de gradiente de pH, que se coloca dentro de cuba adequada. Os suportes recomendados so:
papel de filtro, acetato de celulose, gel de gar ou de agarose, gel de amido, gel de poliacrilamida,
camadas porosas de vidro em p, areia, amido, cloreto de polivinila, celulose ou slica-gel.

A aparelhagem consiste em cuba fechada dentro da qual se coloca suporte com o
material a analisar entre dois compartimentos eletrdicos contendo tampo. Este recipiente
Vigilncia Sanitria Digital 93
costuma ser retangular, com dimenses de acordo com o nmero mximo de anlises
simultneas a executar. Aplicam-se tenses de corrente contnua de 100 a 300 volts para ons
grandes, de 1000 a 10000 volts para ons menores, as correntes usadas no ultrapassam 20 m/A.
A temperatura deve ser mantida constante, se necessrio por resfriamento.
Aps a separao eltrofortica, os componentes separados so identificados por mtodos
adequados. A sensibilidade, que normalmente permite detectar microgramas de substncias,
pode ser aumentada por tcnicas imunolgicas. Todas as substncias ionizveis podem ser
analisadas por eletroforese, para as no-polares indica-se a anlise cromatogrfica.

A eletroforese serve para:

a) caracterizar uma substncia pela comparao de sua mobilidade com aquela de um
padro;
b) verificar a pureza de um produto pela ausncia de contaminantes inicos de cargas
diferentes e
c) determinar as concentraes relativas dos componentes inicos de uma mistura.

A versatilidade da eletroforese permite escolher tcnicas apropriadas para cada caso
dentro de grande variedade de condies, conforme se observa nas tabelas seguintes. O
gradiente de voltagem indicado em kilovolt por metro KV/m -, onde o numerador representa a
tenso entre os eletrodos e o denominador a distncia entre eles.
Assim, uma tenso de 200 V, por exemplo, entre eletrodos distantes de 10 cm ter
gradiente de 2 KV/m. o suporte usado nestes exemplos seguintes o papel de filtro. As
mobilidades relativas formam calculadas em relao mobilidade de on mais lento (mobilidade =
1).

Tabela 1 Quadro geral

Tampo pH Material KV/m Revelador
A





A
3.6





3.6
Ctions inorgnicos
aminas
cidos orgnicos
nucleotdios
peptdeos e aminocidos
estesides hidrossolveis
vitaminas hidrossolveis
6
5
8
3
5
2
4
cido violrico
p-dimetilaminobenzaldeido
nitrato de crio amoniacal
difenilcarbezida
ninidrina
dinitrofenilidrazina
especfico para cada vitamina
B 4.9 fosfatdeos 2 motibdato de amnio
C 9.0 proteinas
pigmentos biliares
1
8
negro de anidro
cido fosfrico
D 9.0 nios inorgnicos
purinas
alcalides
monossacardeos
polissacardeos
corantes hidrossolveis
6
3
3
4
1
5
Quinidina
Difenicarbazida
Dragendortf
oxalato de anilina
vagilina
cores prprias

Vigilncia Sanitria Digital 94
Tabela 2 Preparo dos tampes

Tampo A B C D
PH
Ninidina (ml)
cido actico glacial (ml)
Acetato de sdio anidro (g)
Borato de sdio (g)
Barbitol (g)
metanol (ml) a s p.
gua destilada (ml) q s p
3.6
10
100
-
-
-
-
1.000
4.9
100
100
4.1
-
-
1.000
-
9.0
-
-
-
-
8.24
-
1.000
9.0
-
-
-
6.4
-
-
1.000

Tabela 3 Ctions inorgnicos Tampo A

Mobilidades relativas
As *** 1
Ag * 5
Fe *** 10
Pb ** 11
Cu ** 19
Ca ** 23
Cd ** 28
Pd ** 36
Al *** 39
Zn ** 43
Ni ** 45
Co ** 54
Mn ** 55
Mg ** 57
Fe ** 62

Tabela 4 Aminas Tampo A

Glicina 1.0
Mescalina 6.0
Arginina 6.2
Histidina 6.5
Lisina 6.5
Gramina 6.8
Ornitina 7.0
Tiramina 7.2
Efedrina 8.0
Creatina 9.2
Fenetilamina 10.2
Histamina 14.5
Propilamina 15.2
Cadaverina 16.0
Putrescina 16.8
Etilamina 18.0
Dimetilamina 20.2
Metilamina 23.0
Amnia 25.0

Tabela 5 cidos orgnicos Tampo A

6-aminolevulinato 1.0
hidroxibutirato 7.8
glutarato 8.2
succinato 9.4
oxalato 10.6
lactaso 12.9
malato 14.7
galacturonato 14.7
levulinato 15.5
maleato 19.0
citrato 20.0
tartarato 21.7

Tabela 6 Nucleotdeos Tampo A

cido citidlico
cido adenilico
cido guanflico
cido utidilico
( C )
( A )
( G )
( U )
1.0
2.9
5.9
6.2
AA
GC
CU
AG
4.4
5.3
5.6
6.8
AU
GG
GU
UU
7.1
9.1
9.4
9.6
ACC
AAC
GCC
ACG
3.4
4.7
5.5
6.8
ACU
AAG
AGG
AUU
7.1
8.1
10.2
10.7

Tabela 7 Aminocidos Tampo A

cido asprtico 1.0
cido glutmico 2.8
taurina 4.1
tudroxiprolina 4.6
cistina 4.8
asparagina 5.0
prolina 5.1
metionina 5.3
glutamina 5.3
tirosina 5.5
fenitalanina 5.5
triptofano 5.7

serina 5.7
citrulina 5.7
leucina 5.9
lsoleucina 5.9
treonina 5.9
velina 6.2
Alamina 6.6
glicina 7.0
arginina 17.6
histidina 18.0
lisina 18.0
ornitina 18.1
histamina 20.8

Tabela 8 - Tampo D

Estrona 1.0
Lestosterona 1.4
Metitestosterona 1.5
Desoxicortona 1.6
Androsterona 1.7
Progestorona 1.9

Tabela 9 Vitaminas Tampo A

fosfato de piridoxal 1.0
difosfato de tiomina 6.6
cido nicotnico 9.8
monofosfato de tiamina 10.3
Vigilncia Sanitria Digital 95
cido ascrbico 7.1
fosfato de piridoxamina 8.1
riboflavina 8.9
nicotinamida 19.9
piridoxina 22.6
tiamina 23.7

Tabela 10 Protenas humanas Tampo C

gama globulina 1.0
beta globulina 1.7
2-alfa globulina 2.2
1-alfa globulina 2.7
albumina 3.5

Tabela 11 nions inoprgnicos Tampo D

periodoto 1.0
borato 3.0
telurato 3.5
telurito 4.4
iodato 4.6
metufosfato 5.1
ortofosfato 5.4
matavanadato 5.5
molibdato 5.6
tiocianato 5.8
fluoreto 6.1
bromato 6.1
sulfito 6.4
ferricianeto 6.6
clorato 6.9
sulfato 7.1
persulfato 7.3
cloreto 7.3
iodeto 7.4
brometo 7.6
nitrito 7.6
nitrato 7.6
ferrocianeto 7.7
tiosulfato 7.8

Tabela 12 Alcalides Tampo D

papaverina 1.0
colchicina 1.6
ioimbina 2.9
estricina 2.9
brucina 3.6
quinina 4.0
cinchonina 4.4
pilocarpina 7.7
herona 4.8
morfina 5.0
escopolamina 5.4
tubocurarina 5.6
nicotina 6.7
cocana 6.7
mescalina 8.1
homatropina 8.1
etropina 8.2
efedrina 9.3

Tabela 13 Sacardeos Tampo D

Sacarose 1.0
Maltose 1.9
Lactose 2.3
Glicerol 3.1
D-manose 4.3
D-ribose 4.7
D-sorbitol 5.2
D-frutose 5.6
l-arabinose 5.7
D-manitol 5.7
D-.galactose 5.8
L-sorbose 6.1
D-glicose 6.2
D-xilose 6.3

Tabela 14 - Preparo de reveladores


cido violrico
Contm 1,75 g de cido volrico (C4H3N3O4) em gua a 100.0ml.

p.Dimetilaminobenzaldedo
Contm 1.0 g de p.dimetilaminobenzaldedo (C9H11NO) em 90.0ml de acetona e 10.0ml de cido clordrico.

Nitrato de crio-amoniacal
Contm 2.0 g de nitrato de crio-amoniacal (NH4)2 Ce (NO3)6 em cido ntrico 1 M a 100.0ml.

Difenilcarbazida
Borrifar com soluo 0.2g por cento (p/v) de sulfato cprico (CuSO4.SH2O) e secar a 100
o
C.
Expor durante 5 minutos a vapores de amonaco e tratar em seguida com soluo 0.1h por cento (p/v) de
difenilcarbazida em etanol

Ninidrina
Dissolver 0.4 g de ninidrina de cloreto cobaltoso (CoCl2. 6H2O) em isopropanol a 100.0ml.

Dinitrofenilidrazina
Misturar 0.3 g de 2.4 dinitrofenilidrazina e 0.3ml de cido clordrico em metanol a 100.0ml.

Molibdato de amnio
Dissolver 0.085 g de molibdato de sdio (Na2MoO4. 2H2O) e 0.040g de sulfato de hidrazina em 10 ml degua. Juntar
10 ml de cido sulfrico e completar com gua a a 100.0 ml.

Negro de amido
Dissolver 0.5g de negro de amido (C22H14N6O9S2Na2) em 48ml de metanol. Juntar 5 ml de cido actico glacial e
completar com gua a 100 ml.

cido fosfrico
cido ortofosfrico e 15.0 por cento (v/v).

Quinidina
Vigilncia Sanitria Digital 96
Dissolver 0.3g de quinidina (C20H24N2O2) em clorofrmio a 100.0ml.

Dragendortf
Dissolver 1.7 g de nitrato bsico de bismuto e 20 g de cido tartrico em 80 ml de gua. Antes do uso, misturar 4ml
desta soluo com 2 ml de soluo de iodeto de potssio a 4.0 por cento (p/v). Juntar 12 g de cido tartrico e 60
ml de gua.

Oxalato de anilina
Dissolver 1.3 g de cido oxalato co (C2H2O4. 2H2O) e 0.9 ml de anilina em gua a 100.0 ml.

Vanilina
Misturar antes do uso a soluo etanlica de vanilina (C3H2O3) a 1.0 por cento (p/v) com volume igual de cido
perclrico a 3.0 por cento (p/v).


V.3. MTODOS QUMICOS

V.3.1.REAES DE IDENTIFICAO

V.3.1.1. ONS, GRUPOS E FUNES

Os mtodos clssicos de identificao de funes ou determinados grupos qumicos
presentes em frmacos consistem em reaes que resultam em formao de precipitado, produto
colorido, desprendimento de gs, descoramento do reagente usado ou outro fenmeno qualquer
facilmente perceptvel. Estes ensaios no so aplicveis a misturas de frmacos.

Acetato

1) aquecer a amostra com quantidade igual de cido oxlico, desprendem-se vapores
cidos com odor caracterstico de cido actico.
2) Aquecer a amostra com cido sulfrico SR e etanol, desprendem-se acetato de etila,
de odor caracterstico.
3) Tratar soluo neutra da amostra com cloreto frrico SR, produz-se cor vermelho-
escura, que desaparece pela adio de cidos minerais.
4) Dissolver a amostra em gua, adicionar 5 gotas de nitrato de lantnio SR, 2 gotas de
iodo 0.1 M e 1 gota de hidrxido de amnio SR. Aquecer cuidadosamente at ebulio. Aps
alguns minutos forma-se precipitado azul ou aparece colorao azul intensa.

Acetila

Colocar a amostra em tubo de ensaio e juntar 3 gotas de cido fosfrico SR. Fechar o
tubo com tampa atravessada por outro tubo de ensaio menor cheio de gua e em cujo exterior se
depositou uma gota de nitrato de lantnio SR. Aquecer o conjunto em banho-maria durante cinco
minutos (certas substncias acetiladas se hidrolisam com dificuldade, neste caso a mistura deve
ser aquecida lentamente, at ebulio, sobre chama direta). Transferir a gota de nitrato de
lantnio SR a uma cpsula de porcelana e misturar com uma gota de iodo SR. Colocar na da
mistura uma gota de hidrxido de amnio 2 M. na zona de contato dos dois lquidos aparece
lentamente com azul que persiste por pouco tempo.

Alcalide

Dissolver alguns miligramas de amostra em 5 ml de gua, juntar cido clordrico SR at
acidificar a soluo e, em seguida, verter 1 ml de iodobismutato de potssio SR; forma-se
imediatamente precipitado alaranjado ou vermelho-alaranjado.

Alumnio, on

1) Juntar a amostra a hidrxido de amnio 6 M; forma-se precipitado branco gelatinoso,
insolvel em excesso do mesmo reagente .
2) Adicionar a amostra a hidrxido de sdio M ou sulfeto de sdio SR; forma-se
precipitado branco gelatinoso, solvel em excesso do mesmo reagente.
3) A soluo da amostra juntar hidrxido de amnio 5 M at que se forme turvao.
Adicionar, em seguida, 3 a 4 gotas da soluo recm-preparada de quinalizarina 0.05% em
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hidrxido de sdio 1%. Aquecer at ebulio, resfriar e acidificar com excesso de cido actico 5
M; produz-se cor violeta-avermelhado.

Amina aromtica primria

Acidificar a soluo da amostra com cido clordrico 2 M e juntar 4 gotas de nitrito de
sdio SR. Aps 1 a 2 minutos, acrescentar 1ml de beta-naftol SR; aparece cor alaranjada intensa
ou vermelha, formando-se geralmente precipitado.

Amnia e amina aliftica voltil

Dissolver a amostra em tubo de ensaio, acrescentar xido de magnsio e aquecer se
necessrio; desprendem-se paulatinamente vapores alcalinos, que escurecem o papel de prata-
mangans colocado na parte superior do tubo.

Amnio on

Juntar amostra excesso de hidrxido de sdio M a frio; ocorre desprendimento de
amnia, de odor caracterstico, e que muda para azul a cor vermelha do papel de tornassol. A
decomposio acelerada pelo aquecimento.

Antimnio (III) on

1) Tratar a soluo da amostra, fortemente acidificada por cido clordrico (no mximo 2
M), com sulfeto de hidrognio SR; forma-se precipitado alaranjado de sulfeto de antimnio,
insolvel em hidrxido de amnio 6 M, mas solvel em sulfeto de amnio SR, hidrxido de sdio 2
M e cido clordrico concentrado.
2) Dissolver a amostra em soluo de tartarato de sdio e potssio SR; aps
resfriamento, juntar gota a gota, sufeto de sdio SR; forma-se precipitado vermelho-alaranjado
solvel em hidrxido de sdio 2 M

Arsnio

1) A uma soluo amoniacal da amostra adicionar sulfeto de sdio SR e acidificar com
cido clordrico diludo; forma-se precipitado amarelo. Insolvel em cido clordrico, mas solvel
em solues alcalinas.
2) Aquecer 5 ml da soluo da amostra fortemente clordrica em banho-maria com
volume igual de hipofosfito de sdio SR; forma-se precipitado de cor marrom a preta. Como se
tratar de As(V), a reduo mais lenta, o acrscimo de iodeto de potssio SR exercer efeito
cataltico.

Barbitrico sem substituinte no nitrognio

A uma soluo metanlica da amostra juntar algumas gotas de soluo contendo nitrato
de cobalto SR e cloreto de clcio SR, misturar e acrescentar, com agitao, algumas gotas de
hidrxido de sdio 2 M; forma-se precipitado azul-violeta.

Brio, on

1) Tratar soluo da amostra com cido sulfrico M; forma-se precipitado branco,
insolvel nos cidos clordrico e ntrico.
2) Colocar a amostra na zona redutora de chama: esta adquire cor verde-amarela, que se
apresenta azul quando vista atravs de vidro verde.

Benzoato

1) Tratar soluo neutra da amostra com cloreto frrico SR; forma-se precipitado amarelo
escuro, solvel em ter etlico.
2) Acidular soluo moderadamente concentrada da amostra com cido sulfrico M;
forma-se precipitado de cido benzico, facilmente solvel em ter etlico.
Vigilncia Sanitria Digital 98

Bicarbonato

1) Tratar a amostra com cido mineral; produz-se efervescncia com desprendimento de
gs incolor que, ao reagir com soluo de hidrxido de clcio SR, forma imediatamente
precipitado branco.
2) A uma soluo fria da amostra juntar fenoltaleina SI; a soluo permanece inalterada
ou fica apenas levemente colorida.

Bismuto, on

Dissolver a amostra em ligeiro excesso de cidos ntrico ou clordrico e diluir com gua;
forma-se precipitado branco que, tratado com sulfeto de hidrognio, passa a marrom; o composto
resultante solvel em mistura quente de partes iguais de cido ntrico e gua, mas insolveis
em sulfeto de amnio SR.

Bissulfito

Tratar a amostra com cido clordrico 3 M; desprende-se dixido de enxofre, reconhecido
por seu odor pungente caracterstico e por escurecer papel de filtro umedecido com nitrato de
mercrio (I) SR.

Borato

1) A uma soluo da amostra acidulada com clordrico, juntar algumas gotas de soluo
de iodo 0,1% (p/v) e de soluo de lcool polivinlico 2% (p/v); produz-se cor verde intensa. A
reao alterada por agentes de oxidao ou reduo.
2) Tratar a amostra com cido sulfrico, acrescentar metal e levar a mistura ignio; ela
queima com chama de bordos verdes.

Brometo

1) A soluo da amostra acidificada com cido sulfrico SR, juntar gua de cloro SR;
desprende-se bromo, que confere com perda soluo; agitando-se esta com clorofrmio, o
solvente adquire cor variando de vermelho a marrom-avermelhado e a camada aquosa
permanece incolor.
2) Tratar a soluo da amostra com cido ntrico SR e nitrato de prata SR; forma-se
precipitado caseoso branco levemente amarelado, insolvel em cido ntrico e pouco solvel em
hidrxido de amnio 6 M.

Clcio, on

1) Umedecer a amostra com cido clordrico e lev-la zona redutora da chama; aparece
cor vermelho-alaranjada transitria.
2) Dissolver a amostra, juntar 2 gotas de vermelho de metila SI, neutralizar com hidrxido
de amnio 6 M, acrescentar cido clordrico 3 M, gota a gota, at acidular a soluo e verter
oxalato de amnio SR; forma-se precipitado branco de oxalato de clcio, insolvel em cido
actico 6 M, mas solvel em cido clordrico SR.

Carbonato

1) Tratar a amostra com cido mineral, produz-se efervescncia, com desprendimento de
gs incolor que, ao reagir com hidrxido de clcio SR, forma imediatamente precipitado branco.
2) A uma soluo fria da amostra solvel juntar fenolftalena SI; aparece cor vermelha.

Chumbo, on

1) Tratar soluo da amostra com cido sulfrico M; forma-se precipitado branco,
insolvel em cido clordrico 3 M ou cido ntrico 2 M, mas solvel em hidrxido de sdio M
aquecido, em acetato de amnio SR e em excesso de cido sulfrico M.
Vigilncia Sanitria Digital 99
2) Tratar soluo da amostra, isenta de cidos minerais, com cromato de potssio SR;
forma-se precipitado amarelo, insolvel em cido actico 6 M, mas solvel em hidrxido de sdio
M e em cido ntrico, a quente.

Cianeto

Tratar soluo da amostra com sulfato ferroso Sr, hidrxido de sdio SR e cloreto frrico
SR, aquecer at ebulio e acidular com cido clordrico; produz-se colorao ou precipitado azul.
Se a quantidade de cianeto presente for pequena, forma-se soluo coloidal de colorao azul-
esverdeada.

Citrato

A 15 ml de piridina adicionar alguns miligramas da amostra dissolvida ou suspensa em
1ml de gua, agitar, juntar 5ml de anidro actico mistura, agitar novamente; aparece cor
vermelha clara.

Clorato

1) Tratar soluo da amostra com nitrato de prata SR em meio de cido ntrico SR; no
se forma precipitado. Verter cido sulfuroso ou soluo recente de nitrito de sdio SR a esta
mistura; forma-se precipitado branco, insolvel em cido ntrico SR, mas solvel em hidrxido de
amnio 6 M.
2) Submeter a amostra ignio; forma-se cloreto, identificao por ensaio apropriados.
3) Tratar a amostra seca com cido sulfrico; ocorre crepitao desprendendo-se gs
amarelo esverdeado (para este ensaio usar quantidade pequena de cloreto, devendo-se tomar
cuidado externo ao execut-lo, pois o gs que se forma decompe se de modo explosiva acima
de 45 graus centgrados utilizar capela).

Cloreto

1) Tratar soluo da amostra, acidificada com cido ntrico, com nitrato de prata SR;
forma-se precipitado branco caseoso, insolvel em cido ntrico, mas solvel em ligeiro excesso
de hidrxido de amnio 6 M.
2) Misturar a amostra seca com igual peso de dixido de mangans, umedecer com
cido sulfrico SR. E aquecer brandamente; desprende-se cloro, identificado pelo odor e pela
produo de cor azul em papel de amido iodetado umedecido.

Cobre (II), on

1) Tratar a soluo da amostra com ferrocianeto de potssio SR; forma-se precipitado
marrom-avermelhado. Insolvel em cidos diludos, mas solvel em hidrxido de amnio.
2) Tratar soluo da amostra com cido clordrico e limalhas de ferro metlico; deposita-
se pelcula vermelha de cobre metlica.
3) Tratar soluo da amostra com excesso de hidrxido de amnio 6 M, forma-se
primeiro precipitado azulado e, em seguida, soluo fortemente azulada.

ster

Juntar amostra soluo metanlica de cloridrato de hidroxilamina SR e soluo de
hidrxido de potssio a 10% (p/v) em lcool, aquecer at ebulio, resfriar, acidular com cido
clordrico SR e juntar soluo de cloreto frrico SI; produz-se cor vermelho-azulada ou vermelha.

Ferro

Tratar a amostra com sulfeto de amnio SR; forma-se precipitado preto, que se dissolvido
em cido clordrico 3 M, com desprendimento de gs sufdrico, caracterizado pelo papel acetato
de chumbo.

Frrico, on
Vigilncia Sanitria Digital 100

1) tratar soluo cida da amostra com ferrociamento de potssio SR, forma-se
precipitado azul escuro, que no dissolve por adio de cido clordrico SR, mas decomposto
por hidrxido de sdio 2 M.
2) tratar a amostra com tiocianato de amnio SR; produz-se cor vermelha intensa que
no desaparece co adio de cidos minerais diludos, mas pose ser extrada com ter etlico,
passando a colorao vermelha para a camada etrea.

Ferroso, on

1) Tratar soluo da amostra com ferricianeto de potssio SR; forma-se precipitado azul
escuro, insolvel em cido clordrico 3 M, mas decomposto por hidrxido de sdio M.
2) Tratar soluo da amostra com hidrxido de sdio M; forma-se precipitado branco-
esverdeado, que passa rapidamente a verde e, em seguida quando agitado, a marrom.

Fosfato (ou ortofosfato)

1) Tratar soluo neutra da amostra com nitrato de prata SR; forma-se precipitado
amarelo, solvel em cido ntrico 2M ou hidrxido de amnio 6 M.
2) Tratar soluo ntrica da amostra com molibdato de amnio SR; forma-se precipitado
amarelo, solvel em hidrxido de amnio 6 M; a reao acelerada pelo calor.

Hipofosfito

1) Aquecer soluo da amostra, acidulada por cido sulfrico SR, com sulfato cprico
SR; forma-se precipitado vermelho.
2) Tratar soluo da amostra com cloreto mercrio SR; forma-se precipitado branco, que
se torna cinzento na presena de excesso de hipofosfito.

Iodeto

1) tratar soluo da amostra com gua de cloro SR, gota a gota; desprende-se iodo, que
muda a cor da soluo de amarela para vermelha; agitando-se esta soluo com clorofrmio, este
adquire cor violeta.
2) Tratar soluo da amostra acidificada co cido ntrico SR, com nitrato de prata SR;
forma-se precipitado amarelo caseoso, insolvel em cido ntrico SR e hidrxido de amnio 6 M.

Lactato

Tratar soluo da amostra, acidulada por cido sulfrico SR, com permaganato de
potssio SR e aquecer a mistura; desprende-se acetaldedo, identificado pelo odor caracterstico.

Ltio, on

1) Tratar a soluo da amostra moderadamente concentrada e alcalinizada por hidrxido
de sdio SR, com carbonato de sdio SR; forma-se, por aquecimento, precipitado branco, solvel
em cloreto de amnio S.
2) Umedecer a amostra com cido clordrico e aquecer na zona redutora da chama; esta
cor vermelha intensa.

Magnsio, on

1) Tratar a soluo da amostra com hidrxido de sdio SR; forma-se precipitado branco,
que se dissolve com a adio de cloreto de amnio SR.
2) Tratar a soluo da amostra, na presena de cloreto de amnio SR, com carbonato de
amnio SR; no se forma precipitado mas, ao se adicionar fosfato de sdio SR, forma-se
precipitado cristalino branco, insolvel em hidrxido de amnio 6 M.

Mercrio

Vigilncia Sanitria Digital 101
1) Tratar a soluo da amostra co sulfeto de hidrognio SR; forma-se precipitado preto,
insolvel em sulfeto de amnio SR e em cido ntrico 2 M fervente.
2) Aplicar soluo da amostra, sem excesso de cido ntrico, em lmina de cobre
brilhante; forma-se depsito que, ao ser polido, se torna brilhante e prateado.

Mercrio (II), on

1) Tratar a soluo da amostra com hidrxido de sdio M; forma-se precipitado amarelo.
2) Tratar a soluo neutra da amostra com iodeto de potssio SR; forma-se precipitado
escarlate, muito solvel em excesso de reagente.

Mercrio (I), on

1) Tratar a amostra com hidrxido de sdio M, o sal decompe-se dando cor preta.
2) Tratar a soluo da amostra com cido clordrico SR; forma-se precipitado branco, que
escurece ao ser tratado com hidrxido de amnio 6 M.
3) Tratar a soluo da amostra com iodeto de potssio SP; forma-se precipitado amarelo
que, com o tempo, pode passar a verde.

Nitrato

1) Aquecer a amostra com cido sulfrico e cobre metlico, desprendem-se vapores
vermelho-pardos (realizar em capela)
2) Tratar a soluo da amostra com igual volume de cido sulfrico, esfriar a mistura e
juntar 0.5 ml de soluo de sulfato ferroso 0.5 M; na interface produz-se cor parda a roxa.

Nitrito

1) Tratar a amostra com cidos minerais diludos ou com cido actico 5 M; desprendem-
se vapores pardacentos (realizar em capela).
2) Tratar papel de amido iodetado com soluo da amostra; o indicador se cora de azul.
3) Adicionar a amostra soluo acidificada de permaganato de potssio SR;
desaparece a cor.

Oxalato

1) Tratar a soluo neutra ou alcalina da amostra com cloreto de clcio SR; forma-se
precipitado branco, insolvel em cido actico 6 M, mas solvel em cido clordrico.
2) Tratar a soluo acidificada quente da amostra com permaganato de potssio SR
desaparece a cor.

Permaganato

1) Tratar a soluo da amostra, acidulada por cido sulfrico SR, com perxido de
hidrognio 3% (p/v) SR, a cor desaparece a frio.
2) Tratar a soluo da amostra, acidulada por cido sulfrico SR, co cido oxlico SR em
soluo aquecida, a cor desaparece.

Perxido

Tratar a soluo da amostra, ligeiramente acidulada por cido sulfrico SR, com
dicromato de potssio SR, aparece cor azul intensa. Agitando a mistura com igual volume de ter
etlico e deixando os lquidos se separarem, a cor azul passa apara a camada etrea.

Potssio, on

1) Tratar a soluo alcalina da amostra com tetrafenilborato sdico SR; forma-se
precipitado branco.
2) Tratar a soluo da amostra com cido actico SR e 1ml de cobaltinitrito de sdio SR;
forma-se imediatamente precipitado amarelo ou alaranjado, na ausncia de ons amnio.
Vigilncia Sanitria Digital 102
3) Colocar a soluo da amostra, acidulada, com cido clordrico R, na zona redutora da
chama, esta adquire cor violeta, a presena de pequena quantidade de sdio mascara a cor.
4) Tratar a soluo da amostra com cido perclrico SR, forma-se precipitado branco
cristalino.

Prata, on

1) Tratar a soluo da amostra com cido clordrico, forma-se precipitado caseoso
branco, insolvel em cido ntrico SR, mas facilmente solvel em hidrxido de amnio 6 M.
2) Tratar a soluo da amostra com hidrxido de amnio 6 M e pequena quantidade de
formaldedo SR, por aquecimento, deposita-se espelho de prata metlica na superfcie do
recipiente.

Sulicilato

1) Tratar a soluo diluda da amostra com cloreto frrico SR; produz-se cor violeta.
2) Tratar a soluo moderadamente concentrada da amostra com cido mineral; forma-
se precipitado cristalino branco de cido saliclico, que funde entre 156 e 160graus centgrados.

Sdio, on

1) Colocar soluo da amostra, acidulada, com cido clordrico SR, na zona redutora da
chama, esta adquire cor amarela intensa.
2) Tratar a soluo da amostra com cido clordrico ou ntrico e, em seguida, com acetato
de uranila e zinco SR; forma-se precipitado cristalino amarelo-ouro, aps agitao por alguns
minutos.

Succinato

1) Tratar a soluo neutra da amostra com cloreto frrico SR; forma-se precipitado
marrom claro.
2) Tratar a soluo da amostra com nitrato de prata SR; forma-se precipitado ... solvel
em hidrxido de amnio 6 M.

Sulfato

1) Tratar a soluo da amostra com cloreto de brio SR; forma-se precipitado branco,
insolvel em cido clordrico SR e em cido ntrico SR.
2) Tratar a soluo da amostra com acetato de chumbo SR; forma-se precipitado branco,
solvel em acetato de amnio SR, ma insolvel em cido clordrico ou ntrico SR.
3) Tratar a soluo da amostra com cido clordrico SR; no se forma nenhum
precipitado (distino do tiossulfato).

Sulfito

1) Tratar a soluo da amostra com cido clordrico 3 M; desprendem-se dixido de
enxofre, reconhecido por seu odor pungente caracterstico e por escurecer papel de filtro
umedecido com nitrato mercuroso SR.
2) Acidificar soluo da amostra com cido clordrico SR, aquecer com algumas gotas de
permaganato de potssio SR e juntar gotas de cloreto de brio SR; forma-se precipitado branco.

Tartarato

1) dissolver alguns miligramas da amostra em gua, acidulada com cido actico SR,
adicionar uma gota de soluo a 1% de sulfato ferroso e uma gota de perxido de hidrognio SR;
produz-se cor amarela fugaz. Juntar hidrxido de sdio 2 M gota a gota; produz-se cor azul
intensa.
2) Acidificar soluo da amostra com cido sulfrico M, juntar algumas gotas de
resorcinol SR e adicionar, cuidadosamente, cido sulfrico, de modo a se formarem duas
camadas; aquecendo em banho-maria, por alguns minutos, na interface aparece anel vermelho.
Vigilncia Sanitria Digital 103

Tiocianato

Tratar a soluo da amostra com cloreto frrico SR; produz-se cor vermelha, que no
desaparece pela adio de cidos minerais moderadamente concentrados e pode ser extrada
com ter, passando a colorao vermelha para a camada etrea.

Tiossulfato

1) Tratar a soluo da amostra com cido clordrico; forma-se precipitado branco, que
passa logo a amarelo, e desprende-se dixido de enxofre, reconhecido pelo odor.
2) Tratar a soluo actica da amostra com cloreto frrico SR; produz-se cor violeta
escura que desaparece rapidamente.

Xantina

1) Tratar a amostra com 2 gotas de soluo concentrada de perxido de hidrognio
concentrado e 5 gotas de cido clordrico 2 M, e aquecer at secura em banho-maria; obtm-se
resduo vermelho-amarelado que, tratado com hidrxido de amnio 2 M, muda para vermelho-
violeta.

Zinco, on

1) Tratar a soluo da amostra com ferrociamento de potssio SR; forma-se precipitado
branco, insolvel em cido clordrico 3 M.
2) Tratar a soluo neutra ou alcalina da amostra com sulfeto de amnio SR; forma-se
precipitado branco.
3) Tratar a soluo da amostra com soluo de hidrxido de sdio 2 M, gota a gota;
forma-se precipitado branco, flocoso, solvel em excesso de hidrxido de sdio SR.

V.3.1.2. IDENTIFICAO DE ESTERIDES POR CROMATOGRAFIA EM
CAMADA DELFADA

Procedimento

Preparar cromatoplaca utilizando Kieselguhr G como suporte. Introduzir a cromatoplaca
na cuba contendo o solvente de impregnao e deixar desenvolver at que o solvente atinja o
topo da cromatoplaca. Remover a cromatoplaca da cuba e deixar evaporar o solvente. Preparar
soluo da amostra a 0.25% (p/v) e soluo do padro a 0.25% (p/v), utilizando como solvente
mistura de 9 volumes de clorofrmio e 1 volume de metanol. A no ser que a monografia
estabelea diferentemente, aplicar sobre a cromatoplaca 2 l da soluo de amostra, 2 l da
soluo padro e 2 l mistura 1:1 das solues da amostra e do padro. Desenvolver o
cromatograma com o eluente especificado na monografia, deixando-o subir no mesmo sentido
que o solvente de impregnao. Remover a cromatoplaca da cuba, deixar evaporar o eluente,
aquecer a cromatoplaca a 120 graus centgrados por 15 minutos e nebulizar com soluo de
cido sulfrico a 10% (V/V) em etanol a 96%. Aquecer a 120 graus centgrados por mais 10
minutos, deixar esfriar e examinar luz normal e luz ultravioleta (366 nm). A mancha principal
do cromatograma obtida com a soluo da amostra corresponder mancha principal obtida com
a soluo do padro. A mancha principal resultante da aplicao da mistura das solues e
amostra e de padro aparecer como nica e compacta.

I Mistura de 1 volume de formamida e 9 volumes de acetona
II Mistura de 1 volume de 1,2 propanodiol e 9 volumes de acetona
III Mistura de 1 volume de parafina lquida e 9 volumes de ter de petrleo de faixa de
ebulio 40 60 graus centgrados

Eluentes

A Clorofrmio
B Mistura de 3 volumes de tolueno e 1 volume de clorofrmio
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C Tolueno
D Mistura de 4 volumes de cicloexano e 1 volume de tolueno
E Mistura de volumes iguais de cicloexano e ter de petrleo de faixa de ebulio 40 60
graus centgrados
F Mistura de 2 volumes de cido actico glacial e 3 volumes de gua
G Mistura de 8 volumes de hexano e 2 volumes de dioxana.

V.3.1.3. PESQUISAS DE ESTERIDES ESTRANHOS
POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

PROCEDIMENTO I.

Preparar cromatoplacas segundo mtodo geral para cromatografia em camada delgada,
utilizando slica gel G como suporte. Preparar 3 solues utilizando como solvente mistura de 9
volumes de clorofrmio e 1 volume de metanol nas seguintes concentraes: 1,5% (p/V) da
substncia em exame soluo 1, 1,5% (p/V) do padro oficial correspondente soluo 2 e
0,03% (p/V) de cada um dos seguintes padres oficiais:prednisolona e acetato de cortisona
soluo 3. Aplicar sobre a cromatoplaca 1 ul de cada uma destas solues, separadamente e
desenvolver o cromatograma utilizando como eluente mistura de 77 volumes de diclorometano,
15 volumes de ter, 8 volumes de metanol e 1,2 volumes de gua. Secar o cromatograma ao ar,
aquecer a 105 graus centgrados por 10 minutos e nebulizar com soluo de azul de tetrazlio
alcalina SR. A mancha principal do cromatograma obtida com a soluo 1 corresponde, na
distncia percorrida, colorao e intensidade, mancha principal do cromatograma obtido com a
soluo 2. Qualquer mancha secundria obtida com a soluo 1 no deve ser mais intensa do
que a mancha correspondente no cromatograma obtida com a soluo 3.

PROCEDIMENTO II.

Proceder a cromatografia utilizando slica-gel G como suporte e, como eluente, mistura de
95 volumes de 1,2 dicloroetano, 5 volumes de metanol e 0,2 volumes de gua.
Aplicar sobre a cromatoplaca, separadamente, 1 l de cada uma das 3 solues em
mistura de 9 volumes de clorofrmio e 1 volume de metanol, como no Procedimento I, com
exceo da soluo 3, em que se adiciona acetato de desoxicortona.

V.3.1.4. PESQUISA DE SUBSTNCIAS RELACIONADAS A SULFONAMIDAS
POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

PROCEDIMENTO I.

Proceder cromatografia em camada delgada utilizando slica gel H como suporte.
Preparar soluo de substncia em exame a 1,0% (p/V) utilizandocomo solvente mistura de 9
volumes de etanol a 96% e 1 volume de hidrxido de amnio 13,5 M soluo 1. Preparar
soluo de sulfanilamida a 0,005% (p/V), usando o mesmo solvente soluo 2. Aplicar
separadamente sobre a cromatoplaca 10 ul de solues 1 e 2. Desenvolver o cromatograma
usando mistura de 15 volumes de 1 butanol e 3 volumes de hidrxido de amnio M como
eluente. Remover a cromatoplaca da cuba, aquecer a 105 graus centgrados por 10 minutos e
nebulizar com soluo a 0,1% (p/V) de 4 dimetilaminobenzaldedo em etanol a 96%, contendo
1% de cido clordrico (V/V): qualquer mancha no cromatograma obtida com soluo 1, exceto a
mancha principal, no mais intensa que a mancha obtida no cromatograma com soluo 2.

PROCEDIMENTO II.

Proceder a cromatografia em camada delgada utilizando slica-gel H como suporte e
mistura de 20 volumes de clorofrmio, 2 volumes de metanol e 1 volume de dimetilformamida
como fase mvel. Aplicar sobre a cromatoplaca, separadamente 10 l de cada uma das seguintes
solues: 0,25% (p/V) da substncia em exame em mistura de 9 volumes de etanol e 1 volume de
hidrxido de amnio 13,5 M soluo 1; 0,00125% (p/V) de sulfanilamida no mesmo solvente da
soluo 1. Desenvolver o cromatograma, secar ao ar e revelar conforme prescrito no
procedimento I: qualquer mancha obtida com a soluo 1, exceto a mancha principal, no deve
ser mais intensa que a mancha obtida no cromatograma da soluo 2.
Vigilncia Sanitria Digital 105

V.3.1.5. IDENTIFICAO DE FENOTIAZINAS POR
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Proceder cromatografia em camada delgada, conforme descrito em mtodos gerais.
Usar Kieselguhr G como suporte. Impregnar a cromatoplaca seca, colocando-a em cuba contendo
mistura de 10 volumes de 2 fenoxietanol, 5 volumes de macrogol 300 e 85 volumes de acetona.
Deixar o eluente subir pelo menos 17 cm. Remover a cromatoplaca da cuba e utilizar
imediatamente.
Aplicar sobre a cromatoplaca, separadamente, 2 ul de cada uma das solues seguintes:
0,2% (p/V) da substncia em exame em clorofrmio soluo 1 e 0,2% (p/V) do padro oficial
correspondente soluo 2, operando em atmosfera de nitrognio e luz reduzida. Desenvolver o
cromatograma usando como eluente mistura de 2 volumes de dietilamina e 100 volumes de ter
de petrleo de faixa de vebulio 40 60 graus centgrados, saturada com 2-fenoxietanol.
Remover a cromatoplaca da cuba, deixar ao ar e examinar sob luz ultravioleta com intensidade
mxima em 366 nm: observa-se fluorecncia, produzida em poucos minutos. Em seguida,
nebulizar a cromatoplaca com soluo de cido sulfrico a 10% (V/V) em etanol e observar a
colorao produzida: a mancha principal no cromatograma, obtida com a soluo 1, corresponde,
na distncia percorrida, fluorescncia e colorao, quela obtida no cromatograma da soluo 2 e
tem a mesma estabilidade pelo perodo de, pelo menos, 20 minutos depois da nebulizao.

V.3.1.6. PESQUISA DE IMPUREZAS RELACIONADAS
A FENOTIAZINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

PROCEDIMENTO

Preparar cromatoplacas utilizando slica-gel GF 254 como suporte, operando em
atmosfera de nitrognio e ao abrigo de luz. preparar soluo contendo 2,0% (p/V) da substncia
em exame em mistura de 95 volumes de metanol e 5 volumes de dietilamina soluo 1.
Preparar soluo a 0,01% (p/V) da substncia em exame, utilizando o mesmo solvente soluo
2. Aplicar sobre a cromatoplaca, separadamente, 10 ul de cada soluo recm preparada. Usar
fase mvel especificada na monografia. Deixar o solvente subir 12 cm acima do ponto de
aplicao. Remover a cromatoplaca da cuba, secar ao ar e examinar sob luz ultravioleta com
mximo em 254 nm. Desprezar qualquer mancha sobre a linha-base. Qualquer mancha obtida
com a soluo 1, exceto a mancha principal, no mais intensa que a mancha obtida com a
soluo 2, exceto se a monografia estabelecer diferentemente.

Fases mveis

A Mistura de 80 volumes de cicloexano, 10 volumes de acetona e 10 volumes de
dietilamina
B Mistura de 85 volumes de hexano, 10 volumes de acetona e 5 volumes de dietilamina
C Mistura de 15 volumes de 1-butanol e 3 volumes de hidrxido de amnio M.

V.3.2. ENSAIOS-LIMITE PARA IMPUREZAS INORGNICAS

Ensaios-limite consiste em ensaios quantitativos ou semi-quantitativos destinados
identificao de impurezas presentes em frmacos. Visto que estas impurezas se encontram,
frequentemente, em quantidades pequenas, sua deteco, via de regra feita atravs de reao
visvel, bem como sua determinao quantitativa exigem certos cuidados, sobretudo no que diz
respeito a fatores que podem influir nos resultados, a saber: especificidade do ensaio,
sensibilidade do mesmo e controle dos erros passveis de serem cometidos pelo operador.

Certos ensaios visam a determinar, com preciso, a quantidade de impurezas porventura
presentes no frmaco. So os seguintes: (1) limites de substncias solveis; (2) limites de
substncias insolveis; (3) limites de unidade, substncia voltil e solventes residuais; (4) limite de
substncia no voltil; (5) limites do resduo pela incinerao; (6) limites da perda por
dessecao; (7) limites de cinza.
Vigilncia Sanitria Digital 106
Ensaios-limite de cloreto, sulfato, ferro, metais pesados e arsnio destinam-se a
comprovar se o contedo de tais impurezas no excede o limite em microgramas por grama de
substncia em exame especificado na monografia.

Os ensaios so realizados em tubos de vidro transparente, de fundo chato, geralmente
tubos de Nessler, com capacidade aproximadamente de 70 ml e marca externa correspondente a
volume de 45 a 50 ml, e dimetro interno de 23 mm.

Os tubos empregados devem ser iguais tanto em relao ao dimetro interno quanto aos
outros aspectos, uma vez que a comparao entre cor ou turbidez direta. H duas maneiras de
interpretao no primeiro caso, os tubos devem ser observados de cima para baixo, contra fundo
branco, se possvel com auxlio de luz colocada diretamente por baixo do fundo dos tubos; no
segundo caso, a comparao deve ser feita na horizontal, contra fundo escuro, colocando, caso
possvel, fonte de luz diretamente nas laterais dos tubos.

Quanto ao padro, pode-se optar por padro fixo ou padro varivel. No primeiro caso, a
quantidade de amostra a ser empregada visando comparao com o padro de volume fixo
estabelecida em tabelas (Tabelas I, II e III); no segundo caso, o volume de padro varia de acordo
com o limite de cada impureza em determinada amostra, conforme e especificado na monografia.

V.3.2.1. ENSAIO-LIMITE PARA CLORETOS

Preparo da amostra

Em tubos de Nessler colocar quantidade de amostra especificada na monografia,
adicionando 30 a 40 ml de gua. Caso a substncia j esteja em soluo, completar o volume
para 30 a 40 ml com gua. Neutralizar, se necessrio, com cido ntrico SR. Se aps a
acidificao a soluo no estiver perfeitamente lmpida, filtrar atravs de papel de filtro isento de
cloreto. Caso o limite de cloreto para determinada soluo da substncia corresponda a volume
igual ou inferior a 0,2 ml de cido clordrico padro, no h necessidade de diluir a amostra.

Preparo do padro

Submeter o volume de cido clordrico padro indicado na monografia (HC1 0,01 M), ou
indicado em tabela (Tabela I), ao mesmo tratamento efetuado com a amostra. Utilizar as mesmas
quantidades de reagentes empregadas no Preparo da amostra.

Tcnica

Desenvolver em paralelo padro e amostra, ao tubo padro e ao tubo amostra adicionar 1
ml de cido ntrico SR e 1 ml de nitrato de prata SR. Completar o volume para 50 ml com gua.
Homogeneizar. Deixar em repouso ao abrigo da luz durante 5 minutos. A turbidez desenvolvida
pela amostra no deve ser superior desenvolvida pelo padro.

Tabela 1 Clculo de limites para cloreto

Equivalente: em partes de Cl
-
por 1 milho de partes de substncia (p/p)
Padro: 1 ml de cido clordrico 0,01 M (=0,0003546 g de Cl
-
)
Volume final: 50 ml
Tubo Nessler de 50 ml e dimetro externo de 25 mm

g de
Substncia
Cl p/ Milho g de
Substncia
Cl p/ Milho

0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
3.546 (=0,355%)
2.364 (=0,236%)
1.773 (=0,180%)
1.418 (=0,142%)
1.182 (=0,120%)
1.013 (= 0,100%)
886
788
3,8
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
93
88
84
80
77
74
71
68
Vigilncia Sanitria Digital 107
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
3,6
709
645
591
545
500
473
443
417
394
373
354
295
253
221
197
177
161
148
136
126
118
111
104
99
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,6
7,8
8,0
8,2
8,4
8,6
8,8
9,0
9,2
9,4
9,6
9,8
10,0
65
63
61
59
57
55
53
52
50
49
48
46
45
44
43
42
41
40
39
38
37
37
36
35

Sendo o padro fixo (= 0,0003546 g de Cl), se determinada substncia contiver 354 partes de Cl por milho deve ser
tomado 1 g para obter-se a mesma opalescncia do padro, se ela contiver 21 partes de Cl por milho, devero ser
tomadas 5 g e assim por diante.

V.3.2.2. ENSAIO-LIMITE PARA SULFATOS

Preparo da amostra

Colocar quantidade especificada da substncia em anlise em tubo de Nessler,
adicionando 30 a 40 ml de gua. Se a substncia j se encontrar em soluo, acrescentar gua,
perfazendo volume de 30 a 40 ml. Caso necessrio, neutralizar com cido clordrico SR. Pode-se,
eventualmente, utilizar cido actico, tanto para a neutralizao quanto para a acidificao. Se
aps a acidificao a soluo no estiver perfeitamente lmpida, filtrar atravs de papel de filtro
isento de sulfato. Caso o limite de sulfato para determinada soluo da substncia corresponda a
volume igual ou inferior a 0,2 ml de cido sulfrico padro, no h necessidade de diluir a
amostra.

Preparo do padro

Submeter o volume de cido sulfrico padro indicado na monografia (H
2
SO
4
0,005 M),
ou indicado na tabela (Tabela II), ao mesmo tratamento efetuado com a amostra. Utilizar as
mesmas quantidades de reagentes empregados, no Preparo da amostra.

Tcnica

Desenvolver em paralelo padro e amostra ao tubo padro e ao tubo amostra adicionar 1
ml de cido clordrico 3 M e 3 ml de cloreto de brio SR. Completar o volume para 50 ml com
gua destilada. Homogeneizar. Deixar em repouso por cerca de 10 minutos. A turbidez
desenvolvida pela amostra no deve ser superior desenvolvida pelo padro.


Tabela 2 Clculo de Limites para sulfato

Equivalentes em parte se SO
4
= por milho de partes da substncia (p/p)
Padro: 2,5 ml de cido sulfrico 0,005 M (=0,0012008 g de SO
4
)
Volume final: 50 ml
Tubo Nessler de 50 ml e dimetro externo de 25 mm
Vigilncia Sanitria Digital 108

g da
Substncia
SO4 p/Milho
g da
Substncia
SO4 p/Milho
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
3,6
3,8
4,0
4,2
4,4
2.401 (=0,240%)
2.183 (=0,220%)
2.001 (=0,200%)
1.847 (=0,165%)
1.715 (=0,171%)
1.601 (=0,160%)
1.501 (=0,150%)
1.412 (=0,141%)
1.334 (=0,133%)
1.264 (=0,126%)
1.200 (=0,120%)
1.001 (=0,100%)
858
750
667
600
546
500
462
429
400
375
353
333
316
300
286
273


4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,6
7,8
8,0
8,2
8,4
8,6
8,8
9,0
9,2
9,4
9,6
9,8
10,0
261
250
240
231
222
214
207
200
194
167
182
177
171
166
162
158
154
151
146
143
139
136
133
130
127
125
122
120
Sendo o padro fixo (= 0,0012008 g de SO4), se determinada substncia contiver 500 partes de SO4 por milho, devero
ser tomados 2,4 g para obter-se a mesma opalescncia do padro; se ela contiver 151 partes de SO4 por milho, devero
ser tomados 8 g e assim por diante.

V.3.2.3. ENSAIO-LIMITE PARA METAIS PESADOS

O ensaio-limite para metais pesados consiste em verificar se o contedo de impurezas
metlicas que reagem colorimetricamente com o on sulfeto no ultrapassa o limite especificado
nas monografias em termos de microgramas de chumbo por grama de substncia em anlise.
Analogamente, a reao com tioacetamida pode ser empregada para a determinao do limite de
metais pesados, em termos de chumbo.
Em se tratando de metais pesados que normalmente fornecem reao cida, no h
necessidade de proceder acidificao, como especificado na preparao da amostra, tampouco
de neutralizar a soluo.

Mtodos de reao com on sulfeto

So basicamente trs os mtodos de preparo da amostra para reao com on sulfeto
empregados como ensaio-limite para metais pesados. O Mtodo I utilizado para substncias
que fornecem solues lmpidas nas condies especificadas. o mais recomendado, a menos
que outros sejam especificados pela monografia. O Mtodo II se aplica a substncias que no
apresentam solues lmpidas quando submetidas s condies indicadas para o Mtodo I, para
aquelas que interferem na precipitao dos metais com sulfeto, bem como para leos fixos e
volteis. Caso no se apliquem ambos os mtodos, recorre-se ao Mtodo III que consiste
basicamente em processo de digesto mida.

Soluo estoque de nitrato de chumbo

Vigilncia Sanitria Digital 109
A uma soluo de 159,8 mg de nitrato de chumbo em 100 ml de gua, adicionar 1 ml de
cido ntrico. Completar o volume com gua para exatamente 1000 ml. Homogeneizar. A soluo
obtida deve ser conservada em recipientes de vidro, isentos de sais de chumbo solveis.

MTODO I

Preparo da amostra Colocar, em tubo de Nessler de 50 ml, 25 ml da soluo da
amostra, preparada de acordo com monografia. Se houver indicao do volume de cido, calcular
a quantidade da substncia em gramas, mediante a frmula 2,0/1000 L,em que L o limite, em
porcentagem, dos metais pesados. Dissolver essa massa em 25 ml de gua. Ajustar o pH entre
3,0 e 4,0 com cido actico M ou hidrxido de amnio 6 M. Diluir com gua, perfazendo volume
de 40 ml e homogeneizar a soluo obtida.
Soluo padro de chumbo Diluir 10,0 ml de soluo estoque de nitrato de chumbo para
100,0 ml com gua. Cada ml desta soluo equivale a 10 g de Pb. Uma soluo de 100 g de
padro de chumbo por grama de substncia em exame corresponde a 1 ppm de chumbo.
Preparo do padro Para tubo de Nessler de 50 ml transferir 2,0 ml de soluo-padro de
chumbo, equivalente a 20 g de chumbo. Completar com gua para volume final de 25 ml. Em
seguida, ajustar o pH entre 3,0 a 4,0 com cido actico M ou hidrxido de amnio 6 M. Diluir com
gua, perfazendo volume final de 40 ml. Homogeneizar.
Preparo do tubo controle Paralelamente, colocar em outro tubo de Nessler 25 ml da
soluo da amostra preparada conforme descrito para o Preparo da amostra, acrescentando 2,0
ml de soluo padro de chumbo, ajustando o pH entre 3,0 a 4,0 com cido actico M ou
Hidrxido de amnio 6 M. Diluir com gua para volume de 40 ml, misturando a soluo resultante.
Tcnica Acrescentar, a cada uma das preparaes, 10 ml de sulfeto de hidrognio SR
recm-preparado. Misturar. Deixar em repouso por 5 minutos. Observar os tubos de cima para
baixo, contra fundo branco. A cor obtida com a amostra no deve ser mais escura do que a obtida
com o padro, a cor do tubo-controle (amostra + padro) da soluo deve ser mais intensa que a
do padro ou igual dele. Se, no entanto, for mais clara, aplicar o Mtodo II ao invs do Mtodo I.

MTODO II

Preparo da amostra Colocar em cadinho, de preferncia de slica, que pode ser coberto
com tampa adequada, quantidade em gramas especificada na monografia, ou calculada mediante
a frmula 2,0/1000 L,
em que L corresponde ao limite de metais pesados em porcentagem. Incinerar,
cuidadosamente, baixa temperatura, a amostra previamente umedecida com quantidade
suficiente de cido sulfrico. Em seguida, adicionar ao contedo do cadinho 2 ml de cido ntrico
e 5 gotas de cido sulfrico. Aquecer com cuidado, at que no mais se desprendam vapores
brancos. Colocar, ento, o cadinho em mufla, temperatura de 500 a 600 graus centgrados, por
tempo necessrio combusto completa e em seguida esfriar. Adicionar 4 ml de cido clordrico
6 M, evaporando em banho-maria, lentamente, at secura. Umedecer o resduo com 1 gota de
cido clordrico 6 M, adicionar 10 ml de gua quente e digerir por 2 minutos. Alcalinizar com
hidrxido de amnio 6 M, colocado gota a gota. Diluir com gua para 25 ml, ajustando o pH entre
3,0 e 4,0 com cido actico M. Filtrar, caso seja necessrio, lavar o cadinho e o filtro com 10 ml
de gua. Colocar o filtrado e a gua de lavagem em tubo de Nessler, diluindo com gua at
perfazer volume de 40 ml, misturando em seguida.
Preparo do padro O preparo do padro segue a tcnica descrita para o Mtodo I.
Tcnica Adicionar concomitantemente ao tubo padro e ao tubo amostra 10 ml de
sulfeto de hidrognio SR e homogeneizar. Deixar em repouso por 5 minutos. Observar os tubos
de cima para baixo, contra fundo branco; a cor obtida com a amostra no deve ser mais escura
do que a obtida com o padro.

MTODO III

Preparo da amostra A tcnica de preparao da amostra varia pouco com o estado
fsico das substncias. Para substncias slidas, colocar, em balo de Kjeldahl de 100 ml,
previamente limpo e seco, quantidade da substncia indicada na monografia. Se houver formao
de muita espuma, utilizar balo de maior capacidade. Segurando o balo em ngulo de 45 graus,
umedecer a substncia com quantidade suficiente de mistura de 8 ml de cido sulfrico e 10 ml
de cido ntrico. No caso de substncias lquidas, transferir para balo de Kjeldahl, como descrito
Vigilncia Sanitria Digital 110
para substncias slidas, o volume especificado na monografia e adicionar, cuidadosamente,
alguns poucos ml da mistura de 8 ml de cido sulfrico e 10 ml de cido ntrico. Aquecer
cuidadosamente para iniciar a reao. Quando a reao abrandar, adicionar, em pores, a
mistura cida, aquecendo a cada adio. Repetir a operao at que se tenha acrescentado
volume total de 18 ml. Aumentar a temperatura de aquecimento, alcanando, lentamente, a
fervura, deixando o tempo necessrio para que a soluo escurea. Em seguida, esfriar e
acrescentar 2 ml de cido ntrico. Aquecer novamente at que a soluo no mais escurea.
Aquecer vigorosamente a fim de que se produzam vapores brancos densos e adicionar 5 ml de
gua. Esfriar a mistura. Submeter fervura, quando novamente se desprendem vapores brancos
densos, at que o volume se reduza ao mnimo. Esfriar e adicionar, cuidadosamente, 5 ml de
gua, verificando a cor da soluo. Caso se observe cor amarela, proceder adio de 1 ml de
perxido de hidrognio a 30% (V/V). Ferver at aparecimento de vapores brancos densos,
reduzindo o volume a 2 ou 3 ml. Caso a cor persista, repetir o tratamento anterior. Esfriar e diluir
cautelosamente com pequeno volume de gua. Transferir, com lavagem, para tubo de Nessler de
50 ml, no permitindo que o volume ultrapasse 25 ml.
Preparo do padro Colocar, em balo de Kjeldahl de 100 ml, mistura de 8 ml de cido
sulfrico e 10 ml de cido ntrico. Adicionar volume de cido ntrico para igualar a quantidade
excedente acrescentada no preparo da amostra. Aquecer, em seguida, a soluo a fim de
produzir vapores brancos densos. Esfriar. Adicionar, com cuidado, 10 ml de gua. Caso tenha
sido necessrio utilizar perxido de hidrognio 30% (V/V) na amostra, acrescentar igual volume,
aquecendo lentamente, com produo de vapores brancos densos. Em seguida, resfriar
novamente, adicionar 5 ml de gua, misturando a soluo. Ferver a mistura, produzindo
novamente os vapores e reduzindo o volume para 2 a 3 ml. Esfriar, diluir novamente com
pequeno volume de gua e acrescentar 2,0 ml de soluo padro de chumbo, misturando em
seguida. Transferir a mistura e as guas de lavagem, do balo para tubo de Nessler de 50 ml, at
volume total de 25 ml. Homogeneizar.
Tcnica Desenvolver em paralelo padro e amostra: ajustar o pH da soluo da amostra
e da soluo padro entre 3,0 e 4,0 com hidrxido de amnio 2 M. Diluir com gua, perfazendo
volume total de 40 ml. Homogeneizar. Adicionar a cada tubo 10 ml de sulfeto de hidrognio SR
recm-preparado. Homogeneizar. Deixar em repouso por 5 minutos. A cor da amostra no deve
ser mais escura do que a do padro.

Mtodos de reao com tioacetamida

Soluo padro de chumbo (20 ppm Pb) Diluir 0,8 g de nitrato de chumbo e 2 ml de
cido ntrico em gua para volume de 250 ml.
Transferir 1,0 ml desta soluo para balo volumtrico de 100 ml, completando o volume
com gua.
Soluo padro de chumbo (10 ppm Pb) Diluir 50,0 ml de soluo padro de chumbo
(20 ppm Pb) com gua, perfazendo 100,0 ml.
Soluo padro de chumbo (2 ppm Pb) Diluir 10,0 ml da soluo padro de chumbo (20
ppm Pb) com gua, perfazendo 100,0 ml.
Soluo padro de chumbo (1 ppm Pb) Diluir 5,0 ml de soluo padro de chumbo (20
ppm Pb) com gua, perfazendo 100 ml.
Preparo do reagente de tioacetamida Dissolver 1 g de tioacetamida em gua e
completar o volume a 100 ml.


MTODO I

Preparo da amostra Adicionar a 12 ml de soluo aquosa da amostra, conforme
especificado na monografia do frmaco, 2 ml de soluo tampo acetato pH 3,5 e homogeneizar.
Preparo do padro A 10 ml da soluo padro de chumbo (1 ppm ou 2 ppm de Pb)
adicionar 2 ml de soluo tampo de acetato pH 3,5 e 2 ml da soluo em exame. Misturar,
deixando em repouso por 2 minutos.
Tcnica Nos tubos contendo amostra e padro acrescentar, concomitantemente, 1,2 ml
de reagente tioacetamida. Aps 2 minutos, desenvolve-se cor marrom que, no caso da amostra,
no deve ser mais intensa do que a do padro.

MTODO II
Vigilncia Sanitria Digital 111

Preparo da amostra Dissolver a quantidade de amostra especificada na monografia em
solvente orgnico (dioxana ou acetona, contendo, no mnimo, 15% V/V de gua). Transferir 12 ml
de soluo obtida para tubo de Nessler. Adicionar 2 ml de tampo acetato pH 3,5 e
homogeneizar.
Preparo do padro A 10 ml de soluo padro de chumbo (1 ppm ou 2 ppm de Pb)
obtida mediante dissoluo de soluo padro de chumbo (20 ppm Pb) com o mesmo solvente
empregado para a dissoluo da amostra, adicionar 2 ml de tampo acetato pH 3,5 e 2 ml da
soluo amostra.
Tcnica Acrescentar a ambos os tubos amostra e padro 1,2 ml de reagente de
tioacetamida. Homogeneizar imediatamente. Aguardar 2 minutos. A cor marrom desenvolvida na
amostra no deve ser mais intensa do que a desenvolvida no padro.

MTODO III

Preparo da amostra Colocar em cadinho de slica quantidade da substncia
especificada na monografia. Juntar 4 ml de soluo a 25% (p/V) de sulfato de magnsio em cido
sulfrico M. Misturar e aquecer com cuidado. Caso a mistura seja lquida, evaporar lentamente
em banho-maria at secura. Incinerar a amostra at, no mximo, 800 graus centgrados. Manter o
aquecimento at obter resduo branco ou acinzentado. Esfriar. Umedecer o resduo com poucas
gotas de cido sulfrico M. Evaporar. Incinerar novamente por no mais de 2 horas, esfriando
logo aps. O resduo assim obtido dissolvido com duas vezes 5 ml de cido clordrico 0,2 M,
acrescentando-se 0,1 ml de fenoftalena SI. Adicionar hidrxido de amnio 6 M at que se
desenvolva cor rsea. Esfriar. Descorar a soluo com cido actico glacial e acrescentar mais
0,5 ml do cido. Se necessrio, filtrar e diluir a soluo com gua para volume de 20 ml. Transferir
12 ml da soluo obtida para tubo de Nessler, adicionar 2 ml de tampo acetato pH 3,5 e
homogeneizar imediatamente.
Preparo do padro Submeter, repetidas vezes, volume indicado de soluo padro de
10 ppm de chumbo ao processo de incinerao e extrao utilizado no preparo da amostra,
obtendo 20 ml de soluo padro. Transferir exatamente 10 ml desta soluo e misturar com 2 ml
da amostra e 2 ml de tampo acetato pH 3,5.
Tcnica Em cada um dos tubos referentes amostra e ao padro adicionar
concomitantemente 1,2 ml de reagente de tioacetamida. A cor marrom que se desenvolve para a
amostra no deve ser mais intensa do que a obtida com o padro.

MTODO IV

Preparo da amostra Transferir para cadinho de slica quantidade de substncia
especificada na monografia, misturando 0,5 g de xido de magnsio. Incinerar at vermelho
escuro sobre chama. Prosseguir at obter massa homognea branca ou cinzenta. Se aps 30
minutos de ignio a cor se mantiver, esfriar, misturar a massa no cadinho com basto de vidro,
repetindo, em seguida, a incinerao. Aquecer a 800 graus centgrados por aproximadamente 1
hora. Aps este perodo, seguir a tcnica de preparo da amostra no Mtodo III, iniciando por o
resduo assim obtido dissolvido....
Preparo do padro Misturar o volume especificado de soluo padro de chumbo (10
ppm de Pb) a 0,5 g de xido de magnsio em cadinho de slica. Em seguida, secar a mistura em
estufa a 105 graus centgrados, incinerando logo aps. Seguir a tcnica de preparo da amostra no
Mtodo III, iniciando por o resduo assim obtido dissolvido.... A 10 ml da soluo obtida
adicionar 2 ml da soluo da amostra.
Tcnica Em cada um dos tubos referentes amostra e ao padro adicionar 1,2 ml de
reagente de tioacetamida. A cor marrom que se desenvolve na amostra no deve ser mais
intensa do que a obtida com o padro.

V.3.2.4. ENSAIO-LIMITE PARA FERRO

Soluo padro de ferro (100 ppm Fe) Dissolver com gua, em balo volumtrico de
1000 ml, 0,8634 g de sulfato frrico amoniacal dodecaidratado. Adicionar 2 ml de cido sulfrico
SR e completar o volume com gua.
Vigilncia Sanitria Digital 112
Soluo padro de ferro (20 ppm Fe) Transferir 10,0 ml da soluo a 0,1726% (p/V) de
sulfato frrico amoniacal dodecaidratado em cido sulfrico 0,05 M para balo volumtrico de 100
ml, completando o volume com gua.
Soluo padro de ferro (10 ppm Fe) Diluir 50,0 ml da soluo padro de ferro (20 ppm
Fe) com gua, perfazendo volume de 100,0 ml.
Soluo padro de ferro (2 ppm Fe) Diluir 10,0 ml da soluo padro de ferro (20 ppm
Fe) com gua, perfazendo volume de 100,0 ml.
Soluo padro de ferro (1 ppm Fe) Diluir 5,0 ml de soluo padro de ferro (20 ppm
Fe) com gua, perfazendo volume de 100,0 ml.

MTODO I

Preparo da amostra Dissolver quantidade da amostra especificada na monografia ou na
Tabela III em solvente adequado e diluir para 40 ml com o mesmo solvente ou utilizar 40 ml da
soluo indicada. A essa soluo acrescentar 2 ml de soluo de cido ctrico SR.
Preparo do padro Empregar 10 ml de soluo-padro de ferro (1 ppm de Fe) ou 1 ml
da soluo padro de ferro (100 ppm Fe) (Tabela III) e proceder mesma tcnica indicada para a
amostra.
Tcnica Concomitantemente, juntar aos tubos contendo a amostra e o padro 2 gotas
de cido tiogliclico. Misturar e alcalinizar com hidrxido de amnio. Diluir para 50 ml com gua.
Deixar em repouso por 5 minutos. A cor rsea produzida na amostra no deve ser mais intensa
do que a obtida com o padro.

MTODO II

Preparo da amostra A 10 ml de soluo da amostra especificada na monografia juntar 2
ml de cido clordrico 2 M e 0,5 ml de gua de bromo. Aps 5 minutos, retirar o excesso de bromo
por corrente de ar.
Preparo do padro Submeter 10 ml da soluo padro de ferro (2 ppm de Fe), 1 ml de
cido clordrico 2 M e 1 ml de gua mesma tcnica indicada para a amostra.
Tcnica Concomitantemente, juntar aos tubos da amostra e do padro 3 ml de
tiocianato de potssio M. Agitar, deixando em repouso por 5 minutos. A cor obtida com a amostra
no deve ser mais intensa do que a produzida pelo padro.

MTODO III

Preparo da amostra Colocar em tubos de Nessler a soluo preparada de acordo com a
monografia da substncia.
Preparo do padro Transferir exatamente 1 ml da soluo padro de ferro (10 ppm Fe)
para tubo de Nessler. Diluir para 45 ml com gua e acrescentar 2 ml de cido clordrico M.
Homogeneizar.
Tcnica Adicionar a cada tubo, da amostra e do padro, 50 mg de cristais de
peroxidissulfato de amnio. Juntar 3 ml de soluo de tiocianato de amnio SR. Homogeneizar. A
cor obtida com a amostra no deve ser mais intensa do que a desenvolvida para o padro.

Tabela 3 Clculo de limites para ferro

Equivalentes em partes de Fe por 1 milho de partes da substncia (p/p)
Padro: 1 ml da soluo de sulfato de amnio e ferro (III) dodecaidratado (= 0,0001 g de Fe)
Volume final: 50 ml
Tubo de Nessler de 20 mm de dimetro externo

g de
Substncia
Fe p/Milho
g de
Substncia
Fe p/Milho
0,1
0,105
0,111
0,116
0,125
0,133
1000
950
900
850
800
750
0,4
0,5
0,667
1
1,111
1,25
250
200
150
100
90
80
Vigilncia Sanitria Digital 113
0,143
0,154
0,167
0,182
0,2
0,222
0,25
0,285
0,333
700
650
600
550
500
450
400
350
300
1,429
1,667
2
2,5
3,333
5
10
20

70
60
50
40
30
20
20
5
Sendo o padro fixo (=0,0001 g de Fe), se determinada substncia contiver 1000 partes de Fe por milho, dever ser
tomado 0,1 g para obter-se a mesma colorao do padro, se ela contiver 200 partes de Fe por milho, devero ser
tomados 0,5 g e assim por diante.

V.3.2.5. ENSAIO-LIMITE PARA ARSNIO

Consiste na determinao de traos de arsnio, presente na substncia analisada,
mediante sua converso em arsina (AsH
3
), que pode ser detectada espectrofotomtrica ou
visualmente. Os limites so estabelecidos em termos de arsnio ou, em certos casos, em As
2
O
3
.
importante lembrar que metais ou sais de metais como Cr, Co, Hg, Mo, Ni, Pd e Ag
podem interferir na gerao de arsina.

MTODO ESPECTROFOTOMTRICO

Baseia-se na reao entre a arsina liberada e dietilditiocarbanato de prata, que forma
complexo vermelho, sendo a absoro medida em espectrofotmetro ou colormetro. O antimnio
interferente na reao, uma vez que forma estibina, dando resultado falsamente positivo no
desenvolvimento de cor com dietilditiocarbanato de prata SR. Quando se suspeita dessa
interferncia, deve-se comparar as solues em comprimento de onda de 535 e 540 nm. Neste, a
interferncia da estibina desprezvel.

Dois mtodos podem ser empregados. Estes diferem no que diz respeito ao tratamento
da amostra e do padro. O Mtodo I , em geral, utilizado para substncias inorgnicas; o Mtodo
II empregado para substncias orgnicas.

O aparelho utilizado compreende, conforme mostra a Fig. 1 (a) gerador de arsina, (b) e (d)
juntas; (c) unidade esmerilhada, (c) tubo de absoro. Outro aparelho adaptado, que tenha as
caractersticas essenciais do apresentado, pode, eventualmente, ser utilizado.























Fig. 1 Aparelho para determinao de arsnio
Vigilncia Sanitria Digital 114
pelo mtodo espectrofotomtrico.

A soluo estoque padro de arsnio preparada do seguinte modo: secar por 1 hora a
105 graus centgrados o trixido de arsnio. Pesar exatamente 132,0 mg e dissolver, em 5 ml de
soluo de hidrxido de sdio 5 M na proporo 1:5, em balo volumtrico de 1000 ml.
Neutralizar com cido sulfrico M adicionado, em seguida, mais 10 ml do referido cido.
Completar o volume com gua recm-fervida e resfriada. Transferir 10,0 ml dessa soluo para
outro balo volumtrico de 1000 ml. Acrescentar 10 ml de cido sulfrico M. Completar o volume
com gua recm-fervida e posteriormente esfriada. Homogeneizar. Conservar a soluo em
recipiente de vidro. Deve ser utilizada dentro de 3 dias. Cada ml da soluo obtida corresponde a
1 mg de arsnio.

MTODO I

Preparo da amostra Transferir para frasco gerador de arsina a quantidade de substncia
indicada na monografia, ou calcular essa quantidade, em gramas, mediante a frmula 3,0/L, em
que L o limite de arsnio em ppm. Dissolver com gua, completando o volume para 35 ml.
Adicionar 20 ml de cido sulfrico 2 M, 2 ml de iodeto de potssio SR, 0,5 ml de cloreto estanoso
fortemente cido SR e 1 ml de 2- propanol. Homogeneizar. Deixar em repouso por 30 minutos
temperatura ambiente. Na unidade (c) do aparelho descrito, colocar duas mechas de algodo
embebidas em soluo saturada de acetato de chumbo SR, deixando entre elas espao de 2 mm.
O excesso da soluo deve ser eliminado espremendo-se as mechas de algodo e secando-as
presso reduzida, temperatura ambiente. As juntas (b) e (d) devem ser lubrificadas com
vaselina e unidas como na Fig. 1.
Preparo do padro Transferir para o frasco gerador de arsina 3,0 ml de soluo padro
de arsnio. Diluir com gua at perfazer 35 ml. Proceder da mesma forma descrita para o Preparo
da amostra.
Tcnica - Transferir para a unidade de absoro (e) do frasco gerador contendo a amostra
e do que contm o padro 3,0 ml de dietilditiocarbanato de prata SR. Adicionar 3,0 g de zinco
granulado (malha de 1 mm) mistura do frasco gerador de arsina. Imediatamente aps esta
adio, unir as unidades (c) e (e) ao frasco gerador. Deixar em banho de gua temperatura de
25 graus centgrados (tolerncia de 3 graus centgrados) por 45 minutos. Em intervalos de 10
minutos agitar vagarosamente. Aps este perodo, transferir contedo da unidade de absoro
para cela de 1 cm. Comparar a cor vermelha produzida pelo padro com a obtida com a amostra.
Esta ltima no deve ser mais intensa do que a primeira. Caso necessrio, determinar absoro
em espectrofotmetro ou colormetro em comprimento de onda entre 535 e 540 nm, empregando
dietilditiocarbanato de prata SR como branco.

MTODO II

Este mtodo emprega perxido de hidrognio na digesto da amostra. Com certas
substncias pode provocar reao violenta. Assim, importante que se proceda com a mxima
cautela possvel em todas as operaes. Deve-se tomar cuidado, tambm, na presena de
compostos halogenados, especialmente quando se aquece a amostra com cido sulfrico e
posteriormente se adiciona perxido de hidrognio a 26% (V/V). O aquecimento deve ser mais
brando impedindo que se atinja a temperatura de ebulio da mistura e antes de carbonizar para
evitar a perda de arsnio trivalente.
Preparo da amostra Transferir para o frasco gerador quantidade da amostra
especificada na monografia ou calculada em gramas mediante a frmula 3,0/L, em que L o
limite de arsnio em ppm. Adicionar 5 ml de cido sulfrico e prolas de vidro. Se necessrio,
empregar maior quantidade de cido para umedecer completamente a substncia, cuidando para
que o volume no ultrapasse 10 ml. Proceder digesto em capela, de preferncia usando placa
de aquecimento, com temperatura no superior a 120 graus centgrados, por tempo necessrio
ao incio da queima. Uma vez iniciada a decomposio da amostra pelo cido, adicionar com
cuidado e gota a gota, perxido de hidrognio a 30% (V/V), esperar que a reao se abrande e,
ento, aquecer entre uma gota e outra. Caso haja excesso de espuma, interromper o
aquecimento. Assim que diminuir a intensidade da reao, aquecer cautelosamente, com
agitao do frasco, para promover aquecimento homogneo. necessrio que se mantenham as
condies oxidantes durante toda a digesto. Para tanto, h que se adicionar pequenas
quantidades de soluo de perxido de hidrognio 30% (V/V) sempre que a mistura se torne
marrom ou escurea. Destruda a matria orgnica, aumentar paulatinamente a temperatura de
Vigilncia Sanitria Digital 115
aquecimento, permitindo que saiam os vapores de trixido de enxofre, deixando a soluo incolor
ou cor de palha clara. Esfriar. Acrescentar, com cuidado, 10 ml de gua. Misturar. Evaporar at
que se formem vapores fortes. Caso necessrio, repetir a operao, removendo traos de
perxido de hidrognio. Esfriar e juntar 10 ml de gua. Lavar o frasco e diluir com gua,
perfazendo 35 ml. Proceder como no Preparo da amostra do Mtodo I, iniciando por Adicionar 20
ml de cido sulfrico 2 M....
Preparo do padro A 30 ml de soluo padro de arsnio, colocado no frasco gerador,
juntar 2 ml de cido sulfrico. Misturar. Acrescentar o mesmo volume de perxido de hidrognio a
30% (V/V) empregado para o preparo da amostra. Proceder, em seguida, ao aquecimento da
soluo obtida at que se formem vapores fortes. Esfriar e adicionar, com cuidado, 10 ml de
gua. Repetir a operao de aquecimento, findo este, esfriar novamente e diluir com gua para
completar 35 ml. Proceder como para o Preparo da amostra.
Tcnica Seguir a descrita para o Mtodo I.

MTODO VISUAL

O mtodo consiste na converso de traos de arsnio em arsina, por reduo com zinco e
cido clordrico concentrado. A arsina liberada reage com papel de cloreto de mercrio II, ou
brometo de mercrio II, produzindo mancha de cor amarela. No processo, alm de Hg(As
2
H
2
),
principal produto da reao, podem ser formados, no caso de se empregar cloreto de mercrio,
produtos como AsH (HgCl
2
) e AS(HgCl
3
) que produzem manchas amarela ou marrom.
O aparelho empregado para determinao visual de arsnio o que aparece Fig. 2.
Consiste, basicamente, de erlenmeyer, geralmente de 100 ml, onde se d a gerao de arsina.
Este frasco fechado com rolha de vidro esmerilhado. Por esta rolha passa tubo de vidro de
aproximadamente 200 mm de comprimento e dimetro interno de 5 mm. A extremidade inferior
desse tubo estreita-se para dimetro interno de 1 mm. A aproximadamente 15 mm da ponta
desse tubo h um orifcio com dimetro de 2 a 3 mm, que deve estar, no mnimo 3 mm abaixo da
superfcie mais baixa da rolha de vidro. A extremidade superior do tubo superfcie plana e
forma, com o eixo do tubo, ngulo reto. A esta superfcie se ajusta, mediante 2 espirais, outra,
igualmente plana, de outro tubo de vidro com o mesmo dimetro interno e 30 mm de
comprimento. No tubo inferior, colocam-se 50 a 60 mg de algodo com acetato de chumbo ou
chumao de algodo e papel de acetato de chumbo enrolado, com peso aproximado de 50 a 60
mg. Em seguida coloca-se, entre as superfcies planas, disco de papel de brometo mercrio ou
cloreto mercrio com tamanho adequado a recobrir todo o orifcio do tubo.
























Fig. 2 Aparelho para determinao de arsnio
para mtodo visual (dimenses em mm).


Vigilncia Sanitria Digital 116
Preparo da amostra No erlenmeyer dissolver quantidade especificada de substncia em
25 ml de gua. Se for soluo, ajustar volume para 25 ml. Em seguida, acrescentar 15 ml de
cido clordrico, 0,1 ml de soluo cida de cloreto estanoso SR e 5 ml de iodeto de potssio M.
Deixar em repouso por 15 minutos.
Preparo do padro Colocar 1 ml da soluo padro de arsnio (1 ppm As) no frasco
gerador e diluir com gua para 25 ml. Submeter a soluo ao mesmo tratamento dispensado
amostra.
Tcnica Adicionar ao frasco contendo a amostra e quele contendo o padro 5 g de
zinco ativado. Imediatamente aps, ligar o tubo ao frasco gerador e deixar em banho de gua,
temperatura adequada para que a liberao de arsina seja uniforme. Para melhor visualizao da
cor, aps tempo adequado liberao de arsina umedecer os papis com soluo de iodeto de
potssio a 10%, colocada em cpsula de porcelana de 10 cm de dimetro. A cor vermelha inicial
desaparece, intensificando a cor amarela. A cor obtida com a amostra no deve ser mais intensa
que a obtida com o padro.

V.3. 2.6. ENSAIO-LIMITE PARA AMNIA

Dissolver, em tubo de Nessler, a quantidade indicada da substncia em anlise em 14 ml
de gua. Alcalinizar, se necessrio, com hidrxido de sdio 2 M e diluir para 15 ml com gua.
Adicionar 0,3 ml de soluo de iodeto de potssio mercrio alcalino. Tampar o tubo,agitar e deixar
em repouso por 5 minutos. A cor amarela que se produz no deve ser mais intensa que a
produzida pelo tratamento anlogo de mistura de 10 ml de soluo padro de amnia (1 ppm de
NH
3
) e 5 ml de gua.

Soluo padro de amnia (1ppm)

Diluir 40,0 ml de soluo padro de amnia 2,5 ppm (1,0 ml de soluo de cloreto de
amnio 0,00741% (p/V) em gua a 100,0 ml )com gua a 100,0 ml.

V. 3.3. DETERMINAES EM GORDURAS E LEOS

O controle analtico de substncias graxas gorduras, leos, ceras, resinas, blsamos,
entre outras consiste no estabelecimetano de diversas propriedades fsicas e qumicas, ao lado
da avaliao de especificaes de cor, odor, sabor e limites de impurezas. Os principais ensaios
fsicos compreendem determinao da densidade, das temperaturas de fuso e solidificao, do
ndice de refrao, do desvio polarimtrico e da presena de gua e sedimentos. As
determinaes qumicas, por sua vez, constituem o estabelecimento dos chamados ndices, entre
os quais o de acidez, de steres, de saponificao, de iodo, de perxidos, de hidroxila, de acetila
e a dosagem da matria insaponificvel.

Preparo da amostra

Substncias graxas lquidas devem apresentar limpidez. Havendo turvao, aquecer o
material em banho-maria a 50 graus centgrados at seu desaparecimento. Persistindo a turbidez,
filtrar atravs de papel de filtro seco, em funil provido de camisa de gua quente. Homogeneizar e
pesar, de uma vez, todas as amostras necessrias s diversas determinaes.
Substncias slidas temperatura ambiente devem ser mantidas fundidas durante a
amostragem.

V.3.3.1. DETERMINAO DA DENSIDADE RELATIVA

Proceder conforme instrues sob o ttulo Determinao da densidade de massa e
densidade relativa (V.2.5.).

V.3.3.2. DETERMINAO DA TEMPERATURA DE FUSO

Proceder conforme instrues do Mtodo III, sob o ttulo Determinao da temperatura e
faixa de fuso (V.2.2.).

V.3.3.3. DETERMINAO DA TEMPERATURA DE SOLIDIFICAO
Vigilncia Sanitria Digital 117

Temperatura (ou ponto) de solidificao sinnimo de temperatura de congelamento,
constituindo constante fsica para leos e gorduras. A tcnica descrita prev a separao, por
saponificao seguida de hidrlise, dos cidos graxos contidos na amostra, para posterior
determinao da temperatura de solidificao destes.

Separao dos cidos graxos

Transferir 75 ml de soluo de hidrxido de potssio em glicerol (preparar dissolvendo 25
g de hidrxido de potssio em100 ml de glicerol) para bquer de 1000 ml e aquecer a 150 graus
centgrados. Adicionar 50 ml de amostra tratada conforme indicado acima (clarificada e fundida,
se slida) e prosseguir o aquecimento com agitao frequente no permitindo temperatura
ultrapassar 150 graus centgrados. A saponificao dada por concluda quando a mistura
apresentar homogeneidade, sem vestgios de material particulado. Transferir a mistura para outro
bquer de 1000 ml, contendo 500 ml de gua, quase fervente, juntar lentamente 50 ml de soluo
de cido sulfrico a 25% (V/V) e aquecer sob agitao frequente, at separao definida de fase
lmpida (cidos graxos). Lavar a fase graxa com gua fervente a fim de isent-la de cido
sulfrico e mant-la - em bquer pequeno sobre banho-maria fervente at decantao da gua,
deixando lmpida a fase oleosa. Filtrar e recolher a mistura de cidos graxos enquanto ainda
quente em bquer seco e dessec-la a 150 graus centgrados durante 20 minutos. Transferir a
mistura quente para frasco apropriado e mant-la em banho de gelo at solidificao.
Para avaliar o grau de pureza dos cidos graxos separados pelo procedimento acima,
transferir previamente ao congelamento 3 ml da soluo de cidos graxos dessecados para
tubo de ensaio e adicionar 15 ml de etanol. Aquecer a soluo at fervura e juntar 15 ml de
hidrxido de amnio 6 M. A soluo resultante deve ser lmpida.

PROCEDIMENTO

Proceder conforme instrues sob o ttulo Determinao temperatura de congelamento
(V.2.4.).

V.3.3.4. DETERMINAO DO NDICE DE REFRAO

Proceder conforme instrues sob o ttulo Determinao do ndice de refrao (V.2.6.). A
determinao deve ser feita temperatura ambiente e a 40 graus centgrados, respectivamente,
para leos e gorduras.

V.3.3.5. DETERMINAO DO PODER ROTATRIO

Proceder conforme instrues sob o ttulo Determinao do poder rotatrio e do poder
rotatrio especfico(V.2.8.).

V.3.3.6. DETERMINAO DE GUA E SEDIMENTOS

Materiais graxos pouco refinados especialmente os de origem animal contm umidade
e matria estranha, para os quais so estabelecidos limites especificados nas monografias. A
tcnica de determinao de gua e sedimentos em matrias graxas compreende a solubilizao
da frao lipdica da amostra em benzeno e a leitura aps centrifugao, do volume de fase
aquosa contendo sedimento.

Centrfuga

Empregar preferencialmente centrfuga com dimetro de giro (medida da distncia entre
as extremidades dos tubos dispostos na horizontal) entre 38 e 43 cm, ajustando a velocidade de
rotao para 1500 rpm. (evitar o uso de centrfuga angular). Centrfugas de dimensionamento
diverso podem ser empregadas, calculando-se a velocidade de rotao (em rpm) pela frmula

40,6
1500
d
Vigilncia Sanitria Digital 118

em que d corresponde ao dimetro de giro da centrfuga, em cm.
Os tubos devem ser do tipo cnico, providos de tampa com capacidade para 125 ml e
graduados a partir da base.

PROCEDIMENTO

Transferir para dois tubos de centrifugao 50 ml de benzeno e adicionar 5 ml de amostra
(aquecer ligeiramente o leo, se necessrio, para eliminar turvao provocada pela solidificao
de cido esterico). Tampar, agitar os tubos com vigor e imergi-los em banho-maria a 50 graus
centgrados durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos e ler os volumes de gua e
sedimentos nas bases de ambos os tubos. Repetir a operao por mais 10 minutos e repetir a
leitura quantas vezes for necessrio para que 3 leituras sucessivas forneam resultado constante.
Com base na soma dos volumes de depsito dos dois tubos, calcular a porcentagem, em volume,
de gua e sedimentos no material graxo.

V.3.3.7. DETERMINAO DO NDICE DE ACIDEZ

O ndice de acidez pode ser expresso em unidades de massa (mg de hidrxido de
potssio necessrios neutralizao de cidos graxos livres em 1 g de amostra) ou de volume
(ml de hidrxido de sdio 0,1 M necessrios neutralizao dos cidos graxos livres em 10 g de
amostra). A tcnica a seguir compreendendo solubilizao da tomada de ensaio em solvente
orgnico e neutralizao dos cidos graxos livres nela contidos, leva diretamente segunda
definio, nada impedindo, contudo, a conservao do valor determinado para o primeiro
conceito.
ndices de acidez elevados so sugestivos de hidrlise acentuada dos steres que
compe a matria graxa. As causas da degradao incluem tratamentos qumicos integrantes do
processo industrial de extrao e purificao, atividade bacteriana, ao cataltica (calor e luz),
estocagem prolongada em condies inadequadas e a presena de impurezas, especialmente
umidade. Cabe todavia, salientar que a deteco de proporo elevada de cidos graxos livres
em uma amostra de leo ou gordura no guarda relao com grau de rancificao , pois esta
decorre de oxidao pelo ar (e/ou bactrias) dos cidos graxos livres.

PROCEDIMENTO

Pesar exatamente cerca de 10,0 g de amostra e dissolver em erlenmeyer de 250 ml
em 50 ml de mistura de partes iguais de lcool ter previamente neutralizada fenolftalena SI
com hidrxido de sdio 0,1 M SV. No ocorrendo dissoluo, acoplar o frasco ao condensador de
refluxo vertical e aquec-lo lentamente, sob agitao frequente. leos saturados com dixido de
carbono (tcnica de conservao) devem ser solubilizados na mistura solvente e aquecidos sob
refluxo durante 10 minutos para assegurar a expulso de gs. Opcionalmente, podem ser
transferidos previamente amostragem para cpsula de porcelana rasa e mantidos em
dessecador presso reduzida durante 24 horas.
Para neutralizar os cidos graxos livres, juntar 1 ml de fenolftalena SI e titular com
hidrxido de sdio 0,1 M SV at persistncia da cor rsea plida durante 30 segundos sob
agitao. Proceder a ensaio em branco e corrigir o volume de titulante consumido.

V.3.3.8. DETERMINAO DO NDICE DE SAPONIFICAO

Define-se ndice de saponificao como a quantidade, em mg, de hidrxido de potssio
necessria neutralizao dos cidos graxos livres e saponificao dos steres presentes em 1 g
de amostra. leos e gorduras naturais em sua maioria misturas de steres triglicerdicos de
cidos de cadeia longa apresentam ndices de saponificao semelhantes. Entretanto, a
determinao do ndice de saponificao relevante como indcio da presena de cidos
contendo menos de 16 ou mais de 18 tomos de carbono, pelo fato de seu valor ser inversamente
proporcional ao peso molecular mdio dos cidos graxos presentes na amostra. O ndice de
saponificao tambm indicador vlido para adulterao de matria graxa com substncias
insaponificveis (leo mineral, por exemplo).

PROCEDIMENTO
Vigilncia Sanitria Digital 119

Transferir 1,5 a 2,0 g exatamente pesados, de amostra para frasco cnico de 250 ml e
juntar 25 ml de hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV. Acoplar condensador de refluxo vertical
ao frasco e mant-lo em banho de gua fervente durante 30 minutos sob rotao frequente. Se a
amostra for constituda de leo saturado com dixido de carbono (tcnica de conservao),
transferi-la, previamente pesagem, para cpsula de porcelana rasa e mant-la em dessecador
presso reduzida durante 24 horas. Adicionar 1 ml de fenolftalena SI e titular o excesso de
hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV com cido clordrico 0,5 M SV. Proceder determinao
paralela de branco e corrigir o volume de titulante consumido para a amostra. O ndice de
saponificao fornecido pela frmula.

V.f.28,05
IS = -----------------
m
em que
V = volume corrigido de cido clordrico 0,5 M SV consumido
f = fator de correo, se houver, do cido clordrico SV
m = massa, em g, da tomada de ensaio.

V.3.3.9. DETERMINAO DO NDICE DE STERES

Define-se ndice de steres como a quantidade, em mg, de hidrxido de potssio
necessrio saponificao dos steres presentes em 1,0 g de matria graxa. Conclui-se que para
substncias isentas de cidos graxos livres, o ndice de steres corresponde ao ndice de
saponificao. Alm disso, desnecessrio determin-lo quando o ndice de acidez e o de
saponificao forem conhecidos, neste caso, basta subtrair o primeiro do segundo para se chegar
ao ndice de steres.

PROCEDIMENTO

Transferir 1,5 a 2,0 g, exatamente pesados, de amostra para frasco cnico de 250 ml e
juntar 20 a 30 ml de lcool neutralizado fenolftalena SI. Misturar, adicionar 1 ml de fenolftalena
SI e titular com hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV. Neutralizar os cidos graxos livres,
juntar ao frasco 25 ml de hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV e prosseguir conforme indicado
sob Determinao do ndice de saponificao, a partir de Acoplar condensador de refluxo.
A diferena entre o nmero de ml de cido clordrico 0,5 M consumidos no ensaio e o
nmero de ml gastos no branco multiplicada por 28,05 e dividida pelo peso da amostra em
gramas o ndice de ster.

V.3.3.10. DETERMINAO DO NDICE DE IODO

Define-se ndice de iodo como a quantidade em g, de iodo absorvido sob condies
determinadas, por 100 g de matria graxa. O ndice de iodo constitui, pois, medida quantitativa do
grau de insaturao dos cidos graxos esterificados e livres presentes na amostra.
A tcnica descrita baseia-se na incorporao de quantidade exata de mistura de iodo e
bromo amostra; parte adicionada s duplas ligaes das cadeias dos cidos e o excesso de
iodo, liberado pela adio ao meio de quantidade correspondente de iodeto de potssio, titulado
com soluo padro de tiossulfato de sdio.
O valor encontrado na determinao sugestivo do grau de pureza do material ensaiado
assim como da presena de adulterantes: leos secantes (leos de linhaa e de fgado de
bacalhau, por exemplo) apresentam ndices de iodo elevados, acima de 120 enquanto leos no
secantes (azeite de oliva, por exemplo) geralmente fornecem ndices inferiores a 100 e gorduras
animais, tipicamente saturadas, apresentam ndices de iodo reduzidos, abaixo de 90.

PROCEDIMENTO (MTODO DE HANUS)

Transferir cerca de 800 mg de gordura (slida) ou 200 mg de leo, exatamente pesados,
para frasco de iodo de 250 ml e juntar 10 ml de clorofrmio para dissoluo. Adicionar 25 ml de
brometo de iodo SR, tampar o frasco e deix-lo em repouso ao abrigo da luz durante 30 minutos,
sob agitao ocasional. Em seguida, adicionar 30 ml de iodeto de potssio SR e 100 ml de gua
Vigilncia Sanitria Digital 120
(nessa ordem) e titular o iodo liberado com tiossulfato de sdio 0,05 M SV. Prximo viragem (a
soluo titulada adquire cor amarela plida), juntar 3 ml de amido SR e prosseguir titulando at
desaparecimento da cor azul. Executar branco paralelo e proceder necessria correo do
volume de titulante consumido para a amostra. O ndice de iodo obtido pela frmula

V.f.1,269
ndice de 1
2
= ----------------
m

em que
V = volume corrigido de tiossulfato de sdio 0,05 M SV consumido,
f = fator de correo, se houver, do tiossulfato de sdio SV,
m = massa em g, da tomada de ensaio.

Observao: A tomada de ensaio deve ter grandeza adequada para consumir at cerca
de 50% da soluo de brometo de iodo. Do contrrio, o metablito da determinao no
confivel, sendo necessrio repeti-la com tomada de ensaio menor.

V.3.3.11. DETERMINAO DO NDICE DE PERXIDO

O ndice de perxido exprime o volume, em ml, de soluo volumtrica diluda de
tiossulfato de sdio necessrio titulao ... (excesso de iodo) dos perxidos presentes em 1 g
de matria graxa.
O valor encontrado critrio de avaliao para rancidez ... (pr-rancidez, caracterizada
pela formao de perxidos instveis) e indica o estado de conservao da matria graxa. Os
limites so estabelecidos nas monografias.

PROCEDIMENTO

Transferir cerca de 1 g, exatamente pesado, de amostra para ... de iodo de 250 ml e
juntar 25 ml de mistura de 2 volumes de ... actico glacial e 1 volume de clorofrmio, agitando at
dissoluo na amostra. Adicionar 1 ml de soluo saturada de iodeto de ..., tampar o frasco e
deix-lo em repouso durante 1 minuto. Juntar 35 ml de gua e titular o iodo liberado com
tiossulfato de sdio ... SV. Prximo viragem (a soluo titulada adquire cor amarela plida).
Juntar 1 ml de amido SR e prosseguir titulando at desaparecimento da cor azul. Executar branco
paralelo e proceder necessria ... do volume de titulante consumido para a amostra. O ndice de
perxido fornecido pela frmula V/m, em que V o volume corrigido, em ml, ... tiossulfato de
sdio 0,001 M consumido e ... corresponde a massa, em g da tomada de ensaio.

V.3.3.12. DETERMINAO DO NDICE DE HIDROXILA

O ndice de hidroxila exprime a quantidade, em mg, de hidrxido de potssio necessria
neutralizao do cido formado na acilao com anidrido actico das hidroxilas contidas em 1
g de amostra. O mtodo aplicvel a substncias graxas e derivados, inclusive lcoois graxos,
mono e diglicerdios e cidos hidroxiesterico.
O valor determinado inversamente proporcional ao peso molecular das cadeias
constituintes da amostra e ndices muito reduzidos, por exemplo, sugerem adulterao da
substncia com lcoois superiores ou com substncias graxas no alcolicas (parafinas etc...).

PROCEDIMENTO

Transferir a quantidade especificada (Tabela anexa), exatamente pesada, de substncia
para frasco cnico de 250 ml provido de tampa esmerilhada. Juntar 5 ml de mistura anidrido
acticopiridina SR e acoplar o frasco a condensador de refluxo (juntas esmerilhadas). Mant-lo
sob aquecimento em banho-maria fervente durante 1 hora, ajustando o nvel de gua do banho 2
a 3 cm acima do nvel de lquido no frasco. Em seguida, adicionar 10 ml de gua atravs do
condensador e manter sob aquecimento durante 10 minutos adicionais. Deixar resfriar e verter
ainda pelo condensador 15 ml de lcool butlico, previamente neutralizado fenolftalena SI
com hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV. Remover o condensador e aproveitando para
lavar a parede do frasco adicionar mais 10 ml de lcool butlico neutralizado. Adicionar cerca de
Vigilncia Sanitria Digital 121
1 ml de fenolftalena SI e titular com hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV at viragem para
rosa-plido. Tratar, paralelamente, outro frasco da forma descrita acima, omitindo a amostra
(branco).
O clculo do ndice de hidroxila requer a considerao da acidez livre da amostra original.
Para tanto, adotar o volume de titulante obtido na determinao do ndice de acidez da amostra
ou proceder como segue: transferir para frasco cnico, com 125 ml de capacidade, cerca de 10 g
de amostra, exatamente pesados, e juntar 10 ml de piridina recm-preparada e neutralizada
fenolftalena SI com hidrxido de potssio alcolico 0,5 M SV. Juntar cerca de 1 ml de
fenolftalena SI e titular, at viragem para rosa-plido, com hidrxido de potssio alcolico 0,5 M
SV.
Calcular o ndice de hidroxila pela frmula

I
OH
- = (56,11 M/T
1
) [V
1
+ (T
1
V
3
/T
2
) V
2
]

em que
M = molaridade exata da soluo padro de hidrxido de potssio alcolico,
T
1
= massa, em g, da tomada de ensaio empregada para a acetilao,
T
2
= massa, em g, da tomada de ensaio empregada na determinao da acidez livre,
V
1
= volume, em ml, de soluo padro consumida pelo branco,
V
2
= volume, em ml, de soluo padro consumida pela amostra acetilada,
V = volume, em ml, de soluo padro consumida na titulao da acidez livre.

V.3.3.13. DETERMINAO DO NDICE DE ACETILA

O ndice de acetila, cujo objetivo estabelecer o grau de presena de lcoois livres em
substncias graxas, calculado com base na diferena entre ndices de saponificao da
substncia acetilada pela tcnica descrita a seguir e da substncia no-acetilada. Corresponde
quantidade de lcali em mg de hidrxido de potssio necessria neutralizao do cido
actico liberado na hidrlise de 1 g de substncia acetilada.

PROCEDIMENTO

Transferir 10 g de substncia e 20 ml de anidrido actico para balo de fundo redondo e
gargalo longo, com 200 ml de capacidade, fixado a condensador de refluxo. Apoiar o frasco sobre
tela de amianto em cujo centro tenha sido cortado orifcio de cerca de 4 cm de dimetro e aquecer
sobre chama de bico de gs com altura mxima de 25 mm (evitando que a chama alcance a base
do balo). Manter em ebulio regular durante 2 horas, resfriar e transferir o contedo do balo
para bquer de 1000 ml contendo 600 ml de gua. Adicionar 0,2 g de p de pedra-pomes e ferver
durante 30 minutos. Resfriar e transferir a mistura para funil de separao, rejeitando a camada
aquosa inferior. Lavar a substncia acetilada com 3 ou mais pores de 50 ml de soluo
saturada quente de cloreto de sdio at que a soluo de lavagem no mais fornea reao cida
ao papel de tornassol. Juntar ainda 20 ml de gua quente ao funil e agitar, removendo, em
seguida, o mais completamente possvel, a fase aquosa. Transferir a substncia para cpsula de
porcelana, juntar 1 g de sulfato de sdio pulverizado (desidratante), misturar bem e filtrar atravs
de papel de filtro pregueado.

Determinar o ndice de saponificao da substncia original, no-acetilada, e da
substncia acetilada pelo procedimento acima e calcular o ndice de acetila pela frmula

(b a) 1335
IAc = ----------------------
1335 a

em que

a = ndice de saponificao da substncia original,
b = ndice de saponificao da substncia acetilada.

V.3.3.14. DETERMINAO DE MATRIA INSAPONIFICVEL

Vigilncia Sanitria Digital 122
Matria insaponificvel em gorduras e leos a parcela de substncia que, embora
solvel em solventes lipfilos clssicos; no se deixa saponificar por hidrxidos alcalinos.
Igualmente includos na definio esto os produtos de saponificao lipossolveis.
A frao insaponificvel de leos e gorduras geralmente consiste de fitosterides ou
colesterol e taxa anormalmente elevados indicam a presena de adulterantes.

PROCEDIMENTO

Na falta de especificao de tomada de ensaio na monografia, transferir 5,0 g,
exatamente pesados, de matria graxa para frasco cnico de 250 ml, juntar soluo de 2 g de
hidrxido de potssio em 40 ml de lcool e aquecer o frasco durante 2 horas sob banho-maria
fervente, acoplando-lhe previamente condensador de refluxo vertical. Retirar o condensador e
prosseguir no aquecimento at evaporao do lcool e dissolver o resduo em 50 ml de gua
quente. Transferir a soluo para funil separador provido de tampa de politetrafluoretileno
(Teplon), lavando o frasco com 2 pores de 25 ml de gua e juntando tambm essa gua no
funil. Resfriar temperatura ambiente, juntar algumas gotas de lcool para precipitar a separao
de fases e extrair a fase oleosa com 2 pores de 50 ml de ter etlico, combinando os extratos
etreos em outro funil separador. Lavar os extratos combinados com 20 ml de hidrxido de sdio
0,1 M, com 20 ml de hidrxido de sdio 0,2 M e, finalmente, com pores de 15 ml de gua at
que a ltima no se avermelhe pela adio de 2 gotas de fenolftalena SI. Transferir os extratos
etreos, bem como poro de 10 ml de ter etlico empregado na lavagem do funil, para copo
tarado. Evaporar o ter at secura em banho-maria fervente e dessecar o resduo durante 30
minutos a 100 graus centgrados. Esfriar em dessecador durante 30 minutos e pesar o resduo
(substncia insaponificvel na tomada de ensaio). Calcular o resultado em porcentagem.

V. 3 4. ENSAIOS

V.3.4.1. TITULAES POR DIAZOTAO

O doseamento com nitritos mtodo de utilidade na determinao quantitativa de aminas
aromticas primrias, em geral, e de sulfonamdicos,em particular.
Existem, basicamente, dois mtodos de doseamento com nitritos:
O mtodo 1 emprega como indicador goma de amido iodetado ou papel de amido
iodetado. O excesso de cido nitroso, em consequncia da reao com o cido ioddrico do
indicador, libera iodo, responsvel pela cor azul caracterstica da reao com o amido.
O mtodo 2 compreende a determinao potenciomtrica do ponto final da titulao. Este
mtodo emprega eletrodos adequados platina calomelano ou platina-platina -, que devem ter
diferena de potencial de 50 a 100 mV. A sensibilidade do dispositivo que mede a corrente deve
variar de 0,1a 1 Na. Pode-se utilizar agitao mecnica ou magntica,ou, eventualmente, corrente
de nitrognio atravs da soluo para mistur-la. Aps o uso, deve-se ter o cuidado de imergir os
eletrodos por alguns segundos em cido ntrico SR ao qual se adicionou 1 mg/ml de cloreto
frrico, lavando-os em seguida com gua.

MTODO 1

Tcnica Pesar exatamente cerca de 500 mg, em se tratando de derivado sulfonamdico,
ou quantidade especificada na monografia correspondente, quando se trata de outro tipo de
amina aromtica primria. Transferir para erlenmeyer de 250 ml, adicionando, com agitao, 100
ml de cido clordrico SR para dissolver a amostra. Em seguida, adicionar cerca de 30 ml de gua
e 20 g de gelo picado. Aps resfriamento a aproximadamente 15 graus centgrados, titular a
amostra lentamente com soluo de nitrito de sdio 0,1 M SV, previamente padronizada com
sulfanilamida padro. Atinge-se o ponto final de titulao quando uma gota de lquido da soluo
de erlenmeyer der imediatamente mancha azul sobre goma de amido iodetado SI colocada em
placa de toque, ou sobre papel de amido iodetado SI umedecido. Para se comprovar o trmino da
titulao, repetir a prova de toque 2 minutos aps a ltima adio. Esta deve continuar positiva.
Caso tenha sido empregado, inadvertidamente, excesso de titulante, adicionar quantidade
conhecida de sulfonamdico e proceder titulao por retorno. Para tanto, acrescentar quantidade
conhecida da amostra e titular o excesso com soluo de nitrito de sdio 0,1 M SV.
O peso, em mg, da amostra correspondente a cada ml de nitrito de sdio 0,1 M SV
encontra-se descrito na monografia de cada frmaco em particular.
Vigilncia Sanitria Digital 123

MTODO 2

Tcnica Pesar exatamente cerca de 500 mg, quando se tratar de sulfonamdico, ou a
quantidade especificada na monografia, quando se tratar de outras aminas aromticas primrias.
Transferir para erlenmeyer e adicionar 20 ml de cido clordrico SR e 50 ml de gua. Agitar at
dissoluo. Resfriar para 15 graus centgrados, mantendo esta temperatura no curso da titulao.
Caso for especificado, acrescentar catalizador adequado. Titular, lentamente e sob agitao, com
nitrito de sdio 0,1 M SV, previamente padronizado com sulfanilamida. A ponta da bureta deve
permanecer pouco acima da superfcie da soluo, a fim de evitar a oxidao do nitrito de sdio.
Deve-se, outrossim, impedir a agitao rpida, que forma um vrtice de ar abaixo da superfcie.
No incio da titulao, a agulha do registrador apresenta deflexo a cada volume do titulante
adicionado, voltando, em seguida, ao ponto de origem. Quando a titulao estiver a
aproximadamente 1 ml do ponto final calculado, acrescentar volumes de 0,1 ml em intervalos de,
no mnimo, 1 minuto. Ao se atingir o ponto final da titulao, no se observa deflexo alguma.
O peso, em mg, da amostra que equivale a cada ml de nitrito de sdio 0,1 M SV
adicionado encontra-se especificado na monografia de cada frmaco em particular.
No doseamento de sulfonamdicos ou outras aminas aromticas primrias na forma de
comprimidos, determinar o peso mdio de 20 comprimidos e, aps pulverizao, pesar o
equivalente a 500 mg de princpio ativo. No caso de injetveis ou outras formas lquidas deve-se
pipetar quantidade equivalente a 500 mg de princpio ativo. No restante, o procedimento
anlogo.

V.3.4.2. DETERMINAO DE NITROGNIO PELO MTODO DE KJELDAHL

O mtodo de Kjeldahl, descrito na forma de macro e de semi-microtcnica, destina-se
determinao de nitrognio em substncias relativamente lbeis como amidas e aminas.
Compreende duas fases (1) mineralizao digesto cataltica da substncia orgnica em cido
sulfrico com a decorrente converso quantitativa do nitrognio presente em sulfato de amnio,
(2) destilao do digesto alcalinizado, sendo a amnia liberada no processo doseado por
volumetria.

V.3.4.2.1. MTODO I (MACRODETERMINAO)

Transferir cerca de 1 g de amostra, exatamente pesado, para balo de Kjeldahl de 500 ml.
Juntar 10 g de sulfato de potssio, 0,5 g de sulfato cprico e 20 ml de cido sulfrico. Inclinar o
balo cerca de 45 graus e aquecer lentamente, mantendo a temperatura abaixo do ponto de
ebulio enquanto houver desenvolvimento de espuma. Aumentar a temperatura at que o cido
ferva de modo regular e prosseguir no aquecimento at 30 minutos aps a mistura ter ficado
lmpida e adquirido cor verde-clara. Deixar esfriar, juntar 150 ml de gua, misturar e esfriar
novamente. Juntar cuidadosamente 100 ml de soluo a 40% (p/V) de hidrxido de sdio,
permitindo que o lcali escorra pela parede do balo e forme fase independente sob a soluo
cida. Adicionar pequena quantidade de zinco granulado e, sem demora, conectar o balo ao
bulbo de isolamento previamente fixo a condensador, cuja outra extremidade esteja imersa em
100 ml de soluo a 5% (p/V) de cido brico em erlenmeyer de 500 ml. Misturar as fases no
balo, por agitao suave, e destilar at que cerca de 80-% do volume contido no balo tenham
sido destilados. Adicionar cerca de 3 gotas de vermelho de metila SI ao frasco receptor e titular
com cido sulfrico 0,25 M SV . Fazer ensaio em branco e proceder necessria correo no
volume de titulante consumido. Cada ml de cido sulfrico 0,25 M SV equuivale a 7,003 mg de
nitrognio. Para amostras com baixos nveis de nitrognio, empregar cido sulfrico 0,05 M SV.
Neste caso, cada ml equivale a 1,401 mg de nitrognio.

Na presena de nitratos ou nitritos

Transferir quantidade exatamente pesada de amostra, correspondendo a cerca de 150
mg de nitrognio, para balo Kjeldahl de 500 ml e juntar 25 ml de cido sulfrico contendo 1 g de
cido saliclico dissolvido. Misturar e aguardar durante cerca de 30 minutos,agitando com
frequencia. Juntar 5 g de tiossulfato de sdio, misturar e, em seguida, adicionar 0,5 g de sulfato
cprico. Prosseguir conforme indicado na tcnica j descrita, a partir de Inclinar o balo cerca de
45 graus centgrados.... Quando o contedo de nitrognio na amostra exceder 10%, juntar
Vigilncia Sanitria Digital 124
previamente digesto 0,5 a 1,0 g de cido benzico para facilitar a decomposio da
substncia.

V. 3.4.2.2. MTODO II (SEMI-MICRODETERMINAO)

Transferir quantidade exatamente pesada de substncia,correspondente a 2 3 mg de
nitrognio, para balo de Kjeldahl compatvel com o aparelho. Juntar 1 g de sulfato de potssio
0,1 g de sulfato cprico e, se for o caso, lavar os slidos aderentes ao gargalo com fino jato de
gua. Juntar 7 ml de cido sulfrico e, em seguida, 1 ml de perxido de hidrognio a 30% (V/V),
tomando a precauo de, nas duas adies, permitir que, os lquidos escorram pela parede do
balo. Aquecer o frasco e manter a digesto at desaparecimento dos resduos de carbonizao
e a soluo azul-clara se mostrar perfeitamente lmpida. Cuidadosamente, juntar 20 ml de gua e
esfriar. Conectar o balo ao aparelho de destilao indireta, por vapor e, atravs do funil, juntar 30
ml de soluo a 40% (p/V) de hidrxido de sdio. Lavar o funil com gua e, sem demora, proceder
destilao. Recolher o destilado em erlenmeyer de 250 ml contendo 15 ml de soluo a 5%
(p/V) de cido brico, cerca de 25 ml de gua e 3 gotas de vermelho de metila SI. Certificar-se de
que a extremidade do condensador esteja imersa por meio de tubo de vidro ligado ao
condensador por junta apropriada no lquido coletor, antes de iniciar a destilao. Destilar at
que o volume de destilado atinja 80 a 100 ml, remover o frasco coletor, lavar as paredes com
pequena quantidade de gua e titular com cido sulfrico 0,005 M SV. Fazer ensaio em branco e
proceder necessria correo no volume de titulante consumido. Cada ml de cido sulfrico SV
equuivale a 0,1401 mg de nitrognio.

V.3. 4.3. MTODO DE COMBUSTO EM FRASCO DE OXIGNIO

O mtodo de frasco de combusto constitui variedade de anlise elementar destinada
identificao e/ou doseamento de substncias orgnicas segundo seu contedo em halognios
ou enxofre.
A amostra submetida combusto em frasco apropriado, em ambiente de oxignio,
sendo o halognio gasoso ou dixido de enxofre formados no processo absorvidos em solues
apropriadas, nas quais so convertidos em formas qumicas doseveis por mtodos volumtricos.

APARELHAGEM

Compreende frasco de iodo de parede grossa (cerca de 2 mm), de vidro refratrio
resistente, com capacidade nominal de 500 ml. Para a tcnica de determinao de flor,
emprega-se frasco de quartzo.
A base da tampa esmerilhada que acompanha o frasco, fixa-se, por fuso, segmento de
basto de vidro ao qual, tambm por fuso, fixado fio de platina em cuja extremidade se
encontra anexada rede de platina com abertura de malha 425 um. As dimenses encontram-se
na ilustrao anexa.













Frasco de oxignio para anlise de enxofre e halognios

PROCEDIMENTO

Amostras slidas


Vigilncia Sanitria Digital 125
Pesar a quantidade especificada de substncia (correspondente a cerca de 2 3 mg do
elemento sob anlise) em pedao de papel de filtro de formato e dimenses apropriadas, dobrar e
prender o pacote assim preparado na tela de platina, deixando livre a mecha. Umedecer o gargalo
do frasco com gua, colocar em seu interior a soluo absorvente especificada e borbulhar
oxignio nesta soluo com o intuito de expulsar o ar e saturar o ambiente do frasco e a soluo
absorvente com o gs. Acender a mecha (veja Nota 1) e, sem demora, colocar a tampa no frasco,
mantendo-a em posio com firmeza para evitar seu deslocamento devido presso exercida
pelos gases de ignio. Iniciada a combusto, inverter o frasco para assegurar vedao lquida na
tampa, tomando a precauo de evitar que material incompletamente queimado caia no lquido.
Concluda a combusto, agitar o frasco ocasionalmente, at que a fumaa branca formada no
processo desaparea. Decorridos 15 a 30 minutos, colocar pequena poro de gua na borda do
frasco e remover a tampa, permitindo que esta gua flua para o interior do frasco, lavando as
paredes do gargalo. Lavar tampa, gargalo, fio e rede de platina com gua e juntar estas guas de
lavagem soluo absorvente. A soluo obtida segundo este procedimento designada
soluo-amostra. Para o preparo do branco, proceder da maneira descrita, omitindo a amostra
(Nota 2).

Amostras lquidas

Enrolar pequena quantidade de algodo absorvente em pedao de papel de filtro provido
de mecha e pesar, neste dispositivo, a quantidade especificada da amostra, que absorvida no
algodo. Aps a fixao do algodo envolvido no papel de filtro grade de platina, proceder
combusto tal como descrita para amostras slidas.

Determinao de cloro e bromo

Queimar a quantidade especificada de substncias sob exame de forma descrita,
empregando como soluo absorvente 20 ml de gua acrescidos de 1 ml de perxido de
hidrognio (100 volumes) e 3 ml de hidrxido de sdio 0,1 M. Concluda a absoro, juntar 2
gotas de azul de bromofenol SI e quantidade suficiente de cido ntrico 0,1 M para virar o
indicador de azul para amarelo, incorporando 0,5 ml de excesso. Se a substncia em anlise
contiver enxofre, adicionar algumas gotas de nitrato de brio 0,005 M. Juntar 100 ml de etanol
aproveitando a adio para lavar as paredes internas do frasco e, em seguida, 15 gotas de
difenilcarbazona SI. Titular com nitrato de mercrio (II) 0,005 M SV at colorao rsea
permanente. Cada ml de nitrato de mercrio (II) 0,005 M SV equivale a 0,3550 mg de cloro ou a
0,79904 mg de bromo.

Determinao de iodo

Queimar a quantidade especificada de substncia sob exame da forma descrita,
empregando como lquido absorvente 10 ml de gua acrescidos de 2 ml de hidrxido de sdio M.
Concluda a absoro, juntar 1 ml de soluo de hidrato de hidrazina 4 M em gua, tampar
novamente o frasco e agitar at descoramento da soluo. Em seguida, proceder como descrito
em Determinao de cloro e bromo a partir de Concluda a absoro.... Cada ml de nitrato de
mercrio (II) 0,005 M SV equivale a 1,269 mg de iodo.

Determinao de flor

Queimar quantidade especificada de substncia sob exame da forma descrita,
empregando como lquido absorvente 15 ml de gua. Completada a operao, lavar tampa, fio de
platina, tela de platina e paredes do frasco (Nota 3) com 40 ml de gua. Adicionar 0,6 ml de
alizarina SI e, em seguida, gota a gota, hidrxido de sdio 0,1 M at que a cor mude de rosado
para amarelo. Adicionar 5 ml de soluo tampo de acetato pH 3 e titular com nitrato de trio
0,005 M SV at que a cor amarela mude para amarelo rosado. Cada ml de nitrato de trio 0,005
M SV equivale a 0,380 mg de flor. Havendo dificuldade na identificao do ponto de viragem,
fazer ensaio preliminar com soluo padronizada de flor inorgnico.

Determinao de enxofre

Vigilncia Sanitria Digital 126
Queimar a quantidade especificada de substncia sob exame da forma descrita,
empregando como lquido absorvente 12,5 ml de perxido de hidrognio SR.Concluda a
absoro, juntar 40 ml de gua, aproveitando para lavar tampa, fio e tela de platina e paredes do
frasco. Ferver a soluo por 10 minutos, esfriar, adicionar 2 ml de cido actico SR e 20 ml de
etanol SR. Titular com nitrato de brio 0,01 M SV, usando 2 gotas de torina SI e 2 gotas de cloreto
de metiltionnio SI como indicador at que a cor amarela mude para rsea. Cada ml de nitrato de
brio 0,01 M SV equivale a 0,3206 g de enxofre.

NOTAS

1. Recomenda-se ao analista usar, culos de segurana e proteo adequada para evitar
que estilhaos de frasco o atinjam em caso de acidente.
2. Assegurar-se de que os frascos de combusto estejam escrupulosamente limpos e
isentos de traos de solventes orgnicos.
3. Substncias contendo flor fornecem teores baixos se a combusto for executada em
frascos de vidro borossilicato. Obtm-se resultados satisfatrios em frascos de vidro-soda isento
de boro mas o rendimento ideal implica no emprego de frascos de slica (quartzo).

V.3.4.4. TITULAES COMPLEXOMTRICAS

Complexometria mtodo analtico volumtrico que compreende a titulao de ons
metlicos com agentes chamados complexantes. A reao envolvida do seguinte tipo:

M
n+
+ C
m-
MC
n-m


Muitos complexantes, denominados quelantes, so capazes de formar estruturas cclicas
atravs da coordenao simultnea de vrios grupos da molcula, junto ao on metlico. O cido
edtico (etilenodiaminatetractico, EDTA) exemplo tpico. Este cido consiste no agente
complexante mais utilizado em complexometria.
Como a maioria dos agentes complexantes, o EDTA apresenta vrios equilbrios cido-
base em funo do pH:

OH OH- OH-
H
4
EDTA H EDTA - H
2
EDTA
2OH-
MEDIA
3-
EDTA
4-

H+ H+ H+ H+

Em pH 2, 3, 50% do EDTA esto presentes na forma de H
3
EDTA-; em pH 4,5 cerca de
90% encontram-se
na forma de H
2
EDTA
2-
. Em pH 8,1, todo o EDTA encontrado na forma de HEDTA.
Acima de pH 12,5, o EDTA estar ionizado completamente.
Desta maneira, a formao de complexos em soluo compreende uma srie de equilbrio
do tipo:

M
n+
+ H
x
EDTA
x4
M(H
y
EDTA)
n+y-4
+ (x-y)
H+


Na complexometria, o ponto de viragem pode ser determinado visual ou
instrumentalmente. Via de regra empregam-se indicadores complexantes que exibem profundas
alteraes de cor mediante coordenao com o metal. Exemplos tpicos so: cido
calconcarboxlico, alaranjado de xilenol, calcona, calmagita, murexida, negro de eriocromo-T e
violeta de pirocatecol.
O indicador complexomtrico atua de forma competitiva com o agente titulante, e devendo
ser deslocado efetivamente pelo mesmo nas proximidades do ponto de equivalncia. De modo
anlogo ao agente titulante, a ao do indicador tambm afetada pelo pH. Assim, a escolha
adequada do indicador e o controle do pH (por exemplo, atravs de tampes) tornam-se fatores
decisivos na anlise complexomtrica.
H quatro tipos de titulao complexomtrica: direta, por retorno, por substituio e
indireta.
Na titulao direta, que mais simples e mais frequentemente usada, adiciona-se soluo
padro do agente quelante soluo contendo o on metlico at o ponto de viragem, que
detectado por mtodo conveniente. Emprega-se este mtodo para dosear, pelo EDTA, os ons
Vigilncia Sanitria Digital 127
alumnio, ferro (II), clcio, magnsio, zinco, cdmio, cobre (II), nquel, cobalto, chumbo (II), brio,
mangans, mercrio e muitos outros.
Na titulao por retorno adiciona-se excesso conhecido da soluo padro do agente
quelante de on metlico e titula-se este excesso por retorno com soluo padro de um
segundo on metlico, at viragem. Por este mtodo podem ser doseados chumbo (II), alumnio,
mercrio (II) e nquel. Uma das vantagens deste mtodo a possibilidade de titular metais na
forma de sais insolveis; assim, o sulfato de brio dissolvido em excesso de EDTA amoniacal e
titula-se por retorno com magnsio.
A titulao por substituio consiste em deslocar quantitativamente um segundo metal M
II de um complexo pelo metal M I que est sendo doseado e, em seguida, dosear diretamente,
por soluo padro do agente quelante, o segundo metal assim liberto; a partir destes dados
calcula-se o teor de M I no sistema. Usa-se este mtodo para dosear clcio, chumbo, mercrio e
ferro (III).
A titulao indireta usada para dosear ons, tais como nions, que no reagem com um
agente quelante. Duas maneiras so utilizadas neste mtodo:
a) Precipita-se quantitativamente a substncia doseada fazendo-a reagir com um on
metlico; retira-se complexo por filtrao; redissolve-se este complexo com excesso de soluo
padro de EDTA e titula-se este excesso com soluo padro de um on metlico apropriado.
Usando-se este artifcio possvel dosear barbitricos, que no reagem com o EDTA, pela
anlise complexomtrica.

Barbiturato + Hg (II) Complexo Hg-Barbiturato
(precipitao)

Complexo Hg-Barbiturato + EDTA em excesso Barbiturato +
+ Hg-EDTA + EDTA (dissoluo)

H
2
EDTA
2-
+ Zn
2+
Zn-EDTA
2-
+ 2H+
(titulao)

b) Precipita-se o nion com excesso de metal apropriado e titula-se o metal em excesso
no filtrado com soluo padro de EDTA. Desta maneira possvel dosear, por exemplo, os
sulfatos.

SU
2-
+ Ba
2+
em excesso BaSO
4
+ Ba
2+
(precipitao)
4

Ba
2+
+ EDTA
4-
Ba - EDTA
2-
(titulao)

PROCEDIMENTOS

Alumnio

Pesar exatamente a quantidade da substncia indicada na monografia, dissolver em 2 ml
de cido clordrico M e 50 ml de gua, salvo se a monografia indicar outro tipo de solvente. Juntar
25 ml de EDTA dissdico 0,1 SMV e 10 ml da mistura, em volumes iguais, da soluo de acetato
de amnio 2 M e cido actico 2 M. Aquecer at ebulio, deixando a soluo ferver durante 2
minutos. Resfriar. Juntar 50 ml de etanol e 3 ml de soluo recm-preparada de ditizona em
etanol 0,025% (p/V). Titular o excesso de EDTA dissdico com sulfato de zinco 0,1 M SV at
mudana da cor de azul-esverdeada para violeta-rsea. Cada ml de EDTA dissdico 0,1 M SV
equivalente a 2,698 mg de alumnio.

Bismuto

Pesar exatamente a quantidade da substncia indicada na monografia e dissolver em
quantidade mnima de cido ntrico 2 M. Juntar 50 ml de gua e ajustar o pH a 1,0 2,0
adicionando gota a gota, e com agitao, cido ntrico 2 M ou hidrxido de amnio 5 M. Usar
como indicador alaranjado de xilenol SI. Titular lentamente com EDTA dissdico 0,05 M SV at
mudana de cor de violeta-rsea para amarela. Cada ml de EDTA dissdico 0,05 M SV
equivalente a 10,45 mg de bismuto.
Vigilncia Sanitria Digital 128

Clcio

Pesar exatamente a quantidade da substncia indicada na monografia, dissolver em
alguns ml de gua e acidificar, se necessrio,com quantidade mnima de cido clordrico 2 M.
Diluir a aproximadamente 100 ml com gua. Titular com EDTA dissdico 0,05 MSV at cerca de 2
ml antes do ponto de equivalncia previsto. Adicionar 4 ml de hidrxido de sdio 10 M e gotas de
calcona SI. Prosseguir a titulao at que a cor mude de rsea para azul intensa. Cada ml de
EDTA dissdico 0,05 M SV equivalente a 2,004 mg de clcio.

Chumbo

Pesar exatamente a quantidade da substncia indicada na monografia e dissolver em 5 a
10 ml de gua, ou na quantidade mnima de cido actico 5 M. Diluir a 50 ml com gua. Juntar
gotas de alaranjado de xilenol SI e metenamina suficiente (aproximadamente 5 g) para que a
soluo adquira cor violeta. Titular com EDTA dissdico 0,05 M SV ou 0,1 M SV, conforme
indicado na monografia, at mudana de cor de violeta para amarela. Cada ml de EDTA dissdico
0,05 M SV equivalente a 10,35 mg de chumbo.

Magnsio

Pesar exatamente a quantidade da substncia indicada na monografia e dissolver em 5 a
10 ml de gua, ou na quantidade mnima de cido clordrico 2 M. Diluir a 50 ml com gua. Juntar
10 ml de soluo-tampo de cloreto de amnio, pH 10,0, e negro de eriocromo T SI. Titular com
EDTA dissdico 0,05 MSV ou 0,1 MSV, conforme indicado na monografia, at mudana da cor de
violeta para azul. Cada ml de EDTA dissdico 0,05 MSV equivalente a 1,215 mg de magnsio.

Zinco

Pesar exatamente a quantidade de substncia indicada na monografia e dissolver em 5 a
10 ml de alaranjado de xilenol SI e metenamina suficiente (cerca de 5 g) para conferir cor violeta
soluo. Titular com EDTA dissdico 0,05 M S ou 0,1 MSV, conforme indicado na monografia, at
mudana da cor de violeta para amarela. Cada ml de EDTA dissdico 0,05 M SV equivalente a
3,268 mg de zinco.

V.3.4.5. TITULAES EM MEIO NO-AQUOSO

Os frmacos que no podem ser doseados em meio aquoso, por serem demasiadamente
pouco bsicos ou pouco cidos, so doseados em meio no aquoso, que mtodo rpido e
exato, permitindo, alm disso, dosear misturas de frmacos.
Visto que, neste mtodo de doseamento, se usam solventes orgnicos, deve-se levar em
conta o alto coeficiente de expanso cbica da maioria em relao ao da gua. Isso porque h
possibilidade de ocorrer variao do teor de titulante em meio no-aquoso em funo da
temperatura. Corrigi-se, ento, o volume do titulante e, por conseguinte, seu ttulo, multiplicando-o
pela frmula.

[ 1 + coeficiente de expanso cbica do solvente (t
o
t)]

em que

t
o
= temperatura de padronizao do titulante,
t = temperatura de utilizao do titulante.

So inmeros os compostos qumicos, incluindo os frmacos, que podem ser doseados
com vantagem em meio no-aquoso: cidos carboxlicos, aminocidos, andrido de cidos, enis
do tipo dos barbitricos e das xantinas, fenis, haletos de cidos, imidas, pirris, sulfas, aminas,
compostos de amnio quaternrio, compostos heterocclicos nitrogenados, sais alcalinos dos
cidos orgnicos, sais alcalinos dos cidos inorgnicos, alguns sais de aminas.
A titulao em meio no-aquoso baseia-se no conceito cido-bsico de Bronsted-Lowry.
Segundo esses autores, cido p a substncia que tem a capacidade de doar prtons e base
Vigilncia Sanitria Digital 129
aquela que tem a capacidade de receber prtons. Assim, substncias potencialmente cidas
podem funcionar como cidos somente em presena de base qual possam doar prton e vice-
versa. O solvente desempenha, por conseguinte, papel muito importante na determinao do
carter cido- bsico de uma substncia, j que dele depende o meio necessrio para que um ou
outro carcter seja ressaltado, A gua deveria ser o solvente de escolha, porquanto de fcil
disponibilidade. No entanto, por seu carcter anofotrico cido e bsico pode competir com a
base ou com o cido a ser determinado pela captao ou doao do prton se tais compostos
forem mais fracos do que a gua. Tais substncias no seriam, portanto, titulveis em meio
aquoso.
Como resultado da interao entre soluto e solvente, dois so os efeitos possveis de
serem observados: efeito nivelador e efeito diferenciado do solvente. Pelo efeito nivelador no se
pode comparar a fora, quer cida quer bsica, de dois solutos, visto que se mostraro idnticos
neste particular. Assim que, em gua, os cidos carboxlicos so fracos, mas tornam-se
completamente ionizados quando em amnia lquida. A alta basicidade desta ltima exerce,
portanto, efeito nivelador sobre as foras aparentes dos cidos nela dissolvidos. Os cidos
carboxlicos assemelham-se, nestas condies, aos cidos minerais comuns, fortemente cidos.
Analogamente, a fora aparente de uma base pode ser ressaltada pelo efeito nivelador de
solventes cidos. Assim, aminas, teres, amidas, cetonas e nitrocompostos e mesmo certos
hidrocarbonetos aromticos so fracamente bsicos na presena de gua. Tornam-se, contudo,
fortes ao serem dissolvidos em cido sulfrico 95 a 100%, que exerce, com isso, seu efeito
nivelador. A medida que a acidez do solvente diminui, na seguinte ordem : cido sulfrico, cido
actico, fenol, gua, piridina e butilamina, as bases vo se tornando progressivamente mais
fracas at que percam, com exceo das mais fortes, suas caractersticas bsicas.
Atravs do efeito diferenciador pode-se, em presena de dois cidos em .... proceder
comparao de suas foras. Em solvente fracamente protoflico, como o cido actico glacial, que
forma on acetnico por adio de um prton, pode-se ordenar de forma decrescente a fora de
cidos minerais nele dissolvidos, como segue cido ntrico. Analogamente, o cido actico
perclrico, cido bromdrico, cido sulfrico, cido clordrico e cido actico, por ser anfiprtico,
exerce efeito diferenciador em mistura de bases fracas ou muito fracas.
Os solventes empregados na titulao em meio no-aquoso devem satisfazer certas
exigncias: (1) no devem sofrer reaes secundrias com a substncia, tampouco com o
titulante; (2) devem dissolver a substncia permitindo, no mnimo, preparo de soluo 0,01 M; (3)
devem dissolver o produto da titulao. Se a precipitao for, contudo, inevitvel, o precipitado
deve ser compacto e cristalino, ao invs de volumoso e gelatinoso; (4) devem permitir com
facilidade a visualizao do ponto final, seja este medido mediante o uso de indicadores, seja
mediante potencimetro; (5) devem ser de baixo custo e de fcil purificao.
Para a titulao de substncias de carcter bsico aminas, heterocclicos nitrogenados,
oxazolinas, compostos de amnio quartenrio, sais alcalinos de cidos orgnicos e de
inorgnicos fracos e alguns sais de aminas empregam-se solventes de natureza relativamente
neutra ou cida, sendo o cido actico glacial o mais empregado. O anidrido actico reserva-se a
bases muito fracas, como amidas. Tem igualmente a finalidade de evitar o excesso de gua
eventualmente presente como umidade absorvida ou de hidratao do frmaco. A diozana
frequentemente utilizada com cido actico, uma vez que muitas vezes se recomenda mistura de
solventes aprticos com cidos. Para as de difcil dissoluo pode-se empregar mistura de glicis
com outros solventes. Como titulante emprega-se geralmente, a soluo de cido perclrico em
cido actico. Outros titulantes teis so cido perclrico em dioxana, cido p-toluenossulfnico
(cido tsico) e cido fluorsulfnico. O mtodo de deteco do ponto final do doseamento varia de
acordo com o pKa das bases em gua. Para aquelas que apresentam pKa da ordem de 4, a
deteco , em geral, por meio de indicadores; para as que apresentam pKa entre 1 e 4, a
deteco potenciomtrica. Nesse caso, o eletrodo de vidro-calomelano til. Em cido actico,
tal eletrodo funciona de acordo com o previsto teoricamente. No caso do eletrodo de calomelano
como referncia, vantajoso substituir a ponte salina de cloreto de potssio aquoso por
perclorato de ltio 0,1 M em cido actico glacial. Aps remoo do cloreto de potssio aquoso,
lavar com gua e depois com solvente no-aquoso.
Quando se trata de sais de cidos halogenados cloridrato, bromidrato e iodidrato
deve-se adicionar acetato de mercrio, que no se dissocia em soluo de cido actico. O on
haleto, base demasiadamente fraca para reagir quantitativamente com cido perclrico em cido
actico, substitudo quantitativamente pelo on acetato, que em cido actico base forte.
Quando se emprega cido perclrico 0,1 M SV podem-se utilizar quantidades de acetato de
mercrio superiores a 3 g, sem risco de reaes secundrias. Quando se trata de cido perclrico
Vigilncia Sanitria Digital 130
0,01 MSV, recomenda-se que a quantidade de acetato de mercrio no ultrapasse 2 moles por
mol de composto em exame.
Para a titulao de substncias que se comportam como cidos cidos halogenados,
anidridos de cidos, cidos carboxlicos, aminocidos, enis do tipo de barbitricos e xantinas,
imidas, fenis, piriis e sulfas, empregam-se como solventes os de natureza bsica ou aprtica.
Para os que tem acidez mdia, utiliza-se bases mais fracas, como dimetilformamida a presena
de gua pode provocar hidrlise, produzindo cido frmico, que interfere na titulao -,
frequentemente empregada, e piridina. Em se tratando de cidos fracos, empregam-se bases
mais fortes, como morfolina, etilenodiamina e n-butilamina. Alm dessas, certos lcoois e cetonas
encontram emprego nessas determinaes. Outrossim, selecionado adequadamente os solventes
bsicos, pode-se proceder determinao seletiva em mistura de cidos. importante que se
protejam os solventes da exposio excessivas atmosfera, devido interferncia de CO
2
na
reao. Por isso, pode-se empregar atmosfera inerte ou aparelho especial, durante a titulao.
Para determinar a absoro de CO
2
deve-se proceder titulao do branco, que no deve
exceder 0,01 ml do metxido de sdio 0,1 M SV por ml de solvente. Duas classes de titulantes
podem ser empregadas para determinao de substncias de carter cido (1) os alcxidos de
metais alcalinos e (2) os hidrxidos de alquilamnio quaternrio. Dos alcxidos, o metxido de
potssio, em mistura de metanol- tolueno ou metanol-benzeno, o mais empregado. O metxido
de ltio em metanol-benzeno utilizado para os compostos que formam precipitado gelatinoso
mediante titulao com metxido de sdio. Dos hidrxidos, o mais utilizado o hidrxido de
tetrabutilamnio. O mtodo de deteco do ponto final no doseamento de cidos de pKa em gua
em torno de 7 pode ser feito com o uso de indicador. Por outro lado, para os cidos com pKa
entre 7 e 11 recomenda-se determinao potenciomtrica, ainda que em certos casos se recorra
a indicadores, como violeta aztico ou o-nitroanilina, com menor preciso, entretanto. O erro
alcalino restringe o emprego de eletrodo de vidro com alcxidos de metais alcalinos, sobretudo
em solventes bsicos. Assim, pode-se, ainda que sujeito a erros, utilizar o eletrodo de antimnio.
Com os hidrxidos de amnio quaternrio, em particular os hidrxidos de tetrabutilamonio e o de
trimetilexadecilamonio em mistura de benzeno-metanol ou lcool isoproplico tem-se a
vantagem de que o sal do cido titulado solvel no meio de titulao. Por outro lado, o ponto de
viragem , em geral, determinado potenciomtricamente com sistema de eletrodo de vidro-
calomelano. Nesse caso vantajosa a substituio da ponte salina de cloreto de potssio aquoso
do eletrodo de calomelano de referncia por cloreto de potssio em metano.
Os sistemas mais empregados para a titulao, em meio no-aquoso esto na Tabela.

Titulao de substncias de carcter bsico

Dissolver quantidade de substncia indicada na monografia em quantidade igualmente
especificada do solvente ou mistura de solventes adequados. Juntar o indicador adequado ou, no
caso de determinao potenciomtrica, empregar o eletrodo adequado, titulando com soluo
actica de cido perclrico 0,1 M SV. Paralelamente, proceder titulao em branco.
Para se calcular o teor percentual da substncia doseada emprega-se a frmula que
segue:

100 (n n) mEq
% = --------------------------
p

em que

p = tomada da amostra em g,
m = mililitros de cido perclrico gasto com a amostra,
n= mililitros de cido perclrico gasto com o branco,
mEq = milequivalente da amostra.

Caso necessrio se t
o
for diferente de t corrigir o volume segundo a frmula indicada
anteriormente, a saber:

[ 1 + 0,0011 (t
o
t)]

em que
Vigilncia Sanitria Digital 131

t
o
= temperatura na qual o titulante foi padronizado
t = temperatura na qual a titulao foi realizada.

Titulao de sais de cidos halogenados

A quantidade de substncia especificada na respectiva monografia adicionar solvente ou
mistura de solventes adequados. Adicionar entre 5 e 15 ml (geralmente 10 ml) de acetato de
mercrio actico SR para impedir a interferncia do halognio. Titular com cido perclrico 0,1 M
SV como descrito para as substncias de natureza bsica.

Titulao de substncias de carcter cido

Mtodo I Dissolver quantidade da substncia especificada na monografia
correspondente no solvente ou mistura de solventes indicados. Adicionar o indicador
recomendado ou, se for o caso, usar o eletrodo adequado determinao potenciomtrica. Titular
com soluo padro de metxido de potssio 0,1 M SV, previamente padronizada com cido
benzico. Cuidar para que no haja absoro de dixido de carbono. Efetuar ensaio em branco.
O clculo do teor de substncia segue a frmula anteriormente indicada. Analogamente, se
houver necessidade, aplicar a frmula de correo de volume usando o coeficiente de expanso
cbica do benzeno, que 0,0012.
Mtodo II Dissolver quantidade da substncia indicada na monografia correspondente
no solvente ou mistura de solventes indicados. Titular com soluo de hidrxido de
tetrabutilamnio 0,1 MSV, vertida de bureta equipada com absorvedor de dixido de carbono.

Determinar o ponto de viragem potenciometricamente. Efetuar ensaio em branco,
fazendo, caso necessrio, correo de volume. O clculo do teor da substncia segue a formula
anteriormente indicada.

Sistemas para titulao em meio no-aquoso

Tipo de Solvente Solvente
a
Indicador Eletrodos
cido
(para titulao de bases e
de seus sais)
cido actico glacial
cido frmico
cido propinico
Anidrido
Cloreto de sulfonila
Alfazurina 2-G
Cloreto de metilrosanilina
p-Naftolbenzena
Verde de malaquita
Vermelho de quinaldina
Mercrio-acetato de
mercrio
Vidro-calomelano
Vidro-prata-cloreto de prata
Relativamente neutro
(para titulao diferencial de
bases)
Acetato de etila
Acetonitrila lcoois
Benzeno
Clorobenzeno
Clorofrmio
Dioxana
Alaranjado de metila
p-Naftolbenzena
Vermelho de metila
Calomelano-prata-cloreto de
prata
Vidro-calomelano
Bsico
(para titulao de
cidos)
n-Butilamina
Dimetilformamida
Etilenodiamina
Morfolina
Piridina
Azul de timol
p-Hidroxiazobenzeno
o-Nitroanilina
Timolftalena
Violeta azico
Antimnio-antimnio
b

Antimnio-calomelano
Antimnio-vidro
Platina-calomelano
Vidro-calomelano
Relativamente neutro
(para titulao
diferencial de cidos)
Acetona
Acetonitrila
lcool f-butilico
2-Butanona
Isopropilacetona
Azul de bromotimol
Azul de timol
p-Hidroxiazobenzeno
Violeta azico
Antimnio-calomelano
Vidro-calomelano
Vidro-platina
a = solventes relativamente neutros de constante dieltrica baixa, tais como benzeno, clorofrmio ou dioxana, podem ser
utilizadas junto com qualquer solvente cido ou bsico a fim de aumentar a sensibilidade dos pontos de viragem de
titulao.
b = no titulante.

V.3.4.6. DETERMINAO DA METOXILA

A tcnica destinada determinao da quantidade de grupos metoxila em substncias
orgnicas consiste na reao do composto a dosear com cido ioddrico concentrado. O iodeto de
metila formado mais voltil que o cido ioddrico aquoso separado por destilao sob
corrente contnua de nitrognio ou dixido de carbono, lavado e absorvido em soluo bromo-
Vigilncia Sanitria Digital 132
actica. O doseamento compreende a volumetria de retorno do iodo liberado com soluo
padronizada de tiosulfato de sdio.

APARELHAGEM

O aparelho empregado na determinao da metoxila consiste de balo de fundo redondo,
com 50 ml de capacidade, ao qual se encontra soldado brao lateral capilar, com 1 mm de
dimetro interno, destinado alimentao de gs de arraste inerte (nitrognio ou dixido de
carbono). Ao balo conecta-se - por juntas esmerilhadas condensador vertical de cerca de 25
cm de altura e 9 mm de dimetro interno, em cujo topo est fixado tubo curvo (180 graus), cuja
extremidade, capilar, com 2 mm de dimetro interno, encontra-se imersa em cerca de 2 ml de
gua contida em pequeno frasco de lavagem. A sada do lavador consiste em tubo de cerca de 7
mm de dimetro interno, que termina em tubo removvel de 4 mm, imerso no lquido absorvente
do primeiro de dois frascos receptores montados em srie.

PROCEDIMENTO

Introduzir no balo quantidade de amostra suficiente para formao de aproximadamente
50 mg de iodeto de metila ou a quantidade indicada na monografia. Juntar prolas de vidro, 2,5 ml
de fenol fundido e 5 ml de cido ioddrico. Preparar soluo a 10% (p/V) de acetato de potssio
em cido actico glacial e colocar 6 a 4 ml desta soluo no primeiro e no segundo tubo receptor,
respectivamente, juntando a cada tubo 6 gotas de bromo. Passar corrente uniforme de dixido de
carbono ou nitrognio atravs do brao lateral do balo, visando expulso contnua de iodeto de
metila formado. Aquecer suavemente o balo por meio de micro-bico de Bunsen ou manta de
amianto, de forma a permitir que os vapores do lquido em ebulio alcancem a poro mediana
do condensador. Manter sob aquecimento durante 30 minutos e transferir quantitativamente, por
lavagem, o lquido contido nos dois tubos coletores para erlenmeyer de 250 ml provido de tampa
esmerilhada, contendo 5 ml de soluo a 25% (p/V) de acetato de sdio. Ajustar o volume do
lquido para cerca de 125 ml com gua e juntar 6 gotas de cido frmico. Agitar o frasco por
rotao manual at que o excesso de bromo (cor castanha) desaparea e juntar mais 12 gotas de
cido frmico. Tampar o frasco, agit-lo com vigor para assegurar completa remoo dos vapores
de bromo e deix-lo em repouso durante 1 a 2 minutos. Adicionar 1 g de iodeto de potssio 5 ml
de cido sulfrico M e titular o iodo liberado com tiossulfato de sdio 0,1 M SV, empregando
amido SI como indicador. Repetir a operao omitindo a substncia e proceder necessria
correo do volume de titulante consumido. Cada ml de Na
2
S
2
O
3
0,1 M SV equivale a 0,5172 mg
de metoxila (CH
3
O).

V.3.4.7. DETERMINAO DO DIXIDO DE ENXOFRE

O mtodo compreende o arraste por corrente de dixido de carbono ou nitrognio de
SO
2
a liberado na ebulio da substncia em meio cido aquoso, sua absoro em soluo de
perxido de hidrognio e o doseamento do cido sulfrico formado no processo com lcali
padronizado.

APARELHAGEM

O aparelho empregado na determinao de dixido de enxofre semelhante ao adotado
para a determinao de metoxila. Consiste de balo de fundo redondo, de capacidade para 1000
a 1500 ml, em cuja parede, prximo base, encontra-se soldado brao lateral capilar destinado
alimentao de gs de arraste (nitrognio ou dixido de carbono). Ao balo conecta-se por
juntas esmerilhadas condensador de refluxo vertical em cuja extremidade superior se
encontram ligados dois tubos de absoro em srie, ambos preenchidos com 10 ml de soluo de
perxido de hidrognio SR, neutralizada com hidrxido de sdio 0,1 M pela viragem de azul de
bromofenol SI.

PROCEDIMENTO

Transferir ao balo cerca de 500 ml da gua e 20 ml de cido clordrico. Fixar o balo ao
aparelho e passar corrente lenta e uniforme de dixido de carbono ou nitrognio, previamente em
soluo a 6% (p/V) de carbonato de sdio, pelo brao lateral. Aquecer gradualmente a mistura,
Vigilncia Sanitria Digital 133
mantendo-a em equilbrio durante cerca de 10 minutos e, em seguida, removendo
momentaneamente a fonte de calor, resfriar por imerso progressiva em banho de gua,
constitudo de um recipiente com dimetro maior que o do balo e altura suficiente para no
derramar gua quando o balo estiver inteiramente imerso nele. O volume dgua dever ser
controlado para que isto no acontea. Introduzir removendo momentaneamente o balo do
aparelho cerca de 50 a 100 g de amostra e reiniciar o aquecimento mantendo a ebulio
durante 45 minutos. Desligar a corrente de gs de arraste e transferir quantitativamente, por
lavagem com gua, o lquido contido nos dois tubos coletores para erlenmeyer de 250 ml e titular
com hidrxido de sdio 0,1 M SV pela viragem de azul de bromoferol SI. Repetir a operao
omitindo a amostra e proceder necessria correo no volume de titulante consumido. Cada ml
de hidrxido de sdio 0,1 M SV equivale a 3,203 mg de dixido de enxofre.

V.3.4.8. DETERMIMAO DO LCOOL

V.3.4.8.1.MTODO POR DESTILAO

Este mtodo deve ser usado na determinao de lcool, a menos que na monografia seja
especificado outro mtodo. adequado para exame da maioria dos extratos dos fluidos e tinturas.
Deve ser usado balo destilador com capacidade de duas a quatro vezes o valor do liquido
a ser aquecido. A velocidade destilao deve ser tal que permita a produo de destilados
lmpidos.
Destilados turvos devem ser clarificados por agitao com talco ou com carbonato de clcio
precipitado e filtrados. Em seguida, ajustar a temperatura do filtrado e determinar o teor de lcool
pela densidade. Durante todas as manipulaes, tomar precaues para minimizar a perda de
lcool por evaporao.
Os lquidos que formem demasiada espuma durante a destilao devem ser tratados
previamente com cido fosfrico, sulfrico ou tnico, at reao fortemente cida ou com ligeiro
excesso de soluo de cloreto de clcio, ou pequena quantidade de parafina ou ainda leo de
silicopa, antes de iniciar a destilao.
Para evitar a ocorrncia de ebulio violenta, adicionar fragmentos de material insolvel e
poroso, tal como carbonato de silcio ou prolas de vidro.

PROCEDIMENTO

MTODO 1

Lquidos com menos de 30% de lcool Transferir para aparelho destilador adequado por
meio de pepita, amostra de, no mnimo 35 ml do lquido em que o lquido esta sendo determinado,
anotando a temperatura na qual o volume foi medido. Juntar igual quantidade de gua e destilar
coletar do volume de destilado que seja menor que a amostra medida cerca de 2 ml. Ajustar a
temperatura do destilado quele em que foi medida a amostra e juntar gua suficiente at obter
volume inicial dela. Misturar. O destilado lmpido ou, no mximo, levemente turvo e no contm
mais que traos de substncias volteis alm de lcool e gua. Determinar a densidade do lquido
a 25 graus centgrados. Com o resultado, avaliar a porcentagem , em volume de C
2
H
5
OH contido
no lquido examinado, pela tabela alcoomtrica.

MTODO 2

Lquidos com mais de 30% de lcool Proceder como indicado no mtodo anterior, com
a seguinte modificao: diluir a amostra com volume de gua duas vezes maior e coletar volume
de destilado cerca de 2 ml menor que duas vezes o volume de amostra. Ajustar a temperatura do
destilado quela em que foi medida a amostra e completar com gua a volume igual a duas vezes
o volume inicial. Misturar e determinar a densidade a 25 graus centgrados. A proporo de
C
2
H
5
OH, em volume, neste destilado, avaliada pela densidade, igual metade daquela do
lquido examinado.

Tratamento especial

Vigilncia Sanitria Digital 134
cidos e bases volteis Lquidos contendo bases volteis devem ser tratados com cido
sulfrico diluido SR. At reao levemente cida. Se estiverem presentes cidos volteis,
preparao dever ser adicionado hidrxido de sdio SR at reao levemente alcalina.
Glicerol liquidos contendo glicerol deve ser adicionados de volume tal de gua que o
residuo, aps a destilao, contenha, no mnimo, 50% de gua.
Iodo Solues contendo iodo livre devem ser tratadas antes da destilao com zinco
pulverizado ou descorados com quantidade suficiente de soluo de tiossulfato de sdio 10%
(p/v) seguida da adio de algumas gotas de hidrxido de sdio SR.

Outras substncias volteis Espritos, elixires, tinturas e preparao similares que
contenham propores apreciveis de substncias volteis, alm de lcool e gua, tais como,
leos volteis, clorofrmio, ter, cnfora etc.. devem sofrer o tratamento que segue antes da
destilao.
Lquidos com menos de 50% de lcool Misturar a amostra de 35 ml, exatamente
medidos, com volume igual de gua, em funil separar, saturando esta mistura com cloreto de
sdio. Extrair os componentes volteis, agitando com poro de 25 ml de hexano. Passar a
camadainferior para um segundo funil separador e repetir a extrao com mais duas pores de
hexano. Reunir as pores de hexano e tratar com 3 pores de 10 ml de soluo saturadas de
cloreto de sdio. Reunir as solues salinas e destilar de maneira usual recolhendo volume de
destilados duas ou trs vezes o volume da amostra inicial.
Lquidos com mais de 50% de lcool Tomar uma amostra e diluir com gua de modo
que contenha aproximadamente 25% de lcool e que seu volume final seja cerca de 35 ml. A
seguir proceder como indicado para lquidos com menos de 50% de lcool, prosseguindo a partir
de saturado esta mistura com cloreto de sdio.
Na preparao de coldio para destilao, usar gua em lugar de soluo saturada de
cloreto de sdio, indicada anteriormente. Se o destilado obtido for turvo, por estarem presentes
leos volteis em pequenas propores, e no foi empregado o tratamento com hexano, ele pode
ser classificado e adequado para a determinao da densidade, por agitao com cerca de 1/5 de
seu volume de hexano ou por filtrao atravs de fina camada de talco.

V.3.4.8.2. MTODO POR CROMATOGRAFIA A GS

Proceder de acordo com as especificaes gerais para cromatografia a gs. Usar
aparelho eficiente para a determinao quantitativa do lcool.

Soluo Padro

Para lquidos contendo mais de 10% de lcool, preparar duas solues padro de lcool
em gua, de maneira que as concentraes sejam, respectivamente, cerca de 5% abaixo
(soluo padro 1) a cerca de 5% acima (soluo padro 2) da concentrao de lcool esperada
na amostra sob exame. Determinar a densidade de cada uma das solues padro a 25 graus
centgrados (V.2.5.) e obter a concentrao exata de C
2
H
5
OH pela tabela alcoomtrica. Para
lquidos contendo menos de 10% de lcool, preparar exatamente duas solues alcolicas
padro, de maneira que as concentraes sejam, respectivamente, cerca de 1% menor que a
concentrao esperada, diluindo com gua. Determinar as densidades das solues do mesmo
modo que as anteriores.

EQUIPAMENTO

Sob condies tpicas, o instrumento contm uma coluna de 2m x 4m carregada com
macrogol (polietilenoglicol) 400 a 20% em slica cromatogrfica calcinada. A coluna mantida na
temperatura de 100 graus centgrados. O injetor equipado com filtro para slidos e mantido a
160 graus centgrados, como condutor usa-se gs inerte, como hlio, fluindo com vazo de cerca
de 60 ml por minuto.

Procedimento

Proceder com a amostra e cada uma das solues padro como segue transferir 25 ml
para recipiente adequado de rolha esmerilhada juntar 1,0 ml de padro interno (acetona, a menos
que especificado diferentemente na monografia) para cada 6% de lcool estimado na amostra e
Vigilncia Sanitria Digital 135
misturar. Juntar gua somente se for necessrio para efetuar a soluo. Injetar quantidade
apropriada da soluo no aparelho. Calcular a relao entre a rea do pico do lcool e a rea do
pico do padro interno pelos cromatogramas. Calcular a porcentagem de lcool na amostra pela
frmula

P
1
(Y Y) + P
2
(Z - x)
-------------------------------------------
(Y - Z)

em que

P
1
= porcentagem de lcool na Soluo Padro 1.
P
2
= porcentagem de lcool na Soluo Padro 2.
X = relao entre a rea do pico do lcool e a rea do pico do padro interno da Soluo
Padro 1
Y = relao entre a rea do pico do lcool e a rea do pico do padro interno da Soluo
Padro 2
Z = relao entre a rea do pico do lcool e a rea do pico do padro interno da Soluo
Amostra.

Se o valor obtido estiver fora da faixa dos valores lquidos pelas solues padro, repetir
o procedimento usando aquelas que forneam uma faixa que inclua o valor da amostra.

DETERMINAO DO LCOOL

Tabela alcoomtrica

Porcentagem de C2H5OH Densidade no ar Porcentagem de C2H5OH Densidade no ar
Em volume a
15,56C
Em
peso
25
25
15,56
15,56
Em
Peso
Em volume a
15,56C
25
25
15,56
15,56
Vigilncia Sanitria Digital 136
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
0.00
0.80
1.59
2.39
3.19
4.00
4.80
5.61
0.42
7.23
8.05
8.86
9.68
10.50
11.32
12.14
12.90
13.79
14.01
15.44
10.27
12.10
17.93
18.77
19.60
20.44
21.29
22.13
22.97
23.82
24.67
25.52
26.38
27.24
28.10
28.97
29.84
30.72
31.60
32.48
33..30
34.25
35.15
36.05
36.96
37.87
38.79
39.70
40.62
41.55
42.49
43.43
44.37
45.33
46.28
47.25
48.21
49.19
50.17
51.15
52.15
53.15
54.15
55.17
56.18
57.21
58.24
59.28
60.33
61.38
62.44
63.51
64.59
65.67
66.77
67.87
68.98
70.10
71.23
72.35
73.53
74.69
75.80
77.04
78.23
79.44
80.66
81.90
83.14
84.41
85.69
86.99
88.31
89.65
91.03
92.42
93.85
95.32
96.82
98.38
100.00
1.0000
0.9985
0.9970
0.9956
0.9941
0.9927
0.9914
0.9901
0.9896
0.9875
0.9862
0.9850
0.9838
0.9820
0.9814
0.9802
0.9790
0.9778
0.9767
0.9756
0.9744
0.9733
0.9721
0.9718
0.9698
0.9685
0.9673
0.9661
0.9648
0.9635
0.9622
0.9609
0.9595
0.9581
0.9567
0.9552
0.9537
0.9521
0.9536
0.9489
0.9473
0.9456
0.9439
0.9421
0.9403
0.9385
0.9366
0.9348
0.9328
0.9309
0.9289
0.9269
0.9248
0.9228
0.9207
0.9185
0.9164
0.9142
0.9120
0.9098
0.9076
0.9053
0.9030
0.9006
0.8983
0.8959
0.8936
0.8911
0.8987
0.8862
0.8837
0.8812
0.8787
0.8761
0.8735
0.8709
0.8682
0.8655
0.8628
0.8600
0.8572
0.8544
0.8516
0.8487
0.8458
0.8428
0.8397
0.8367
0.8335
0.8303
0.8271
0.8237
0.8202
0.8167
0.8130
0.8092
0.8053
0.8011
0.7968
0.7921
0.7671
1.0000
0.9985
0.9970
0.9956
0.9942
0.9928
0.9915
0.9902
0.9890
0.9878
0.9866
0.9854
0.9843
0.9832
0.9821
0.9810
0.9800
0.9789
0.9779
0.9769
0.9759
0.9749
0.9739
0.9729
0.9719
0.9708
0.9697
0.9687
0.9670
0.9664
0.9653
0.9641
0.9629
0.9617
0.9604
0.9590
0.9570
0.9562
0.9548
0.9533
0.9517
0.9501
0.9485
0.9469
0.9452
0.9434
0.9417
0.9399
0.9380
0.9361
0.9342
0.9322
0.9302
0.9262
0.9252
0.9241
0.9220
0.9190
0.9177
0.9155
0.9133
0.9111
0.9088
0.9065
0.9042
0.9019
0.8995
0.8972
0.8948
0.8923
0.8899
0.8874
0.8848
0.8823
0.8797
0.8771
0.8745
0.8718
0.8691
0.8664
0.8636
0.8608
0.8580
0.8551
0.8422
0.8493
0.8462
0.8432
0.8401
0.8369
0.8336
0.8303
0.8268
0.8233
0.8196
0.8158
0.8118
0.8077
0.8033
0.7986
0.7936
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100

0.00
1.29
2.51
3.76
5.00
6.24
7.48
8.71
9.94
11.17
12.39
13.61
14.83
16.05
17.20
18.47
19.89
20.88
22.08
23.25
24.47
25.05
26.85
28.03
29.21
30.39
31.56
32.72
33.88
35.08
36.18
37.32
38.49
39.59
40.72
41.83
42.94
44.05
45.15
46.24
47.33
48.41
49.48
50.55
51.61
52.66
53.71
54.75
55.78
56.81
57.83
58.84
59.85
60.85
61.85
62.84
63.82
64.80
65.77
65.73
67.69
68.64
69.59
70.52
71.46
72.38
73.33
74.21
75.12
76.02
76.91
77.79
78.67
79.54
80.41
81.27
82.12
82.97
83.81
84.64
85.46
86.28
87.08
87.89
88.08
89.40
90.24
91.01
9177
92.52
93.25
93.98
94.70
95.41
96.10
96.79
97.46
98.12
98.76
99.39
100.00
1.0000
0.9981
0.9963
0.9945
0.99
0.9911
0.9894
0.9879
0.9863
0.9849
0.9835
0.9818
0.98
0.9789
0.9776
0.9762
0.9748
0.9734
0.9729
0.9706
0.96
0.96
















0.9382
0.9362
0.9341
0.9320
0.9299
0.9278
0.9256
0.9235
0.9213
0.9191
0.9169
0.9147
0.9124
0.9102
0.9079
0.9056
0.9033
0.9010
0.8987
0.8964
0.8941
0.8918
0.8995
0.8871
0.8848
0.8824
0.8801
0.8777
0.8752
0.8729
0.8708
0.8682
0.8658
0.8634
0.8609
0.8585
0.8561
0.8537
0.8512
0.8489
0.8463
0.8439
0.8414
0.8389
0.8364
0.8339
08314
0.8288
0.8263
0.8237
0.8211
0.8184
0.8158
0.8131
0.8104
0.8076
0.8048
0.8020
0.7992
0.7962
0.7932
0.7902
0.7871






































0.9432
0.9412
0.9392
0.9372
0.9367
0.9331
0.9310
0.9289
0.9268
0.9246
0.9225
0.9203
0.9181
0.9159
0.9137
0.9114
0.9092
0.9069
0.9046
0.9024
0.9001
0.8978
0.8955
0.89
0.8909
0.8886
0.8862
0.8839
0.8815
0.8792
0.8768
0.8745
0.8721
0.8697
0.8673
0.8649
0.8625
0.8601
0.8570
0.8552
0.8528
0.8503
0.8479
0.8454
0.8429
0.8404
0.8379
0.8354
0.8328
08302
0.8276
0.8250
0.8224
0.8197
0.8170
0.8142
0.8114
0.8086
0.8057
0.8028
0.7988
0.7967
0.7936
Vigilncia Sanitria Digital 137

V.3.4.9. ANLISE DE AMINOCIDOS

A anlise de aminocidos realizada atravs de duas operaes (1) hidrlise das
ligaes peptdicas seguida de (2) avaliao de cada aminocido no hidrolisado resultante.

Tcnica para hidrlise de protenas e peptdicos isolados

1. Pesar (ou pipetar ,caso esteja em soluo) 4 a 10 mg protena em tubo de cultura de
microrganismos de 20 x 150 mm (com disco de teflom na tampa para melhor vedao),
previamente lavado com hidrxido de sdio 0,2 M, enxaguado e seco em estufa.
2. Se a amostra for slida, pipetar 5 ml de cido clordrico sobre a mesma, seguido de
gua. Se a amostra for lquida pipetar igual volume de cido clordrico, de modo que a
concentrao final de cido clordrico seja 6 M.
3. Passar nitrognio no interior do tubo na altura da superfcie da soluo, para
eliminao do O
2
, durante 2 3 minutos. Fechar em seguida o tubo com disco e a tampa
rosquevel.
4. Colocar o tubo em posio vertical em estufa regulada a 110 graus centgrados mais
ou menos 2 graus centgrados, mantendo-o por 22 horas.
5. Remover o tubo da estufa e, ainda na vertical, resfri-lo em gua corrente ou banho de
gelo.
6. Transferir quantitativamente o contedo do tubo para balo volumtrico de 10 ml e
completar o volume com gua destilada.
7. Se houver algum resduo ou preciptado, remov-lo por centrifugao em filtrao em
placa de vidro sinterizado ou membrana filtrante de 0,45 mm de porosidade.
8. Pipetar 5,0 ml da soluo para balo de evaporador rotatrio, procedendo a secagem
a presso reduzida, temperatura mxima de 50 graus centgrados.
9. Adicionar ao resduo do balo 10 ml de gua destilada e reevaporar. Esta operao
deve ser repetida mais duas vezes, ou at o resduo no apresentar odor de cido clordrico.
10. Solubilizar a pelicula seca formada pelo hidrolizado em volume adequado de tampo
citrato PH 2,2 (0,20 M em Na+). A soluo resultante de aminocidos deve ento ser mantida em
frasco de vidro tampado e sob refrigerao at a realizao da anlise.

Tcnica para hidrlise de amostras, com baixo teor de protena, contendo carboidratos e/ou de
lpdios

1. Transferir quantidade de amostra que contenha 10mg de protena para balo de 150
ml de fundo redondo e boca esmerilhada.
2. Juntar ao meio 40 ml de cido clordrico 6 M, preparado com partes iguais de gua
destilada e cido clordrico. Adicionar algumas prolas de vidro.
3. Conectar condensador a refluxo e iniciar o aquecimento do balo usando manta
eltrica. Manter a suspenso sob ebulio constante e suave por 24 horas.
4. Resfriar a temperatura ambiente e transferir quantitativamente o contedo para balo
volumtrico de 50 ml, completando o volume com gua destilada.
5. Seguir as demais etapas conforme os itens 7 a 10 da tcnica anterior

Misturas de aminocidos em soluo (soros) ou em preparaes farmacuticas

1. diluir adequadamente a soluo com tampo de citrato pH 2,2 (0,20 M em Ma+),
podendo ser analisada em seguida.
2. Caso esteja na forma de p ou comprimido solubilizar a amostra em cido clordrico
0,1 M.
3. Transferir o material para balo volumtrico e completar o volume com o mesmo
tampo acima.
4. Filtrar a soluo mantendo-a sob refrogerao sob 4 graus centgrados at ser
analisada.

Tcnica de hidrlise com oxidao de cistina e metionina

Vigilncia Sanitria Digital 138
Devido a perdas durante a hidrlise cida de protenas, os aminocidos sulfurados so
preferencialmente analisados atravs de seus respectivos derivados oxidados. A oxidao
promovida por cido perfrmico, que transforma cistina e cisteina s condies de hidrlise.

1. Preparar o cido perfrmico acrescentando 1ml de perxido de hidrognio 30 volumes
a 90 ml de cido frmico.
2. Agitar ligeiramente a soluo mantendo-a em seguida em repouso a temperatura
ambiemte.
3. Resfriar o cido perfrmico formado em banho de gelo.
4. Pesar a amostra contendo 10 mg de protena em balo de fundo redondo de 25 ml e
adicionar 2ml de cido perfrmico gelado.
5. Manter a mistura em banho de gelo durante 4horas se a amostra for solvel, ou
16horas, se for insolvel.
6. Adicionar 0,5 ml de cido bromdrico 40% para remover o excesso de cido
perfrmico.
7. Acoplar o balo a evaporador rotatrio e remover atravs de presso reduzida o bromo
residual, fazendo os vapores passar por soluo de hidrxido de sdio M.
8. Proceder hidrlise como descrito anteriormente.

Separao e anlise quantitativa de aminocidos isolados

A separao dos aminocidos nos hidrolisados , normalmente, normalisada por
cromatogrfia de troca inica, atravs de resinas de poliestireno sulfonado em analisadores de
aminocidos. Nesses aparelhos, aps a separao os aminocidos eludos das colunas
cromatogrficas formam complexo de colorao azul-violeta pela reao com ninidrina. A
determinao quantitativa feita espectrofotomtricamente. No uso de autoanalisadores de
aminocidos, devem ser seguidas as especificaes dos respectivos fabricantes.

V.4.MTODOS DE FARMACOGNOSIA

V.4.1.PREPARO DE MATERIAL VEGETAL PARA
OBSERVAO E ESTUDOS HISTOLGICOS

Amolecimento do material

Como normalmente os rgos e tecidos vegetais que compem os fitofrmacos se
apresentam secos, para serem observados ao microscpio conveniente primeiro amolec-los
mediante tratamento com gua quente, ou outro mtodo de amolecimento indicado. O tempo
necessrio para o amolecimento de cada rgo vegetal vria de acordo com a sua textura. Se se
tratar de rgo recm-colhido apenas os de consistncia mais firme necessitam de tal tratamento.

Execuo dos cortes

Uma vez amolecidos, procede-se preparao dos cortes dos rgos vegetais a serem
observados. Os cortes podem ser realizados com auxlio de objeto cortante, como navalha,
lmina de barbear ou bisturi. Recomenda-se incluir a amostra em material adequado que permita
fixar o fragmento a fim de ser secsionado. Entretanto, cortes melhores e mais precisos podem ser
obtidos com o emprego de nicrtomos. H basicamente, trs tipos de micrtopos: os de
congelao usados para os materiais mais frgeis; os rotativos para cortes em srie de material
incluido em parafina, e os de deslizamento, para aqueles materiais mais resistentes, como o
caos de ramos, partes de caule e razes. Neste ltilmo caso mtodo relativamente fcil de preparo
do material a ser cortado consiste em sua incluso em macrogol solvel em gua. Este mtodo
descrito a seguir.

Incluso do material em macrogol

- Ferver as amostras para retirar o ar.
- Coloc-las em bquer contendo soluo de macrogol a 20%
- Marcar o bquer, a partir da superfcie do lquido, dividindo-o em 5 partes
aproximadamente iguais.
Vigilncia Sanitria Digital 139
- Deixar o material em estufa a 65graus centgrados (por 3 a 4 dias)
- Quando a soluo evaporar at 1/5 do seu volume inicial, transferir as amostras para
macrogol puro e derretido, onde permanecem durante 12 a 25horas, em estufa em
65graus centgrados.
- Retirar da estufa e emblocar e deixar esfriar a temperatura ambinte.
- Aparar os blocos para colocao no micrtomo.
- Cortar o material a seco e
- Lavar os cortes com gua a colorir

Mtodo de colorao

Em histologia vegetal, o emprego de corantes prtica generalizada. Os mtodos de
colorao podem compreender a aplicao de um s corante (colorao simples) ou de dois ou
trs corantes diferentes (colorao composta)
Colorao simples alguns corantes que podem ser usados:

- Soluo de safranina a 1%: colorao de clulas com paredes lignificadas;
- Soluo de verde malaquita a 1%: colorao de celulose;
- Soluo de acridina - laranja a 0,1%: colorao de floema e de clulas no
lignifivadas e
- Azul de Astra a 1%: colorao de paredes celulsicas sem impregnao de lignina

Colorao composta algumas misturas de corantes que podem ser usadas:

1.) Safranina azul de Astra procedimento:
- Colocar em safranina por 5 a 25 minutos;
- Lavar duas vezes com gua destilada;
- Colocar em azul de Astra por 10 a 25 minutos;
- Lavar duas vezes com gua;
- Passar por bateria de lcool: a 50%, a 70%, a 90%, a 95%, lcool absoluto (2 vezes),
xilol e
- Montar em lminas com blsamo do Canad ou resina sinttica

2.) Safranina verde malaquita procedimento:
- Colocar em verde malaquita por 1minuto, aquecendo levemente
- Lavar duas vezes com gua
- Passar por lcool a 70%, a 95% e novamente a 70%
- Lavar com gua
- Colocar em safranina por 5 minutos
- Lavar duas vezes com gua
- Passar por lcool a 70% (3 vezes), a 95% e por lcool absoluto e
- Montar em lmina com blsamo do Canad
3.) Crisoidina vermelho de acridina azul de Astra procedimento:
- Colocar em crisoidina vermelho de acridina por 5 a 25 minutos
- Lavar duas vezes com gua destilada
- Colocar em azul de Astra por 5 a 25 minutos
- Lavar duas vezes com gua
- Passar por lcool a 70% (3vezes), a 95% por lcool absoluto e
- Montar em lminas com blsamo do Canad ou com resina sinttica.

Preparo e montagem das lminas

Os cortes histolgicos so montados, entre lmina e lamnula, em gua, glicero, hidrxido
do potcio a 30%, hidrato de cloral a 50% ou outro lquido qualquer que permita a observao dos
tecidos vegetais. O glicerol mais usado nos estudos microqumicos de mucilagens, gomas,
inulinas e aleorona. O hidrxido de potcio agente diafanizador : tem ao sobre protenas,
amido, gorduras, resinas e materias corantes. O hidrato de cloral tambm agente diafanizador
e, embora de ao mais lenta que os hidrxidos alclinos, tem a vantagem de no dissolver o
oxalato de clcio.
Vigilncia Sanitria Digital 140
Dependendo da finalidade a que se destina, podem-se montar os cortes em lminas para
observao imediata ou lminas ditas permanentes.
Nas preparaes para observao imediata, depois de selecionados e curados, monta-se
os cortes em meio adequado, tomando-se o cuidado de evitar a formao de bolhas de ar. Se o
exame prometer ser mais prolongado, recomenda-se revestir os bordos da lamnula de um luto,
que pode ser esmalte de unha blsamo do Canad ou soluo alcolica de goma laca, para
evitar a evaporao do meio de montagem, todos eles aplicveis com auxlio de pincel macio e
pequeno.
Nas preparaes permanentes, depois de selecionados e cortados, os cortes devem ser
desidratados em bateria de lcool, a saber; lcool a 50%, a 70%, a 90%, a 95%, lcool absoluto
(2 vezes) e xilol, e permanecendo aproximadamente 3 minutos em cada um deles. Depois so
montados, entre lmina e lamnula, em Entellan, blsamo do Canad ou outro meio
conveniente. Deve-se manter a montagem comprimida atravs da aplicao de pequenos pesos
de chumbo sobre a lamnula, em posio perfeitamente horizontal e sobre papel de filtro, cuja
finalidade a de se precaver contra possveis extravasamento do meio de montagem.

Macerao dos tecidos

Seces de caules, razes, cascas ou outros rgo vegetais raramente do idia precisa
da natureza real de suas clulas. Para se revelar algumas particularidades, como, por exemplo,
espessamentos e pontuaes, deve-se empregar um dos mtodos indicados para dissociao de
tecidos. Nesses mtodos, o rgo a ser estudado, tratado com substncias qumicas capazes
de dissolver lamela mdia e, desta forma, permitir a separao das clulas.
Mtodo prtico de dissociao de tecidos o seguinte:

- Cortar o material em pequenos fragmento ou em fatias com cerca de 300 mm de
espessura e colocar em gua
- Retirar todo ar do material, fervendo e resfriando repetidamente
- Macerar o material em soluo de Jeffrey (soluo aquosa de cido ntrico a 10%
mais cido crnico a 10%, na proporo de 1.1). o tempo de macerao varia com a
natureza do material. Geralmente as clulas comeam a separar-se em cerca de 24
horas. Pode ser usado basto de vidro de ponta arredondada para amassar
levemente o material. Se houver dificuldade na separao das clulas, renovar a
soluo maceradora
- Lavar muito bem o material com gua de torneira, para remover os cidos. Verter a
mistura com o tecido macerado para funil contendo papel de filtro
- Lavar o macerado, ainda no funil, com soluo saturada de bicarbonato de sdio e, a
seguir, com gua
- Fechar a abertura inferior do funil e cobrir o macerado com soluo aquosa de
safranina a 1%, durante tempo suficiente para boa colorao do material (de 15
minutos a 6 horas)
- Abrir a ponta do funil e lavar novamente com gua, at retirar o excesso de corante
- Desidratar pela adio de solues de lcool a 50%, a 70%, a 90%, a 95% e lcool
absoluto
- Retirar com pina o macerado do papel de filtro e colocar em xilol
- Montar entre lmina e lamnula, com resina sinttica ou blsamo do Canad e
- Manter a lmina em posio horizontal, porm no utilizar peso sobre a lamnula, pois
as clulas macerada so muito frgeis.

V.4.2. MTODOS DE ANLISE DE DROGAS VEGETAIS

V.4.2.1. AMOSTRAGEM

Para que os resultados dos mtodos de anlise de drogas vegetais expressem valores
representativos da quantidade total de droga disponvel, imprescindvel recorrer a tcnicas de
amostragem definidas e uniformes.
Os procedimentos de amostragem especificados levam em considerao trs aspectos
(a) nmeros de embalagens que contm a droga, (b) grau de diviso da droga e (c) quantidade de
droga disponvel.

Vigilncia Sanitria Digital 141
Nmero de embalagens

Examinar a integridade dos recipientes de embalagem e a natureza da droga neles
contida. Havendo razovel homogeneidade, recolher amostras segundo o esquema abaixo.

Nmero de embalagens Nmero de embalagens a serem amostradas
1 a 10 1 a 3
10 a 25 3 a 5
25 a 50 4 a 6
50 a 75 6 a 8
75 a 100 8 a 10
mais de 100 5% do total de embalagens
(10, no mnimo)

Grau de diviso e quantidade droga

Consistindo a droga de componentes de dimenses inferiores a 1 cm ou quando ela se
constituir de material finamente fragmentado ou pulverizado, empregar aparelho de amostragem
(tubo provido de dispositivo de fechamento na base). Recolher amostras de cima para baixo e de
baixo para cima (direo vertical) e lateralmente direo (transversal), perfazendo amostra de, no
mnimo, 250 g para at 100 kg de droga. Havendo mais de 100 kg a amostra, proceder a
amostragem seguida de seleo por quarteamento, gerando amostra de 250 g no final do
processo.
Para drogas com dimenses superiores a 1 cm, proceder amostragem manual.
Combinar as amostras retiradas de cada embalagem aberta, tomando a precauo de no
aumentar seu grau de fragmentao durante a manipulao. Para quantidades de drogas at 100
kg, a amostra deve constituir-se de, no mnimo, 500 g. havendo mais de 100 kg de droga a
amostrar, proceder amostragem seguida de seleo por quarteamento, gerando amostra de 500
g no final do processo.
Em ambos os casos drogas com dimenses inferiores ou superiores a 1 cm
permissvel amostrar quantidades inferiores s especificadas acima desde que a quantidade total
de droga disponvel seja inferior a 10 kg. Todavia a amostra final no dever ser inferior a 125 g.

Quarteamento

Distribuir a droga sobre rea quadrada, dividida em quatro partes iguais. Com a mo,
distribuir a droga sobre a rea de modo homogneo e rejeitar as pores contidas em dois
quadrados opostos, em uma das diagonais do quadrado. Juntar as duas pores restantes e
repetir o processo, se necessrio. Havendo diferena acentuada em dimenses de fragmentos,
executar separao manual e anotar as porcentagem aproximadas dos componentes de
diferentes graus de diviso encontrados na amostra.

V.4.2.2. DETERMINAO DE MATERIAL ESTRANHO

Drogas vegetais devem estar, o quanto possvel isentas de fungos, isentos e outros
materiais contaminantes. No devem apresentar aspecto ou odor anormal, descoramento ou
quaisquer outros indcios de deteriorao. Materiais estranhos droga so classificados em trs
tipos fundamentais: (a) partes do organismo ou organismos dos quais a droga deriva, excetuados
aqueles includos na definio e descrio da droga, acima do limite de tolerncia especificado na
monografia, (b) quaisquer organismos, pores ou produtos de organismos alm daqueles
especificados na definio e descrio da droga em sua respectiva monografia e (c) impurezas de
natureza mineral no inerentes droga, tais como pedras, areia ou terra.

Procedimento

Determinao a quantidade de amostra a ser submetida ao ensaio com base na seguinte
tabela:

Razes, rizomas, cascas e ervas 500 g
Folhas, inflorescncias, sementes
Vigilncia Sanitria Digital 142
e frutos 250 g
Materiais particulados ou fracionados 50 g
( de peso mdio inferior a 0,5 g por (componente)

Colher por quarteamento a quantidade de tomada de ensaio especificada, a partir da
amostra obtida por amostragem segundo o procedimento descrito anteriormente e espalh-la em
camada fina sobre superfcie plana. Separar manualmente os materiais estranhos droga,
inicialmente a olho nu e, em seguida, com auxlio de lente de aumento (5 a 10 vezes). Pesar o
material separado e determinar sua porcentagem com base no peso da tomada de ensaio.

V.4.2.3. DETERMINAO DE GUA EM DROGAS VEGETAIS

A presena de quantidade excessiva de gua em drogas vegetais propicia o
desenvolvimento de microrganismos, insetos e hidrlise e consequente deteriorao de
constituintes da droga. Da a necessidade de estabelecimento de limites de umidade para drogas
vegetais, em geral, na faixa de 8 a 14%.
Trs mtodos so utilizados: gravimtrico (dessecao), azeotrpico (destilao de
tolueno) e volumtrico (Karl Fischer). O primeiro, tcnicamente mais simples e rpido, no
aplicvel quando a droga contm substncias volteis alm da gua. Os demais requerem
equipamentos especiais e comprendem tcnicas mais complexas, sendo, contudo, aplicveis com
menos restries.

Preparo da amostra

Reduzir por corte, granulao ou fragmentao drogas no pulverizadas ou trituradas
de forma a limitar a dimenso de seus componentes a, no mximo, 3 mm, de espessura.
Sementes e frutos, mesmode dimenses inferiores a 3mm, devem ser quebrados. Evitar moinhos
de alta velocidade ou outros procedimentos que acarretem perda de umidade no preparo da
amostra.

Mtodo gravimtrico

Proceder conforme descrito em Determinao da perda por dessecao (V.2.9.).
Transferir cerca de 2 a 5 g, ou o especificado na monogrfia, exatamentepesados, de amostra
preparada conforme instrues anteriores, para pesa - filtro chato tarado, previamente dessecado
nas mesmas condies a serem adotadas para a amostra durante 30 minutos. Dessecar a
amostra por um dos seguintes procedimentos, conforme especificado na monogrfia:
a) Estufa: a 100 105 graus centgrados durante 5 horas antes da primeira pesagem,
salvo quando houver outra especificao na monogrfia
b) Dessecador: sobre pentxido de fsforo, sob presso atmosfrica e temperatura
ambiente
c) Presso reduzida: sobre pentxido de fsforo, sob presso no superior a 2,7 Kpa
(aproximadamente 20 mm de Hg) e temperatura ambiente salvo quando houver outra
especificao na monogrfia.
O ensaio dado por concludo quando duas pesagens sucessivas no diferirem entre si
por mais de 5 mg. Calcular a porcentagem de gua em relao droga seca ao ar.
Mtodos azeotrpico e volumtrico

Proceder conforme descrito em Determinao de gua (V.2.20.), empregando amostra
de droga vegetal preparada conforme descrito em V.4.1.

V.4.2.4. DETERMINAO DE CINZAS TOTAIS

A determinao de cinzas totais destina-se a estabelecer a quantidade de substncia
residual no - voltil no processo de incinerao especificado. As cinzas totais incluem as
derivadas de tecido vegetal (cinzas fisiolgicas) e de materiais estranhos, especialmente areia e
terra aderente superfcie da droga (cinzas no fisiolgicas).

PROCEDIMENTO

Vigilncia Sanitria Digital 143
Pesar exatamente cerca de 3 g ou a quantidade especificada na monogrfia da droga
pulverizada, transferir para cadinho ( de silcio ou platina) previamente calcinado, resfriado e
pesado. Aps distribuir a amostra uniformemente no cadinho, inciner-la aumentando
paulatinamente a temperatura, no ultrapassando 450 graus centgrados, at que todo o carvo
seja eliminado. Resfriar em dessecador e pesar. Nos casos em que o carvo no puder ser
eliminado totalmente, resfriar o cadinho e umedecer o resduo com cerca de 2ml de gua ou
soluo saturada de nitrato de amnio (oxidante). Evaporar at secura sucessivamente em
banho maria e sobre chapa quente e incinerar at peso constante, no excedendo 450 graus
centgrados. Calcular a porcentagem de cinzas em relao droga seca ao ar.

V.4.2.5. DETERMINAO DE CINZAS INSOLVEIS EM CIDO

Cinzas insolveis em cido compreendem o resduo obtido na fervura de cinzas totais ou
sulfatadas com cido clordrico diludo, aps filtragem, lavagem e incinerao. O mtodo destina-
se determinao de slica e constituintes siliciosos da droga.

PROCEDIMENTO

Ferver o resduo obtido na determinao de cinzas totais ou sulfatadas durante 5 minutos
com 25 ml de cido clordrico (70 g/10 em cadinho coberto com vidro de relgio. Lavar o vidro de
relgio com 5 ml de gua quente, juntando esta gua ao cadinho. Recolher o resduo insolvel em
cido sobre papel de filtro isento de cinza, lavando-o com gua quente at que o filtrado se
mostre neutro. Transferir o papel de filtro contendo o resduo para o cadinho original, secar sobre
chapa quente e incinerar a cerca de 500 graus centgrados at peso constante. Calcular a
porcentagem de cinzas insolveis em cido em relao droga seca ao ar.

V.4.2.6. DETERMINAO DE LEOS ESSENCIAIS EM DROGAS VEGETAIS

O teor de leos essenciais em drogas vegetais determinada pelo processo de
destilao por arraste a vapor, com auxlio do equipamento descrito abaixo.
O equipamento (figura), confeccionado em vidro resistente, de qualidade apropriada,
compreende:
1) Balo de fundo redondo, de 500 a 1000 ml de capacidade, de colo curto, provido de
uma junta 24/40, fmea
2) Condensador, adaptvel ao balo atravs de uma junta esmerilhada 24/40, macho,
construdo em pea nica de vidro, compreendendo as partes descritas a seguir, com as
respectivas medidas:
2.1 Tubo vertical (AC) de 210 260 mm de comprimento e 13 15 mm de dimetro
interno
2.2 Tubo dobrado, com segmentos (CD) e (DE) medindo 145 155 mm de comprimento
cada dimetro interno de 7 8 mm
2.3 Condensador de bolhas, tipo Allihn (FG), de 145 155 mm de comprimento e
dimetro interno de 15 mm nas bolas e 8 10 mm nos estreitos
2.4 Rolha (junta esmerilhada 14/20) (K) que obtura uma sada lateral (K) provida da
junta esmerilhada 14/20 fmea, na extremidade
2.5 Tubo (GH) de 30 40 mm de comprimento e 7 8 mm de dimetro interno,
formando as partes (HK) ngulo (GHK) de 30 graus a 40 graus
2.6 Alargamento em forma de pera (J) de 5 ml de capacidade
2.7 Tubo (JL) provido de escala graduada de 110 120 mm, de 3 ml de capacidade e
subdividida em vigsimos de mililitro
2.8 Alargamento em forma de bola (L) de aproximadamente 2 ml de capacidade
2.9 Torneira de 3 vias e
2.10 Tubo de conexo (BM) de 7 8 mm de dimetro, provido de tubo de segurana. O
ponto de interseo (B) encontra-se 20 25 mm acima da parte mais alta da escala graduada.
3) Fonte de3 calor que pode ser aquecedor eltrico ou bico de gs dotado de
regulagem fina da chama e
4) Suporte vertical adequado.

Vigilncia Sanitria Digital 144
Antes da utilizao o equipamento deve ser limpo por lavagens repetidas e sucessivas
com acetona, gua, mistura sulfocrmica e, novamente, gua. Depois de seco deve ser montado
em local protegido de correntes de ar.
























Aparelho para determinao de leos essenciais em drogas vegetais (dimenses em mm)
PROCEDIMENTO

Introduzir no balo o volume do lquido indicado na monografia e pedaos de pedra
porosa para regularizar a ebulio. Adaptar o condensador ao balo. Retirar a rolha esmerilhada
(K) e , pela abertura (K), introduzir gua at que a mesma comece a escorrer em (B). Com auxlio
de pipeta volumtrica introduzir xilol, na quantidade prescrita, apoiando-se a ponta da pipeta no
fundo da sada lateral (K). Aquecer o lquido no interior do balo at o inicio da ebulico e destilar
na vazo de 2 a 3 ml por minuto, a no ser que a monografia prescreva diferente.
Para determinar a velocidade da destilao, escoar a gua com auxlio da torneira de trs
vias, at que o menisco esteja no nvel do trao de referncia inferior (figura). Fechar a torneira e
cronometrar o tempo necessrio para encher o volume compreendido entre os traos de
referncia inferior e superior (5 ml). Abrir a torneira e continuar a destilao por 3 minutos.
Desligar o aquecimento, deixar esfriar por 10 minutos e fazer a leitura do volume de xilol no tubo
graduado.
Introduzir no balo a quantidade da droga prescrita na monografia e proceder com a
destilao por arraste e vapor, como descrito acima, pelo tempo e na velocidade indicada na
monografia. Terminada a operao, deixar esfriar por 10 minutos e ler o volume do leo essencial
recolhido no tubo graduado. Subtrair da leitura o volume do xilol determinado anteriormente. A
diferena representa a quantidade de leo essencial contida na amostra. Calcular o resultado em
mililitros de leo essencial por 100 g da droga.

V.4.2.7. DETERMINAO DE LEOS FIXOS

A determinao de leos fixos baseia-se na sua extrao por solvente que, depois de
evaporado, deixa como resduo o leo cuja quantidade determinada por pesagem.
Caso a amostra contenha teor elevado de componentes hidrossolveis (carboidratos,
uria, cido ltico, entre outros) cabe pre-tratamento da amostra, a fim de evitar interferncia na
determinao de matrias graxas. Para tanto, transferir a tomada de ensaio para funil de filtro,
lavar com gua e secar o resdua em estufa a 105 graus centgrados durante 2 horas.

PROCEDIMENTO


Vigilncia Sanitria Digital 145
Transferir cerca de 10 g, exatamente pesados, de droga seca, obtida na determinao da perda
por dessecao (V.2.9) para cartucho de celulose e coloc-lo em aparelho extrator Soxhlet,
cobrindo-o com algodo desengordurado. Pesar o balo limpo e seco (contendo fragmentos de
porcelana ou contas de vidro) e mont-lo no aparelho sobre banho-maria, tomando a precauo
de assegurar vedao na junta esmerilhada do balo (recomenda-se operao em capela).
Transferir para o extrator ter de petrleo em quantidade suficiente para realizar trs sifonagens
examinar o condensador de refruxo. Proceder extrao sob aquecimento suficiente para manter
o solvente em ebulio moderada durante 4 horas.
Concluda a extrao, aguardar, esfriamento, transferir o contedo do cartucho para
almofariz de porcelana e juntar quantidade aproximadamente igual de areia lavada e seca.
Pulverizar a droga e transferi-la novamente, no interior do cartucho, para o extrator. Reiniciar e
manter a extrao, nas condies acima, por perodo adicional de 2 horas. Desligar o balo do
aparelho e evaporar o solvente (de preferncia por destilao sob corrente de dixido de
carbono). Transferir o balo para estufa a 105 graus centgrados, resfriar e pesar. Repetir a
operao at peso constante e calcular a porcentagem de leos fixos na droga com base na
diferena entre a massa da tomada de ensaio e a do resduo.

V.4.2.8. DETERMINAO DO CINEOL

A determinao de cineol compreende adeterminao do ponto de congelamento
(criometria) do composto de combinao molecular entre cineol e o-cresol cresineol. Sendo esta
temperatura proporcional ao contedo de cineol no composto, possvel estabelecer-se seu teor
pela tabela a seguir.
O mtodo empregado na dosagem de cineol, em essncias de eucalipto e niaouli.
Determinaes em outras essncias no so recomendadas sem comprovao prvia de
exatido em vista de alguns constituintes essenciais solubilizarem o cresineol (mesmo na
essncia de eucalipto, h risco de erro quando o contedo de alfa-terpineol for superior a 12,5%).
Erros tambm advm na presena de unidade, seja na essncia, seja no o-cresol. O o-
cresol empregado deve ser puro e seco, apresentando ponto de fuso superior a 30 graus
centgrados. Deve ser conservado em frasco hermtico, por ser higroscpico.

PROCEDIMENTO

Secar a essncia em ensaio, agitando-a com sulfato de sdio ou cloreto de clcio, ambos
anidros, em tubo de ensaio ou erlenmeyer provido de tampa esmerilhada. Deixar em contato
durante 24 horas e filtrar. Transferir para tubo de ensaio (cerca de 15 mm de dimetro e 80 mm
de altura) 3,0 g de essncia, exatamente pesados, e adicionar 2,1 g de o-cresol em sobrefuso.
Agitar a mistura com bulbo de termmetro (0 60 graus centgrados, graduado em dcimos de
graus), suspenso sobre o tubo de modo que a extremidade do bulbo no ultrapasse o limite de 5
mm da base do tubo e sem tocar em suas paredes, at induo de cristalizao. Anotar a
temperatura mxima observada no termmetro, durante a cristalizao. Aquecer o tubo a cerca
de 5 - 10 graus centgrados acima da temperatura lida e introduzi-lo em outro tubo maior (cerca
de 60 mm de dimetro e 100 mm de altura) de modo a criar camada de ar, fixar o tubo menor
dentro do outro com auxlio de placas de cortia adaptadas ou por qualquer outro meio e
mergulhar o conjunto em banho-maria termostatizado, mantendo a temperatura cerca de 5 graus
centgrados abaixo do ponto de congelamento previamento anotado para o cresineol. Agitar a
mistura com movimentos verticais do termmetro e, ao iniciar-se a cristalizao (turvao do
lquido), observar a estabilizao da temperatura. Havendo flutuaes durante a cristalizao,
considerar sempre a temperatura mxima lida durante o perodo do congelamento.
Repetir a determinao quantas vezes for necessrio para que duas leituras sucessivas
acusem variao mxima de 0,1 graus centgrados.

Teor do cineol em essncias

Temp.
(C )
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
24
25
26

27
28
45,6
46,9
48,2

49,5
50,8
45,7
47,0
48,3

49,6
50,9
45,9
47,2
48,5

49,8
51,1
46,0
47,3
48,6

49,9
51,2
46,1
47,4
48,7

50,0
51,3
46,3
47,6
48,9

50,2
51,5
46,4
47,7
49,0

50,3
51,6
46,5
47,8
49,1

50,4
51,7
46,6
47,9
49,2

50,5
51,8
46,8
48,1
49,4

50,7
52,0
Vigilncia Sanitria Digital 146
29

30
31
32

33
34
35

36
37
38

39
40
41

42
43
44

45
46
47

48
49
50

51
52
53

54
55
52,1

53,4
54,7
55,0

57,3
58,6
59,9

61,2
62,5
63,8

65,2
66,8
68,6

70,5
72,3
74,2

76,1
78,0
80,0

82,1
84,2
86,3

88,8
91,3
93,8

96,3
99,3
52,2

53,5
54,8
56,1

57,4
58,7
60,0

61,3
62,6
63,9

65,4
67,0
68,8

70,7
72,5
74,4

76,3
78,2
80,2

82,3
84,4
86,6

89,1
91,6
94,1

96,6
99,7
52,4

53,7
55,0
56,3

57,6
58,9
60,2

61,5
62,8
64,1

65,5
67,2
69,0

70,9
72,7
74,6

76,5
78,4
80,4

82,5
84,6
86,8

89,3
91,8
94,3

96,9
100,0
52,5

53,8
55,1
56,4

57,7
59,0
60,3

61,6
62,9
64,2

65,7
67,3
69,2

71,0
72,9
74,8

76,7
78,6
80,6

82,7
84,8
87,1

89,6
92,1
94,6

97,2
52,6

53,9
55,2
56,5

57,8
59,1
60,4

61,7
63,0
64,4

65,8
67,5
69,4

71,2
73,1
75,0

76,9
78,8
80,8

82,9
85,0
87,3

89,8
92,3
94,8

97,5
52,8

54,1
55,4
56,7

58,0
59,3
60,6

61,9
63,2
64,5

66,0
67,7
69,6

71,4
73,3
75,2

77,1
79,0
81,1

83,2
85,3
87,6

90,1
92,6
95,1

97,8
52,9

54,2
55,5
56,8

58,1
59,4
60,7

62,0
63,3
64,6

66,2
67,9
69,7

71,6
73,4
75,3

77,2
79,2
81,3

83,4
85,5
87,8

90,3
92,8
95,3

98,1
53,0

54,3
55,6
56,9

58,2
59,5
60,8

62,1
63,4
64,8

66,3
68,1
69,9

71,8
73,6
75,5

77,4
79,4
81,5

83,6
85,7
88,1

90,6
93,1
95,6

98,4

53,1

54,4
55,7
57,0

58,3
59,6
60,9

62,2
63,5
64,9

66,5
68,2
70,1

71,9
73,8
75,7

77,6
79,6
81,7

83,8
85,9
88,3

90,8
93,3
95,8

98,7
53,3

54,6
55,9
57,2

53,5
59,8
61,1

62,4
63,7
65,1

66,6
68,4
70,3

72,1
74,0
75,9

77,8
79,8
81,9

84,0
86,1
88,6

91,1
93,6
96,1

99,0


V.4.2.9. DETERMINAO DO NDICE DE ESPUMA

Para a quantidade de droga estabelecida na monografia, transferir para proveta de 500 ml
provida de rolha esmerilhada e adicionar 50 ml de gua. Arrolhar a proveta e agitar manualmente,
durante 3 minutos, com duas agitao por segundo. Deixar em repouso por 1 minuto e fazer a
leitura de coluna de espuma que se forma a ndice de espuma (aps 1 minuto e aps 30 minutos)
o nmero de ml correspondente altura da coluna de espuma.

V.4.2.10. DETERMINAO DE SUBSTNCIAS EXTRAVEIS POR LCOOL
(EXTRATO ALCOLICO)

pesar exatamente cerca de 2 g da droga e transferir a amostra para cartucho do extrator
de Soxhlet, previamente tarado e seco. Introduzir no balo do extrator 200 mg de hidrxido de
sdio e lcool absoluto em quantidade suficiente. Extrair por cinco horas, retirar o cartucho com o
resduo e sec-lo em estufa a 105 graus centgrados por 30 minutos. Pesar o resduo seco e
calcular o teor de substncias extraveis por lcool (extrato alcolico) por diferena entre o peso
da amostra e o peso do resduo seco. Referir o resultado ao peso da droga seca (Determinao
de gua em drogas vegetais V.4.2.3.).

V.5. MTODOS BIOLGICOS

V.5.1. TESTES DE SEGURANA BIOLGICA

V.5.1.1. ESTERILIDADE

Os testes aqui apresentados so aplicados a insumos farmacuticos, medicamentos e
correlatos que, de acordo com a Farmacopia, devem ser estreis, e so adequados para revelar
a presena de bactrias, fungos e leveduras nos mesmos. Contudo, resultado satisfatrio indica
somente que no foi encontrado microrganismo contaminante na amostra examinada. A extenso
deste resultado ao restante do lote requer a ssegurana de que todas as unidades do mesmo
tenham sido preparadas de modo a garantir grande probabilidade de que todo o lote passaria pelo
Vigilncia Sanitria Digital 147
teste. Obviamente isso depende das precaues tomadas durante os processos operacionais da
fabricao.

PRECAUES DURANTE O TESTE

Os testes no devem ser realizados sob exposio direta da luz ultravioleta ou em reas
sob tratamento com aerossis. Devem ser efetuados em condies adequadas de forma a evitar
contaminao acidental da amostra durante o teste. Isto conseguido, por exemplo, pelo uso de
cabina de fluxo laminar, associado a freqentes ensaios quanto contaminao do ar e
superfcies, contagens de partculas, determinao de velocidade e direo do fluxo de ar.

MEIOS DE CULTURA E FLUIDOS DE DILUIO E/OU LAVAGEM

A escolha do meio de cultura de vital importncia para oferecer condies ideais
multiplicao dos mais diversos microrganismos, com exigncias diferentes para o crescimento.
As monogrfias indicam os meios a serem empregados.
Os meios mais usados atualmente para testes de esterilidade so meio de caseina soja
e Tioglicolato, o primeiro para leveduras, fungos e aerbios e o segundo, especialmente, para
anaerbios, embora haja, tambm, crescimento de aerbios, leveduras e at mesmo fungos no
tioglicolato.

a) Meio de tioglicolato fluido (meio l)
- L-Cistina 0,5 g
- Cloreto de sdio 2,5 g
- D Glicose 5,5 g
- Agar granulado ( umidade no superior 15%) 0,75g
- Extrato de levedura (solvel em gua) 5,0 g
- Casena de digesto pancretica 15,0g
- Tioglicolato de sdio 0,5 ou cido tiogliclico 0,3 ml
- Soluo de resarzurina sdica (1:1000) recm-preparada 1,0 ml
- gua pH aps esterilizao: 7,1 mais ou menos 0,2 1000 ml

Misturar todos os ingredientes, menos o tioglicolato de sdio ou cido tiogliclico,
soluo de resarzurina sdica, com 1000 ml de gua e aquecer at dissoluo total . dissolver o
tioglicolato de sdio ou cido tiogliclico nesta soluo e, se nacessrio, ajustar pH para 7,1 mais
ou menos 0,2 aps a esterilizao, com soluo de hidrxido de sdio 0,1 M.
Adicionar a soluo de resarzurina sdica, misturar e distribuir em frascos adequados.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 graus centgrados. Desenvolve-se cor rsea na superfcie,
que no deve exceder 1/3 da altura, caso mais que 1/3 adquirir cor rsea, restaurar o meio por
aquecimento em banho-maria ou em vapor fluente.

b) Meio de tioglicolato com 1% de penicilinase (Meio ll)
Empregar, preferencialmente para produtos contendo penicilina, soluo de penicilinase
padronizada em termos de unidade Levy. Uma unidade Levy de penicilinase inativa 59,3 unidades
de benzilpenicilina em 1 hora, a 25 graus centgrados em soluo tampo fosfato pH 7,0. Usar
esta soluo para inativar apenicilina nas amostras. A penicilinase deve ser adicionada aos tubos
aps a esterilizao, usando tcnica assptica. Nmero representativo de tubos contendo meio
com penicilinase sem o produto dever acompanhar o teste durante o perodo de incubao.
Quando se empregar meio com pelicilinase, realizar controle positivo. Proceder o seguinte teste
para verificar se toda a penicilina foi inativada.
- O tubo de meio contendo amostra, adicionar 1 ml de cultura de Stafhylococcus atcc
6538-P, contendo 50 a 100 clulas. Aps 24 horas de incubao a 30 graus
centgrados observar se ocorreu o crescimento.

c) Tioglicolato com 1% de polissorbato 80 (Meio lll)
Empregar nos testes de esterilidade para pomadas oftlmicas.
Adicionar 1 ml de polissorbato 80 por litro, antes da esterilizao.

d) Tioglicolato com 0,5% de azolectina e 0,4 de polissorbato 80 (Meio lV)
Vigilncia Sanitria Digital 148
Empregar para teste da estabilidade de produtos que requeiro inativao de substncias
inibidoras.

e) Meio de casna-soja (Meio V)
Empregar para deteco de bactrias aerbicas, fugos e leveduras.

- Caseina de digesto pancretica 17.0 g
- Farinha de soja de digesto papanica 3.0 g
- Cloreto de sdio 5.0 g
- Fosfato de potssio dibsico 2.5 g
- D-Glicose 2.5 g
- gua pH aps esterilizao: 7,3 mais ou menos 0,2 1000 ml

Dissolver todos os ingredientes em gua, com ajuda de aquecimento. Resfriar
temperatura ambiente. Se necessrio, adicionar hidrxido de sdio 0,1 M, de modo a obter pH 7,3
mais ou menos 0,2 aps a esterilizao. Caso necessrio, filtrar, distribuir em frascos adequados
e esterilizar por 15 minutos a 121 graus centgrados.

f) Casena- soja com 1% de penicilinase (meioVl)
Empregar para produtos contendo penicilina. Preparar e usar conforme o meio ll.

g) Cascna-soja com 0,1% de polissorbato 80 (meio Vll)
Preparar e empregar conforme meio lll.

h) Casena-soja com 0,5 de azolectina e 0,4 de polissorbato 80 (meio Vlll)
Preparar e empregar conforme o meio lV.

i) Fluido l
- Tecido animal de digesto pptica1 g
- gua pH aps esterilizao: 7,1 mais ou menos 0,2 1000 ml

Dissolver o tecido animal de digesto pptica em gua. Filtrar e, caso necessrio, ajustar
o pH para 7,1 mais ou menos 0,2 com hidrxido de sdio 0,1 M. Distribuir em frascos adequados
e esterilizar durante 15 minutos a 121 graus centgrados.

j) Fluido ll
- O fluido l com adio de 0,1% de polissorbato 80, antes da esterilizao.

k) Fluido lll
- Tecido animal 5,0 g
- Extrato de carne 3,0 g
- Polissorbato 80 10,0 g
- gua 1000 g
pH aps esterilizao: 6,9 mais ou menos 0,2

Misturar todos os ingredientes com gua e aquecer at dissoluo. Filtrar e, se
necessrio, ajustar o pH para 6,9 mais ou menos 0,2 com hidrxido de sdio 0,1 M. Distribuir em
frascos adequados e esterilizar durante 15 minutos a 121 graus centgrados. Ajustar o pH a 6,9
mais ou menos 0,2 com hidrxido de sdio 0,1 M. Distribuir em frascos adequados.

PR-INCUBAO E TESTE DE SENSIBILIDADE DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura devem apresentar esterilidade e capacidade de promover
crescimento de microorganismos que devem ser testadas em cada lote antes do teste das
amostras ou em paralelo com ele.
Aps a esterilizao, os meio de Tioglicolato fluido e de Casena-soja devem ser
incubados, respectivamente, a 30 35 graus centgrados e 20 25 graus centgrados durante, no
mnimo, 7 dias. No deve ocorrer crescimento de microrganismos.
Efetuar teste para verifica a capacidade dos lotes de meios em promover o crescimento
de microrganismos. Os seguintes microrganismos so adequados para realizar o teste:
Vigilncia Sanitria Digital 149

a) Bacilus subtilis ATCC 6633, ou se no for desejado microrganismos formador de
esporo, Micrococus luteus ATCC 9341.
b) Candida albicans ATCC 10.231.
c) Aspergilus niger ATCC 16.404.


Meio Microrganismo Temperatura de incubao
Tioglicolato
Fluido B. subtilis ou M. Luteus 30 35 graus C
C. albicans
C. sporogenes ou
B. vulgatus
Casena-soja B. subtilis ou N. luteus 20 - 25 graus C
C. albicans
A. niger

d) Clostridium sporogenes ATCC 11.437, se no for desejado microrganismo formador de
esporo, Bacteroides vulgatos ATCC 8482.

Inocular pelo menos dois tubos de cada meio, com volume de suspenso de
microrganismo que contenha 50 a 100 clulas, conforme tabela da pgina anterior.
Este meio ser considerado satisfatrio desde que todos os tubos inoculados apresentem
evidencia de crescimento dentro de 7 dias.
Sendo o teste de crescimento realizado concomitantemente com o teste de esterilidade,
este considerado invlido, caso no ocorra proliferao de microrganimo na prova de
crescimento.

PREPARAO DA SUSPENSO BACTERIANA

Usualmente necessrio efetuar ajuste do processo de diluio antes de iniciar a prova
para conseguir densidade especfica de 50 100 clulas viveis por milimetro da soluo, devido
variao entre cepas no mesmo microrganismo, meios de cultura e superfcie de gar inclinado.
Para estabelecer, numricamente, uma variao entre o crescimento em um meio e o
microrganismo especfico, fazer uma srie de contagens em placas a partir da diluio 10
-6

(1:1000.000), para determinar a densidade bacteriana. Escolher volume adequado desta diluio
de tal modo que ao ser diluido em volume conhecido contenha de 50 100 clulas viveis por ml.
Se o procedimento estiver bem padronizado (como, o exemplo, a rea da superfcie do gar
inclinado, tcnicas de laboratrio etc.) possvel reproduzir os resultados com a mesma cepa de
bactrias.

Procedimento

1) Com o auxlio de ala de platina transferir inculo da seta do microrganismo especfico
para tubo de ensaio contendo gar nutriente inclinado. Semear levemente a cultura sobre toda a
superfcie do gar inclinado, de modo a obter pelcula uniforme de crescimento
2) Incubar sob condies timas de crescimento do microrganismo especfico
3) Aps o perodo de incubao transferir a cultura do microrganismo da superfcie do
gar inclinado para frasco contendo 99 ml de gua esterilizada
4) Homogeneizar a suspenso, no mnimo, 25 vezes por inclinao do frasco
5) Preparar uma seqncia de diluies desejadas: 1:1000; 1:10.000 e 1:1.000.000, a
partir da suspenso do frasco original
6) A homogeneizao das suspenses de cada diluio pode ser realizada tambm com
o auxlio de basto de vidro, por agitao magntica ou prolas de vidro.

AVALIAO DA ATIVIDADE BACTERIOSTTICA OU FUNGISTTICA

Antes de iniciar o teste de esterilidade de insumos farmacuticos, medicamentos ou
correlatos, avaliar seu nvel de atividade bacteriosttica e/ou fungisttica pelo seguinte
procedimento:
Vigilncia Sanitria Digital 150
Preparar, pelo menos, quatro tubos de meio de cultura ou de cada um dos meios de
cultura a serem empregados no Teste de esterilidade. Adicionar a todos os tubos quantidade do
produto em anlise, conforme segue (2):

Contedo do recipiente (ml)
Volume mnimo
de produto (ml)
Volume mnimo de meio (ml)
menos que 10 1 ml, ou o contedo total, se
menor que 1
15
11 a 50 5 40
51 a 100 10 80

Inocular metade dos tubos com microrganismos aerbico e a outra metade com
aneorbico, conforme indicado para Teste de crescimento nos Meios de cultura (1). Preparar
duplicata do conjunto, em condies idnticas, porm no adicionar o produto a ser testado.
Incubar todos os tubos contendo tioglicolato a 30 35 graus centgrados e a 20 25 graus
centgrados, os que contiverem casena-soja. Se houver crescimento normal dos microrganismos
na presena e na auxncia do produto, o Teste de esterilidade pode ser realizado sem
modificaes. Se o crescimento for pequeno ou nulo o produto exerce atividade bacteriosttica
e/ou fungisttica e essa atividade deve ser eliminada antes do teste de esterilidade por meio de
agentes neutralizantes ou, no decorrer do mesmo, atravs da diluio do produto. Deve-se repetir
o teste at determinar relao ideal entre os volumes do produto e do meio, que no interfira no
crescimento de microrganismos. Outra maneira de evitar as atividades bacteriostticas e/ou
fungistticas empregar o mtodo de filtrao por membrana, quando a natureza do produto
assim o permitir.

PROCEDIMENTO PARA O TESTE DE ESTERILIDADE

O teste de esterilidade pode ser realizado de duas maneiras, atravs do mtodo de
inoculao do produto diretamente no meio (Mtodo direto) ou pelo mtodo de filtrao por
membrana, o qual deve ser empregado sempre que possvel.

Amostragem

O nmero de amostra de um produto para teste de esterilidade deve ser, no mnimo, de
20 unidades ou 10% do nmero de unidades que constituem o lote se este for inferior a 199
unidades. Antes do teste proceder assepsia das paredes externas dos frascos e ampolas,
mergulhando-os em soluo antimicrobiana. No caso de artigos cujas embalagens no resistam a
esse tratamento, fazer assepsia das amostras por meio de gaze ou pano estril, embebido em
soluo antimicrobiana.
Para matrias-primas, amostragem satisfatria baseada na raiz quadrada do nmero
total de recipientes do lote, conforme abaixo indicado:

Nmero total de
recipientes do lote
Nmero de recipientes a serem
abertos para teste
1 a 3 todos
4 a 9 3
10 a 16 4
17 a 25 5
26 a 36 6
37 a 49 7
50 a 64 8
65 a 81 9
82 a 100 10
101 a 121 11

A assepsia dos recipientes deve ser realizada por meio de gaze ou plano estril,
embebido em soluo antimicrobiana.

Mtodos de inoculao ou direto

Vigilncia Sanitria Digital 151
Procedimento

O teste de esterilidade pelo mtodo de inoculao direto consiste na transferncia
assptica de quantidade de produto a ser examinado para Meio de tioglicolato fluido e Meio de
casena-soja seguida de incubao a 30 35 graus centgrados e 20 25 graus centgrados,
respectivamente, durante 14 dias.

Lquidos

Retirar o lquido do recipiente utilizando pipeta estril ou seringa estril. Transferir
asspticamente o volume indicado de cada amostra para os tubos contendo Meio de tioglicolato
fluido e Meio de casena-soja (os volumes mnimos, tanto de material em anlise quanto dos
meios de cultura, esto especificados no item Teste de Avaliao da Atividade Bacteriosttica ou
Fungisttica). Misturar o lquido com o meio sem arejar excessivamente. Incubar o Meio de
tioglicolato fluido por 14 dias a 30 35 graus centgrados e o meio de casena-soja a 20 25
graus centgrados.
Se o material em anlise provocar turvao dos meios de cultura, de modo a impedir a
observao do crescimento microbiano, transferir pores adequadas de cada tubo para outros
tibos contendo os meios, aps 3 7 dias do incio da incubao. Continuar a incubao de todos
os tubos at que se completem 14 dias a contar do incio do teste.

Slidos

Transferir quantidade de produto na forma de slido seco (ou de soluo ou suspenso
do produto preparada pela adio de diluente estril ao recipiente), correspondente a 300 mg de
cada recipiente sob anlise, ou todo o contedo, se for menor que 300 mg, a volume no inferior
a 40 ml de Meio de tioglicolato fluido e a 40 ml de Meio de casena- soja. Misturar e proceder
como para Lquidos.
Pomadas e leos insolveis em miristrato de isopropila

Selecionar 20 recipientes, dividi-los em dois grupos de 10 e trat-los como segue:
transferir assepticamente 100 mg de cada recipiente para frasco contendo 100ml de veculo
aquoso estril capaz de dispersar o material em anlise homogeneamente por toda a mistura. A
escolha do agente dispersante incoporado ao veculo aquoso pode diferir de acordo com a
natureza do material em anlise: contudo, este agente no deve causar bacteriostase nem
fungistase na concentrao utilizada: portanto, executar o Teste de Avaliao de Atividade
Bacteriosttica e/ou Fungisttica para esse agente, antes de empreg-lo.
Transferir 10 ml dessa mistura a 80 ml de Meio de tioglicolato fuido e 10 ml a 80 ml de
Meio de casena-soja. Continuar o procedimento como descrito para lquidos.

Algodo purificado, gaze, bandagem e material relacionado

De cada embalagem de algodo, gaze em rolo ou gaze em bandagem a ser analisada,
retirar, com instrumentos estreis, duas pores de 100 a 500 mg das partes mais internas da
amostra. Para materiais em embalagem individual, tais como chumao de gaze, retirar duas
pores individuais 250 a 500 mg, ou duas unidades totais, no caso de unidades pequenas (ex.
bandagens menores que 25 a 75 mm). Transferir uma poro para tubo com 40 ml de Meio de
tioglicolato fluido e outra para tubos com 40 ml de Meio de casena-soja. Continuar o
procedimento como descrito para lquidos.

Aparelhos parenterais

Para aparelhos de formas e dimenses que permitam sua imerso total em no mais que
1000 ml de meio de cultura, testar o aparelho intacto, mergulhando uma unidade em Meio de
tioglicolato fluido em outra em Meio de casena-soja. Verificar se os pequenos canais e orifcios
esto em contato com o meio de cultura, caso isto no ocorra, fazer cortes no aparelho para
atingir tal objetivo. No podendo o aparelho ser imerso completamente, dividi-lo em pores
adequadas. No podendo ser dividido, passar Meio de casena-soja e tioglicolato fluido pelo
interior de 20 amostra, recolher pelo menos 15 ml destes meios e incub-lo por 14 dias a 20 - 25
Vigilncia Sanitria Digital 152
graus centgrados com no menos que 100 ml dos mesmos meios. Continuar o procedimento
como descrito para lquidos.

Gaze com vaselina

Preparar o Meio de tioglicolato fluido conforme descrito no item Meio de cultura,
adicionando 1,0 g de gare 5,0 g de gelatina para cada 1000 ml de meio. Distribuir pores de
300 ml em frascos que permitam o fechamento hermtico aps a esterilizao. Esterilizar durante
15 minutos a 121 graus centgrados. Aquecer o meio a 52 graus centgrados e transferir
assepticamente o contedo total de uma embalagem de gaze com vaselina. Fechar
hermeticamente e agitar durante 10 minutos em agitador mecnico. Resfriar os frascos em
posio inclinada at que a vaselina forme camada slida vedando a superfcie do meio. Quebrar
a vedao por uma nica e rpida agitao. Incubar 20 25 graus centgrados durante sete dias e
agitar, em agitador mecnico, durante, pelo menos, 10 minutos. Transferir assepticamente 0,5 ml
dessa mistura para 15 ml de Meio de tioglicolato fluido e 0,5 ml para 15 ml de Meio de casena-
soja. Incubar, respectivamente, a 30 - 35 graus centgrados a 20 - 25 graus centgrados durante,
pelo menos, sete dias.

Mtodo de filtrao por membrana

O teste de esterilidade pelo Mtodo de filtrao por membrana consiste na dissoluo das
substncias em anlise em fluido estril adequado e a passagem dessa soluo atravs de
membrana estril, que ir reter qualquer contaminao em sua superfcie em seguida esta
lavada, seccionada e transferida assepticamente para meio de cultura adequada. Para realizar o
teste necessrio funil apropriado no qual colocada a membrana e receptculo para esse funil,
que acoplado a reservatrio (que acolhera as solues filtradas), ligado a bomba de vcuo. A
membrana pode ser de nitrato de celuse (empregada, por exemplo, em solues aquosas,
oleosas e alcolicas fracas) ou acetato de celuse (empregada, por exemplo, em alcolicas fortes),
com dimetro de 47 mm, porosidade nominal de 0,45 m mais ou menos 0,02 m e fluxo de 55 a 75
ml de gua por centmetro quadrado por minuto, presso de 700 mm a 25 graus centgrados.
Todo material deve ser esterilizado durante 15 minutos a 121 graus centgrados. No empregar
volume de amostra menor que o indicado.

Volume de lquido e meio de cultura para Mtodo de Filtrao por Membrana

Volume de recipiente
( ml )
Volume mnimo de cada
recipiente para meio de
cultura ( ml )
Volume mnimo de cada
meio de cultura
( ml )
Nmero mnimo de amostra
a serem testadas
Menos que 10

11 a 50
51 a 100
101 a 500
Acima de 500
1 ml ou contedo total
se menor que 1 ml
5
10
Contedo total
500
100

100
100
100
100
20

20
20
10
10

Lquidos miscveis em veculo aquoso

Transferir, assepticamente, o volume indicado abaixo para conjunto de funil e membrana,
filtrar lavar com trs pores de 100 ml de Fluido l, cortar a membrana ao meio, colocar uma das
metades no Meio de tioglicolato fluido e a outra no Meio de casena-soja. Incubar,
respectivamente, a 30 35 graus centgrados e 20 25 graus centgrados durante, pelo menos 7
dias.
No realizar o teste com volume de amostra inferior ao indicado. Se o volume for
insuficiente, aumentar o nmero de amostras.

Lquidos imiscveis em veculos aquosos

Proceder como Lquidos miscveis em veculos aquosos, substituindo o fluido I pelo fluido
II.

Pomadas e leos solveis em miristrato de isopropila

Vigilncia Sanitria Digital 153
Selecionar 20 unidades, transferir 100mg de cada unidade para frasco contendo 100ml de
miristrato de isopropila, cujo pH seja igual ou superior a 5,5, e que tenha sido esterilizado por
filtrao em membrana de 0,22 mm. Aquecer o miristrato de isopropila a 47 graus centgrados.
Agitar e dissolver a pomada. Transferir a mistura para conjunto de funil e membrana. Umedecer
antes a membrana com pequena quantidade do lquido de lavagem, filtrar, lavar com 3 pores
de 100ml de Fluido II. Cortar a membrana ao meio, colocar uma das metades no Meio de
tioglicolato fluido e a outra no Meio de casena-soja. Incubar, respectivamente, a 30 35 graus
centgrados e 20 25 graus centgrados durante, pelo menos 7 dias. Se a substncia contiver
vaselina, usar como lquido de lavagem o Fluido III.

Slidos solveis

Transferir uma quantidade de substncia em forma slida (ou de soluo ou suspenso
da substncia preparado pela adio de diluente estril ao recipiente), correspondente a 300 mg
de cada recipiente em anlise, ou todo o contedo, se for menor que 300 mg, a cerca de 100 a
200 ml de diluente apropriado (Fluido I ou Fluido II). Filtrar o contedo do frasco em conjunto de
funil e membrana, lavar com 3 pores de 100 ml de fluido apropriado e prosseguir como par
lquidos miscveis em veculos aquosos.

Algodo purificado, gaze e material relacionado
(categute, saturas etc.)

Fazer amostragem de acordo com a monografia para algodo para frasco contendo
volume suficiente de fluido I, ou, quando for o caso, passar o fluido pelo interior dos tubos ou do
equipamento. Agitar vigorosamente. Transferir o lquido para conjunto de funil e membrana e
filtrar. Prosseguir como indicado para lquido miscveis em veculos aquoso.

Controle negativo ou branco

Efetuar constantemente controle negativo, simulando teste com os lquidos e solventes
utilizados. O resultado do teste deve ser negativo.

Observao e interpretao dos resultados

Durante o tempo de incubao, observar os tubos em anlise, periodicamente, para
verificar eventual aparecimento de crescimento microbiano. Se, ao final do perodo de incubao,
no ocorrer crescimento microbiano, a amostra considerada satisfatrio par o teste de
esterilidade. Se ocorrer crescimento, o produto no corresponde ao teste de esterilidade, a menos
que se possa demonstrar o contrario por reteste, ou por meios que comprovem no ter a
contaminao causa relacionada com a amostra (ex. contaminao ambiente, contaminao de
controle negativo).
O reteste deve ser feito de maneira idntica ao teste inicial. Se no aparecer evidncia
decrescimento, a amostra satisfatria para o teste de esterilidade. Se houver crescimento no
primeiro reteste, isolar e caracterizar o(s) contaminante(s) microbiano(s) do primeiro reteste e
comparar com o(s) contaminantes do teste de esterilidade original. Se o contaminante for o
mesmo nos dois testes, a amostra no corresponde ao teste de esterilidade. Se os dois
contaminantes forem diferentes, deve ser realizado um segundo reteste.
O segundo reteste deve ser feito com o dobro de unidades de amostra utilizadas no etste
inicial. Os volumes de cada unidade devem ser os mesmos indicado para o teste inicial. Se no
houver evidncia de crescimento, a amostra satisfatria para o teste de esterilidade. Se houver
crescimento de qualquer microrganismo, a amostra considerada insatisfatria para o teste de
esterilidade.

V.5.1.2. PIROGNIOS

O teste de pirognios fundamenta-se na medida do aumento da temperatura corporal dos
coelhos, quando se injeta intravenosamente uma dose-limite de 10 ml por kg de peso, durante
perodo no superior a 10 minutos, de soluo estril da substncia sem anlise.
Para os produtos que requeiram preparao preliminar ou que necessitem de condies
especiais de administrao, seguir as normas recomendadas na monografia.
Vigilncia Sanitria Digital 154

Seleo dos animais

Usar coelhos de ambos os sexos, adultos, sadios, preferencialmente da mesma raa,
pesando no mnimo 1,5 kg. Manter os animais em gaiolas individuais em sala de temperatura
uniforme (20 graus centgrados mais ou menos 2 graus centgrados) e livre de perturbaes que
os possam excitar. Uma semana antes de usar um animal pela primeira vez, iniciar exerccio do
condicionamento segundo a tcnica recomendada para o teste, mas sem a injeo do produto a
ser analisado.
Ocorrendo teste de pirgnio negativo, pode-se usar o mesmo animal aps 13 horas.
Quando o teste de pirognio for positivo no se usam os mesmos animais antes duas semanas.

Registro da temperatura

Usar termmetro clnico de preciso, graduado em 0,1 graus centgrados, com tempo de
elevao de temperatura mxima previamente determinado ou qualquer outro dispositivo de
registro de temperatura de igual sensibilidade.
Introduzir o termmetro no reto do animal profundidade aproximada de 6 centmetros.
Se for utilizado dispositivo registrador, que deva permanecer no reto durante o perodo de teste,
conter os coelhos de maneira que fiquem em postura natural de repouso. Quando se emprega
termmetro clnico deixar transcorrer o tempo necessrio (previamente determinado) para que
alcance a temperatura mxima, antes de proceder leitura.

Material

As seringas, agulhas e vidrarias tornam-se apirognicas a 250 graus centgrados durante
30 minutos ou a 200 graus centgrados por uma hora. O cloreto de sdio, a 200 graus centgrados
durante duas horas.

Procedimento

Durante as duas horas precedentes, e durante o teste, suprimir alimentao dos trs
coelhos, dando-lhes somente gua. No mximo 40 minutos antes da injeo da dose do produto a
ser testado, determinar a temperatura de controle (inicial) de cada animal mediante duas leituras
feitas com intervalos de 30 minutos. A mdia das duas temperaturas considerada como a
temperatura de controle do animal, que a base para a determinao de qualquer aumento de
temperatura resultante da injeo da soluo de teste. No usar animais com temperatura
superior a 39,8 graus centgrados. Usar no teste somente os animais cujas temperaturas de
controle no se desviem de mais de 1,0 graus centgrados um do outro. No devem ser usados
os animais que apresentem desvio maior do mais ou menos 2 graus centgrados, nas duas
leituras da temperatura controle.
Preparar o produto a ser testado conforme especificado na monografia. Aquecer o mesmo
a 37 38 graus centgrados.
Injetar pela veia marginal da orelha de trs coelhos no menos do que 0,5 ml nem mais
de 10 ml da soluo por kg de peso corporal ou a quantidade indicada na monografia. A injeo
no deve durar mais de 10 minutos, a menos que na monografia se especifique tempo diferente.
Registrar a temperatura 1, 2 e 3 horas aps a injeo.

Interpretao

A temperatura mxima registrada para cada coelho considerada como sua resposta.
Quando as temperaturas medidas aps a injeo forem inferiores temperatura de controle a
resposta equivale elevao de temperatura zero.
Se nenhum dos trs coelhos apresentar elevao de temperatura de 0,6 graus
centgrados, ou mais, sobre suas respectivas temperaturas de controle, e se a soma dos
aumentos dos trs no exceder a 1,4 graus centgrados, o produto em exame cumpre os
requisitos de ausncia de pirognios.
Se algum coelho apresentar aumento da temperatura de 0,6 graus centgrados, ou mais,
ou se a soma dos aumentos exceder a 1,4 graus centgrados, repete-se o teste usando-se outros
cinco animais.
Vigilncia Sanitria Digital 155
Se no mximo trs dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de temperatura de
0,6 graus centgrados, ou mais, e se a soma dos oito aumentos de temperatura no exceder a 3,7
graus centgrados, o produto em exame cumpre os requisitos para ausncia de pirognios.

V.5.1.3. TOXICIDADE

TESSE GERAL

Seleo dos animais

Usar camundongos sadios, de ambos os sexos, preferencialmente de cepa conhecida,
no utilizados previamente em testes biolgicos. Mant-los sob dieta uniforme, gua vontade e
temperatura ambiente constante a 20 a 24 graus centgrados. No dia do teste selecionar
camundongos com peso entre 18 e 22 g.

Preparao da amostra

A amostra deve ser preparada conforme especificao constante na respectiva
monografia e administrada imediatamente.

Procedimento

Usar seringas, agulhas e vidraria estreis. Segundo especificado na monografia,
administrar volume da substncia sob teste, em cinco camundongos por uma das vias seguintes:

1) intravenosa. Injetar a dose na veia caudal, mantendo-se a velocidade constante de 0,1
ml por segundo ou a indicada na monografia;
2) intraperitonial. Injetar a dose na cavidade peritonial;
3) subcutnea. Injetar a dose na regio cervical ou abdominal;
4) oral. Administrar a dose por meio de sonda ou outro dispositivo adequado.

Interpretao

Manter os animais em observao durante 48 horas ou pelo tempo indicado na
monografia. A sobrevivncia de todos os camundongos durante o perodo estabelecido determina
a aprovao do produto. A morte de um ou dois animais ou a presena de sintomas anormais
requer repetio do teste, empregando-se cinco ou mais camundongos (19,5 a 20,5 g), no
utilizados previamente. A amostra cumpre os requisitos do teste se o nmero de camundongos
mortos no exceder 10% do total de animais testados, incluindo o teste original.

TESTE PARA SOROS E VACINAS DE USO HUMANO

Salvo especificao doferente constante na monografia, injetar intraperitonealmente uma dose
humana
1
, porm no exceder 1,0 ml, em 5 comundongos selecionados conforme descrito no teste
geral, e uma dose humana em dois cobaios sadios, pesando entre 250 e 350 g. Neste caso no
exceder 5 ml.
A amostra aprovada no teste se nenhum dos animais apresentar sintomas anormais
durante os sete dias seguintes. Se um animal morrer ou apresentar sintomas anormais, repetir o
teste. A amostra cumpre os requisitos do teste caso nenhum dos animais do segundo grupo
morrer ou apresentar sintomas anormais no intervalo de tempo especificado.

1 A dose humana a declarada no rtulo ou na bula da preparao a ser examinada.

V.5.1.4. SUBSTNCIAS VASODEPRESSORAS

Preparao do padro de referncia

Empregar dicloridrato de histamina, conservado em frasco hermtico e opaco, dessecado
sobre slica-gel durante duas horas, antes do uso.

Vigilncia Sanitria Digital 156
Soluo padro de referncia

Dissolver, em gua estril, quantidade suficiente e exatamente pesada de dicloridrato de
histamina para obter soluo contendo o equivalente a 1 mg/ml de histamina (base livre).
Conservar sob refrigerao em recipiente de vidro mbar dotadode tampa esmerilhada, ao abrigo
da luz, durante um ms. no dia do teste, preparar soluo padro de referncia contendo o
equivalente a 1,0 mg/ml de histamina (base livre), em soluo fisiolgica.

Soluo da amostra

Preparar a soluo da amostra conforme a especificao da monogrfia respectiva.

Mtodo sugerido

Pesar gato adulto e sadio (no caso de fmea, que no esteja prenha) e anestesi-lo
atravs de injeo intraperitonial de cloralose ou barbitrico que permita a manuteno de
presso arterial uniforme. Imobilizar o animal e proteg-lo para previnir perda de calor corporal.
Dissecar a veia femural ou jugular, preparando-a por insero de cnula de heparina
(1000 unidades/ml de soluo fisiolgica) para a administrao das solues padro de referncia
e amostra.
Expor cirrgicamente a artria cartida, dissecando-a completamente das estruturas
circundantes, inclusive o nervo vago. Inserir uma cnula conectando-a diretamente ao manmetro
de mercrio ou outro dispositivo apropriado para o registro contnuo da presso arterial.
Avaliar a sensibilidade do gato histanina, injetando em intervalos uniformes de, no
mnimo, 5 minutos, doses correspondentes a 0,05 ug (dose A), 0,10 ug (dose B) e 0,15 ug (dose
C) de histamina (base livre) por kg de peso corporal. Aps cada administrao, lavar
imediatamente a cnula por injeo de aproximadamente 0,5 ml de soluo fisiolgica, para
remover atividade residual. Repetir trs vezes a administrao de dose B a fim de observar a
uniformidade de conformidade de resposta mesma dose. O animal considerado apto
realizao do teste se as respostas aos trs nveis de dosagem forem nitidamente diferenciadas e
as respostas sequncia de doses B forem aproximadamente similares, correspondendo a
quedas de presso arterial no inferiores a 2,7 Kpa (20 mm de mercrio).
Injetar duas sries de quatro doses, consistindo cada srie de duas injees da dose
especificada na monografia da amostra, intercaladas com a dose B, sempre com intervalo
uniforme de, no mnimo, 5 minutos.
Medir a alterao da presso arterial aps cada uma das injees. Na anlise dos
resultados, considera-se que a amostra cumpre os requisitos do teste se a medida de suas
respostas depressoras for inferior quela da dose B.
Terminar o teste administrando uma dose C do padro para comprovar que a resposta se
mantm superior dose B. caso isto no ocorra, o teste no vlido.
O animal pode ser usado enquanto permanecer estvel e responder, adequadamente,
administrao da soluo padro de referncia.

V.5.1.5. HISTAMINA

Usar cobaia com peso entre 250 e 350 g, em jejum de aproximadamente 24 horas.
Sacrificar o animal com golpe na nuca e sangria imediata por seco dos vasos. Retirar
aproximadamente 10 cm da poro distal do leo. Lavar internamente com soluo nutritiva.
Selecionar poro com cerca de 2 ou 3 cm de comprimento e amarrar duas linhas finas nas
extremidades. Efetuar pequena inciso na poro central do tecido. Transferi-lo para cuba-de-
rgo-isolado, de10 a 20 ml de capacidade, temperatura controlada entre 34 a 36 graus
centgrados sob corrente de ar ou mistura de 95% de oxignio e 5% de CO
2
. Fixar uma das linhas
no fundo da cuba e amarrar a outra na alavanca destinada a registrar as contraes musculares
do quimgrafo ou outro sistema de registro adequado. Ajustar a alavanca para o registro das
construes do leo com grau de ampliao da ordem de 20 vezes. Lavar a preparao com
soluo nutritiva e deix-la em repouso durante 10 minutos.
Adicionar volumes conhecidos da ordem de 0,2 a 0,5 ml de soluo padro de
referncia de histamina (1 g/ml) para obter resposta submxima (dose maior). Lavar o leo trs
vezes com soluo nutritiva. Efetuar as condies sucessivas em intervalos regulares de
aproximadamente 2 minutos. Adicionar novas doses de soluo padro de referncia de
Vigilncia Sanitria Digital 157
histamina obtidas por diluio da soluo original, de modo a manter os volumes de doses
sempre iguais estabelecendo a dose responsvel por resposta cuja intensidade seja a metade
da dose maior (dose menor).
Prosseguir o teste adicionando sequncias de 3 doses do padro de referncia menor,
dose de soluo da substncia sob teste e dose padro de referncia maior. Ajustar a diluio da
amostra para que, ocorrendo contrao do leo, esta seja menor que a produzida pela dose
padro de referncia maior.
Estabelecer a reprodutividade da contrao por repeties sucessivas da sequncia de
doses.
Calcular a atividade da substncia sob teste em termos de seu equivalente em ug/ml de
histamina (base livre), tomando por base as diluies efetuadas. O valor encontrado no deve
exceder o limite estabelecido na monografia.
No ocorrendo contrao no teste supracitado por efeito da amostra ensaiada, preparar
nova soluo da amostra, adicionando quantidade de histamina correspondente ao limite mximo
especificado na monografia e observar se a contrao produzida proporcional quantidade de
histamina adicionada. Considerar o teste vlido se essa resposta for proporcional e se confirmar
reprodutibilidade das contraes induzidas pela sequncia de dose padro de referncia menor,
dose de soluo da substncia sob teste e dose padro de referncia maior. Caso contrrio,
realizar o teste para substncias vasodepressoras.

Soluo nutritiva
(preparar no momento da utilizao)

Soluo A* 5 ml
Sulfato de atropina 0,5 mg
Bicarbonato de sdio 1,0 g
D-glicose anidra (para uso parenteral) 0,5 g
gua bidestilada (obtida de equipamento de vidro) 950 ml

*Soluo A
Cloreto de sdio 160,0 g
Cloreto de potssio 4,0 g
Cloreto de clcio anidro 2,0 g
Cloreto de magnsio anidro 1,0 g
Hidrogenofosfato de sdio 0,5 g
gua qsp 1000 ml

V.5.1.6. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIVEIS EM PRODUTOS QUE NO
NECESSITAM CUMPRIR COM O TESTE DE ESTERILIDADE

V.5.1.6.1. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIVEIS TATAIS

Este mtodo capaz de determinar o nmero total de bactrias e fungos presentes em
produtos e matrias-primas no estreis. O mtodo consiste na contagem da populao de
microrganismos que apresentem crescimento visvel, em 4 dias, em gar casena-soja (Meio I) a
30 35 graus centgrados e em sete dias, em gar sabouraud-dextrose (Meio II) e 20 25 graus
cntgrados.
A determinao pode ser efetuada atravs do mtodo de filtrao por membrana. Mtodo
de contagem em placa ou mtodo dos tubos mltiplos.
Empregar tcnicas asspticas na amostragem e na execuo do teste. Realizar o teste
preferencialmente em capela de fluxo laminar e empegar, quando possvel, a tcnica de filtrao
por membrana.
Na amostragem de produtos em processamento, coletar 3 amostras do incio, 4 do meio e
3 do fim do processo. Executar o teste na mistura destas amostras.
Utilizar diluio que permita que o nmero de Unidades Formadoras de Colnias se
encontre dentro dos limites sugeridos para o mtodo a ser usado.

MTODO DE FILTRAO POR MEMBRANA

Vigilncia Sanitria Digital 158
Empregar membrana de nitrato de celulose ou acetato de celulose, com porosidade no
superior a 0,45um. O equipamento para filtrao e a membrana devem ser esterilizado por
autolavagem e devem ser obedecidas precaues durante o teste, conforme descrito na seco
V.5.1.1.
Transferir 10 ml ou a quantidade de diluio que represente 1 g da amostra a ser testada,
para uma de duas membranas filtrantes e filtrar imediatamente. Se necessrio, diluir a amostra de
maneira a obter contagem de colnias entre 10 e 100. Lavar ambas as membranas , pelo menos
trs vezes, com aproximadamente 100 ml de lquido estril adequado. Transferir uma das
membranas, para contagem de bactrias , para superfcie de placa de Petri contendo 15 20 ml
Meio I. Incubar a 30 35 graus centgrados durante 4 dias. Transferir a Segunda membrana, para
contagem de fungos, para superfcie de placa de Petri contendo 15 20 ml de Meio II. Incubar a
20 25 graus centgrados durante 7 dias. Avaliar o nmero de colnias desenvolvidas. Calcular o
nmero de microrganismos por grama ou ml de amostras. Se necessrio. Proceder a contagem
de bactrias e fungos separadamente.

Preparao de amostras

Substncias solveis em gua transferir 10 mg ou 10 ml da mistura de amostras para
frasco volumtrico contendo 90 ml de tampo fosfato pH 7,2. Agitar at dissoluo e ajustar o pH
entre 6,5 e 7,5 com cido clordrico 0,1 M ou hidrxido de sdio 0,1 M e completar o volume de
100 ml. Transferir duas alquotas de 10 ml para dois frascos volumtricos contendo 90 ml do
fluido I.
Filtrar, lavar as membranas trs vezes com fluido I., incubar, contar as colnias e calcular
o nmero de microrganismos.
Substncias oleosas miscveis em gua transferir 10 mg ou 10 ml da mistura de
amostras para frasco volumtrico contendo 90 ml de fluido II aquecido a 45 48 graus centgrados
e completar o volume de 100 ml. Ajustar o pH entre 6,5 a 7,5 com cido clordrico 0,1 M ou
hidrxido de sdio 0,1 M. transferir duas alquotas de 10 ml para dois frascos volumtricos
contendo 90 ml de fluido II. Filtrar, lavar as membranas trs vezes com fluido II, incubar, contar as
colnias e calcular o nmero de mocrorganismos.
Substncias solveis em miristato de isopropila transferir 6 alquotas de 1 g ou 1 ml da
mistura de amostras para cada um de 6 frascos volumtricos e completar volume de 100 ml com
miristato de isopropila aquecido a 45 46 graus centgrados. Agitar os frascos, rapidamente, at
dissoluo. Filtrar cada uma das solues atravs de membrana filtrante e lavar as 6 membranas
com caldo nutriente esterilizado por filtrao e aquecido a 45 - 48 graus centgrados. Tranferir 3
membranas para 3 placas de petri contendo Meio I e 3 membranas para 3 placas contendo Meio
II. Incubar, contar as colnias e calcular o nmero de microrganismos.
Para pomada de uso tpico, efetuar teste adicional, transferindo uma membrana para
placa contendo gar para fermentao de anaerbios, incubando em jarra para anaerbios a 30
35 graus centgrados durante trs dias.

MTODO DE CONTAGEM EM PLACA

Bactrias Empregar placas de petri 100 x 20 mm, adicionando a cada placa 1 ml da
mistura de amostras 15 20 ml de Meio I liquefeito a 45 graus centgrados, ou alternativamente,
dispersar a mistura de amostras na superfcie do meio solidificado na placa. Diluir a mostra de
maneira que o nmero de colnias no ultrapassem a 300 por placa. Preparar pelo menos, duas
placas de petri para cada diluio e incubar a 30 35 graus centgrados, durante 4 dias. Contar o
nmero de colnias desenvolvidas. Calcular o resultado empregando placas com o maior nmero
de colnias, sem ultrapassar 300 colnias por placa.
Fungos Empregar placas de Petri 100 x 20 mm, adicionando a cada placa 1 ml da
mistura de amostras e 15 20 ml de Meio II liquefeito a 45 graus centgrados, ou,
alternativamente, dispersar a mistura de amostras na superfcie do meio solidificado na placa.
Diluir a amostra de maneira que o nmero de colnias no ultrapasse a 100 por placa. Preparar,
pelo menos, duas placas de Petri para cada diluio e incubar a 20 25 graus centgrados,
durante 7 dias. Contar o nmero de colnias desenvolvidas. Calcular o resultado empregando
placas com o maior nmero de colnias, sem ultrapassar 100 colnias por placa.

Preparao da amostra

Vigilncia Sanitria Digital 159
Empregar no mtodo de contagem em placas, 1 ml de preparaes de amostras contendo 10 g
ou 10 ml, diluidas ou dissolvidas em 1 ml de diluente adequado, conforme descrito no Mtodo de
Filtrao por Membrana para substncias solveis em gua. Substncias oleosas miscveis em
gua e substncias solveis em miristato de isopropila.
Cremes e pomadas insolveis em miristato de isopropila Transferir 10 g da mistura de
amostras para frasco volumtrico contendo 90 ml de caldo nutriente com 0,1% de tetradecilsufato
sdico, aquecido a 45 - 48 graus centgrados e agitar at a mistura homognea. Transferir 4
alquotas de 5 ml para 4 placas de, pelo menos, Petri 20 x 150 mm, adicionar a duas delas 20 a
40 ml de Meio I e s outras duas, igual volume de Meio II, ambos liquefeitos a 45 graus
centgrados. Misturar, homogeneamente, o gar com a amostra e deixar solidificar. Incubar,
contar e calcular o nmero de microrganismos.
Efetuar teste adicional, transferindo duas alquotas de 1 ml da primeira diluio para duas
placas de Petri 10 x 100 mm, contendo 15 20 ml de gar para fermentao de anaerbios,
incubando em jarra para anaerbios a 30 35 graus centgrados durante trs dias.
Cpsulas vazias adicionar 90 ml de tampo fosfato pH 7,2, aquecido a 45 graus
centgrados sobre 50 cpsulas. Agitar at suspenso total e completar o volume de 100 ml
(diluio 5:10). Transferir 1ml desta suspenso para 9 ml de gua (diluio 5:100) e, caso
necessrio, transferir 1 ml da ltima diluio para 9 ml de gua (diluio 5:1000). Transferir
alquotas de 1 ml de cada diluio para, pelo menos, 4 placas de Petri 20 x 100 mm, adicionar a
duas delas 15 20 ml de Meio I e s outras duas, igual volume de Meio II, ambos lquefeitos a 45
graus centgrados. Misturar homogeneamente, o gar com a amostra e deixar solidificar. Incubar,
contar as colnias e calcular o nmero de microrganismos.

Gelatinas Transferir 10 g da mistura de amostras para frasco volumtrico contendo 90
ml de gua estril aquecida a 48 graus centgrados e deixar em repouso durante uma hora
(diluio 1:10). Em seguida transferir o frasco para banho-maria a 45 graus centgrados durante
30 minutos, agitando vigorosamente a intervalos frequentes.
Diluir 1 ml desta soluo com 9 ml de gua estril (diluio 1:100) e, caso necessrio,
transferir 1 ml da ltima diluio para 9 ml de gua (diluio 1:1000). Prosseguir conforme
indicado para cpsulas vazias, a partir de transferir alquotas de ...
Demais substncias insolveis ou parcialmente solveis em gua transferir 10 ml da
mistura de amostras para frasco volumtrico contendo 90 ml de tampo fosfato pH 7,2 (diluio
1:10) Agitar at dissoluo e ajustar o pH entre 6,5 7,5 com cido clordrico 0,1 M. Transferir 1
ml desta diluio para 9 ml de gua (diluio 1:100) e, caso necessrio, transferir 1 ml da ltima
diluio para 9 ml de gua (diluio 1:1000). Prosseguir conforme indicado para cpsulas vazias a
partir de transferir alquotas de ...
Aerosis resfriar pelo menos 10 recipientes em mistura de lcool e gelo seco por uma
hora. Abrir os recipientes e deix-los temperatura ambiente para que o propelente escape.
Retirar 10 g ou 10 ml dos recipientes e transferir para frascos contendo 90 ml de tampo fosfato
pH 7,2 (diluio 1:10) ou outro diluente apropriado e completar o volume de 100 ml. Transferir 1
ml desta diluio para 9 ml de gua (diluio 1:1000). Prosseguir conforme indicado para
Cpsulas vazias a partir de transferir alquotas de ...
Contagem de colnias usar contador de colnias com iluminao artificial controlada,
lupa apropriada e, quando possvel, contador registrador. Somente as placas que apresentam at
300 colnias para bactrias e 100 para fungos devero ser consideradas para registro dos
resultados. Calcular a mdia aritmtica de cada diluio a partir dos valores obtidos das placas.
Calcular o nmero de microrganismos por g ou ml para cada diluio, multiplicando o nmero de
colnias da placa pela diluio usada e relatar a mdia aritmtica dos resultados. Expressar os
resultados como Unidades Formadoras de Colnias (UFC).


Exemplo :

Diluio Colnias p/ placas UFC / g ou ml
1:100 293 2,93 x 10
4

1:100 100 1,00 x 10
4

1:1000 41 4,1 x 10
4

1:1000 12 1,2 x 10
4


Vigilncia Sanitria Digital 160
(2,93 + 1,00 + 4,1 + 1,2)
Mdia: ------------------------------------- x 10
4
= 2,3 x 10
4
UFC/g ou ml
4

Caso o nmero de colnias nas placas de todas as diluies seja menor que 20, registrar a
contagem correspondente menor diluio e expressar como UFC/g ou ml. Se as placas de
todas as diluies no apresentarem colnias, registrar a contagem como sendo menor que uma
vez na diluio menor correspondente. Por exemplo, se nenhum crescimento for detectado na
diluio 1: 100, expressar a contagem como menor do que 100 Unidades Formadoras de
Colnias/g ou ml.

(1) Alguns produtos podem requerer o emprego de volumes maiores de diluente.

MTODO DOS TUBOS MLTIPLOS

utilizado principalmente quando se espera que o produto apresente densidade
bacteriana baixa. Deve ser mantida a razo entre o volume da amostra e 0
o
volume do meio de
cultura a utilizar.

Preparao de amostras

Preparar as amostras, inicialmente na diluio 1 : 10, atravs dos procedimentos que
seguem:
Amostras slidas Misturar 10 g da amostra com 90 ml de diluente. Se forem
necessrios volumes maiores, misturar 25 g da amostra com 225 ml de diluente.
Amostras lquidas Misturar 1 ml da amostra com 9 ml de caldo de casena-soja ou este
adicionado de substncias emulsificantes ou 2 neutralizantes (polissorbatos, lecitina de soja etc.).
Preparar diluies 1 : 100 e 1 : 1000 a partir da diluio 1:10.

Staphylococcus ATCC 6538 P 18 24 hs 30 35 graus C
Aureus ou ATCC 6538 18 24 hs 30 35 graus C
Bacilus subtilis ATCC 6633 18 24 hs 30 35 graus C
Escheruchia coli ATCC 8739 18 24 hs 30 35 graus C
Candida ATCC 10231 48 hs 20 25 graus C
Albicans ou ATCC 2091 48 hs 20 25 graus C

Empregar uma srie de dose tubos, contendo 10 ml de caldo de casena-soja. Aos trs
primeiros tubos, adicionar 1 ml da amostra diluda, dissolvida ou homogeneizada, na proporo
de 1:10, conforme descrito nos mtodos anteriores. Aos trs tubos seguintes, adicionar 1 ml da
diluio 1:100 da amostra e aos prximos trs tubos, 1 ml da diluio 1:1000 da amostra. Aos trs
ltimos tubos, adicionar 1 ml do diluente. Incubar os tubos a 30 35 graus centgrados durante 4
dias. Os ltimos trs tubos no devem apresentar crescimento microbiano. Anotar como positivo
os tubos que apresentarem crescimento de microrganismos. Isto pode ser caracterizado, tambm,
pela formao de produtos finais de metabolismo (gs, cido, base, etc...) ou pelo exame
microscpico direto. No caso de amostras que turvem o meio, confirmar se os tubos so positivos
para o crescimento de microrganismos, transferindo uma alada de cada tubo para outro tubo
contendo caldo de casena-soja ou meio equivalente, ou semeando em meios slidos, seletivos
ou no, incubando, por perodo adicional. Determinar o nmero mais provvel de microrganismos
por g ou ml, atravs da Tabela I. Sendo necessria maior preciso no teste, pode-se empregar 5
tubos por diluio, avaliando o Nmero Mais Provvel atravs da Tabela II.

(2) Caldo de casena-soja com 0,1% de polissorbato 80 usado para pomadas; caldo de
casena-soja com 0,4% de polissorbato 80 e 0,5% de lecitina de soja usado em amostras
que requeriram inativao de substncias inibidoras; caldo de casena-soja com 1% de
penicilinase usado para amostras que contenham penicilinas.

Capacidade nutritiva dos meios de cultura e avaliao dos mtodos de contagem

Incubar os microrganismos que seguem em tubos contendo caldo de casena-soja.
Vigilncia Sanitria Digital 161
Diluir cada cultura empregando tampo cloreto de sdio peptona pH 7,0 de modo a
obter 100 clulas por ml. Empregar inculo dos microrganismos separadamente, como controle
do mtodo de contagem, na presena e na ausncia de amostra. No ocorrendo crescimento
esperado na presena da amostra, significa que esta possui atividade inibidora. Para elimin-la,
adicionar agentes neutralizantes, como polissorbato 80 a 0,4% e lecitina de soja 0,5%, aumentar
o volume de diluente, associar ambos os procedimentos, ou empregar o Mtodo de Filtrao por
Membrana.

Meios e diluentes utilizados

gar de Casena-soja (Meio I)
Digesto pancretico de casena ..................................................................... 15,0 g
Digesto papanico de farinha de soja ............................................................. 5,0 g
Cloreto de sdio ............................................................................................. 5,0 g
gar ................................................................................................................ 15,0 g
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 7,3 mais ou menos 0,2

gar de Sabouraud-dextreose (Meio II)
Dextrose ......................................................................................................... 40 g
Mistura de partes iguais de casena tratada por suco
pancretico e digesto pptico de tecido animal ............................................. 10 g
gar ................................................................................................................ 15 g
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 5,6 mais ou menos 0,2
Misturar e ferver para efetuar a soluo
gar para Fermentao de Anaerbios
Extrato de levedura ........................................................................................ 5 g
Digesto pptico de tecido animal.................................................................... 5 g
Digesto papanico de farinha de soja ............................................................. 10 g
Dextrose ......................................................................................................... 10 g
Cloreto de sdio ............................................................................................. 5 g
gar ................................................................................................................ 20 g
Tioglicolato de sdio ....................................................................................... 2 g
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 7,2 mais ou menos 0,2

Caldo de casena-soja
Casena tratada por suco pancretico ........................................................... 17,0 g
Farinha de soja por digesto papanica ......................................................... 3,0 g
Cloreto de sdio ............................................................................................. 5,0 g
Fosfato de potssio dibsico .......................................................................... 2,5 g
Dextrose ......................................................................................................... 2,5 g
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 7,3 mais ou menos 0,2
Caldo nutriente
Extrato de Carne ............................................................................................ 3 g
Digesto pancretico de gelatina ..................................................................... 5 g
Polissorbato 80 ............................................................................................... 10,0 ml
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 6,9 mais ou menos 0,2
Fluido I
Digesto pptico de tecido animal.................................................................... 1 g
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 7,1 mais ou menos 0,2
Fluido II
Digesto pptico de tecido animal.................................................................... 1 g
Polissorbato 80 ............................................................................................... 1 ml
gua ............................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao 7,1 mais ou menos 0,2
Vigilncia Sanitria Digital 162
Tampo Fosfato pH 7,2
Soluo-estoque
Fosfato de potssio monobsico .................................................................... 34 g
Hidrxido de sdio 4% .................................................................................... (175 ml aprx.)
gua qsp ......................................................................................................... ml

Dissolver o fosfato de potssio monobsico em 5000 ml de gua, acertar o pH para 7,2
mais ou menos 0,1 com hidrxido de sdio 4%. Completar o volume com gua, esterilizar e
conservar sob refrigerao. Quando da utilizao diluir a soluo estoque com gua na proporo
de 1 para 800 e esterilizar.
Tampo cloreto de sdio-peptona pH 7,0
Fosfato de potssio monobsico .................................................................... 3,56 g
(equivalente a 0,067 M)
Fosfato dissdico 2H20 .................................................................................. 7,23 g
Cloreto de sdio ............................................................................................. 4,30 g
Peptona .......................................................................................................... 1,0 g
gua ............................................................................................................... 1000 ml

Tabela I Nmero mais provvel e limites de confiana
Nmero de tubos cujo crescimento
visvel para quantidade ... do produto
sob exame Nmero mais provvel de
microrganismos por g ou ml
Limite ...
100 mg ou
0,1 ml tubo
10 mg ou
0,01 ml
tubo
1 mg ou
0,001 ml
tubo
Inferior Superior
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0
0
1
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
3
0
1
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3
< 3
3
3
4
7
7
11
11
8
14
15
20
21
26
23


43
75
120
93
150
210
210
450
1.100
> 2.400
-
< 0.5
< 0.5
0.5
1
1
3
3
1
3
3
7
4
10
4
7
15
7
14
20
15
20

36
71
50
-
-
9
13
20
21
23
36
38
38
37
44

47
150
120
139
240
210
250
280
280
446
470

2480

-

TABELA 2 ndice do nmero mais provvel e limites de confiana 95%

Usando 5 tubos com 0.1, 0.01 e 0.001 g
Nmero de positivos NMP Limite NMP
Tubos
0.1 0.01 0.001 1 g Inferior Superior
0 0 0 <2 <0,5 -
0 0 1 2 <0,5 7
0 0 2 4 <0,5 11
0 1 0 2 <0,5 7
0 1 1 4 <0,5 11
0 1 2 6 <0,5 15
0 2 0 4 <0,5 11
Vigilncia Sanitria Digital 163
0 2 1 6 <0,5 15
0 3 0 6 <0,5 15
1 0 0 2 <0,5 7
1 0 1 4 <0,5 11
1 0 2 6 <0,5 15
1 0 3 8 1 19
1 1 0 4 <0,5 11
1 1 1 6 <0,5 15
1 1 2 8 1 19
1 2 0 6 <0,5 13
1 2 1 8 1 19
1 2 2 10 2 23
1 1 0 8 1 19
1 3 1 10 2 23
1 4 0 11 2 23
2 0 0 5 <0,5 13
2 0 1 7 1 17
2 0 2 9 2 21
2 0 3 12 3 28
2 1 0 7 1 17
2 1 1 9 2 21
2 1 2 12 3 28
2 2 0 9 2 21
2 2 1 12 3 28
2 2 2 14 4 34
2 3 0 12 3 28
2 3 1 14 4 34
2 4 0 15 4 37
3 0 0 8 1 19
3 0 1 11 2 35
3 0 2 13 3 31
3 1 0 11 2 25
3 1 1 14 4 34
3 1 2 17 5 46
3 1 3 20 6 60
3 2 0 14 4 34
3 2 1 17 5 46
3 2 2 20 6 60
3 3 0 17 5 46
3 3 1 71 7 63
3 4 0 21 7 63
3 4 1 24 8 72
3 5 0 25 8 73
4 0 0 13 3 31
4 0 1 17 5 46
4 0 2 21 7 63
4 0 3 26 8 75
4 1 0 17 5 46
4 1 1 21 7 63
4 1 2 26 9 78
4 2 0 22 7 67
4 2 1 26 9 78
4 2 2 32 11 91
4 3 0 27 9 80
4 3 1 33 11 93
4 3 2 39 13 126
4 4 0 34 12 195
4 4 1 40 14 108
5 5 0 41 14 110
5 5 1 48 16 124
Vigilncia Sanitria Digital 164
5 0 0 23 7 70
5 0 1 31 11 89
5 0 2 43 15 114
5 0 3 58 19 144
5 0 4 76 24 180
5 1 0 33 11 93
5 1 1 46 16 120
5 1 2 61 21 134
5 1 3 84 26 197
5 2 0 49 17 126
5 2 1 70 23 108
5 2 2 94 28 219
5 2 3 120 33 281
5 2 4 148 38 366
5 2 5 177 44 515
5 3 0 79 23 187
5 3 1 109 31 251
5 3 2 141 37 343
5 3 3 175 44 503
5 3 9 257 53 669
5 3 5 253 77 768
5 4 0 130 35 300
5 4 1 172 41 484
5 4 2 221 57 698
5 4 3 278 90 849
5 4 4 345 117 999
5 4 5 436 145 1161
5 5 0 240 68 734
5 5 1 348 118 1005
5 5 2 542 180 1405
5 5 3 920 210 3000
5 5 4 1000 350 5300
5 5 5 1000 800 -

INTERPRETAO DOS RESULTADOS
O Limite prescrito em uma monografia deve
ser interpretado da seguinte forma:
10
2
Microrganismos
- limite mximo de aceitao 5 x 10
2

10
3
Microrganismos
- limite mximo de aceitao 5 x 10
3
: etc.

INTERPRETAO DOS RESULTADOS

O limite prescrito em uma monografia deve ser interpretado da seguinte maneira:
10
2
Microrganismos
- limite mximo de aceitao 5 x 10
2

10
3
Microrganismos
- limite mximo de aceitao 5 x 10
3
: etc.

V.5.1.7. MTODO GERAL PARA PESQUISA E IDENTIFICAO DE PATGENOS

Este Mtodo permite a deteco da presena de clulas viveis de Salmonella sp.
Escherichia coli, pseudonas aeruginosa e Sthaphylococcus aureus, que devem estar ausentes em
produtos farmacuticos no estreis e matrias-primas de uso direto em sua fabricao.
Conforme a via de administrao do produto, alm dos quatro microrganismos
anteriormente citados indesejvel a presena dos seguintes:

VIA ORAL (SLIDOS E FLUDOS)
Bacillus cereus
Enterobacter sp
Candida Albicans
Vigilncia Sanitria Digital 165
Aspergillus Favus e parasiticus

VIA NASAL OU RESPIRATRIA
Enterobacter sp
Serratia marcescens
Klebsiella sp
Candida Albicans
Proteus sp
Arinetobacter sp
Pseudomonas cepacia
Pseudomonas maltophilia
Pseudomonas stuzeri

VIA TPICA
Serratia marcescens
Klebsiella sp
Pseudomonas cepacia
Pseudomonas maltophilia
Pseudomonas stuzeri
Streptococcus sp, grupo B

VIA INTRAMAMRIA
Staphylococcus sp
Streptococcus sp, grupo B
Bacillus cereus
Serrarias marcescens
Corynebacterium pyogenes
Klebsiella sp
Mycoplasma sp
Enterobacter sp
Pseudomonas sp
Citrobacter sp
Nocardia sp
Proteus sp
Cryptococcus neoformans
Cndida sp

V.5.1.7.1. ENRIQUECIMENTO NO-SELETIVO

SUBSTNCIAS SOLVEIS EM GUA

1) Transferir 10g ou 10m da amostra para frasco contendo 90ml de tampo fosfato pH
7,2 e agitar at dissoluo;
2) Filtrar atravs de membrana de 0,45um. Lavar com 100ml de Fluido I;
3) Colocar a membrana em frasco contendo 300ml de Caldo de enriquecimento;
4) Incubar a 30 35 graus centgrados, durante 24 48 horas.

SUBSTNCIAS OLEOSAS MISCVEIS EM GUA

1) Transferir 10g ou 10ml da amostra para frasco contendo 90ml de Fluido II aquecido a
45 48 graus centgrados;
2) Filtrar atravs de membrana de 0,45um. Lavar com 100ml de Fluido II;
3) Prosseguir conforme itens 3 e 4 de substncias solveis em gua.

SUBSTNCIAS SOLVEIS EM MIRISTATO DE ISOPROPILA

1) Transferir 6 pores de 1g ou 1ml da amostra para 6 frascos contendo 100ml de
miristato de isopropila aquecido a 45 48 graus centgrados. Agitar cada frasco rapidamente at
dissoluo;
Vigilncia Sanitria Digital 166
2) Filtrar o contedo de cada frasco atravs de membrana com 100ml de Caldo nutriente
pr-filtrado e aquecido a 45 48 graus centgrados;
3) Colocar as membranas em 6 frascos contendo 300ml de Caldo de enriquecimento;
4) Incubar a 30-35 graus centgrados, durante 24-48 horas.

POMADAS E CREMES INSOLVEIS EM MIRISTATO DE ISOPROPILA

1) Transferir 2 pores de 5g ou 5ml para dois frascos contendo 300ml de Caldo de
enriquecimento com 0,1% de polissorbato 80. Se necessrio, ajustar o pH entre 6,5 7,5 com
HCI 0,1 M;
2) Incubar a 30 35 graus centgrados, durante 24 48 horas.

GELATINAS

1) Transferir 10g de amostra para frasco contendo 300ml de Caldo de enriquecimento.
Deixar a 48 graus centgrados, durante 1 hora, transferir para banho-maria a 45 graus centgrados
e esperar 30 minutos, agitando a intervalos frequentes;
2) Incubar a 30 35 graus centgrados, durante 24 48 horas.

SUBSTNCIAS INSOLVEIS OU PARCIALMENTE SOLVEIS EM GUA

1) Transferir 10g ou 10ml da amostra para frasco contendo 300ml de Caldo de
enriquecimento. Se necessrio, ajustar o pH entre 6,5 7,5 com HCI 0,1 M ou NaOH 0,1 M;
3) Incubar a 30 35 graus centgrados, durante 24 48 horas.
No se dispondo de sistema de filtrao por membrana, proceder conforme
Substncias insolveis ou parcialmente solveis em gua.

V.5.1.7.2. FASE SELETIVA E TESTES DE CONFIRMAO

Pseudomonas aeruginosa

A) Transferir com ala, para placa com gar cetrimida, o material enriquecido em meio
no seletivo, usando o mtodo de estrias em superfcie. Nesse meio, as colnias de p.
aeruginos apresentam aspecto muito variado, portanto, deve-se a testes de
confirmao para cada colnia com aspecto morfolgico diferente.

B) Testes de confirmao
1. Citocromo oxidase Colocar uma gota de soluo aquosa a 1% de cloridrato de
N, N-dimetil-p-fenilenodiamina, recentemente preparada, em colnia suspeita da
placa de gar cetrimida. Colnias de p. aeruginosas desenvolvem colorao
rsea, que passa a marrom, vermelho escuro e negro entre 10 e 30 minutos.
Todas as espcies de p. aeruginosa produzem citocromo oxidase. Empregar no
trabalho ala de platina, pois ala de nquel-cromo pode interferir no teste;
2. Produo de fluorescena Inocular colnia isolada em gar inclinado para
deteco de fluorescena. Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 24 horas,
e examinar a fluorescncia do gar luz ultravioleta, no comprimento de onda
entre 328 e 210mm. Cerca de 99% das cepas de p. aeruginosa produzem
fluorescena.
3. Crescimento a 41 graus centgrados Inocular colnia isolada em gar inclinado
de infuso crebro e corao. Incubar o tubo a 41 graus centgrados, em banho-
maria ou estufa, durante 48 horas. Aproximadamente 99% das cepas de p.
aeruginosa crescem a 41 graus centgrados.

Staphylococcus aereus

A) Transferir por meio de ala e pelo mtodo de estrias em superfcie o material
enriquecido em meio no-seletivo para placa com gar sal manitol-vermelho de fenol
ou gar de Vogel-Johnson. Incubar a 36 graus centgrados, durante 48 horas. As
colnias de s. aureus apresentam-se amareladas, lisas de consistncia untuosa e
circundadas por zona diferente, de cor amarela forte, quando multiplicadas em gar
Vigilncia Sanitria Digital 167
sal manitol-vermelho de fenol. Em gar de vogel-Johnson as colnias so de cor
negro brilhante e circundadas por zona amarela;

B) Testes de confirmao

1. Colorao de gram s. aureus so cocos gram-positivos, formando grupamentos
semelhantes a galhos de uva.
2. Coagulase Reconstituir liofilizado de plasma de coelho ou cavalo em gua
estril. Inocular colnia suspeita em 0,5ml de plasma reconstitudo. Controles
positivo e negativo devem ser procedidos em paralelo. Inocular os tubos em
banho-maria a 30 37 graus centgrados e verificar a formao de gel. Examinar
os tubos em 2,4 e 24 horas. Se ocorrer formao de gel em 24 horas, o teste
considerado positivo.
3. Desoxirribonuclease Preparar tubos contendo gar para teste de
desoxirribonuclease com verde de metila.

Repicar a colnia suspeita para o meio contido no tubo. Incubar a 30 37 graus
centgrados, durante 18 horas. Controle positivo deve ser procedido em paralelo
para comparao dos resultados. A formao de zona incolor ao redor de
crescimento indica reao de desoxirribonuclease positiva. Culturas de s. aureus
devem apresentar reao positiva.

Salmonella

A) Fazer repique de colnia do meio no-seletivo para placa de gar-verde brilhante.
Colnias de Salmonella sp neste meio so razoavelmente grandes e produzem zona
avermelhada ao redor. Inocular colnia suspeita em 100ml de Caldo de digesto
pancretico de casena. Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 24 48 horas.
Adicionar 0,5ml de reagente de Kovac e agitar suavemente. Reao positiva (presena
de indol) apresentar cor vermelha intensa. Salmonella sp indol negativa.

B) Teste de confirmao
1. gar trplice aucar-ferro Inocular colnia suspeita em gar trplice aucar-ferro
contido em tubo. Para isto, furar a base no inclinada com fio reto, retir-lo e pass-
lo pela superfcie inclinada. Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 24 horas.
Colnias tpicas de Salmonella sp apresentam reao alcalina(cor vermelha) na
parte superior (inclinada) e cida (cor amarelada) na base, com ou sem produo
de gs e H
2
S. Se estas reaes forem positivas, prosseguir com os itens que
seguem:
2. Lisina-descarboxilase Inocular colnia suspeita em gar de Lisina-ferro, contido
em tubo, empregando o mesmo procedimento descrito para gar trplice aucar-
ferro. Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 24 horas. Colnias tpicas de
Salmonella sp apresentam reao alcalina (cor purprea) em todo meio, com ou
sem formao de gs H
2
S;
3. Crescimento a partir de citrato como nica fonte de carbono Repicar a cultura do
item A para gar citrato de Simmons inclinado. Incubar a 30 37 graus
centgrados, durante 4 dias. Colnias tpicas de Salmonella sp crescem sobre o
meio e mudam a cor da parte inclinada para azul;
4. Urease Repicar a cultura do item A para gar uria inclinando. Incubar a 30 37
graus centgrados, durante 4 dias. Colnias tpicas de Salmonella sp no produzem
urease;
5. Fermentao da lactose Repicar cultura do item A para tubo contendo Caldo de
lactose. Incubar a 30 37 graus centgrados , durante 24 horas. A maioria das
cepas de Salmonella sp no fermenta lactose, permanecendo o meio inalterado.

Escherichia coli

A) Fazer repique do meio no-seletivo para placa de gar Mac Conkey. Colnias de E.
coli apresentam cor vermelha tijolo. Caso haja crescimento heterogneo, transferir
Vigilncia Sanitria Digital 168
colnias circundadas de colorao vermelha tijolo para nova placa contendo gar Mac
Conkey.
Inocular colnia suspeita em gar peptona-ferro. Para inocular este meio, furar a
base no inclinada com fio reto, retir-lo e pass-lo pela superfcie inclinada.
Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 24 horas. E. coli no produz gs
H
2
S.
B) Teste de confirmao
1. gar de eosina-cloreto de metiltionino Incubar colnia tpica da placa de gar
Mac Conkey para placa contendo gar de eosina-cloreto de metiltionnio. Incubar
a 30 37 graus centgrados, durante 24 horas. Colnias pretas, esverdeadas e
brilhantes podem evidenciar a presena de E. coli;
2. gar trplice aucar-ferro Inocular colnia isolada da placa de gar de eosina-
cloreto de metiltionnio em tubo contendo gar trplice aucar-ferro, seguindo o
mesmo procedimento empregado para Salmonella sp. Colnias tpicas de E. coli
apresentam reao alcalina (vermelha) ou cida (amarela) na parte superior
(inclinada) e cida(amarela) na base, com ou sem formao de gs CH
2
S;
3. Teste de indol Inocular tubo contendo Caldo de digesto pancretico de casena
com colnia suspeita da placa de gar de eosina-cloreto de mitiltionnio. Incubar a
30 37 graus centgrados, durante 48 horas. Adicionar 0,5ml de reagente de
Kovac e agitar o tubo suavemente. Colorao vermelha intensa indica a presena
de indol, que produzido por E. coli;
4. Teste de vermelho de metila Inocular tubo contendo Caldo vermelho de metila-
voges-Proskauer com colnia suspeita da placa de gar de eosina-cloreto de
metiltionnio. Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 18 48 horas.
Adicionar 5 a 6 gotas do indicador vermelho de metila SI por 5ml de cultura.
Reaes positivas, fortemente cidas, desenvolvem colorao vermelha
brilhante, reaes fracamente positivas desenvolvem colorao vermelha-
alaranjada e reaes negativas desenvolvem colorao amarela. E. coli
vermelho de metila positivo;
5. Teste de voges-Proskauer Inocular tubo contendo Caldo vermelho de metil-
Voges-Proskauer com colnia da placa de gar de eosina-cloreto de metiltionnio.
Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 24 horas. Adicionar 4ml do reagente
de Voges-Prokauer por 5ml de cultura. Incubar a 35 37 graus centgrados,
durante 1 hora. O desenvolvimento de cor vermelha de eosina indica a presena
de diacetila, produto de oxidao de acetilmetilcarbinal. E. coli Voges-Proskauer
negativa.
6. Crescimento a partir de citrato como nica fonte de carbono Inocular colnia
isolada da placa de gar eosina cloreto de metiltionnio em gar citrato de
Simmons inclinado. Incubar a 30 37 graus centgrados, durante 4 dias. E. coli
no utiliza citrato como nica fonte de carbono, no ocorrendo crescimento.

V.5.1.7.3. DESCRIO DOS MEIOS CULTURA E REAGENTES

Caldo de enriquecimento

Digesto pancretico de tecido animal ....................................................... 5,0 g
Extrato de levedura ................................................................................... 1,5 g
Extrato de carne ........................................................................................ 1,5 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 3,5 g
D-Glicose ................................................................................................... 1,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 3,68 g
Fosfato de potssio monobsico ............................................................... 1,32 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 8,0 mais ou
menos 0,1
Volume por frasco ..................................................................................... 300 ml

gar cetrimida

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 20,0 g
Vigilncia Sanitria Digital 169
Cloreto de magnsio ................................................................................. 1,4 g
Sulfato de potssio .................................................................................... 10,0 g
Brometo de cetrimnio .............................................................................. 0,3 g
Glicerol ....................................................................................................... 10,0ml
gar ........................................................................................................... 13,6 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,2 mais ou
menos 0,2
Volume por placa ....................................................................................... 15 20 ml

gar verde brilhante

Extrato de levedura ................................................................................... 3,0 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 5,0 g
Digesto pancretico de casena ................................................................ 5,0 g
Lactose ...................................................................................................... 10,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Sacarose .................................................................................................... 10,0 g
Vermelho de fenol ..................................................................................... 80 mg
Verde brilhante .......................................................................................... 12,5 mg
gar ........................................................................................................... 20,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
PH aps esterilizao ................................................................................ 6,9 mais ou
menos 0,2
Volume por placa ....................................................................................... 15 20 ml

gar Mac Konkey

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 17,0 g
Digesto pancretico de casena. ............................................................... 1,5 g
Digesto pancretico de tecido animal ....................................................... 1,5 g
Lactose ...................................................................................................... 10,0 g
Mistura de sais biliares .............................................................................. 1,5 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Vermelho neutro ........................................................................................ 0,030 g
Cloreto de metilrosanilnio ......................................................................... 0,001 g
gar ........................................................................................................... 13,5 g
gua .......................................................................................................... 1000 g
PH aps esterilizao ................................................................................ 7,1 mais ou
menos 0,2
Volume por placa ....................................................................................... 15 20 ml

gar sal manitol-vermelho de fenol

Extrato de carne ........................................................................................ 1,0 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 5,0 g
Digesto pancretico de casena ................................................................ 5,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 75,0 g
D(-)-Manitol ................................................................................................ 10,0 g
Vermelho de fenol ..................................................................................... 0,025 g
gar ........................................................................................................... 15,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,4 mais ou
menos 0,2
Volume por placa ....................................................................................... 15 20 ml

gar de vogel-Johnson

Digesto pancretico de casena ................................................................ 10,0 g
Extrato de levedura ................................................................................... 5,0 g
Vigilncia Sanitria Digital 170
D-Manitol ................................................................................................... 10,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 5,0 g
Cloreto de ltio............................................................................................ 5,0 g
Glicina ........................................................................................................ 10,0 g
Vermelho de fenol ..................................................................................... 25,0 mg
gar ........................................................................................................... 16,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,2 mais ou
menos 0,2
Antes de distribuir o meio nas placas, adicionar 20ml de soluo de telrio de potssio a
1% para 100ml de meio resfriado a 45 50 graus centgrados.
Volume por placa ....................................................................................... 15 20 ml

gar de eosina cloreto de metiltionnio

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 10,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 2,0 g
Lactose ...................................................................................................... 10,0 g
Eosina Y .................................................................................................... 400 mg
Cloreto de metiltionnio .............................................................................. 65 mg
gar ........................................................................................................... 15,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,1 mais ou
menos 0,2
Volume de placa ........................................................................................ 15 20 ml

gar para deteco de fluorescena

Digesto pancretico de casena ................................................................ 10,0 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 10,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 1,5 g
Sulfato de magnsio heptaidratado ........................................................... 1,5 g
Glicerol ....................................................................................................... 10,0 ml
gar ........................................................................................................... 15,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,2 mais ou
menos 0,2
Volume por tubo ........................................................................................ 10 ml

Infuso de crebro e corao

Infuso de crebro de novilho ................................................................... 200,0 g
Infuso de corao de boi ......................................................................... 250,0 g
Digesto pancretico de casena ................................................................ 5,0 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 5,0 g
D-Glicose ................................................................................................... 2,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Fosfato de sdio dibsico .......................................................................... 2,5 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,4 mais ou
menos 0,2

gar de infuso de crebro e corao

Composio idntica infuso de crebro e corao com adio de 15,0 g de gar por
litro.
Volume por tubo: 10ml (inclinado)


Caldo de nitrato enriquecido
Vigilncia Sanitria Digital 171

A composio deste meio idntica infuso de crebro e corao qual so
adicionados 3g de nitrato de potssio e mais 500ml de gua.
Volume por tubo: 20ml (com tubo de Durham)

gar para teste de desoxirribonuclease

cido desoxirribonuclico .......................................................................... 2,0 g
gar ........................................................................................................... 15,0 g
Verde de metila ......................................................................................... 0,05 g
Digesto pancretico de casena ................................................................ 15,0 g
Digesto papanico de farinha de soja ........................................................ 5,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,3 mais ou
menos 0,2
Volume por tubo inclinado ......................................................................... 10 ml

Caldo de digesto pancretico de casena

Digesto pancretico de casena ................................................................ 10,0 g
gua qsp .................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,2 mais ou
menos 0,1

gar trplice acar-ferro

Extrato de carne ........................................................................................ 3,0 g
Extrato de levedura ................................................................................... 3,0 g
Digesto pancretico de casena ................................................................ 15,0 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 5,0 g
Lactose ...................................................................................................... 10,0 g
Sacarose .................................................................................................... 10,0 g
D-Glicose ................................................................................................... 1,0 g
Sulfato ferroso ........................................................................................... 0,2 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Tiosulfato de sdio .................................................................................... 0,3 g
gar ........................................................................................................... 12 g
Vermelho de fenol ..................................................................................... 0,025 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,4 mais ou
menos 0,2
Volume por tubo inclinado ......................................................................... 10 ml

gar de lisina-ferro

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 5,0 g
Extrato de levedura ................................................................................... 3,0 g
D-Glicose ................................................................................................... 1,0 g
L-Lisina ...................................................................................................... 10,0 g
Citrato frrico amoniacal ............................................................................ 0,5 g
Tiosulfato de sdio .................................................................................... 0,04 g
Prpura de bromocresol ............................................................................ 0,02 g
gar ........................................................................................................... 15,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 6,7 mais ou
menos 0,1
Volume por tubo inclinado ......................................................................... 10 ml

gar citrato de Ciommons
Vigilncia Sanitria Digital 172

Fosfato de amnio monobsico ................................................................ 1,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 1,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Citrato de sdio ......................................................................................... 2,0 g
Sulfato de magnsio .................................................................................. 0,2 g
Azul de bromotimol .................................................................................... 0,08 g
gar ........................................................................................................... 15,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 6,8 mais ou
menos 0,2
Volume por tubo inclinado ......................................................................... 10 ml

gar uria

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 1,0 g
D-Glicose ................................................................................................... 1,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Fosfato de potssio monobsico ............................................................... 2,0 g
Uria .......................................................................................................... 20,0 g
gar ........................................................................................................... 15,0 g
Vermelho de fenol ..................................................................................... 0,012 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 6,8 a 6,9

Dissolver todos ingredientes, sem gar, em 100ml de gua e esterilizar por filtrao
atravs de membrana esterilizante. Separadamente, dissolver gar em 900ml de gua, esterilizar
a 121 graus centgrados, durante 15 minutos, resfriar a 50 graus centgrados, juntar primeira
soluo e agitar vigorosamente. Distribuir alquotas de 10ml em tubos e deixar solidificar em
posio inclinada.

Caldo vermelho de mitila e Voges-Proskauer

Digesto pancretico de casena ................................................................ 3,5 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 3,5 g
D-Glicose ................................................................................................... 5,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 5,0 g
gua .......................................................................................................... 1000ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 6,9 mais ou
menos 0,2
Volume por tubo ........................................................................................ 10ml

Caldo de casena-soja

Casena tratada por suco pancretico ...................................................... 17,0 g
Farinha de soja por digesto papanica .................................................... 3,0 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 5,0 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 2,5 g
Dexitrose .................................................................................................... 2,5 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,3 mais ou
menos 0,2

Caldo lactose

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 5,0 g
Extrato de carne ........................................................................................ 3,0 g
Lactose ...................................................................................................... 5,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 6,0 mais ou
Vigilncia Sanitria Digital 173
menos 0,1
Volume por tubo ........................................................................................ 10 20 ml

gar peptona-ferro

Digesto pancretico de gelatina ................................................................ 15,0 g
Digesto pancretico de casena ................................................................ 2,5 g
Digesto pptico de tecido animal............................................................... 2,5 g
Citrato frrico amoniacal ............................................................................ 0,5 g
Fosfato de potssio dibsico ..................................................................... 1,1 g
Tiossulfato de sdio ................................................................................... 0,08 g
gar ........................................................................................................... 15,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH .............................................................................................................. 6,7 mais ou
menos 0,2
Volume por tubo ........................................................................................ 10 ml

Reagente de Kovac

lcool amlico ou isoamilico ....................................................................... 15,0 ml
p-Dimetilaminobenzaldeido ....................................................................... 1,0 g
cido clordrico concentrado ..................................................................... 5,0ml
Dissolver o aldedo no lcool e adicionar o cido lentamente.
Conservar sob refrigerao.

Indicador vermelho de metila

Vermelho de metila .................................................................................... 0,01g
Etanol ......................................................................................................... 30,0ml
gua .......................................................................................................... 50,0ml
Dissolver o corante no lcool e completar com gua.

Reagente Voges-Proskauer

Soluo alcolica de naftol a 5% ........................................................... 3,0ml
Hidrxido de potssio a 40% ..................................................................... 1,0ml

Tampo cloreto de sdio peptona pH 7,0

Fosfato de potssio monobsico ............................................................... 3,56 g
Fosfato disdico 2H2O .............................................................................. 7,23 g
Cloreto de sdio ........................................................................................ 4,30 g
Peptona ..................................................................................................... 1,0 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml

Fluido I

Digesto pptico de tecido animal............................................................... 1 g
gua .......................................................................................................... 1000 ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,1 mais ou
menos 0,2

Fluido II.

Digesto pptico de tecido animal............................................................... 1 g
Polissorbato 80 .......................................................................................... 1ml
gua .......................................................................................................... 1000ml
pH aps esterilizao ................................................................................ 7,1 mais ou
menos 0,2

Vigilncia Sanitria Digital 174
V.5.1.7.4. ESTERILIZAO E ACONDICIONAMENTO DOS MEIOS DE CULTURA

1) Meios em placas esterilizar o meio a 121 graus centgrados, durante 15 minutos e
distribuir, assepticamente, em placas de Petri estreis de 100 x 20 mm. Incubar a 30 35 graus
centgrados, durante 24 horas, e conservar sob refrigerao;
2) Meios em tubos dissolver os ingredientes do meio (ferver durante 1 a 2 minutos
quando se empregar gar) e distribuir em tubos 18 x 150mm, quando se empregar o volume de
10ml, e em tubos 25 x 200 mm, quando se empregar o volume de 15 a 20 ml. Esterilizar a 121
graus centgrados, durante 15 minutos. Incubar a 30 35 graus centgrados, durante 24 horas e
conservar sob refrigerao.

V.5.1.7.5. CAPACIDADE SELETIVA E NUTRITIVA DOS MEIOS DE CULTURA E
VALIDAO DO TESTE PARA PESQUISA E IDENTIFICAO DE PATGENOS

Incubar os microrganismos que seguem em tubos contendo os meios indicados,
temperatura de 30 35 graus centgrados, durante 18 24 horas.

Staphilococcus

Aureus ATCC 6538 P
ou ATCC 6538
Caldo de casena-soja
Pseudomonas
aeroginosa
ATCC 9027 Caldo de casena-soja
Escherichia coli ATCC 8739 Caldo de Lactose
Salmonella 1
typhimurium
Caldo de Lactose

Diluir cada cultura empregando tampo cloreto de sdio-peptona pH 7,0 de modo a obter
1000 clulas por ml. Testar o mtodo aplicando inculos de aproximadamente 100 clulas dos
microrganismos Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas Aeruginosa e Estafhilococcus aureus
na presena e na ausncia da amostra sob exame. Deve ocorrer crescimento e identificao
positiva para os respectivos microrganismos.

1 No recomendado nmero de cepa. Pode ser empregada salmonella no patognica
para o homem, como Salmonella abony (MCTC 6017)

V.5.1.8. SUBSTNCIAS PRESSORAS

Preparao padro de referncia

Como preparao padro, empregar bitartarato de epinefrina. Esta preparao deve ser
conservada em frascos hermticos e opacos e dessecada sobre slica-gel durante 18 horas antes
do uso.

Soluo padro de referncia

Dissolver 91 mg de bitartarato de epinefrina (equivalente a 50 mg de epinefrina base
C
9
H
13
NO
3
) em soluo recente de bissulfito de sdio 0,4 % (p/V). Completar 50 ml com gua e
homogeneizar. A soluo final ter 1,0 mg de epinefrina (base livre) por ml. Conservar sob
refrigerao, em frasco hermtico mbar. Usar, no mximo, durante 6 meses. Desprezar a
soluo quando esta apresentar algum sinal de deteriorao, tal como mudana de cor.
Diluio padro

Diluir a soluo padro de referncia de epinefrina, em soluo fisiolgica, de modo que a
administrao de dose entre 0,1 e 0,5 ml produza aumento de 20 a 70 mm de mercrio na
presso arterial.
Vigilncia Sanitria Digital 175

Mtodo proposto

Selecionar rato com peso entre 275 e 325 g e anestesiar com anestsico isento de efeitos
sobre presso arterial. Imobilizar o animal e mant-lo aquecido para prevenir a perda de calor
corporal. Cirurgicamente proceder a intubao traqueal, se necessrio, e expor a veia femural ou
jugular, preparando-a para injees intravenosas. Administrar 200 unidades de heparina por 100
g de peso corporal. Cirurgicamente expor a artria cartida e canular, conectando-a ao
manmetro ajustado para o registro contnuo de presso arterial.
Injetar, intravenosamente, soluo de sulfato de atropina 0,1 % (p/V) na proporo de 1
ml por Kg de peso corporal. Considerar o receptor muscarnico suficientemente bloqueado
somente se injeo subsequente de soluo recente de cloreto de acetilcolina 0,001 % (p/V) na
dose de 1ml por Kg de peso no produzir queda transitria na presso arterial. Se esse
mecanismo no estiver suficientemente paralisado, injetar dose de 0,5 ml da soluo de sulfato
de atropina at paralisia completa.

Procedimento

Selecionar dose de diluio padro que produza aumento entre 2,7 KPa e 9,3 KPa (20 e
70 mm de mercrio) na presso arterial. Injetar a dose a intervalos constantes de, no mnimo, 5
minutos para possibilitar o retorno da presso arterial ao nvel basal. Aps cada injeo,
administrar imediatamente 0,2 ml de soluo fisiolgica para lavar a cnula. Assegurar-se da
reprodutibilidade da resposta, repetindo a dose duas ou mais vezes. Administrar nova dose da
diluio do padro de modo a obter resposta hipertensora aproximadamente 20 % maior do que a
mdia das respostas da dose menor. Considerar o animal apto para o teste se (1) as respostas
para a primeira dose selecionada forem reprodutveis entre 2,7 KPa e 9,3 KPa (20 e 70 mm de
mercrio) e (2) significativamente menores em relao resposta da dose maior.
Mantendo constante o intervalo de tempo estabelecido, injetar srie de cinco doses na
qual se alterem a dose selecionada da diluio padro e dose de igual volume da substncia sob
teste, diluda convenientemente. Aps cada uma das cinco injees, medir a variao na presso
arterial.
Calcular a diferena entre cada resposta da amostra e a mdia das respostas das doses
da diluio padro, imediatamente anterior e posterior. A amostra cumpre os requisitos do teste
se a mdia destas diferenas significar que as respostas obtidas com a soluo da amostra no
so maiores do que aquelas da diluio padro. Os resultados devem corresponder ao limite de
atividade pressora especificado para este teste na monografia correspondente.

V.5.2. ENSAIOS

V.5.2.1. ENSAIO BIOLGICO DE OXITOCINA

Determina-se a potncia da oxitocina comparando sua atividade com aquela da
preparao padro por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o quarto padro internacional de oxitocina para avaliao biolgica,
estabelecido em 1978, que consiste de oxitocina sinttica, dessecada, com albumina humana e
cido ctrico (disponvel em ampolas que contm 12,5 unidades). Pode ser utilizada outra
preparao, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

Soluo padro

Transferir o contedo da ampola do padro internacional para recipiente adequado e
adicionar 0,5 ml de cido actico 0,045 m para cada unidade de oxitocina. Tampar o frasco com
algodo e levar a banho-maria fervente, onde deve permanecer, com leve agitao, durante 5
minutos resfriar sob gua corrente e filtrar. Colocar a soluo estoque em ampolas, fechar por
fuso no vidro e aquecer em banho-maria fervente durante 20 minutos. Conservar a soluo em
refrigerador e usar, no mximo, durante 6 meses.

Vigilncia Sanitria Digital 176
MTODOS PROPOSTOS

MTODO A: HIPOTENSO ARTERIAL EM FRANGO

Diluio do padro

No dia de ensaio, efetuar uma primeira diluio da soluo estoque em soluo
fisiolgica, de modo a obter soluo com potncia de 0,4 unidades de oxitocina por ml. Esta
concentrao usada para avaliao da sensibilidade do animal.

Diluio da amostra

Efetuar diluio da amostra de oxitocina, em soluo fisiolgica, de modo a obter soluo
com potncia presumida idntica a da diluio do padro.

Animal

Selecionar um frango domstico, sadio, pesando entre 1,1 a 2,5 Kg. Empregar anestsico
de ao prolongada e isento de efeitos sobre a presso arterial (por exemplo, 5 ml de soluo de
carbamato de etila 2,5 % (p/V) por Kg de peso do animal). Por dissecao cuidadosa, expor a
artria isquitica conectando-a diretamente ao manmetro de mercrio ajustado para o registro
contnuo da presso arterial. Canular a veia curral ou branquial, preparando-a para injetar as
diluies do padro e da amostra.

Avaliao da sensibilidade do animal

Determinar, atravs de administrao experimental, volumes da diluio padro que
produzam queda rpida e transitria de 20 a 40 mm de mercrio na presso arterial. Se
necessrio, no decorrer do ensaio alterar a concentrao do padro, a fim de que a injeo
intravenosa de duas doses, entre 0,15 e 0,5 ml, produza resposta na faixa indicada. A razo entre
doses da amostra e do padro deve ser idntica e constante no decorrer do ensaio. Se ocorrer
taquifilaxia, manifestada por rpido decrscimo na resposta, considerar o frango inadequado para
o ensaio.

Procedimento

Injetar as duas doses selecionadas do padro e da amostra, em seqncia aleatria, a
intervalos uniformes de 3 a 10 minutos, registrando, no mnimo, 4 respostas para cada dose. Ao
invs desta seqncia aleatria, pode-se usar delineamento de blocos ao acaso para eliminar a
influncia de possveis alteraes de sensibilidade do animal.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo V.1.5.

MTODO B: CONCENTRAO DO TERO DE RATA IN VITRO

Usar uma rata em fase sexual estro e pesando entre 120 e 200 g. Sacrificar com golpe na
nuca e sangria imediata por seco dos vasos cervicais. Dissecar um corno uterino e suspender
em cuba-de-rgo isolado, contendo soluo nutritiva da seguinte composio:
Cloreto de sdio ................................................................................................. 9,0 g
Cloreto de potssio ............................................................................................. 0,42 g
Cloreto de clcio ................................................................................................. 0,0795 g
Bicarbonato de sdio .......................................................................................... 0,50 g
D-Glicose ............................................................................................................ 0,50 g
gua (destilada e condensada em condensador de vidro) qsp ......................... 1000 ml

Monte a cuba-de-rgo-isolado a 32 graus centgrados ou outra temperatura adequada,
na qual se evitem as contraes espontneas e o tero mantenha sua sensibilidade. Oxigenar a
soluo contra mistura de 95% de oxignio e 5% de dixido de carbono. Registrar as contraes
do msculo isolado, atravs de alavanca isotnica de inscrio frontal. Preparar a soluo padro,
em soluo nutritiva, de modo a obter concentrao de 0,02 unidades por ml. Similarmente, fazer
Vigilncia Sanitria Digital 177
a soluo da amostra de modo que, com base na potncia presumida, apresente a mesma
concentrao da soluo padro. Estabelecer a curva dose-resposta pela adio de doses da
soluo padro. Uma vez completa a resposta, a cada dose substituir a soluo nutritiva para
relaxar o msculo. As doses so adicionadas em intervalos uniformes de 3 a 5 minutos conforme
a velocidade de recuperao do rgo. Selecionar duas doses da soluo padro que produzem
contraes claramente descriminadas entre 20 e 80% da resposta mxima. A razo entre as duas
doses do padro e da amostra deve ser idntica e mantida constante no decorrer do ensaio.
Adicionar as doses de seqncia segundo o delineamento do quadrado latino (2 x 2),
registrando-se, no mnimo, quatro respostas para cada dose do padro e da amostra.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5

V.5.2.2. ENSAIO BIOLGICO DE CORTICOTROFINA

Determina-se a potncia da corticotrofina comparando um ou mais dos seus efeitos
biolgicos com o mesmo efeito da preparao padro de corticotrofina, por mtodo de ensaio
adequado. Quando o material a ser ensaiado se destina administrao subcutnea ou
intramuscular, usar o mtodo de ensaio subcutneo; quando intravenosa, usar o mtodo de
ensaio intravenoso.

Preparao padro

Empregar o terceiro padro internacional de corticotrofina suna (ACTH) para avaliao
biolgica, estabelecido em 1962, que consiste de corticotrofina suna purificada, liofilizada com
lactose (disponvel em ampolas contendo 5 unidades). Pode ser utilizada outra preparao
adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

Soluo padro

Dissolver o contedo total da ampola da preparao padro de corticotrofina em 2,5 ml de
gelatina SR e homogeneizar de modo a obter soluo que contenha 2,0 unidades internacionais
por ml. Com o mesmo solvente, preparar trs diluies do padro que produzam depleo do
nvel de cido ascrbico adrenal varivel entre 20 e 80% da resposta mxima. Como
aproximao, podem ser testadas concentraes entre 20 e 600 miliunidades internacionais por
ml, aplicando-se doses crescentes segundo progresso geomtrica. As solues devem ser
injetadas no mximo, quatro horas aps sua preparao.

Soluo da amostra

Diluir do mesmo modo que o padro a fim de obter 3 diluies da amostra com potncia
presumida igual a das diluies do padro.

MTODOS PROPOSTOS

MTODO A: SUBCUTNEO

Animais

Usar ratos sadios, do mesmo sexo, cujo peso esteja entre 100 e 200 g; para cada ensaio,
a faixa de peso entre os ratos devem ser mantida to estreita quanto possvel e nunca exceder 15
g. manter os animais em condies uniformes de gua, alimentao e temperatura, no mnimo,
durante uma semana. Anestesiar os ratos com ter e hipofisectomiz-los. Aps a operao,
deix-los com acesso alimentao, gua e soluo de D-Glicose a 5% (p/V) em soluo
fisiolgica. Manter a sala isenta de rudos e com temperatura uniforme entre 24 e 27 graus
centgrados. Realizar o ensaio 18 a 36 horas aps a hipofisectomia. Para o ensaio, pesar os
animais, distribu-los aleatoriamente em 6 grupos de 6 a 10 ratos, destinando-os respectivamente
para as diluies do padro e da amostra.

Procedimento

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Injetar subcutneamente 0,5 ml da respectiva diluio em todos os ratos de cada grupo.
Trs horas aps a injeo, anestesiar os animais, retirar as glndulas adrenais, isolar de tecidos
circunvizinhos e pesar. Executar a operao to rpido quanto possvel, para evitar perda de
peso. Sacrificar os ratos e examinar se a hipsectomia foi completa. Colocar o par de glndulas
adrenais de cada rato em recipiente adequado contendo 8 ml de cido metafosfrico 2,5% (p/V) e
triturar convenientemente. Deixar o homogeneizado em repouso durante 30 minutos.

Determinao de cido ascrbico

Filtrar os extratos de cido metafosfrico e pipetar 4 ml de cada filtrado para os tubos de
ensaio contendo 4 ml da soluo de acetato de indofenol SR. Misturar por agitao e, 30
segundos depois, ler a absorvncia em espectrofotmetro a 520nm. Calcular a concentrao de
cido ascrbico em mg para 100 g de glndula adrenal, a partir da absorvncia encontrada e da
curva padro elaborada conforme processo descrito a seguir.
Preparar curva padro, observncia-concentrao, usando 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 e 12,0 g de
cido ascrbico por ml de cido metafosfrico 2,5% (p/V). Transferir 4,0 ml para cinco tubos de
ensaio, contendo cada um 4,0 ml da soluo de acetato de indofenol SR. Misturar por agitao e,
30 segundos depois, ler a observncia em espectrofotmetro a 520 nm. Plotar os valores de
observncia concentrao para obter a curva padro. A partir dos resultados, calcular a
potncia da substncia que est sendo examinada e seus limites de confiana, atravs de mtodo
estatstico descrito na seo VI.5.

MTODO B: INTRAVENOSO

O mtodo subcutneo proposto adequado desde que sejam observadas as seguintes
modificaes:

1) Preparar as solues padro e amostra em soluo fisiolgica sem a adio de
gelatina e acidificar pela adio de 0,25% (V/V) de cido actico 5M. Administrar por via
intravenosa;
2) Cinqenta e cinco a sessenta e cinco minutos depois, retirar as glndulas adrenais.

V.5.2.3. ENSAIO BIOLGICO DE INSULINA

Determina-se a potncia da insulina comparando seu efeito hipoglicemiante com aquele
produzido pela preparao padro de insulina por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o quarto padro internacional de insulina para avaliao biolgica, estabelecido
em 1958, que consiste em mistura de 52% de insulina bovina e 48% de insulina suna purificada e
recristalizada (contendo 24,0 unidades por mg). Pode ser utilizada outra preparao adequada,
cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

Soluo padro

Pesar exatamente quantidade adequada da preparao padro e dissolver em soluo
fisiolgica acidificada com cido clordrico at pH 2,5, de modo a obter soluo com 40 unidades
internacionais por ml. conveniente adicionar substncia conservante para evitar o crescimento
de microrganismos. Conservar a soluo entre 2 e 8 graus centgrados, evitando o congelamento.
Usar a soluo, no mximo, durante 6 meses aps sua preparao.

MTODOS PROPOSTOS

MTODO A: CONVULSO EM CAMUNDONGOS

Diluio do padro

Diluir a soluo padro em soluo fisiolgica acidificada com cido clordrico, at pH 2,5,
de modo a obter duas diluies contendo, respectivamente, por exemplo, dependendo da
Vigilncia Sanitria Digital 179
sensibilidade dos animais, 30 miliunidades (diluio do padro 1) e 60 miliunidades internaci onais
de insulina por ml (diluio do padro 2).

Diluio da amostra

Dissolver a amostra em soluo fisiolgica acidificada com cido clordrico, at pH 2,5, de
modo a obter duas diluies presumidas de, respectivamente, por exemplo, dependendo da
sensibilidade dos animais, 30 miliunidades (diluio do padro 1) e 60 miliunidades internacionais
de insulina por ml (diluio do padro 2).

Animais

Selecionar, no mnimo, noventa e seis camundongos sadios, do mesmo sexo, e mant-los
em dieta uniforme e adequada. Para cada ensaio, a faixa de diferena de peso no deve exceder
a 5g. Alm disso, deixar os animais em jejum, mas com acesso gua, entre 2 e 24 horas antes
do ensaio.

Procedimento

Distribuir os camundongos, ao acaso, em quatro grupos iguais de 24 animais cada um,
identificando cada lote para a administrao das duas diluies do padro e da amostra,
respectivamente. Injetar cada dose, subcutaneamente, usando o mesmo volume, usualmente
0,25 ml, nunca exceder, porm, 0,5 ml para cada camundongo. Colocar os animais em
recipientes transparentes no interior de um incubar de ar com a parte frontal tambm
transparente, ajustado temperatura uniforme entre 29 a 35 graus centgrados e umidade relativa
de 40 a 60%. Pode ser usada uma srie de pequenas caixas submersas at trs quartas partes
de sua altura em banho-maria temperatura adequada e que possibilite a ventilao necessria
das mesmas. Planejar o ensaio de modo que os recipientes dos quatro lotes sejam distribudos
uniformemente no incubador ou em banho-maria. Observar os camundongos durante uma hora e
meia aps a injeo e registrar o nmero de animais que entram em convulso ou morrem. Para
recuperar os animais, injetar 0,5 ml de glicose 15% (p/v), subcutaneamente.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.7.

MTODO B: GLICOSE SANGNEA EM COELHOS

Diluio do padro

Diluir volume adequado da soluo de modo a obter duas diluies contendo,
respectivamente, por exemplo, dependendo da sensibilidade dos animais, 1,0 unidade (diluio
do padro 1) e 2,0 unidades internacionais de insulina por ml (diluio do padro 2). Usar como
solvente soluo contendo cresol ou fenol 0,1 a 0,25% (p/v). Glicerol 1,4 a 1,8% (p/v) e cido
clordrico suficiente para produzir pH entre 2,5 e 3,5.

Diluio da amostra

Utilizando o mesmo solvente, fazer duas solues da amostra de modo que, com base na
potncia presumida, se obtenha, respectivamente, por exemplo, dependendo da sensibilidade dos
animais, 1,0 unidade (diluio 1) e 2,0 unidades internacionais de insulina por ml (diluio da
amostra 2).

Dose a injetar

Com base em ensaio prvio, selecionar as doses a injetar cujo volume, usualmente, deve
estar entre 0,30 e 0,50 ml. Para ensaio, esse volume da diluio padro e da amostra deve ser o
mesmo.

Animais

Vigilncia Sanitria Digital 180
Selecionar, no mnimo 24 coelhos sadios, pesando no menos que 1,8 kg cada um. Uma
semana antes do ensaio, colocar os animais nas condies do laboratrio, com livre acesso
gua e com dieta uniforme.

Procedimento

Dividir os coelhos, ao acaso, em quatro grupos iguais de, no mnimo, 6 coelhos cada um,
destinando-os, respectivamente, para as duas doses do padro e da amostra. Aproximadamente
20 horas antes do ensaio, deixar para cada coelho quantidade de alimento que deve ser
consumida durante 6 horas. Antes de cada fase do ensaio seguir o mesmo horrio de
alimentao. Durante o ensaio, retirar o alimento e a gua at que seja coletada a ltima amostra
de sangue. Injetar, subcutaneamente, a dose indicada para o respectivo grupo, conforme o
planejamento a seguir:

Grupo 1 Injeo 2 Injeo

1 diluio do padro 1 diluio da amostra 2
2 diluio do padro 2 diluio da amostra 1
3 diluio da amostra 1 diluio do padro 2
4 diluio da amostra 2 diluio do padro 1

Observar que a segunda injeo deve ser feita preferencialmente no dia seguinte, porm
nunca exceder uma semana aps a primeira injeo. Coletar amostra de sangue atravs da veia
marginal da orelha de cada coelho uma hora e duas horas e meia aps cada injeo. Determinar
a concentrao de glicose de cada amostra por mtodo adequado, tal como o descrito no mtodo
C.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito, na seo VI.5.

MTODO C: GLICOSE SANGNEA EM CAMUNDONGOS

Diluies do padro

Diluir volume adequado da soluo de modo a obter duas diluies contendo,
respectivamente, por exemplo, dependendo da sensibilidade dos animais, 50 miliunidades
(diluio do padro 1) e 100 miliunidades internacionais de insulina por ml (diluio do padro 2).
Ajustar a concentrao destas diluies conforme a sensibilidade da cepa de camundongos
utilizada. Usar como solvente, soluo fisiolgica acidificada com cido clordrico at pH 2,5 e 3,5.

Diluio da amostra

Utilizando o mesmo solvente, fazer duas solues da amostra de modo que, com base na
potncia presumida, se obtenha, respectivamente, por exemplo, dependendo da sensibilidade dos
animais, 50 miliunidades (diluio da amostra 1) e 100 miliunidades internacionais de insulina por
ml (diluio da amostra 2).

Animais

Selecionar, no mnimo, 40 camundongos do mesmo sexo, pesando entre 20 e 25 g. Para
cada ensaio, a faixa de diferena de peso no deve exceder 2g. Manter os animais temperatura
ambiente uniforme, com acesso gua e alimentao.

Procedimento

Distribuir os camundongos, por sorteio, em quatro grupos iguais de, no mnimo, 10
animais cada um, identificando cada lote para a administrao das duas diluies do padro e da
amostra, respectivamente. Injetar cada dose, subcutaneamente, utilizando 0,1ml para cada 10g
de peso mdio dos animais. Adotar o delineamento duplo cruzando, conforme o esquema a
seguir:

Vigilncia Sanitria Digital 181
Grupo 1 Injeo 2 Injeo

1 diluio do padro 1 diluio da amostra 2
2 diluio do padro 2 diluio da amostra 1
3 diluio da amostra 1 diluio do padro 2
4 diluio da amostra 2 diluio do padro 1

Exatamente quarenta minutos aps cada injeo, coletar amostra de 50 a 100 l de
sangue de cada animal, atravs da explorao do plexo venoso ocultar com tubo capilar
heparinizado. Nas mesmas condies, aplicar a Segunda injeo pelo menos duas horas e meia
aps a primeira ou no dia seguinte. Centrifugar o sangue para separar o plasma e determinar o
teor de glicose pelo mtodo a seguir.
Transferir 25 ml do plasma, recentemente separado, para um tubo de ensaio. Adicionar
2,5 ml de reagente de cor, agitar e deixar temperatura ambiente por 60 minutos. Determinar a
observncia em espectrofotmetro a 510mm, usando como branco 25 l de gua e 2,5 ml de
reagente de cor. Determinar o contedo de glicose utilizando curva padro com concentraes
variando de 50 a 250 mg por ml.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs do mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

REAGENTES

Reagente de cor

Dissolver 0,1 g de aminofenazona em 250 ml de tampo fosfato pH 6,0. Juntar 5ml da
soluo de glicose-oxidase, 5 ml da soluo de peroxidase e 0,33 g de cido 4-hidroxibenzico.
Completar com tampo fosfato pH 6,0 a 300 ml.

Soluo de glicose-oxidase

Obtm-se a enzima a partir de miclios de Aspergillus niger. Ela catalisa a oxidao
aerbica da glicose. A soluo contm no mnimo 735 unidades/ml, e no mximo 790 unidades/ml
de atividade de glicose-oxidase, e no mximo 15 unidades/ml de atividade de catalase. Pode
conter tampes e estabilizantes.
Unidade de atividade de glicose-oxidase a quantidade capaz de absorver 10
3
mm de
oxignio/minuto, atuando sobre o substrato glicose, a 30 graus centgrados, em pH 5,9, na
presena de excesso de catalase.

Caractersticas da soluo: lmpida, de colorao marrom-amarelada. Densidade em torno de
1,18 a 1,21. Armazenagem: recipientes bem fechados, sob refrigerao. A estabilidade de, no
mnimo, 6 meses.

Peroxidase

Preparado liofiliado obtido a partir da raiz de Cochlearia armoracia L. Catalisa reaes de
oxidao com o perxido de hidrognio.

Caractersticas: p de cor branca a parda.

A soluo da enzima a 0,025 por cento (p/v) em tampo fosfato pH 6,0, apresenta:

abservncia 403 nm
= mnimo 0,6
abservncia 275 nm

Soluo de perxido: contm 1,0g de perxidase em tampo fosfato pH 6,0. Apresenta, no
mnimo, 820 unidades internacionais/ml.

V.5.2.4. DURAO DO EFEITO DA INSULINA

Vigilncia Sanitria Digital 182
A durao do efeito hipogliceminante, produzido por preparaes modificadas de insulina,
comparada com a hipoglicemia produzida em coelhos ou cobaias, pela preparao padro de
insulina.
Selecionar os animais a partis de colnia sadia e distribu-los aleatoriamente e em dois
grupos iguais de, no mnimo, 10 animais. Aproximadamente dezoito horas antes da realizao do
ensaio colocar os animais isolados e deix-los em jejum com acesso gua. No incio do ensaio,
determinar o nvel mdio de glicose sangnea de cada grupo. Injetar, subcutaneamente, nos
animais de um grupo soluo da amostra e nos do outro soluo padro fisiolgica acidificada
com cido clordrico para pH 2,5., de modo a conter a potncia nominal da amostra: ambas as
solues so injetadas, sem diluies posteriores, em volumes correspondentes ao peso corporal
dos animais. Uma, duas, quatro e seis horas aps as injees determinar o nvel mdio de glicose
sangnea de cada grupo atravs de mtodo adequado, tal como o descrito no mtodo C do
ensaio biolgico de insulina (V.5.2.3.)

V.5.2.5. ENSAIO BIOLGICO DE GLUCAGON

Determina-se a potncia do glucagon, comparando sua atividade hiperglicemiante com
aquela da preparao padro por mtodo de ensaio adequado.

Preparao do padro

Empregar o primeiro padro internacional de glucagon suno para avaliao biolgica,
estabelecido em 1973, que consiste em glucagon suno liofilizado com lactose de sdio (fornecido
em ampolas contendo 1,49 unidades). Pode ser utilizada outra preparao adequada, cuja
potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

Soluo padro

Reconstituir o contedo total da ampola da preparao padro com 2 ml de soluo
fisiolgica acidificada com cido clordrico R a pH 3,0. Diluir soluo resultante com o mesmo
solvente, de modo a obter concentrao conveniente, como a de 100 miliunidades internacionais
por ml. Conservar esta soluo entre 2 graus centgrados e 8 graus centgrados e us-la, no
mximo, at dois dias aps sua preparao.

MTODO PROPOSTO

Selecionar, no mnimo, vinte e quatro coelhos adultos, sadios, cada qual com peso entre
1,8 e 2,8 kg. Mant-los em condies uniformes de temperatura, umidade e dieta adequada, pelo
menos durante uma semana. Trat-los cuidadosamente para evitar excit-los. Quarenta e oito
horas antes do ensaio, injetar intramuscularmente, em cada coelho, 1ml de acetato de cortisona.
Dezesseis horas antes do ensaio, deixar os animais em jejum, com acesso gua, assim
permanecendo at a ltima coleta de amostra sangnea. Distribuir os coelhos em quatro grupos
iguais de, no mnimo, seis coelhos cada um. Fazer duas diluies da soluo padro, em soluo
acidificada a pH 3,0 com cido clordrico, de modo que contenha respectivamente 6 e 24
miliunidades internacionais de glucagon por ml. Paralelamente, fazer duas diluies da amostra,
usando o mesmo solvente, a fim de obter concentrao presumida idntica das diluies do
padro. No mesmo horrio, em dois dias consecutivos, injetar os coelhos, subcutaneamente, 1ml
de cada uma das quatro diluies, conforme o planejamento duplo cruzado a seguir:

Grupo 1 Injeo 2 Injeo

1 diluio do padro 1 diluio da amostra 2
2 diluio do padro 2 diluio da amostra 1
3 diluio da amostra 1 diluio do padro 2
4 diluio da amostra 2 diluio do padro 1

Coletar a amostra sangnea pela veia marginal da orelha de cada coelho aos vinte e aos
sessenta minutos aps a injeo. Determinar a concentrao de glicose atravs de mtodo
adequado, como o descrito no mtodo do ensaio biolgico de insulina (V.5.2.3.).
Vigilncia Sanitria Digital 183
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.6. ENSAIO BIOLGICO DE HEPARINA

Determina-se a potncia da heparina comparando a concentrao necessria para inibir a
coagulao do plasma citrato de ovelha, recalcificado, com a da preparao padro de heparina
necessria para produzir o mesmo efeito pr mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o quarto padro internacional de heparina suna, estabelecido em 1983, que
consiste do sal sdico do princpio ativo purificado, isolado da mucosa intestinal suna, liofilizado
(disponvel em ampolas de 1780 unidades). Pode ser utilizada outra preparao adequada, cuja
potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

Soluo padro

Dissolver o contedo da ampola de heparina padro em soluo de cloreto de sdio 0,9%
(p/v) de modo a obter soluo de concentrao de 3 unidades internacionais por ml. Conservar
sob refrigerao evitando o congelamento.

Ensaio preliminar

Determinar, se necessrio, atravs de ensaio preliminar, a concentrao mnima
aproximada de heparina que, apresente em 0,80 ml de cloreto de sdio 0,9% (p/v), inibe a
coagulao de 1ml de plasma na presena de 0,2 ml de cloreto de clcio 1% (p/v), aps 1 hora
em banho-maria a 37 graus centgrados. Esta concentrao, usualmente, est entre 0,5 e 3
unidades internacionais. Para o ensaio, preparar uma diluio do padro com a concentrao
determinada em ensaio preliminar.

Soluo da amostra

Dissolver a amostra em cloreto de sdio 0,9% (p/v) de modo a obter soluo com
potncia presumida da soluo padro. Preferencialmente, realizar ensaio preliminar.

MTODO PROPOSTO

Plasma

Coletar sangue de ovelha diretamente no frasco que contm soluo de citrato de sdio
8% (p/v), na proporo de 1 ml para cada 19 ml de sangue. Misturar, imediatamente, por leve
agitao e inverso do frasco. A seguir, centrifugar o sangue e reunir todo o plasma no mesmo
recipiente. Retirar 1ml deste plasma e transferir para tubo de ensaio. Adicionar 0,2 ml de cloreto
de clcio 1% (p/v) e homogeneizar trs vezes por inverso leve do tubo. Colocar em banho-maria
a 37 graus centgrados. Considerar o plasma adequado se houver a formao de cogulo slido
em at 5 minutos. Armazenar o lote de plasma em frascos contendo, no mximo, 100 ml cada um
e congelar. Evitar o descongelamento parcial antes da utilizao. Para o ensaio, descongelar o
plasma em banho-maria temperatura no superior a 37 graus centgrados e filtrar em gaze.

Procedimento

Usar dez tubos de ensaio de 13 x 100 mm meticulosamente limpos. Adicionar volumes
decrescentes da diluio padro de modo que a dose maior no exceda 0,80ml e que
correspondam a sries geomtricas, nas quais cada passo seja aproximadamente 5% menor do
que o anterior. Adicionar, a cada tubo, cloreto de sdio 0,9% (p/v) suficiente para completar
0,80ml. Adicionar 1ml de plasma a todos os tubos. A seguir, juntar 0,20ml de cloreto de clcio 1%
(p/v) e anotar a hora. Tampar cada tubo e homogeneizar, invertendo trs vezes de tal maneira
que toda a superfcie interna seja umedecida. Colocar em banho-maria a 37 graus centgrados.
Similarmente, fazer a srie usando a soluo da amostra de heparina. Completar todo o processo
Vigilncia Sanitria Digital 184
de preparao e mistura dos tubos da soluo padro e amostra no perodo de 20 minutos aps a
adio do plasma. Uma hora, exatamente marcada, aps a adio de cloreto de clcio 1% (p/v)
determinar, por observao, a extenso do cogulo em cada tubo. Identificando trs graus (0,25;
0,50; 0,75) entre o zero(0,00) e a coagulao total (1,00). Se a srie no apresentar dois tubos
com graduao acima de 0,50 e dois tubos abaixo de 0,50, repetir o ensaio usando solues do
padro e da amostra com concentrao modificada.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.6.

V.5.2.7. ENSAIO BIOLGICO DE SULFATO DE PROTAMINA

MTODO PROPOSTO

Amostra

Dissolver em gua quantidade suficiente e exatamente pesada de sulfato de protamina,
para obter soluo contendo 1,0 mg por (base livre)

Soluo de heparina

No dia do ensaio preparar soluo de heparina, em soluo fisiolgica, de modo a obter,
respectivamente, potncia de 90 ou 115 unidades internacionais por ml, conforme origem da
mesma, tecido pulmonar ou mucosa intestinal.

Plasma

Empregar o plasma nas condies descritas no ensaio biolgico de heparina.

Soluo de tromboplastina-clcio

Dissolver, em soluo de cloreto de clcio 2% (p/v), quantidade de tromboplastina
determinada, se necessrio, atravs de ensaio preliminar que, em aproximadamente 35
segundos, coagula soluo com volume iguais de plasma e mistura de 4 volumes da soluo de
cloreto de sdio 0,9% e 1 volume da soluo tromboplastina-clcio.

Procedimento

Usar tubos de ensaio de 13 x 100 mm meticulosamente limpos. Em 10 tubos, colocar 2,5
ml de plasma. Colocar os tubos em banho-maria a 37 graus centgrados mais ou menos 2,0 graus
centgrados em nove deles adicionar 0,5ml da amostra. No dcimo tubo, que servir como
controle, pipetar 2 ml de cloreto de sdio 0,9% (p/v) e 0,5 ml da soluo de tromboplastina-clcio.
Homogeneizar por dispositivo adequado e registrar o tempo de coagulao, isto , o perodo entre
adio da soluo de tromboplastina-clcio e a formao de fibras de fibrina. E o tempo normal de
coagulao do plasma. Pipetar, respectivamente, para os nove tubos restantes, volume em ml de
soluo de heparina: 0,43; 0,45; 0,47; 0,49; 0,50; 0,51; 0,53; 0,55 e 0,57. Adicionar cloreto de
sdio 0,9% (p/v) para completar 4,5 ml. Tomando os tubos aleatoriamente, adicionar 0,5 ml da
soluo de tromboplastina-clcio e determinar o tempo de coagulao individual do modo descrito
para o tubo controle.
Calcular a potncia em unidades internacionais de heparina neutralizadas por mg, pela
frmula N
H
/N
P
, na qual N
H
o nmero de unidades internacionais de heparina e N
P
o nmero de
mg de sulfato de protamina no tubo seguinte quele em que o tempo de coagulao no mnimo,
2 segundos maior do que o do controle.

V.5.2.8. ENSAIO BIOLGICO DE GONADOTROFINA SRICA

Determina-se a potncia da gonadotrofina srica comparando seu efeito sobre o aumento
de peso de ovrios de ratas imaturas com aquele da preparao padro de gonadotrofina srica,
por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro
Vigilncia Sanitria Digital 185

Empregar o segundo padro internacional de gonadotrofina srica equina para avaliao
biolgica, estabelecido em 1966, que consiste em princpio ativo extrato de soro de guas
prenhes, liofilizado, com lactose (fornecido em ampolas contendo 1600 unidades. Pode ser
utilizado outra preparao adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro
internacional.

Soluo padro

Dissolver o contedo total da ampola da preparao de gonadotrofina srica em tampo
albumina-fosfato pH 7,2 de modo a obter soluo com concentrao de 100 unidades
internacionais de gonadotrofina srica por ml. Com o mesmo solvente, preparar trs diluies do
padro de tal forma que a menor dose produza resposta positiva, a maior no produza resposta
mxima e, alm disso, as trs doses estejam em srie geomtrica como 1:1,2:1,44. Fazer curva
dose-resposta a fim de selecionar as doses de acordo com a sensibilidade da colnia de animais.

Soluo amostra

Do modo anterior descrito, reparar a amostra de gonadotrofina srica, usando o mesmo
solvente, a fim de obter as trs diluies da amostra com potncia presumida idntica a das
diluies do padro.

MTODO PROPOSTO

Selecionar ratas imaturas de 21 a 24 dias de idade e com variao de peso no superior
a 10g. distribuir os animais ao acaso, em seis lotes iguais, cada qual com seis a dez ratos.
Identificar cada lote designando-os, respectivamente, para cada uma das trs diluies do padro
e da amostra. Manter os animais em condies uniformes de gua, alimentao, temperatura e
iluminao. Efetuar, em cada rata, seis administraes de 0,20 ml, subcutaneamente, na rea
dorsal, com a respectiva soluo. Injetar os animais, na tarde do primeiro dia, manh, meio-dia e
tarde do segundo dia e na manh e tarde do terceiro dia. No sexto dia, sacrificar cada rata, retirar
os ovrios, isolar da gordura e trompas de falpio e pesar imediatamente, registrar o peso
combinado dos ovrios de cada rata.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.9. ENSAIO BIOLGICO DE GONADOTROFINA CORINICA

Determina-se a potncia da gonadotrofina corinica, comparando sei efeito sobre o
aumento de peso da prstata ventral ou vesculas seminais de ratos imaturos com aquele da
preparao padro do gonadotrofina corinica por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o segundo padro internacional de gonadotrofina corinica humana para
avaliao biolgica, estabelecido em 1963, que consiste em princpio ativo extrado de urina de
mulher grvida e liofilizado com lactose (fornecido em ampolas contendo 5300 unidades). Pode
ser utilizada outra preparao adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao
padro internacional.

Soluo padro

Dissolver o contedo total da amostra preparao padro de gonadotrofina corinica em
tampo albumina-fosfato pH 7,2, de modo a obter soluo com a concentrao de 10 unidades
internacionais de gonadotrofina corinica por ml. Com o mesmo solvente, preparar trs diluies
do padro de modo que as respostas estejam na zona linear da curva dose-resposta e, alm
disso estejam em srie geomtrica como, por exemplo, 1:2:4. Como aproximao inicial, poderia
ser tentadas doses entre 0,75 e 3,0 unidades internacionais.

Soluo da amostra
Vigilncia Sanitria Digital 186

Do modo anteriormente descrito, preparar a soluo da amostra de gonadotrofina
corinica usando o mesmo solvente, a fim de obter as trs distribuies da amostra com potncia
idntica a das diluies padro.

MTODO PROPOSTO

Selecionar ratos imaturos de, aproximadamente, 2 dias de idade e peso semelhante na
faixa de 30 a 40 g. Os animais so distribudos, ao acaso, em seis lotes de, no mnimo, dez ratos.
Mant-los em condies uniformes de gua, alimentao, temperatura e iluminao. Identificar
cada lote designando-os para uma das trs diluies do padro e da amostra. Injetar cada rato,
subcutaneamente na rea dorsal, com 0,20ml da respectiva soluo, durante trs dias
consecutivos, aproximadamente no mesmo horrio. No quarto dia, cerca de 24 horas aps a
ltima injeo, sacrificar os animais, retirar a prstata ventral ou as vescula seminais de cada um
e pesar imediatamente. Registrar o peso.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.10. ENSAIO BIOLGICO DE GONADORELINA

Determina-se a potncia de gonadorelina, comparando o efeito estimulante da secreo
do hormnio luteinizante da hipfise (avaliado comparando a depleo de cido ascrbico
ovariano de ratos pseudoprenhes) com aquele da preparao padro por mtodo de ensaio
adequado.

Preparao padro

Empregar a primeira preparao de referncia, estabelecida em 1980, que consiste em
resduo liofilizado de soluo com aproximadamente 50 ug de gonadorelina, 2,5 mg de lactose e
0,5 mg de albumina de plasma humano (fornecida em ampolas contendo 31 unidades). Pode ser
utilizada outra preparao adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao
preparao de referncia.

MTODO PROPOSTO

Animais

Selecionar, no mnimo, 56 ratas de aproximadamente 21 dias e peso semelhante na faixa
de 30 a 40 g. mant-las em condies uniformes de gua, alimentao, temperatura e iluminao.

Procedimento

Distribuir as ratas, por sorteio, em sete grupos iguais de oito animais. Identificar cada
grupo designando-os respectivamente para as trs doses do padro e da amostra. O stimo
grupo servir como controle. Injetar todas as ratas, subcutaneamente, no primeiro e terceiro dia
com 50 unidades de gonadotrofina srica e no quinto dia com 50 unidades de gonadotrofina
corinica, cada qual dissolvida em 0,5ml de tampo albumina-fosfato pH 7,2.
Estabelecer a curva dose-resposta e selecionar trs doses do padro e da amostra que
estejam na regio linear. Como aproximao, pode ser tentadas doses de 0,5, 1,0 e 2,0 g, de
acordo com a sensibilidade da cepa de animais usados. Dissolver as doses em 0,1 ml de tampo
albumina-fosfato pH 7,2 contendo gelatina 1% (p/v). Injetar cada rata, subcutaneamente, seis a
nove dias aps a administrao da gonadotrofina corinica. Trs horas aps a injeo, sacrificar
os animais, remover os ovrios, isol-los de tecidos circunvizinhos e imediatamente pes-los.
Executar a operao to rapidamente quanto possvel para evitar perda de peso. Tratar os
ovrios de cada rata separadamente, como segue. Homogeneizar convenientemente com
soluo recente de cido metafosfrico 2,5% (p/v) e ajustar o valor para 10 ml com a mesma
soluo. Deixar o homogeneizado em repouso durante 30 minutos.

Determinao de cido ascrbico

Vigilncia Sanitria Digital 187
Filtrar os extratos de cido metafosfrico e pipetar 4 ml de cada um para tubos de ensaio
contendo 4ml da soluo de acetato de fenol SR. Misturar por agitao e, 30 segundos depois, ler
a observncia em espectrofotmetro a 520 nm. Calcular a concentrao de cido ascrbico em
mg por 100 g de ovrio, a partir da absorvncia encontrada e da curva padro elaborada do
mesmo modo tratando volumes adequados de soluo de cido L-ascrbico em cido
metafosfrico 2,5% (p/v).

A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.11. ENSAIO BIOLGICO DE MENOTROFINA

Determina-se a potncia da menotrofina em relao atividade hormonal folculo-
estimulante, comparando seu efeito sobre o crescimento e maturao dos ovrios de ratas
imaturas com aquele da preparao padro de FSH e LH (ICSH) urinrio humano, por mtodo de
ensaio adequado. A potncia em relao atividade hormonal luteinizante estimada
comparando a depleo do contedo de cido ascrbico ovariano de ratas pseudoprenhes, com
aquele da preparao padro de FSH e LH(ICSH) urinrio humano, por mtodo de ensaio
adequado.

Preparao padro

Empregar o primeiro padro internacional de FSH e LH(ICSH) urinrio humano, para
avaliao biolgica, estabelecido em 1974, que consiste em extrato de urina de mulher aps
menopausa, liofilizado, com 5 ml de lactose (disponvel em ampolas contendo 54 unidades de
atividade de folitropina e 46 unidades de atividade de lutropina). Pode ser utilizada outra
preparao adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

MTODO PROPOSTO

Atividade da folitropina: FSH

Selecionar ratas de aproximadamente 21 dias e peso semelhante na faixa de 30 a 40 g.
Distribu-las, por sorteio, em 6 grupos iguais de, no mnimo, oito ratas. Identificar cada grupo
designando-os, respectivamente, para as trs doses do padro e amostra.
Estabelecer a curva dose-resposta e selecionar trs doses do padro e da amostra que
estejam na regio linear. Embora dependa da sensibilidade da colnia de animais, como
aproximao podem ser tentadas doses de 0,5, 0,71, e 1,0 unidades por injeo.
Dissolver cada dose em 0,5 ml de tampo albumin-fosfato pH 7,2 contendo 14 unidades
de gonadotrofina corinica. Injetar cada rata, subcutaneamente, na rea dorsal. Repetir a injeo
24 e 48 horas depois. Cerca de 24 horas aps a ltima injeo, sacrificar as ratas, remover os
ovrios e pes-los. Registrar o peso de ovrios por rata.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

Atividade da lutropina: LH (ICSH)

Selecionar ratas de aproximadamente 21 dias e peso semelhante na faixa de 30 a 40 g.
Distribu-las, por sorteio, em 6 grupos iguais de, no mnimo, oito ratas. Identificar cada grupo
designando-os, respectivamente, para as trs doses do padro e amostra.
Injetar os animais, subcutaneamente, no primeiro e terceiro dia com 50 unidades de
gonadotrofina srica e no quinto dia com 50 unidades de gonadotrofina corinica, cada qual
dissolvida em 0,5 ml de tampo albumina-fosfato pH 7,2. Estabelecer a curva dose-resposta e
escolher trs doses do padro e da amostra que estejam na regio linear. Embora dependa da
sensibilidade da colnia de animais, como aproximao podem ser tentadas doses de 0,5, 1,0 e
2,0 unidades. Seis a nove dias aps a aplicao da gonadotrofina corinica, dissolver cada dose
de gonadotrofina em 0,5 ml de tampo albumina-fosfato pH 7,2 e aplicar intravenosamente em
cada grupo de animais. Trs horas aps, sacrificar as ratas, remover os ovrios, isol-los de
tecidos estranhos e pesar imediatamente, executando a operao to rapidamente quanto
possvel para evitar perda de peso. Tratar os ovrios de cada rata separadamente, como segue.
Vigilncia Sanitria Digital 188
Homogeneizar em soluo recente de cido metafosfrico 2,5% (p/v) e ajustar a 10ml com a
mesma soluo. Deixar o homogeneizado em repouso durante 30 minutos. Filtrar os extratos de
cido metafosfrico e pipetar 4ml de cada filtrado para tubos de ensaio contendo 4ml da soluo
de acetato de indofenol SR. Misturar por agitao e, 30 segundos depois, ler a observncia em
espectrofotmetro a 520 nm. Calcular a concentrao de cido ascrbico, a partir da observncia
lida e da curva padro elaborada do mesmo modo tratando, volumes adequados da soluo de
cido L-ascrbico em cido metafosfrico 2,5% (p/v). Expressar o resultado em mg por 100 g de
ovrio.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.12. ENSAIO BIOLGICO DE DIGITAL

Determina-se a potncia de digital, comparando sua atividade sobre o msculo cardaco
de cobaia com aquela da preparao padro por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o terceiro padro internacional de digital, estabelecido em 1949, que consiste
em p seco de folhas de Digitalis purpurea (disponvel em ampolas contendo 2,5 g) g. pode ser
utilizada outra preparao adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro
internacional.

Soluo padro

Transferir quantidade exatamente pesada da preparao padro para balo volumtrico
de 50ml e adicionar 10 ml de etanol 80% (v/v) para cada g de p. Tampar o balo aps untar,
levemente, a parte esmerilhada com parafina lquida. Agitar continuamente durante 24 horas mais
ou menos 2 horas a 25 graus centgrados mais ou menos 5 graus centgrados ou 48 horas de 10
a 20 graus centgrados. Em seguida, centrifugar ou filtrar a mistura, atravs de vidro sinterizado,
evitando a evaporao do solvente. Transferir o lquido para recipiente adequado, bem fechado, e
manter a temperatura entre -5 e 5 graus centgrados. Usar no mximo, durante 1 ms. No dia do
ensaio diluir a soluo padro em soluo fisiolgica de modo a obter concentrao padro de
digital com 3 a 5 ml.

Soluo da amostra

Preparar a amostra de digital da mesma maneira, usando o mesmo solvente a fim de
obter soluo com potncia presumida idntica da soluo padro.

MTODO PROPOSTO

Selecionar, no mnimo, doze cobaios adultos, sadios de peso entre 200 e 600 g. para
cada ensaio, o peso mdio dos dois grupos no deve diferir mais de 10% e o animal mais pesado
no deve variar mais do que 100g, em relao ao mais leve. Separar em dois grupos de 6
cobaios cada um, designando-os, respectivamente, para a soluo padro e amostra. Anestesiar
o animal com carbamato de etila a 50% (p/v) na dose de 2ml/kg por via intraperitoneal, dissecar e
canular a veia jugular, preparando-a para as administraes intravenosas das solues do padro
e da amostra. Paralelamente, preparar o animal para a manuteno de respirao artificial.
Aleatoriamente, injetar as doses de soluo padro ou da amostra, atravs da veia jugular, em
velocidade lenta e uniforme, como a de 0,5 a 1 ml por minuto. A durao da infuso pode variar
de 20 a 40 minutos, com a durao mdia dos grupos no diferindo em mais de 10%. Continuar a
injeo at que ocorra a parada cardaca, observvel atravs de eletrocardiograma ou outro
dispositivo adequado. Anotar o volume de extrato administrado como sendo a dose letal.
Determinar, para cada animal, a dose letal em ml por kg de peso corporal e transformar em
logaritmo.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.4.

V.5.2.13. ENSAIO BIOLGICO DE VASOPRESSINA
Vigilncia Sanitria Digital 189

Determina-se a potncia da vasopressina comparando sua atividade com aquela da
preparao padro de argipressina por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o primeiro padro internacional de argipressina para avaliao biolgica,
estabelecido em 1978, que consiste em argipressina sinttica liofilizada com albumina humana e
cido ctrico (disponvel em ampolas que contm 8,20 unidades). Pode ser utilizada outra
preparao adequada, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro internacional.

Soluo padro

Dissolver o contedo total de preparao padro em cloreto de sdio 0,9% (p/v), de modo
a obter soluo de 2,0 unidades internacionais por ml. De acordo com a sensibilidade do animal,
sero necessrias diluies posteriores, de modo que o volume injetado no seja inferior a 0,1ml
nem superior a 0,5ml.

Soluo amostra

Preparar a amostra de vasopressina, de modo anteriormente descrito, usando o mesmo
solvente a fim de que a soluo resultante tenha potncia presumida idntica da soluo
padro.

MTODO PROPOSTO

Preparao do animal

Aproximadamente 18 horas antes do ensaio, selecionar um rato pesando ao redor de 300 g.
Injetar, intravenosamente, 10 ml por kg de peso corporal, uma soluo preparada do seguinte
modo: dissolver 10 mg de cloridrato defenoxibenzamina em cloreto de sdio 0,9% (p/v), adicionar
0,1 ml de lcool, acidificar com 1 gota de cido clordrico e diluir com cloreto de sdio 0,9% (p/v)
at completar 10ml. No dia do ensaio, anestesiar o rato, usando como anestsico carbamato de
etila 5%(p/v) favorvel manuteno de presso arterial uniforme. Quarenta e cinco e sessenta
minutos depois, fixar o rato sobre a mesa de cirurgia. Dissecar a veia jugular ou femural, inserir
cnula adequada com, aproximadamente, 1mm de dimetro externo e prepar-la para a
administrao intravenosa. Administrar 200 unidades de heparina, dissolvida em soluo
fisiolgica para cada peso corporal. Dissecar a artria cartida e conectar a manmetro de
mercrio de 2 a 3 mm de dimetro interno, ou outro sistema adequado para obter registro
contnuo da presso arterial. Manter o animal aquecido durante a cirurgia, bem como durante o
ensaio.

Determinao da sensibilidade do animal

Determinar, por experimentao, a dose de soluo padro que, injetada
intravenosamente, a intervalos regulares de 12 a 15 minutos, produz elevao da presso arterial
entre 2,7 a 9,3 Kpa (20 e 70 mm de mercrio). A partir desta observao, selecionar duas doses
da soluo padro que estejam na razo de aproximadamente 2 para 3 ou 3 para 5. Aps o teste
preliminar, selecionar duas doses da amostra que estejam na mesma razo e correspondam, em
atividade, quelas doses selecionadas da preparao padro. Como referncia inicial, podem ser
tentadas doses de 6 a 10 miliunidades.

Procedimento

Injetar as duas doses selecionadas da soluo padro e da amostra, em seqncia
aleatria, a intervalos uniformes de 12 a 15 minutos, registrando pelo menos quatro respostas
para cada dose. Aps cada injeo, lavar a cnula com 0,2 ml de soluo fisiolgica. Ao invs
desta seqncia aleatria, pode-se usar um planejamento de blocos ao acaso para eliminar a
influncia de variaes na sensibilidade do animal sobre o resultado do ensaio.
Vigilncia Sanitria Digital 190
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.14. ENSAIO BIOLGICO DE LIPRESSINA

Determina-se a potncia da lipressina comparando sua atividade com aquela da
preparao padro por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o primeiro padro internacional de lipressina, estabelecido em 1978, que
consiste em lipressina liofilizada, com albumina e cido ctrico (disponvel em ampolas contendo
7,7 unidades). Pode ser utilizada outra preparao adequada. Cuja potncia tenha sido
determinada em relao ao padro internacional.

Mtodo proposto

Usa-se o mtodo proposto descrito para ensaio biolgico da vasopressina.

V.5.2.15. ENSAIO BIOLGICO DE FELIPRESSINA

Determina-se a potncia da felipressina comparando sua atividade com aquela da
preparao padro de felipressina por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro de referncia

Empregar preparao padro de referncia de felipressina.

Soluo padro

Dissolver quantidade calculada e exatamente pesada, da preparao padro em soluo
fisiolgica, de modo a obter soluo de 0,1 unidade por ml. No dia do ensaio fazer em soluo
fisiolgica, para obter soluo de 0,1 unidade por ml.

Soluo da amostra

Preparar a amostra de felipressina do mesmo modo, usando o mesmo solvente, a fim de
que a soluo resultante tenha a potncia presumida idntica da soluo padro.

MTODO PROPOSTO

Usa-se o mtodo descrito para ensaio biolgico de vasopressina.
Observar, porm, que na determinao da sensibilidade do animal podem ser tentadas,
como referncia inicial, doses de 2,0 a 5,0 miliunidades.

V.5.2.16. ENSAIO BIOLGICO DA SOMATOTROFINA

Determina-se a potncia da somatotrofina comparando seu efeito sobre o aumento de
peso corporal, ou da espessura da cartilagem de conjugao da tbia de ratas hipofisectomizadas,
com aquele de preparao padro de somatotroina por mtodo de ensaio adequado.

Preparao padro

Empregar o primeiro padro internacional de somatotrofina para avaliao biolgica,
estabelecido em 1982, que consiste em somatotrofina purificada, liofilizada, com lactose, glicina,
manitol e bicarbonato de sdio (disponvel em ampolas contendo 4,4 unidades internacionais).
Pode ser utilizada outra preparao, cuja potncia tenha sido determinada em relao ao padro
internacional.

MTODOS PROPOSTOS
Vigilncia Sanitria Digital 191

Selecionar, no mnimo, sessenta ratas, da mesma linhagem, de 26 a30 dias de idade e
peso aproximadamente igual. Duas a trs semanas antes do ensaio, colocar os animais em
condies de gua, alimentao, temperatura e iluminao. Para o ensaio, pesar as ratas e
realizar a hipofisectomia. Aps a cirurgia, mant-los temperatura constante entre 25 e 27 graus
centgrados e controlar a estabilidade do peso durante, no mnimo, 14 dias. Desprezar aquelas
que apresentarem flutuao ponderal maior que 3% nos ltimos 10 dias. Dividir aleatoriamente
em quatro grupos iguais de, no mnimo, oito ratas cada um, designando-os, respectivamente,
para as duas doses do padro e da amostra. Preparar duas diluies do padro em bicarbonato
de sdio 1,4% (p/v), de modo que estejam em srie geomtrica como 2:4. Como aproximao
inicial podem ser tentadas doses entre 40 e 160 miliunidades internacionais por ml.
Paralelamente, fazer duas diluies da amostra, usando o mesmo solvente, a fim de obter
concentraes presumidas idnticas das diluies do padro.

MTODO A: AUMENTO DE PESO CORPORAL

Injetar 0,5 ml da respectiva soluo, subcutaneamente, durante nove dias consecutivos,
no mesmo horrio. Acompanhar a variao individual pesando as ratas durante os 10 dias de
durao do ensaio. No dcimo dia, pesar os animais, sacrific-los e examinar macroscopicamente
se a hipofisectomia foi completa. Desprezar os animais que apresentarem algum vestgio do
rgo. Registrar aumento de peso corporal individual.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo...

MTODO B: MTODO DA TBIA

Injetar 0,5 ml da respectiva soluo, subcutaneamente, durante quatro dias consecutivos.
Vinte e quatro horas aps a ltima injeo, sacrificar os animais e examinar se a hipofisectomia
foi completa. Desprezar os animais que apresentarem algum vestgio do rgo. Retirar as tbias e
isol-las dos tecidos circunvizinhos. Cortar com lmina fina e afiada a parte prxima dos ossos,
em sentido longituninal, corando-os com nitrato de prata da seguinte maneira: lavar os fragmentos
dos ossos durante 10 minutos com gua, por 10 minutos com acetona e 10 minutos novamente
com gua. Transferir para soluo recente de nitrato de prata 2 p/v. dois minutos depois, lavar
comgua, expondo-os ao mesmo tempo luz intensa, at que todas as pores calcificadas
apresentem colorao marrom-escura. Medir a espessura da cartilagem epifisria, usando
microscpio equipado com micrmetro ocular. Efetuar 10 medidas distribuidas diagonalmente ao
longo de todo o comprimento da epfise de cada fragmento. Registrar como resposta o aumento
mdio da espessura da cartilagem epifisria das tbias d cada rata.
A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

V.5.2.17. ENSAIO MICROBIOLGICO DE ANTIBITICOS

Determina-se a potncia (atividade) de um antibitico comparando a dose que inibe o
crescimento de microrganismo sensvel com a dose da preparao padro do antibitico que
produz inibio similar.

Unidade internacional e Preparao Padro

Unidade internacional a atividade especfica contida em uma quantidade (massa) de
Padro Biolgica Internacional ou Preparao de Referncia Biolgica Internacional. A
quantidade equivalente de unidades para uso internacional estabelecida, sempre que
necessrio, pela Organizao Mundial da Sade.
Substncias Qumicas de Referncia Internacional no apresentam unidades de
atividades biolgica definidas. Quando so necessrios ensaios biolgicos, a potncia desses
produtos expressa em termos de massa equivalente da substncia pura.
O nmero de unidades ou a massa equivalente da substncia pura, em microgramas,
contidos em 1mg de substncia antibitica, est indicado na monografia de cada um dos produtos
inscritos na Farmacopia.
Vigilncia Sanitria Digital 192
Para os ensaios microbiolgicos da Farmacopia, Preparaes Padro (Padres
primrios) so os Padres Internacionais e Preparaes de Referncia estabelecidos pela
Organizao Mundial da Sade e pela Farmacopia Europia ou os Padres e preparaes de
Referncia Brasileiros. Outras preparaes adequadas, de uso internacional corrente, nas quais a
potncia tenha sido determinada em relao s preparaes padro da Organizao Mundial da
Sade, possuem valor legal idntico.
Recomenda-se que sejam preparados e empregados padres de trabalho (secundrios),
todavia imprescindvel que a potncia tenha sido determinada por nmero adequado de ensaio
comparativos em relao a padro primrio relevante, validada por anlise estatstica apropriada
e que os dados e resultados sejam arquivados disposio da fiscalizao competente por prazo
idntico ao da validade dos produtos ensaiados.
Para o ensaio de lotes de substncias antibiticas, para as quais existam Preparaes
Padro nacionais, referendadas por organizaes internacionais, obrigatrio o uso dessas
preparaes.

Solues

Soluo 1 (tampo fosfato de potssio a 1%, pH 6,0)
Dissolver 2,0g de fosfato de potssio dibsico e 8,0g de fosfato de potssio monobsico
em gua suficiente para perfazer 1000 ml. Esterilizar a soluo por 20 minutos em autoclave a
121 graus centgrados e, se necessrio, ajustar o pH para 5,9 6,1 com cido fosfrico 6 M ou
hidrxido de potssio 10 M.

Soluo 2 (tampo fosfato de potssio 0,1 M, estril pH 8,0)
Dissolver 16,73 g de fosfato de potssio dibsico e 0,523g de fosfato de potssio
monobsico em gua suficiente para perfazer 1000 ml. Esterilizar a soluo por 20 minutos em
autoclave a 121 graus centgrados e, se necessrio, ajustar o pH para 7,9 8,1 com cido
fosfrico 6 M ou hidrxido de potssio 10 M.

Soluo 3 (tampo fosfato de potssio 0,1 M, estril pH 4,5)
Dissolver 13,6 g de fosfato de potssio monobsico em gua suficiente para perfazer
1000ml, esterilizar a soluo por 20 minutos em autoclave a 121 graus centgrados e, se
necessrio, ajustar o pH para 4,4 4,5 com cido fosfrico 6 M ou hidrxido de potssio 10 M.

Soluo 4 (tampo fosfato de potssio 10%, estril, pH 6,0)
Dissolver 20,0 g de fosfato de potssio dibsico e 80,0 g de fosfato de potssio
monobsico em gua suficiente para perfazer 1000 ml. Esterilizar a soluo por 20 minutos em
autoclave a 121 graus centgrados e, se necessrio, ajustar o pH para 5,6 6,1 com cido
fosfrico 6 M ou hidrxido de potssio 10 M.

Soluo 5 (tampo fosfato de potssio 0,2 M, estril pH 10,5)
Dissolver 35,0 g de fosfato de potssio dibsico e 2,0 ml de hidrxido de potssio 10 M
em gua suficiente para perfazer 1000 ml. Esterilizar a soluo por 20 minutos em autoclave a
121 graus centgrados e, se necessrio, ajustar o pH para 10,4 10,6 com cido fosfrico 6 M ou
hidrxido de potssio 10 M.

Soluo 6 (cido clordrico metanlico 0,1 M)
Diluir 10,0 ml de cido clordrico 1,0 M em metanol suficiente para perfazer 1000 ml.

Soluo 7 (soluo de lcool isoproplico a 80%)
Diluir 800 ml de lcool isoproplico em gua suficiente para perfazer 1000 ml.

Soluo 8 (tampo fosfato de potssio 0,1 M, estril, pH 7,0)
Dissolver 13,6 g de fosfato de potssio dibsico e 4,0 g de fosfato de potssio
monobsico em gua suficiente para perfazer 1000 ml. Esterilizar a soluo por 20 minutos em
autoclave a 121 graus centgrados e, se necessrio, ajustar o pH para 6,8 7,2 com cido
fosfrico 6 M ou hidrxido de potssio 10 M.

Meios de cultura

Vigilncia Sanitria Digital 193
Podem ser empregados meios de cultura desidratados, disponveis no comrcio que,
quando reconstitudos com gua destilada, conforme as especificaes do fabricante, possuam a
mesma composio que o meio confeccionado com os ingredientes individualmente indicados
para sua obteno.

Meio de cultura nmero 1
Dissolver 6,0 g de peptona seca, 4,0 g de casena de digesto pancretica, 3,0 g de
extrato de levedura, 1,0 g de D-glicose e 15,0 g de gar em gua suficiente para perfazer 1000
ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 6,6.

Meio de cultura nmero 2
Dissolver 6,0 g de peptona seca, 3,0 g de extrato de levedura, 1,5 g de extrato de carne e
15 g de gar em gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 6,6.

Meio de cultura nmero 3
Dissolver 5,0 g de peptona seca, 1,5 g de extrato de levedura, 1,5 g de extrato de carne,
2,5 g de cloreto de sdio, 1,0 g D-glicose, 3,68 g de fosfato de potssio dibsico e 1,32 g de
fosfato de potssio monobsico, gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao,
dever ser 7,0.

Meio de cultura nmero 4
Dissolver 6,0 g de peptona seca, 3,0 g de extrato de levedura, 1,5 g de extrato de carne,
1,0 g de D-glicose 15,0 de gar em gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps
esterilizao, dever ser 6,6.

Meio de cultura nmero 5
Usar o meio de cultura nmero 2, porm, o pH, aps esterilizao, dever ser 7,8.

Meio de cultura nmero 6
Dissolver 40,0 g de D-glicose e 10,0 g de peptona seca em gua suficiente para perfazer
1000 ml. 0 pH, aps esterilizao, dever ser 5,6.

Meio de cultura nmero 7
Usar o meio de cultura nmero 1, esterilizado e resfriado a 50 graus centgrados.
Preparar soluo aquosa contendo 10 mg de neomicina por ml e esterilizar por filtrao em
membrana com porosidade de 0,22m. adicionar, assepticamente, soluo estril de sulfato de
neomicina, para obter concentrao final com potncia de 100g de neomicina por ml de meio.

Meio de cultura nmero 8
Usar o meio de cultura nmero 2, porm, o pH, aps esterilizao, dever ser ajustado
para 5,8 6,0.

Meio de cultura nmero 9
Dissolver 17,0 g de casena de digesto pancretica, 3,0 g de soja de digesto papanica,
5,0 g de cloreto de sdio, 2,5 g de fosfato de potssio dibsico, 2,5 de D-glicose e 20,0 g de gar
em gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 7,3.

Meio de cultura 10
Usar o meio de cultura nmero 9, adicionando, porm, ao invs de 20,0 g, 12,0 g de gar
e 10,0 ml de polissorbato 80 (esse ltimo adicionado aps aquecer o meio para dissolver o gar,
diluindo, imediatamente, com gua para perfazer 1000 ml). O pH, aps esterilizao, dever ser
7,3.

Meio de cultura nmero 11
Usar o meio de cultura nmero 1, mas o pH, aps esterilizao, dever ser ajustado para
8,0.

Meio de cultura nmero 12
Preparar como o meio de cultura o nmero 1, adicionando, porm, 300 mg de sulfato de
mangans hidratado (MnSO
4
.H
2
O) para cada 1000 ml de meio.
Vigilncia Sanitria Digital 194

Meio de cultura nmero 13
Dissolver 10,0 g de peptona seca, e 20,0 g de D-glicose em gua suficiente para perfazer
1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 5,6.

Meio de cultura nmero 14
Dissolver 10,0 g de glicerol, 10,6 g de peptona seca, 10,6 g de extrato de carne e 3,0 g de
cloreto de sdio em gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser
7,0.

Meio de cultura nmero 15
Preparar como o meio de cultura o nmero 14, adicionando, porm, 17,0 g de gar para
cada 1000 ml de meio.

Meio de cultura nmero 16
Dissolver 15,0 g de casena de digesto pancretica, 5,0 g de soja de digesto
papanica, 5,0 g de cloreto de sdio e 15,0 g de gar em gua suficiente para perfazer 1000 ml. O
pH, aps esterilizao, dever ser 7,3.

Meio de cultura nmero 17
Dissolver 17,0 g de casena de digesto pancretica, 3,0 g de peptono de soja, 2,5 g de
D-glicose, 5,0 g de cloreto de sdio, 2,5 g de fosfato de potssio dibsico em gua suficiente
para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 7,3.

Meio de cultura nmero 18
Usar o meio de cultura nmero 11, mas, aps aquecer a soluo para dissolver os
ingredientes, adicionar 20,0 ml de polissorbato 80. OpH, aps esterilizao, dever ser 8,0.

Meio de cultura nmero 19
Dissolver 9,4 g de peptona seca, 4,7 g de extrato de levedura, 2,4 g de extrato de carne,
10,0 g de cloreto de sdio, 10 g D-glicose, e 23,5 de gar em gua suficiente para perfazer 1000
ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 6,1.

Meio de cultura nmero 20
Dissolver 40,0 g de D-glicose, 10,0 g de peptona seca, 15,0 g de gar e 0,05 de cloranfenicol (em
potncia) em gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 5,6.

Meio de cultura nmero 21
Usar o meio de cultura nmero 20, esterilizado e resfriado a 50 graus centgrados.
Adicionar, assepticamente, 2,0 ml de soluo estril de cicloeximida para cada 100 ml de gar
fundido. Preparar soluo contendo 10,0 mg de cicloeximida por ml, em gua , e esterilizar, por
filtrao, em membrana com porosidade de 0,22m.

Meio de cultura nmero 22
Dissolver 15,0 g de peptona seca, 5,0 g de farinha de soja de digesto papanica, 4,0 de cloreto
de sdio, 02,2 g de sulfito de sdio e 7,0 g de L-cistina, 5,5 g de dextrose e 15,0 g de gar, em
gua suficiente para perfazer 1000 ml. O pH, aps esterilizao, dever ser 7,0.

Preparao do inoculo

Microrganismos recomendados
- Staphylococcus .................................................................................. (ATCC 6538p)
- Micrococcus aureus ........................................................................... (ATCC 7468)
- Micrococcus luteus ............................................................................. (ATCC 9341)
- Staphylococcus epidermidis ............................................................... (ATCC 12228)
- Saccharomyces cerevisiae ................................................................. (ATCC 9763)
- Bordetella bronchiseptica ................................................................... (ATCC 4617)
- Bacillus cereus var. mycoides ............................................................ (ATCC 11778)
- Bacillus subtilis ................................................................................... (ATCC 6633)
- Klebsiella pneumoniae ....................................................................... (ATCC 10031)
Vigilncia Sanitria Digital 195
- Escherichia coli .................................................................................. (ATCC 10536)
- Streptococcus faecium ....................................................................... (ATCC 10541)
- Micrococcus luteus ............................................................................. (ATCC 10240)
- Microsporum gypseum ....................................................................... (ATCC 14683)
- Saccharomyces cerevisiae ................................................................. (ATCC 2601)
- Micrococcus flavus resistente neomicina ........................................ (ATCC 14452)
- Pseudomonas aeruginosa .................................................................. (ATCC 25619)
- Mycobacterium smegmatis ................................................................. (ATCC 607)

Com a finalidade de indicao, foram arrolados microrganismos disponveis na ATCC. Os
mesmos grmens podem tambm ser obtidos de outras fontes: INCQS, CIP , NCIB, NCPF,
NCTC, NCYC E SSI. A correspondncia entre os microrganismos e os endereos das entidades
fornecedoras dos mesmos encontram-se indicadas na seco XIII.5.

Procedimento 1

Com Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Staphylococcus epedermidis,
Bordetella bronchiseptica, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa.

Preparao da suspenso

Manter o microrganismo em tubo contendo 10 ml do meio de cultura nmero 1 inclinado.
Incubar o tubo a 32 graus centgrados, por 24 horas. Empregando 3 ml de soluo fisiolgica
estril, transferir a cultura crescida sobre o meio do tubo inclinando para maior superfcie de gar,
como em frasco de Roux contendo 250 ml do meio de cultura nmero 1. Incubar o frasco de Roux
a 32 graus centgrados. Lavar a cultura a resultante na superfcie do meio com 50 ml de soluo
fisiolgica estril.

Padronizao da suspenso

Diluir a suspenso preparada, com soluo fisiolgica estril de modo a obter a
transmitncia de 25% no comprimento de onda de 580nm, empregando colorimetro adequado e
tubos de ensaio com 13 mm de dimetro como cuba de absoro. Determinar a quantidade de
suspenso a ser adicionada a cada 100 ml de gar ou caldo nutriente para produzir zonas de
inibio claras e definidas ou relao satisfatria dose-resposta no mtodo turbodimtrico. O
inculo dos microrganismos submetidos ao procedimento 1 pode ser estocado temperatura de 4
graus centgrados, respectivamente, pelos seguintes perodos: 1 semana, 2 semanas, 2
semanas, 2 semanas, 6 meses, 1 semana, 2 semanas e 2 semanas.
Micrococcus flavus. Efetuar como indicado no Procedimento 1. Empregar, entretanto, no
tubo com meio inclinado e no frasco de Roux, meio de cultura nmero 7, incubando o frasco por
perodo de 48 horas. A suspenso pode ser estocada por duas semanas, temperatura no
superior a 4 graus centgrados.

Procedimento 2

Bacillus subtilis. Efetuar como indicado no Procedimento 1. Na preparao da suspenso,
porm, empregar, no frasco de Roux, o meio de cultura de nmero 12, cujo perodo de incubao
de 5 dias. Na padronizao da suspenso proceder a choque trmico e padronizar a suspenso
como segue: centrifugar e decantar o lquido sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 50 a
70 ml de soluo fisiolgica estril e aquecer a suspenso por 30 minutos a 70 graus centgrados.
Executar testes em placas, para se assegurar da viabilidade dos esporos e determinar a
quantidade dos que devero ser adicionados a cada 100 ml de meio, para obter zonas de inibio
adequadas. A suspenso pode ser estocada, por 6 meses, em temperatura no superior a 4
graus centgrados.

Procedimento 3

Bacillus cereus. Efetuar como indicado no Procedimento 1. Entretanto, incubar o frasco
de Roux por uma semana. Na padronizao da suspenso, proceder a choque trmico e
Vigilncia Sanitria Digital 196
padronizar a suspenso como segue: aquecer a suspenso por 30 minutos, a 80 graus
centgrados. Lavar trs vezes a suspenso de esporos com 20 a 25 ml de gua estril.
Ressuspender os grmens em 50 a 70 ml de gua estril e promover novo choque trmico por 30
minutos a 70 graus centgrados. Executar testes em placas para se assegurar da viabilidade dos
esporos e determinar a quantidade dos que devero ser adicionados a cada 100 ml de gar, para
obter zonas de inibio adequada. A suspenso pode ser estocada, por 6 meses, temperatura
no superior a 4 graus centgrados.

Procedimento 4

Microsporus gyseuum. Incubar o microrganismo, por 6 a 8 semanas, a 25 graus
centgrados em frasco de Erlenmeyer de 31, contendo 200 ml de meio de cultura nmero 6.
Verificar o crescimento por esporulao por 80% ou mais, recolher os condios da camada
micelial com esptula estril ou outro instrumento adequado. Os condios esto na parte superior
da camada flutuante. Manter os condios em 50 ml de soluo fisiolgica. Determinar,
experimentadamente, a quantidade de condios para o ensaio. A suspenso pode ser estocada,
por dois meses, temperatura no superior a 4 graus centgrados.

Procedimento 5

Streptococcus faecium. Manter o microrganismos em quantidades de 100 ml de meio de
cultura nmero 3. Para realizar o ensaio, preparar subcultura, transferindo, com ala de platina,
microrganismos da cultura estoque para o mesmo caldo nutriente e incubar, por 16 a 18 horas, a
37 graus centgrados, determinar, experimentalmente, a quantidade de grmens para o ensaio.
Manter esta cultura sob refrigerao por prazo no superior a 24 horas.

Procedimento 6

Sccharomyces cerevisiae. (ATCC 9763). Manter o microrganismo em tubo contendo 10
ml de meio de cultura nmero 19 inclinado. Incubar os tubos a 32 35 graus centgrados, durante
24 horas. Incubar 100 ml de caldo nutriente meio de cultura nmero 13 e incubar, por 16 a 18
horas a 37 graus centgrados. Padronizar a suspenso conforme descrito no procedimento 1. A
suspenso pode ser estocada, por 4 semanas, temperatura no superior a 4 graus centgrados.

Procedimento 7

Sccharomyces cerevisiae. (ATCC 9763 e ATCC 2601). Seguir o indicado no
Procedimento 1. Incubar, porm, o tubo inclinado e o frasco de Roux, com o meio de cultura
nmero 19, a 30 graus centgrados, o ltimo perodo de 48 horas. A suspenso pode ser
estocada, por 4 semanas, temperatura no superior a 4 graus centgrados.

Procedimento 8

Mycobacterium smegmatis. Manter o microrganismo em tubos com meio inclinado
contendo 10 ml de meio de cultura nmero 16 e efetuar repiques semanalmente. Incubar o tubo a
37 graus centgrados, por 48 horas. Usando 3 ml de soluo fisiolgica estril, transferir as
culturas que cresceram no gar inclinado para frasco de erlenmeyer de 500 ml, contendo 100 ml
de meio de cultura nmero 14 e 50 g de prolas de vidro. Agitar a cultura por rotao velocidade
de 130 ciclos por minuto, num raio de 3,5 cm e temperatura de 27 graus centgrados, por
perodo de cinco dias. Determinar a quantidade de suspenso a ser adicionada a cada 100 ml de
gar por intermdio de ensaio em placas. A suspenso pode ser estocada, por duas semanas
temperatura no superior a 4 graus centgrados.

Dessecao de substncias antibiticas

Usar para dessecao dos padres o procedimento indicado nos Mtodos de Ensaio
Microbiolgico e, para as amostras, o mtodo especificado para cada antibitico na respectiva
monografia.

Mtodo 1
Vigilncia Sanitria Digital 197

Em ambiente de baixa umidade relativa, pulverizar, caso necessrio, a amostra para obter
p fino. Empregar na preparao da amostra quatro unidades, quando forem nalizadas formas
farmacuticas como comprimidos, cpsulas, drgeas ou pastilhas. Transferir aproximadamente
100 mg de amostra para pesa-filtro tarado provido de tampa esmerilhada. Pesar o frasco e
coloc-lo em estufa sob presso reduzida, inclinando a tampa sobre a boca do frasco para
assegurar que permanea aberto durante a dessecao. Dessecar a 60 graus centgrados, sob
presso de 0,67 Kpa ou menos, durante trs horas. Concludo o processo, introduzir ar seco na
estufa, submetendo-o a agente dessecante como cido sulfrico ou slica-gel. Repor a tampa e
colocar o pesa-filtro em dessecador contendo agente dessecante como pentxido de fsforo ou
slica-gel. Deixar esfriar temperatura ambiente e pesar, calculando a perda percentual de massa
da amostra.

Mtodo 2

Proceder conforme o mtodo 1. Porm, pesa-filtro tarado provido de tampa com tubo
capilar, de dimetro interno de ordem de 0,20 a 0,25 mm, e dessecar sem remover a tampa.

Mtodo 3

Proceder conforme o mtodo 1. Dessecar, porm, a amostra a 110 graus centgrados,
sob presso de 10,67 Kpa ou menos, durante trs horas.

Mtodo 4

Proceder conforme o mtodo 1. Dessecar, porm, a amostra a 40 graus centgrados, sob
presso de 10,67 Kpa ou menos, durante duas horas.

Mtodo 5

Proceder conforme o mtodo 1. Dessecar, porm, a amostra a 100 graus centgrados,
sob presso de 5 mm de Hg ou menos, durante quatro horas.

Mtodo 6

Proceder conforme o mtodo 1. Dessecar, porm, a amostra a 40 graus centgrados, sob
presso de 10,67 KPa ou menos, durante trs horas.

Mtodo 7

Proceder conforme o mtodo 1. Dessecar, porm, a amostra a 25 graus centgrados, sob
presso de 10,67 KPa ou menos, durante quatro horas.

Mtodo 8

A substncia antibitica no submetida dessecao.

Mtodo de ensaio microbitico

Todo o material deve ser adequado para o uso pretendido e deve ser minuciosamente
limpo, aps cada utilizao, para remover qualquer vestgio de antibitico. O material deve
permanecer coberto quando no estiver em uso. Toda vidraria destinada ao trabalho com o
microrganismo deve ser esterilizada em estufa entre 200 graus centgrados e 220 graus
centgrados por perodo de 2 horas. Na diluio da soluo padro e amostra empregar frasco
volumtricos, pipetas ou equipamentos cuidadosamente calibrados.

V.5.2.17.1 ENSAIO MICROBIOLGICO POR DIFUSO EM GAR

Para cada antibitico relacionado na Tabela I, apresentada a seguir verificar o meio de
cultura (conforme a relao dos meios de cultura), a quantidade de meio a ser usada na camada
Vigilncia Sanitria Digital 198
base e na camada semeada e o microrganismo de ensaio. O volume de inculo a ser adicionado
a cada 100 ml de meio de cultura deve ser determinado experimentalmente. Entretanto, como
referncia inicial, sugere-se quantidade de inculo a ser adicionado por 100 ml de meio.
Preparar a camada base atravs da adio de quantidade apropriada de gar fundidos
nas placas de Petri, as quais devem ser especialmente selecionadas, Ter fundo plano, possuir
dimenses e 20 por 100 mm e tampa de material apropriado. Distribuir o gar uniformemente nas
placas, que devem ser colocadas em superfcie nivelada para assegurar que a camada de meio
tenha profundidade uniforme. Colocar a tampa de cada placa no lado dessa, se for utilizada
tampa no porosa, deix-la levemente entreaberta para evitar o acmulo de unidade condensada
a partir da camada de gar quente. Aps o endurecimento do gar, tampar as placas. Para
preparar a camada semeada superfcie adicionar o volume de inculo determinado para a
quantidade apropriada de meio de cultura que tenha sido fundido e resfriado entre 48 graus
centgrados e 50 graus centgrados. Agitar o frasco, por rotao, para obter suspenso
homognea e adicionar a quantidade indicada do meio inoculado em cada placa de Petri,
contendo a camada base no inoculada. Espalhar uniformemente a camada, tampar as placas e
permitir o seu endurecimento sobre superfcie plana. Aps o endurecimento do meio, colocar seis
cilindros de ao inoxidvel, com dimetro externo de 8 mm mais ou menos 0,1 mm, dimetro
interno de 6 mm mais ou menos 0,1 mm e comprimento de 10 mm mais ou menos 0,1 mm, sobre
a superfcie do gar inoculado, de maneira que forme entre si ngulo de 60 graus e com raio de
2,8 cm. Tambm podem ser utilizados cilindros confeccionados em vidro, porcelana ou alumnio e
esterilizados nas condies j descritas. Em lugar dos cilindros, podem ser perfurados, no meio
com furador estril, poos de 5 a 8 mm de dimetro. Podem, ainda, ser usados discos de papel,
confeccionados com papel de qualidade apropriada ou moldes de ao inoxidvel. Quando so
usados discos de papel, eles devem ser esterilizados, de ambos os lados, por meio de lmpada
de esterilizao.

Preparao da Soluo Padro de Trabalho e da Curva Padro

Para assegurar a validade do ensaio, usar pelo menos trs diferentes doses da
substncia que est sendo ensaiada, tendo presumida a mesma concentrao (atividade) que as
solues do padro de potncia conhecida.

As doses usadas na curva de dosagem devem estar em progresso geomtrica, por
exemplo, pela preparao de sries de distribuio na razo 2:1, uma vez que para o sistema
ensaiado existe relao linear entre o logaritmo da concentrao do antibitico e o dimetro da
zona de inibio.
A Tabela II, exemplo a seguir, indica para cada antibitico a preparao da soluo
padro e da curva padro.

Compreendendo:

a) condies de dessecao, conforme Dessecao de substncias antibiticas;
b) solvente inicial para dissoluo do antibitico, caso seja necessrio, e at qual
concentrao usado;
c) soluo para diluio at a concentrao de trabalho, conforme solues;
d) concentrao da soluo de trabalho, expressa em peso ou unidades Internacionais
por ml de soluo;
e) prazo de validade da soluo padro de trabalho sob refrigerao;
f) soluo empregada para diluio de trabalho, por ocasio da preparao da curva
padro, conforme solues e
g) faixas de concentrao sugeridas, em peso ou unidades Internacionais por ml, dentro
das quais podem ser encontradas as concentraes adequadas para a curva padro.

A preparao das amostras dos antibiticos est indicada na respectiva monografia.

Em ensaios de rotina, quando a linearidade do sistema foi comprovada em nmero
adequado de experimentos usando o ensaio de trs pontos . quando se emprega o delineamento
com mais de trs pontos, pode ser de dois pontos. Utilizar placas de 20 x 150 mm. Ser aceito,
igualmente, o delineamento 5 x 1, adotado oficialmente por outras Farmacopias de uso
Vigilncia Sanitria Digital 199
internacional corrente. Todavia, em caso de controvrsia ou litgio, devem ser aplicado o ensaio
de trs pontos.

... (Segue uma tabela publicada de forma ilegvel) ...

(1) Determinar a quantidade de inculo, na ocasio do ensaio

Procedimento

Empregar, o ensaio, pelo menos seis placas de Petri. Dispor as solues, em cada, de tal
forma que as solues do material de referncia e as da amostra estejam na camada inoculada e
que no estejam adjacentes concentrao mais alta do padro e da amostra para evitar a
sobreposio das zonas. Aplicar as solues nos cilindros por meio de pipeta que libere volume
uniforme de lquido. Quando for usado o sistema de poos, o volume de lquido aplicado deve ser
suficiente para ench-los completamente, e quando forem usados moldes de ao inoxidvel,
adicionar volume de 0,2 ml.
Incubar as placas na temperatura indicada, que no dever Ter variao superior a mais
ou menos 0,5 graus centgrados, durante perodo de 16 a 18 horas. Em seguida, medir o dimetro
das zonas de inibio, empregar dispositivo adequado para medida, como paqumetro, rgua
milimetrada ou projetar ptico.
Para alguns microrganismos, o procedimento pode ser melhorado se as placas
preparadas permanecerem temperatura ambiente por perodo de 30 minutos a 2 horas, durante
o qual ocorre a difuso do antibitico para o meio.

Clculo da Potncia

A partir dos resultado, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico padro, descrito na seo VI.5.

V.5.2.17.2. ENSAIO MICROBIOLGICO POR TURBIDIMETRIA

Inocular o meio de cultura recomendado para o ensaio com quantidade conhecida do
microrganismo sensvel ao antibitico, de modo que, aps incubao de aproximadamente quatro
horas, a turbidez bacteriana no meio seja de medida e mantenha correlao entre a dose e a
resposta da substncia em anlise.
A seguir, descrever-se-o os antibiolgicos a serem ensaiados pelo mtodo turbidimtrico
(Tabela III), com microrganismo, meio de cultura, volume de inculo padronizado sugerido como
referncia inicial e temperatura de incubao para cada caso.

Preparao da Soluo de Trabalho e da Curva Padro
Para assegurar a validade do ensaio a ser executado, empregar pelo menos trs doses
da preparao padro e da substncia que est sendo examinada, as quais devem ter,
presumidamente, a mesma concentrao que as solues do padro de potncia conhecidas. As
doses usadas devem estar em progresso logartmica.
A preparao das amostras dos antibiticos est indicada na respectiva monografia.
A tabela VI, apresentada a seguir, indica, para cada antibitico, a preparao da soluo
padro de trabalho e da curva padro, compreendendo:
a) Condio de dessecao, conforme Dessecao de substncias antibiticas;
b) Solvente inicial para dissoluo do antibitico, caso seja, necessrio, e at qual
concentrao usado;
c) Soluo para diluio do antibitico at a concentrao de trabalho, conforme
solues;
d) Concentrao de soluo de trabalho, expressa em peso ou Unidades Internacionais
por ml de soluo;
e) Prazo de validade da soluo padro de trabalho sob refrigerao;
f) Soluo empregada para diluio da soluo de trabalho, na ocasio da preparao
da curva padro, conforme soluo;
g) Faixa de concentrao, em peso ou Unidades Internacionais por ml, dentro da qual as
concentraes adequadas para a curva padro podem ser encontradas.

Vigilncia Sanitria Digital 200
A concentrao de referncia do meio a dose do meio ou a dose central da curva
padro.

* Pode ser necessrio realizar o ensaio com nmero maior de doses do padro e da
amostra ou repeti-lo e combinar os resultados para obter a preciso requerida.

Procedimento

Empregar para cada antibitico o microrganismo e o caldo nutritivo j relacionados.
Determinar experimentalmente o volume de inculo a ser adicionado a 100 ml de caldo a partir da
quantidade sugerida como referncia inicial. O meio inoculado deve ser preparado e utilizado
imediatamente.
Distribuir, em tubos idnticos, volume igual de cada uma das solues do padro e da
amostra, adicionar para cada tubo volume igual de caldo nutriente inoculado, por exemplo, 1 ml
de soluo com antibitico e 9 ml do meio (0,1 ml de soluo para gramicidina e tirotricina). Pelo
menos dezoito tubos so usado para ensaio por retas paralelas 3 x 3, trs tubos para cada
concentrao do padro e da amostra. O nmero de replicaes por concentrao em cada
ensaio deve ser suficiente para assegurar a preciso estatstica, especificada na monografia.
Incubar, em banho-maria, temperatura adequada, por 3 a 4 horas, tomando a precauo de
assegurar temperatura uniforme e tempo de incubao idntico para todos os tubos. O tempo
adequado deve ser verificado pela observao do crescimento no tubo contendo a concentrao
de referncia do ensaio. Aps o perodo de incubao, interromper a multiplicao dos
microrganismos pela adio de 0,5 ml de soluo de formaldedo, a 12 por cento, em cada tubo.
Determinar a absorvncia para cada tubo em fotocolormetro apropriado, no comprimento
de onda de 530 nm. Padronizar o aparelho em absorvncia zero atravs de branco contendo a
mesma quantidade de caldo nutriente e formaldedo, a 12 por cento, em cada tubo.


... (Segue a Tabela 2, publicada de forma ilegvel) ...

1 Diluir alquotas da soluo de trabalho com dimetilsulfoxida, para obter concentraes entre 10 e 40 mg por ml conforme
os pontos da curva padro
2 Diluir alquotas da soluo de trabalho com dimetilsulfoxida, para obter concentraes entre 10 e 40 unidades por ml
conforme os pontos da curva padro
3 Adicionar 2 ml de gua estril para cada 5 mg de padro
4 Diluir alquotas da soluo de trabalho com dimetilformemida, para obter concentrao entre 40 e 200 mg por ml
conforme os pontos da curva padro
5 Quando se empregar oritromicina sob a forma de estolato, hidrolisar a soluo do trabalho, em banho-maria, a 80 C,
durante 2 horas
6 Sidomicina e higroscpica, tomar precaues durante a pesagem. O padro do trabalho deve permanecer a 20 C, em
atmosfera de nitrognio
7 Preparar concomitantemente as solues do padro e amostra
8 A soluo padro de trabalho deve permanecer durante uma noite temperatura ambiente para completa dissoluo

... (Segue a Tabela 3, publicada de forma ilegvel) ...
... (Segue a Tabela 4, publicada de forma ilegvel) ...

Clculo da Potncia

A partir dos resultados, calcular a potncia da substncia que est sendo examinada e
seus limites de confiana, atravs de mtodo estatstico descrito na seo VI.5.

VI. PROCEDIMENTOS ESTATSTICOS
APLICVEIS AOS ENSAIOS BIOLGICOS

VI.1. GLOSSRIO DE SMBOLOS

Todos os logaritmos desta seco so em base 10.

SMBOLO DEFINIO
A1 ... Z1 .......................... doses das preparaes ensaiadas (amostras) A ....Z
B ..................................... estimativa da inclinao da linha de regresso da resposta em relao
ao logaritmo da dose baseada em todas as preparaes do ensaio
Vigilncia Sanitria Digital 201
b1 .................................... nmero de blocos (animal) num ensaio cruzado
c ..................................... constante usada na avaliao dos limites de confiana (Tabela 15)
d ...................................... nmero de nveis de doses para cada preparao num ensaio
balanceado
gl ..................................... graus de liberdade
h ...................................... nmero de preparaes em um ensaio, incluindo a preparao padro
k ...................................... nmero de tratamento diferentes dentro de um ensaio k = dh
n ...................................... nmero de rplicas para cada tratamento
n ..................................... nmero de estimativas individuais da potncia
p ...................................... probabilidade
p1p2p3 ............................ doses menor, mdia e maior da preparao padro p em ensaios com
somente dois nveis de doses, p2 representa a dose maior
S
2
.................................... estimativa da varincia fornecida pelo quadrado mdio do erro na
anlise de varincia. Tambm usado com uma letra ndice, por exemplo,
S
2
M
representa a varincia do log potncia M
S ..................................... estimativa do desvio padro, ou seja, a raiz quadrada de S
2

T ..................................... estatstico de Student (Tabela 3)
t ..................................... estatstico de Dunnett (Tabela 12)
v ...................................... varincia para heterogeneidade entre ensaios
w ..................................... coeficiente de ponderao
x ...................................... log dose tambm usado com ndice para indicar uma preparao
particular
x ...................................... mdia dos log dose
y ...................................... resposta individual ou resposta individual 1 transformada
y ..................................... resposta calculada para substituir um valor perdido
y
P
...y
Z
............................ mdia das respostas para as preparaes padro e amostra
A...Z ................................ amostras ensaiadas
A...Z ................................ soma das respostas para as amostras A...Z
A1,A2,A3 ........................ soma das respostas para as doses menor, mdia e maior da amostra A .
Para um ensaio com dois nveis de doses, A2 representa a resposta
para dose maior. Similarmente para outras amostras ensaiadas
B1...B2n .......................... soma das respostas para cada sujeito (1 a 2n) em ensaio duplo cruzado
total incompleto das respostas em fila ou bloco que tem um valor
perdido.
........................................ estatstico usado no clculo dos limites de confiana (frmula 14) Mede
a preciso da inclinao
C1...Cn ........................... soma de respostas em cada coluna (1 a n) em delineamento quadrado
latino
C .................................... soma incompleta das respostas em uma coluna de delineamento em
quadrado latino com um valor perdido
x
2
..................................... constante estatstica da Tabela 18
x
2
M .................................. constante estatstica para testar homogeneidade de estimativas
individuais de logaritmo da potncia
E ..................................... soma de quadrados para regresso (Tabela 10)
F ..................................... razo de duas estimativas da varincia independentes (Tabela 4 e 45)
FI, FII .............................. soma das respostas na fase ou fase II num ensaio cruzado
F1...Fn ............................ soma das respostas em cada uma das filas 1 a n em delineamento de
quadrado latino, ou em cada bloco de um delineamento em blocos ao
acaso
G1, G2, G3 ..................... estatstico usado no teste de valores aberrantes
G total incompleto das respostas em um ensaio com excluso do valor perdido
I ....................................... intervalo entre log doses consecutivas
K ..................................... termo de correo usado na anlise da varincia k = (Ey)
2
/n
L ...................................... intervalo de confiana em logaritmos
Lc .................................... intervalo de confiana em logaritmos para mdia semi-ponderada
Lp...Lz ............................. contrastes lineares para as preparaes padro e amostra (Tabela 8 e
9)
M ..................................... estimativa do log da potncia ou do log da razo de potncia usada com
uma letra ndice em um ensaio mltiplo, para denotar uma preparao
particular (M=logR)
Vigilncia Sanitria Digital 202
Mi, Ms ............................. limites de confiana da estimativa do log da potncia
M ..................................... mdia de varia estimativas independentes de M
M .................................... estimativa do log da potncia da amostra A ou do log da razo de
potncias antes de corrigir pela potncia suposta (M=log R)
Ms, Mi ........................... limites superior e inferior da estimativa do log potncia, antes de corrigir
pela potncia suposta
N ..................................... nmero total de respostas no ensaio
Np,Na ............................. nmero total de respostas para as preparaes P e A
p ...................................... preparao padro
P ..................................... soma das respostas para a preparao padro
P1,P2,P3 ........................ soma das respostas para as doses inferior, mdia e superior da
preparao padro P. Para ensaio de somente dois nveis, de dosagem,
P2 representa as respostas para a dose maior
Q ..................................... soma de quadrados quadrtica. A partir da anlise da varincia (Tabelas
9 e 10)
Qp...Qz ........................... contraste quadrtico para as preparaes padro e amostra (Tabela 9)
R ..................................... estimativa da potncia da amostra
Ri,Rs ............................... limites de confiana inferior e superior da estimativa de potncia
R .................................... estimativa da razo de potncia antes da correo pela potncia
suposta (R = antilog M)
R+ ................................... constante especfica para testar valores aberrantes (Tabela 2)
SA ................................... potncia suposta a amostra A, quando se prepara as doses
T ..................................... total incompleto das respostas para um tratamento excluindo o valor
perdido
V=1/W ............................. varincia do logaritmo de potncia individual
W .................................... ponderao estatstica usada na combinao de vrias estimativas,
independentes do log potncia
W ................................... semi-ponderao de cada logaritmo numa srie de ensaio

VI.2. FUNDAMENTOS
Ensaios biolgicos

So procedimentos destinados a avaliar a potncia dos princpios ativos contidos nas
matrias-primas e preparaes farmacopicas, utilizando reagente biolgicos tais como
microrganismos, animais, fluidos e rgos isolados de animais. A caracterstica dos reativos
biolgicos sua variabilidade. Enquanto os reativos fsico-qumicos podem ser definidos e
padronizados para fornecerem resultados idnticos em todos os laboratrios, impossvel definir
totalmente os reagentes biolgicos, apesar dos esforos de entidades internacionais neste
sentido. Essa viabilidade inerente aos reativos biolgicos torna imprescindvel: 1) o emprego de
padres de referncia adequados para se obter potncias relativas e 2) o emprego de mtodos
estatsticos para os delineamentos experimentais e anlise dos resultados.

Delineamentos experimentais

O delineamento de um ensaio compreende: a) seleo do conjunto de doses do padro
(P) e das amostras do desconhecido (A) que sero ensaiados, b) especificao das unidades
experimentais (animais, microrganismos, anti-soros, sangue etc.), c) regras pelas quais se
distribuiro as doses para as unidades experimentais, d) especificaes das medidas ou outros
registros que devam ser procedidos em cada unidade experimental. O melhor delineamento
experimental aquele que produz a informao desejada com a maior eficincia.
Por dificuldades prticas. Pode ser possvel alcanar este objetivo. Portanto, para cada
ensaio podem-se empregar diferentes delineamentos experimentais, de acordo com a
disponibilidade de pessoal, reagentes e tempo. Todos os delineamentos que forneam ensaios
vlidos e de preciso adequada, como resultado final, so cientificamente aceitveis. Alm disso,
devem compreender algum sistema que assegure distribuio ao acaso das unidades
experimentais para as diversas doses utilizadas.

Acaso e vcio

Vigilncia Sanitria Digital 203
Deve-se fazer distribuio ao acaso utilizando aparelho empregado em jogos de azar ou
tabela de nmero aleatrios. Convm assinalar que este procedimento no elimina todos os
vcios, por exemplo, por efeito do acaso, os animais de maior peso podero ser destinados a
determinada dose e esta diferena de peso viciar os resultados. Portanto, dever ser criado o
equilbrio, ou seja, deve-se classificar os animais por faixa de peso e distribuir, ao acaso, aqueles
de mesmo peso para todas as doses e preparaes (padro e amostra).

Anlise estatstica

procedimento matemtico aplicado aos resultados experimentais para estimar a
potncia da amostra e avaliar a validade e preciso de ensaio. Os mtodos de anlise se
relacionam com os delineamentos experimentais utilizados.

Resultados

Expressar os resultados de avaliao biolgica como estimativa da potncia relativa, que
ser a melhor expresso da verdade potncia relativa (P), impossvel de ser calculada com
certeza, devido variabilidade dos reativos biolgicos. Tal estimativa da potncia relativa deve
ser acompanhada por limites de confiana inferior e superior (Ri,Rs). Estes limites definem o
intervalo de modo que seja pr-determinada a probabilidade (p) de a verdadeira potncia relativa
(p) estar fora deste intervalo. As probabilidades de erro mais utilizadas nos ensaios biolgicos so
p=5% e p=1%, tambm expressas como p=0,05 e p=0,01. As monografias estabelecem
especificaes para a amplitude aceitvel desses intervalos em relao potncia estimada.
Estas especificaes levam em conta a dificuldade dos mtodos e a necessidade prtica de se
estimar a verdadeira potncia com determinada preciso. Nos casos no especificados
explicitamente entender-se- que a probabilidade de erro utilizada no clculo dos limites p=0,05.
Para alcanar os limites de confiana especificados deve-se, s vezes, realizar mais de um
ensaio. Para se obter uma estimativa da potncia com intervalo de confiana reduzido, deve-se
combinar estatisticamente os resultados destes ensaios independentemente.
Os procedimentos de clculo so planejados para o ensaio de amostra nica. No caso de
serem ensaiadas vrias amostras simultaneamente, empregar as modificaes descritas neste
volume.

VI.3. VALORE ABERRANTES

Toda as respostas obtidas sem obter estritamente o protocolo pr-estabelecido devem ser
eliminadas. Quando, aps tabular as demais respostas, se observarem valores aparentemente
aberrantes, a deciso de mant-los ou elimin-los deve basear-se em critrios estatsticos, como
os descritos a seguir:
1.)

Critrio baseado na variao dentro de um nico grupo de respostas supostamente
equivalentes. Em mdia, para relativamente poucas respostas idnticas dentro do grupo, sero
desprezadas observaes vlidas em 2 ou 4% das provas. Comeando com o valor
supostamente aberrante, indicar as respostas em ordem de magnitude de y1 a yn, onde n
representa o nmero de observaes do grupo.

Calcular

G1 = (y2-y1)/(yN-y1), quando N = 3 a 7
G2 = (y3-y1)/(yN-1-y1), quando N = B a 13 ou
G3 = (y3-y1)/(yN-2-y1), quando N = 14 a 24,

Se G1, G2 ou G3 excedem o valor crtico dado pela Tabela 1 para o valor correspondente
de N, existe base estatstica para eliminao do valor suspeito.
2.) Critrio que contempla a amplitude de uma srie k = 2 ou mais grupos de igual
tamanho. Os grupos podem receber diferentes tratamentos, porm, todas as n respostas dentro
de cada grupo decorrem do mesmo tratamento. Calcular os intervalos em cada um dos k grupos,
subtraindo a resposta menor da maior. Dividir o maior dos k intervalos pela soma de todos eles.
Comparar este valor (R+) com a Tabela 2. Se k for menor ou igual a 10, usar os valores tabulados
na parte superior da tabela, se maior, multiplicar R+ por (K+2) e interpolar, se necessrio, entre os
valores tabulados na parte inferior da mesma. Se R+ exceder o valor tabulado ou interpolado, o
Vigilncia Sanitria Digital 204
grupo com intervalo maior suspeito (p=0,05) e a observao de seus dados permitir identificar
o valor que, ento, se considera aberrante. O procedimento pode ser respeitado com os demais
intervalos se houver suspeita de valor aberrante em um segundo grupo.

VI.4 ENSAIOS DIRETOS

Mede-se diretamente as doses de cada preparao (padro e amostra) necessrias para
produzir respostas pr-determinadas em cada unidade experimental de dois grupos equivalentes
de animais ou outros relativos biolgicos. Exemplo tpico o ensaio biolgico de digital. Preparar
as solues do padro e amostra de modo que contenham aproximadamente a mesma potncia,
levando em considerao a atividade declarada da amostra ou a estimada em ensaios
prvios(S
A
).
Transformar cada resultado (dose eficaz) em logaritmos (X) e calcular os valores mdios
dos logaritmos das doses eficazes para o padro (XP) e para a amostra (XA). Calcular a potncia
relativa da amostra (R), antes de ajustar pela potncia suposta, como o antilogaritmo de M, em
que:
M= XP - XA (1)
Calcular a varincia de M como a soma das varincias das duas mdias, a partir da equao




(2)
em que





(3)
N
P
e NA so os nmeros de animais tratados com padro e amostra; E
P
e E
A
representam
somatrios dos resultados calculados para as duas preparaes. Calcular os limites de confiana
como:
R
S

= antilog (M + ou TsM)
R
i

Obter o valor apropriado de t na Tabela 3, de acordo com os graus de liberdade (g) dados
denominados da equao (3).
Calcular a potncia relativa da amostra e os limites de confiana, levando em
considerao a potncia suposta da amostra (SA) utilizada para preparar as diluies:
R = antilog M (5)
em que
M = M+ log SA (6)
Com limites de confiana
R
S

= antilog [ M = ou ts
M
] (7)
R
i

Neste ensaio, SM igual a SM
Para que o ensaio seja vlido, a varincia de xp deve ser a mesma xa, diferindo somente
por erros de amostragem. Para testar, calcular as varincias e dividir a maior pela menor. Deste
modo, obtm-se uma relao de varincias (F).
Calcular a varincia de xp do seguinte modo:




(8)
Calcular analogamente
S
2

XA (8a)



Vigilncia Sanitria Digital 205
A distribuio da razo de varincias (F) encontra-se nas Tabelas 4 e 5, porm para este
teste os valores da Tabela 4 correspondem a R=0,10 e os da Tabela 5 a p+0,02. O valor do
ensaio no deve ultrapassar o valor da Tabela, correspondente aos graus de liberdade do
numerador e denominador com que se obteve F. os graus de liberdade so aqueles dos
denominadores das varincias das equaes (8) e (8a).

VI.5 ENSAIOS INDIRETOS QUANTITATIVOS

Natureza e validade

Em geral no possvel medir diretamente a dose eficaz. Por essa razo, a potncia
determinada indiretamente, comparando as respostas produzidas em escala quantitativa ex.:
peso, por doses conhecidas do padro com aquelas produzidas por uma ou mais doses de
amostra.
Num intervalo restrito de doses, as respostas ou sua transformao conveniente
(logaritmo, probito etc.) apresentam relao linear com o logaritmo das doses correspondentes.
Usar dois ou mais nveis de doses do padro ou, preferencialmente, do padro e amostra para
determinar a posio e a inclinao da reta. Proceder em cada ensaio desta maneira, pois,
dependendo da sensibilidade dos reativos biolgicos utilizados, pode variar tanto a posio
quanto a inclinao da reta.
Cada tratamento consiste de uma dose fixa do padro (p1, p2, p3 etc.) ou da amostra (a1,
a2, a3 etc.) e administrado a um certo nmero (n) de unidades experimentais (animais, rgos,
cultura, tubos etc.). Registrar n respostas, ou seja, uma para cada unidade experimental. Para
que nos mtodos apresentados neste captulo sejam vlidos, devem-se cumprir as seguintes
condies:
1) as unidades experimentais correspondentes a cada tratamento devem ser
selecionadas ao acaso;
2) para cada tratamento, as respostas ou a transformao das mesmas usadas no
clculo (y) constituem amostra de distribuio normal;
3) o desvio padro da resposta ou de sua transformao independente do nvel de
resposta, ou seja, igual para todos os tratamentos, s diferindo pelos erros da amostragem;
4) a resposta, ou sua transformao utilizada nos clculos (y), tem relao linear com o
logaritmo da dose (x) no intervalo de doses utilizadas;
5) a linha reta correspondente a uma ou mais amostras deve ser paralela do padro.

A partir de estudos preliminares do mtodo de ensaio, possvel supor o cumprimento
das condies 2 e 3. De posse dos resultados de cada ensaio pode-se testar as condies 4 e 5.
A condio 4 (linearidade) s pode ser verificada em ensaios em que se aplicam pelo menos trs
diluies de cada preparao. Quando se realiza ensaio com somente duas diluies, presume-
se que a linearidade do sistema foi previamente estabelecida. A condio 5(paralelismo) deve ser
testada em cada ensaio. Neste, nunca se devem utilizar menos de duas diluies de cada
preparao.
Se no for cumprida qualquer das condies de 1 a 5, os mtodos de clculo descritos
neste captulo no so confiveis e tornam-se necessrios estudos para estabelecer as iluses
corretas.
conveniente que a amostra seja ensaiada com doses cujas respostas sejam
aproximadamente iguais quelas obtidas com as correspondentes doses do padro. Isto aumenta
a preciso do resultado. Denominar a potncia suposta para a amostra SA.

Expresso de potncia e restries

Realizando os testes de validade correspondentes e sendo satisfatrios os resultados,
pode-se expressar a potncia relativa de cada amostra em relao ao padro com uma razo de
potncias ou converter em unidades apropriadas para cada amostra, por exemplo unidades
Internacionais, nacionais, unidades de peso etc. Tambm podem-se calcular os limites de
confiana a partir do conjunto de dados obtidos no ensaio.
Para simplificar os clculos da anlise estatstica apresentados neste captulo,
necessrio impor as seguintes restries ao delineamento dos ensaios:
Vigilncia Sanitria Digital 206
a) testar cada preparao, padro e amostra, com o mesmo nmero de distribuies.
Apresentam-se frmulas para ensaios farmacopticos, utilizando dois e trs nveis de doses para
cada preparao;
b) manter constante em cada ensaio a razo de doses consecutivas para todos os
tratamentos e
c) obter o mesmo nmero de respostas para cada tratamento.

Caso alguma resposta for perdida, esta pode ser estimada pelos mtodos apropriados a
cada delineamento apresentados neste captulo, e se se perder um tratamento, atender ao
especificado na seo de ensaios parcialmente balanceados.

VI. 5.1. TIPOS DE DELINEAMENTO

Ao acaso

Quando as unidades experimentais forem, na totalidade, razoavelmente homogneas e
no houver indicao de que a variabilidade da resposta poder ser menor em certos subgrupos,
proceder distribuio das unidades experimentais para os diferentes tratamentos ao acaso.
Havendo possibilidade de alguns subgrupos como, por exemplo, camadas, posies em
estantes ou dias de experimento, serem mais homogneos que a totalidade das unidades, a
preciso do ensaio pode ser aumentada introduzindo-se uma ou mais restries no delineamento
experimental.

Blocos ao acaso

Possibilita segregar uma fonte de variao tal como a sensibilidade de diferentes
ninhadas de animais ou a variao entre as placas de Petri no ensaio microbiolgico por difuso.
Este planejamento obriga que cada tratamento seja aplicado uma vez em cada bloco (ninhada,
placa etc.) e s pode ser realizado quando o bloco for suficientemente grande para comandar
todos os tratamentos.

Cruzado

Utilizar este planejamento quando o experimento puder ser dividido em blocos. Contudo,
s possvel aplicar dois tratamentos por bloco. Por exemplo, um bloco pode ser um animal
possvel de ser testado em duas ocasies diferentes. Tem como objetivo aumentar a preciso,
eliminando a influncia da variao dos animais, ao mesmo tempo que se equilibram os efeitos de
qualquer diferena entre os nveis gerais de resposta, nas duas etapas do ensaio. Determinar
duplo cruzado o ensaio com duas doses do padro e da amostra, e triplo cruzado aquele de trs
doses de cada preparao. Proceder o ensaio em, duas fases conforme o perodo de tempo
definido no mtodo. Dividir os animais em quatro ou seis grupos e realizar um tratamento em
cada grupo na primeira fase. Na Segunda fases, os animais que receberam uma preparao
recebero outra, os animais que receberam doses menores, nesta etapa recebero as maiores.
Seguir o esquema da Tabela 6.

Quadrado latino

Adequado quando a resposta pode ser afetada por duas fontes de variao, cada qual
podendo Ter k nveis diferentes. Por exemplo, se se realiza o experimento k dias diferentes e por
k experimentadores, ou se realiza um ensaio de antibiticos por difuso em placas, no qual os
tratamentos podem ser aplicados num esquema de k.k, onde cada tratamento s ocorre uma vez
em cada coluna. Utilizar somente quando o nmero de colunas, filas e tratamentos for igual.
As respostas so registradas em forma de um quadrados denominado latino. Existem
muitas possibilidades de quadrados latinos encontradas na literatura especializada. A partir de um
pode-se confeccionar outros, alternando ao acaso filas e/ou colunas. A Tabela 7 apresenta
exemplo da atmosfera.
Para qualquer delineamento, a distribuio das unidades experimentais nos blocos deve
ser por procedimento ao acaso, sendo as unidades mantidas o mais uniformemente possvel
antes e durante o experimento.

Vigilncia Sanitria Digital 207
VI.5.2. ANLISE DE VARINCIA

Tem por objetivo estudar a validade do ensaio e calcular o erro residual. Com exceo do
clculo do erro residual, a anlise dos dados de um ensaio idntica para os delineamentos ao
acaso, blocos ao acaso e quadrado latino. A seguir, sero descritas as frmulas para a anlise de
cada tipo de ensaio. Consultar o glossrio de smbolos. As frmulas so apropriadas para o caso
em que se esteja comparando uma nica amostra (A) contra o padro de referncia (P), como
tambm para o caso de ensaios mltiplos onde estejam includas h-1 amostras (A...Z). As
frmulas para os ensaios cruzados no se enquadram no esquema geral e sero apresentadas
separadamente.
Se necessrio, transformar as respostas (y) para cumprir as condies de validade
descritas. Somar todos os valores y para cada tratamento e para cada preparao, como se
observa nas Tabelas 8 e 9. A partir destes dados, obter os contrastes lineares relacionados com
as inclinaes das linhas dose-resposta.
Quando so ensaiadas trs doses de cada preparao se obtm tambm contrastes
quadrticos, que representam a curvatura das linhas.
Ver frmulas nas Tabelas 8 e 9.
A variao total de respostas decorrentes dos diferentes ... (ilegvel) se mostra na Tabela
10. As somas de quadrados so obtidas a partir dos valores das Tabelas 8 ou 9. K representa o
quadrado da soma de todas as respostas obtidas no ensaio dividido pelo nmero total das
mesmas:
K = {(Ey)
2
/N}
Calcular o erro residual do ensaio subtraindo as variaes controladas no delineamento
da variao total nas respostas (Tabela 11). Nesta tabela, Ey
2
representa a soma dos quadrados
de todas as respostas registradas no ensaio. Convm assinalar que a soma de quadrados reduza
correspondente ao item tratamentos igual ao somatrio das somas de quadrados reduzidas da
Tabela 10 e que, para o quadrado latino, o nmero de respostas replicadas (n) igual ao nmero
de filas, colunas ou tratamentos (k).

VI.5.3. TESTES DE VALIDADE

Para ensaiar a significncia das fontes de variao relacionadas na Tabela 10, cada soma
de quadrados reduzida obtida na tabela deve ser dividida pelo nmero correspondentes de graus
de liberdade para se obter os quadrados mdios. O quadrado mdio do erro residual (s
2
)
quociente similar, obtido da linha apropriada na Tabela 11.
Para obter a razo conhecida como F, dividir o quadrado mdio de cada fonte de variao
a ser testada por s
2
. Calcular a significncia de cada fonte, utilizando as Tabelas 4 e 5 em que se
encontram valores de F crticos para probabilidade de erro de 5% (p=0,05) e 1% (p=0,01). Os
valores de F crticos so obtidos na coluna correspondente ao nmero de graus de liberdade
associado ao quadrado mdio da fonte ensaiada (gl
1
) e na fila da tabela correspondente ao
nmero de graus de liberdade associado com s
2
(gl
2
). Se o valor de F calculado for maior que o
valor tabulado, a fonte de variao ensaiada considerada significativa para o nvel de
probabilidade utilizada.
Considerar os ensaios estatisticamente vlidos se os testes apresentarem os seguintes
resultados:
1) Regresso significativa, ou seja, F calculado maior que o tabulado para uma
probabilidade p=0,01. Indica que a inclinao da linha dose-resposta satisfatria;
2) Termos quadrticos no significativos, ou seja, os valores de F calculados devem ser
menores que aqueles tabulados para p=0,05. Equivale a satisfazer a condio de linearidade da
relao entre a transformao da resposta utilizada e o logaritmo da dose;
3) Paralelismo no significativo. Caso se estejam ensaiando vrias amostras
simultaneamente e se obtenha um desvio significativo do paralelismo, isto pode ser devido
utilizao de alguma preparao que forneceu linha dose-resposta com uma inclinao diferente
em relao s outras amostras. Neste caso, calcular o valor de t para cada preparao A...Z ,
usando a equao.

Lp L
A

t = ------------------------
2 s \ n
Vigilncia Sanitria Digital 208
Cada t` calculado deve ser comparado com o valor da Tabela 12, onde gl
1
=h-1 e gl
2

igual ao nmero de graus de liberdade associado com s2. Se encontrar valor de t` significativo
para algumas amostras, todos os dados relativos a esta preparao devem ser eliminados do
ensaio e a anlise repetida desde o incio.
Em ensaios com erro residual muito grande, uma razo F significativa para o termo
preparaes pode indicar que a suposio de potncia que serviu de base para a preparao das
diluies no foi correta. Isto no condio de invalidade. Chegando-se a essa concluso, a
potncia estimada no ensaio pode ser usada como potncia suposta em ensaios posteriores.
Nos testes de paralelismo e quadrticos podem ocorrer por acaso valores de F muito
baixos, menores que l. Se isto acontecer repetidamente, pode ser indicao de que no se
cumpriram as condies supostas, a que deve ser investigado mais profundamente.
No caso de ensaios cruzados, com esquema de clculo especial, as frmulas a utilizar
encontram-se nas Tabelas 13 e 14.
Existem trs termos de interaes devidos s rplicas dentro de cada grupo fases x
preparaes, fases x regresso e fases x paralelismo.
Como nos delineamento anteriormente discutidos, cada soma de quadrados reduzida
deve ser dividida pelo nmero correspondente de graus de liberdade para se obter os quadrados
mdios. No caso do delineamento duplo cruzado, obtm-se dois quadrados mdios
correspondentes aos erros I e II, que se denominam s
2
I
e s
2
II

Dividir o quadrado mdio de cada fonte de variao pelo s
2
apropriado para se obter a
razo F.
Para as fontes paralelismo, fases x preparaes, fases x regresso, utiliza-se s
2
I
. Para as
outras fontes, utiliza-se s
2
II
.
Calcular a significncia da fonte utilizando as Tabelas 4 e 5. Se o F calculado for maior
que o valor tabulado, para os graus de liberdade da fonte ensaiada (gl ) e do s
2
correspondente
(gl
2
), a fonte de variao considerada significativa para o nvel de probabilidade utilizada
(p=0,05 ou p=0,01).
Para que o ensaio seja vlido, a regresso deve ser significativa e o paralelismo e as trs
interaes no devem ser significativas.
No ensaio cruzado, o teste de paralelismo no muito sensvel, pois depende da variao
entre blocos (animais).
Estabelecida a validade estatstica dos ensaios feitos com qualquer delineamento,
calcular a potncia e os limites de confiana pelos mtodos descritos a seguir.

VI.5.4. ESTIMATIVA DA POTNCIA E LIMITES DE CONFIANA

Calcular primeiro a resposta mdia para cada preparao (y
P
, y
A
...yZ)
P
y
P
= ------------ (10)
N
P

e analogamente para outras preparaes.
Chamado I o intervalo entre log doses consecutiva de cada preparasso nos ensaios com
duas doses de cada preparao obtm-se a inclinao comum(b), a partir da equao
L
P
+ L
A
+ ... LZ
b = --------------------------- (11)
Inh
Para ensaio com trs doses de cada preparao, o denominador Inh deve ser substitudo
por 2 Inh.
O logaritmo da razo de potncia da amostra A (M
A
), antes de corrigir pelo valor de SA,
y
A
- y
P

M
A
= --------------- (12)
b
A potncia calculada estimativa da verdadeira potncia de cada amostra. Os limites de
confiana (com 5% de probabilidade de excluir a verdadeira potncia) podem ser calculados
como o antilogaritimo da frmula






Vigilncia Sanitria Digital 209
(13)

em que
C = E/ (E s
2
t
2
) (14)
Obter E da Tabela 10. O s
2
erro residual da Tabela 11 dividido por seus graus de
liberdade e t se encontra na Tabela 3 de acordo com os graus de liberdade de s
2
.
Para ensaios balanceados de 2 e 3 doses por preparao, a frmula para os limites da
equao 13 pode simplificar-se:







(15)

em que c coeficiente obtido na Tabela 15 e C, medida da significncia da regresso. Em ensaio
com inclinao bem definida o valor de C estar muito prximo da unidade.
Obter a razo de potncia (R
A
) e os limites de confiana (R
S
, R
i
) tomando os
antilogaritimos dos valores obtidos a partir das frmulas 12 e 15, aps somas log AS a ambos:
M
A
= M
A
+ log
SA
(16)
R
A
= antilog M
A
(17)
M
As
= M
As
+ log
SA
(18)
M
Ai
= M
Ai
+ log
AS
(19)
R
AS
= antilog M
As
R
Ai
= antilog M
Ai

Valores perdidos:

Em ensaio balanceado requer-se o nmero de observaes em cada total. Se alguma
resposta, for perdida por causa no relacionada com os tratamentos aplicados, como a morte de
um animal ou quebra de algum tubo de ensaio, a anlise estatstica torna-se muito mais
complexa. Pode-se restabelecer o equilbrio de dois modos:
1) Reduzir o nmero de observaes nos grupos maiores at que o nmero de
respostas sejam o mesmo para cada tratamento. Se o delineamento for totalmente ao acaso,
pode-se subtrair a mdia de cada grupo maior, tantas vezes quantas forem necessrias, ou
eliminar uma ou mais respostas de cada grupo maior, selecionando-as ao acaso. Para ensaio de
blocos completos;
2) Alternativamente, um grupo casualmente menor pode ser recomposto no tamanho
original, quando o nmero de respostas perdidas no for maior que um em qualquer tratamento
ou 5% no total do ensaio. Neste caso, calcular a substituio do valor perdido. Perde-se um grau
de liberdade na varincia de erro s
2
para cada valor substitudo.
a) Se o delineamento totalmente ao acaso, substituir o valor perdido pela mdia das
respostas restantes do grupo incompleto;
b) Se o delineamento de blocos ao acaso, substituir o valor perdido aplicando a frmula
nB + kT - G
y = ------------------------- (20)
(n 1) (k 1)
em que B total incompleto das respostas no bloco que contm o valor perdido, T o
correspondente total incompleto do tratamento que tem o valor perdido, G a soma de todas as
respostas registradas no ensaio. Conforme definiu anteriormente, n o nmero de blocos e k o
nmero de tratamentos ou doses;
c) Se o ensaio estiver baseado em delineamento de quadrado latino, o valor perdido (y)
se obtm da equao
k (B + C + T ) - 2 G
y = ----------------------------------- (21)
(k-1)(k-2)
em que B e C so as somas das respostas nas filas e colunas, respectivamente, que contm o
valor perdido. Neste caso, k=n.
Se houver perda de mais do que um valor, substituir temporariamente, pela mdia do
tratamento respectivo, todos os lugares vazios, exceto um. Completar este lugar com valor y,

Vigilncia Sanitria Digital 210
calculando pela equao 21. Substituir um por um os valores que haviam sido colocados
temporariamente, usando o valor calculado com a equao 21. O processo se repete desde o
incio (2
o
ciclo) e assim sucessivamente, at se obter, em dois ciclos consecutivos de clculo,
conjunto estvel de valores y para todas as observaes perdidas.
Se o nmero de valores substitudos for pequeno em relao ao nmero total de
observaes do ensaio (menor que 5%), a aproximao decorrente das substituies descritas e
da reduo dos graus de liberdade, equivalente ao nmero de valores substitudos , geralmente,
satisfatria. Porm, a anlise deve ser interpretada com cuidado, sobretudo se existe
predominncia de valores perdidos em um tratamento ou bloco particular. O mesmo vlido para
o caso de valores perdidos nos planejamentos cruzados.

Ensaios particularmente balanceados

Se a potncia presumida das amostras (usada para calcular as doses de ensaio) for muito
diferente da verdadeira potncia, possvel que a doses maior fornea resposta mxima ou que a
doses menor fornea resposta muito baixa ou nula. Estas respostas estaro fora da zona linear
da curva log doses-resposta e os testes de validade indicaro curvatura e/ou desvio de
paralelismo significativo.
Neste caso, as respostas dose maior ou menor da amostra podem ser desprezadas,
calculando-se um valor de potncia relativa a partir dos dados remanescente. Esta potncia pode
ser tomada como potncia suposta para selecionar doses de amostra para outro ensaio, com o
objetivo de se obterem respostas similares ao padro e, deste modo, aumentar a preciso do
resultado. A equao que se emprega para calcular a potncia :

y
A
- y
P

M
A
= -
b
1 ou - (22)

Esta frmula similar frmula 12, porm subtrai-se a metade do intervalo log-dose
quando se omitirem as respostas da dose menor e adiciona-se o mesmo intervalo quando se
desprezar a dose maior. _ _
As respostas mdias yA e yP so obtidas da mesma forma que nos ensaios totalmente
balanceados (frmula 10), porm deve-se introduzir modificao no clculo da inclinao (b) de
acordo com delineamento do ensaio.
Para ensaios mltiplos, que originariamente teriam duas doses de cada preparao, os
contrastes lineares (L
P
...L
Z
) devem se formar excluindo L
A
(como as respostas para a1 ou a2
foram Eliminadas, no possvel formar um contraste L
A
). Calcular a inclinao a partir da mdia
dos valores de L dividida po In:

L
P
+ ... L
Z

b 1 = ------------------- (23)
In (h - 1)
Para ensaio simples com um amostra:
L
P

b = -------- (24)
In
Para ensaios mltiplos com trs doses de cada preparao, obter L
A
da Tabela 8 e todos
os outros contrates da Tabela 9. A equao para a inclinao :
2 (L
P
+ ... + L
Z
) + L
A

b = ------------------------------- (25)
In (4h 3)
Se existir uma nica amostra, a equao se reduz a :
2 L
P
= L
A

b = ----------------- (26)
5 In

VI.6. MDIAS MVEIS

No caso particular do ensaio biolgico da heparina, o intervalo entre a dose que permite a
coagulao e aquela que a inibe to pequeno que a curva dose-resposta no pode ser
Vigilncia Sanitria Digital 211
determinada explicitamente. Para interpolar o logaritmo da dose correspondente a 50% da
coagulao, tanto para o padro quanto para a amostra, utilizam-se as mdias mveis.

Clculo da potncia

Transformar em logaritmo os volumes da preparao padro usados em 5 ou 6 tubos que
constituem a srie, de modo que 2 ou 3 tubos apresentem grau de coagulao iguais ou menores
que 0,5 e 2 ou 3 tubos tenham graus iguais ou maiores que 0,5.
Confeccionar tabela correlacionando os tubos numerados consecutivamente com o grau
de coagulao observado.
Denominar x os logaritmos dos volumes utilizados e y os graus de coagulao
correspondentes. Calcular as mdias emparelhadas x e y
i i
dos tubos 1, 2 e 3, dos tubos 2, 3 e 4 e, dos tubos 3,4 e 5 e, quando a srie consistir de 6 tubos,
dos tubos 4, 5 e 6, respectivamente. Se para um destes pares de mdias o grau de coagulao
mdio y
i
exatamente 0,50, o correspondente x a mediana do logaritmo do volume da preparao padro
x. Caso isto no ocorra, interpolar o x a
p
partir dos valores emparelhados de y
i
, x
i
e y
i
+ 1, x
i
+ 1 que ocorram

imediatamente abaixo e acima do grau 0,5, como:
x
p
= x
i
+ (y
i
0,5) (x
i+ 1
x
i
>>>/(y
i
-y
i+1
) (27)

A partir dos dados emparelhados obtidos nos tubos da amostra, calcular do mesmo modo
a mediana do logaritmo do volume x. O
A
logaritmo da potncia da amostra :
M
A
=x
p
-x
A
+ log S
A
(28)

em que S
A
a suposio da potncia da amostra feita na preparao da

soluo correspondente dos tubos da amostra.
Repetir o ensaio independentemente e calcular a mdia de dois ou mais valores de M
para obter M. Caso a Segunda determinao de M difira da primeira mais que 0,05, continuar
realizando ensaios at que o logaritmo do intervalo de confiana, calculado conforme final de
seo Combinao de estimativas de potncia, no exceda 0,20.
A potncia da heparina sdica :
R = antilog de M

VI.7. ENSAIOS INDIRETOS TUDO OU NADA

Em alguns ensaios no possvel nem conveniente medir o efeito em cada unidade
experimental (por exemplo, animal) em escala quantitativa. Neste caso, podem-se medir efeitos
de tudo ou nada, como morte ou ocorrncia de sintoma pr-estabelecido. A proporo de
unidades experimentais que apresentam o sintoma constitui o resultado. Esses ensaios so
chamados quantais. Neste captulo ser apresentado clculo aproximado. No caso de dispor de
facilidade de computao, pode-se recorrer ao clculo terico exato. Deve-se registrar, para cada
dose, a percentagem de animais com efeito positivo. Exemplo porcentagem de camundongos em
convulso. Transformar as porcentagens em probitos, utilizando a Tabela 16. Cada probito ser
considerado como o valor da resposta transformada (y). O mtodo a seguir utilizado quando
no ocorrem respostas equivalentes a porcentagens zero ou 100. Nesse caso, empregar mtodos
estatsticos completos de mxima probabilidade (logito ou probito). Para cada valor de y, deve-se
obter um valor de coeficiente de ponderao (w) na Tabela 17.
As frmulas das somas de quadrados para os testes de validade so as mesmas
utilizadas nos ensaios indiretos quantitativos (Tabela

10), tomando n=1, com exceo do termo do erro (s
A
), que tem graus de liberdade iguais a
infinito, e se calcula como:
Vigilncia Sanitria Digital 212
2 k
s =-----------
(29
)
N E w
onde k = nmero de tratamentos, n = nmero de animais utilizados em cada treinamento.
Calcular a potncia e os limites de confiana usando as frmulas 12 e 19. Este mtodo
aproximado til quando o ensaio delineado de modo que as respostas em porcentagem
correspondentes s doses menores e sejam uniformemente espaadas ao redor de 50%. Se uma
das doses testadas fornecer respostas zero ou 100%, estas podem ser desprezadas. Neste caso,
obter a estimativa de potncia pelos mtodos descritos na seo Ensaios parcialmente
balanceados.

VI.8. COMBINAO DE ESTIMATIVAS DE POTNCIA

Quando se realizam n ensaios independentes para cada amostra, os resultados podem
ser combinados a fim de se obter uma potncia estimada com intervalo de confiana reduzido,
que cumpra os, limites estabelecidos em cada monografia. Existem vrios mtodos para combinar
ensaios repetidos.
Adotar simplificaes, levando-se em conta dois aspectos:
a) corrigir estimativas do log da potncia (M) pela potncia suposta (S
A
) antes de realizar as
combinaes (M = M + log SA)

b) as estimativas devem ser independentes, ou seja, obtidas em ensaios separados.

VI.8.1. POTNCIA MDIA PONDERADA E LIMITES DA CONFIANA

Supor que foram analisados resultados de n ensaios para se fornecerem n valores de M
com limites de confiana (em logaritmos) associados a cada valor de M, obtidos segundo as
equaes 13 e 19. Para cada ensaio, obter o intervalo de confiana logartmico (L), subtraindo o
limite inferior do superior. Calcular tambm uma ponderao (W) para cada valor M a partir da
equao 30. Onde t o mesmo valor empregado no clculo do intervalo de confiana


4 t
2

w = ----2------
L (30)
Para cada ensaio, calcular o produto WM e dividir seu somatrio pelo somatrio de todas
as ponderaes a fim de se obter o logaritmo da potncia mdia ponderada (M), conforme a
equao 31

M = E
WM
/ E
W
(31)
n n
O erro padro da potncia mdia (s) a raiz quadrada da recproca da ponderao total:

M
S
M
= 1/
w
(32)

Calcular os limites de confiana aproximados (p=0,05), a partir do antilogaritmo
dos valores obtidos atravs da frmula 33

M + ou ts
M
(33)

Obtm-se o valor t na Tabela 3, com graus de liberdade equivalentes soma dos graus
de liberdade da varincia do erro dos ensaios individuais.
Este mtodo aproximado de combinao d resultados satisfatrios quando: a) C for
menor que 1,1 para cada um dos n ensaios e b) as estimativas individuais da potncia formarem
um conjunto homogneo de acordo com o teste de homogeneidade realizado,

Vigilncia Sanitria Digital 213
aplicado a estatstica x
2
. Esta calculada elevando-se ao quadrado a diferena entre cada valor
de M em relao mdia ponderada (M), multiplicando-se este quadrado pela ponderao
correspondente (w) e somando-se os valores para todos os ensaios:

x
2
M
= E
W
(M - M
2
) (34)
n

Se o valor de X
2
M
calculado for menor que o correspondente na Tabela 18 para (n 1)
graus de liberdade, considera-se que no h elementos para suspeitar heterogeneidade de
potncias. Neste caso, a potncia mdia e os limites calculados so corretos.

Se o valor X
2
M
for maior que o da Tabela 18, considera-se que as potncias so
heterogneas, ou seja, que a disperso dos valores individuais de M maior que a esperada, de
acordo com os respectivos limites de confiana. Neste caso, no aplicar as frmulas 31 e 33,
averiguar a origem desta heterogeneidade e, caso se considerar adequado, calcular M usando
semi-ponderaes w :
w = 1/(V + v) (35)

em que L
2

V = =/ w = ----
4t
2
(36)
e v a varincia da heterogeneidade entre ensaios e se calcula pela equao:

EM
2
- (EM
2
)/n EV
v =---------------- - ------------- (37)
n - 1 n
quando V varia de tal maneira que v calculado nmero negativo, pode-se calcular v aproximado,
omitindo-se o termo aps o sinal negativo na equao 37.
Para calcular a mdia semi-ponderada (M), substituir na equao 31 os valores de w e Ew pelos
respectivos valores de w e Ew

M - E (w M) /Ew (38)
n n
pode-se considerar este valor de M prximo ao centro de um intervalo de confiana de tamanho
aproximado L
C
, que a raiz quadrada de

L
2
= 4 t
2
/ Ew (39)

em que t, da Tabela 3, tem graus de liberdade iguais ao somatrio de graus de liberdade
varincia do erro dos n ensaios individuais.
No caso especial do ensaio de heparina, todos os logaritmos de potncia (M) tm a
mesma ponderao e o intervalo de confiana de logaritmo da estimativa da potncia M se
determina como segue:
Calculo da varincia do erro com n - 1 graus de liberdade

S
2
= (E
M
2
- (E
M
2
)/n ) /n - 1 (40)

Determinar o intervalo de confiana em logaritmos (l)

L = 2 st/ n (41)

Em que
s = s
2
, t(Tabela 3) com n 1 graus de liberdade, n = nmero de estimativas
individuais da potncia.
Calcular os limites de confiana:

M
s
= M + 1/2 L (42)

M
i
= M - 1/2 L (43)

Vigilncia Sanitria Digital 214
R

s
= antilog Ms (44)

R

i
= antilog Mi (45)

VI.9. TABELAS ESTATSTICAS

Tabela I Teste de valores aberrantes

Em amostras de uma populao normal, valores iguais ou maiores que G1, G2 e G3 ocorrem com
probabilidade p=0,02 quando podem existir dados aberrantes s num extremo, ou com p=0,04,
quando ocorrem em qualquer extremo.
N 3 4 5 6 7
G1 ,976 ,846 ,729 ,644 ,586
N 8 9 10 11 12 13
G2 ,780 ,725 ,678 ,638 ,605 ,678
N 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
G3 ,602 ,579 ,659 ,542 ,527 ,514 ,502 ,491 ,481 ,472 ,464

Tabela 2 Teste para grupos contendo valores aberrantes

N. de intervalos K Valores de R, crticos para intervalos de n observaes cada um
2 3 4 5 6 7 8 9 10
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,962 0,862 0,803 0,764 0,736 0,717 0,702 0,691 0,682
,813 ,667 ,601 ,563 ,539 ,521 ,507 ,498 ,489
,681 ,538 ,479 ,446 ,425 ,410 ,398 ,389 ,392
,581 ,451 ,398 ,369 ,351 ,338 ,328 ,320 ,314
,508 ,389 ,342 ,316 ,300 ,288 ,280 ,273 ,267
,451 ,342 ,300 ,278 ,263 ,253 ,245 ,239 ,234
,407 ,305 ,267 ,248 ,234 ,225 ,218 ,213 ,208
,369 ,276 ,241 ,224 ,211 ,203 ,197 ,192 ,188
,339 ,253 ,220 ,204 ,193 ,185 ,179 ,174 ,172


N. de intervalos K
Valores de (K + 2) R, crticos para intervalos n observaes cada um
2 3 4 5 6 7 8 9 10
10
12
15
20
50
4,06 3,04 2,65 2,44 2,30 2,21 2,14 2,09 2,05
4,06 3,03 2,63 2,42 2,29 2,20 2,13 2,07 2,04
4,06 3,02 2,62 2,41 2,28 2,18 2,12 2,06 2,02
4,13 3,03 2,62 2,41 2,28 2,18 2,11 2,05 2,01
4,26 3,11 2,67 2,44 2,29 2,19 2,11 2,06 2,01

Tabela 3 distribuio de

Probabilidade
Gl , ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 ,2 ,1 ,05 ,02 ,01 ,001

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
,158 ,325 ,510 ,727 ,1000 1,376 1,963 3,076 6,314 12,706 31,821 63,657 636,619
,142 ,289 ,445 ,617 ,816 1,061 1,386 1,886 2,920 4,303 6,965 9,925 31,598
,137 ,277 ,424 ,584 ,765 ,978 1,250 1,638 2,353 3,182 4,541 5,841 12,924
,134 ,271 ,414 ,569 ,741 ,941 1,190 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,610
,132 ,267 ,408 ,559 ,727 ,920 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869
,131 ,265 ,404 ,553 ,718 ,906 1,134 1,440 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959
,130 ,263 ,402 ,549 ,711 ,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,998 3,499 5,408
,130 ,262 , 9 ,546 ,706 ,883 1,108 1,397 1,860 2,306 2,896 3,355 5,041
,129 ,261 ,398 ,543 ,703 ,883 1,100 1,383 1,833 2,262 2,821 3,250 4,781
,129 ,260 ,397 ,542 ,700 ,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587
,129 ,260 ,396 ,540 ,697 ,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437
,128 ,259 ,395 ,539 ,695 ,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318
,128 ,259 ,394 ,538 ,694 , 870 1,079 1,350 1,771 2,160 2,650 3,012 4,221
,128 ,258 ,393 ,537 ,692 ,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,140
Vigilncia Sanitria Digital 215
15
16
17
18
19
20
21
22
23
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28
29
30
40
60
120

,128 ,256 ,393 ,536 ,691 ,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073
,128 ,258 ,392 ,535 ,690 ,865 1,071 1,337 1,746 2,120 2,583 2,921 4,015
,128 ,257 ,392 ,534 ,689 ,863 1,069 1,333 1,740 2,110 2,567 2,898 3,965
,127 ,257 ,392 ,534 ,688 ,862 1,067 1,330 1,734 2,101 2,552 2,878 3,022
,127 ,257 ,391 ,533 ,688 ,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883
,127 ,257 ,391 ,533 ,687 ,860 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,850
,127 ,257 ,391 ,532 ,686 ,859 1,063 1,323 1,721 2,080 2,518 2,831 3,819
,127 ,256 ,390 ,532 ,686 ,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792
,127 ,256 ,390 ,532 ,685 ,858 1,060 1,319 1,714 2,069 2,500 2,807 3,767
,127 ,256 ,390 ,531 ,685 ,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745
,127 ,256 ,390 ,531 ,684 ,856 1,058 1,316 1,708 2,060 2,485 2,787 3,725
,127 ,256 ,390 ,531 ,684 ,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707
,127 ,256 ,389 ,531 ,684 ,855 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,690
,127 ,256 ,389 ,530 ,683 ,855 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,674
,127 ,256 ,389 ,530 ,683 ,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,659
,127 ,256 ,389 ,530 ,683 ,854 1,055 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,646
,126 ,255 ,388 ,529 ,681 ,851 1,050 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551
,126 ,254 ,387 ,527 ,679 ,848 1,046 1,296 1,671 2,000 2,390 2,660 3,460
,126 ,254 ,386 ,526 ,677 ,845 1,041 1,289 1,658 1,980 2,358 2,617 3,373
,126 ,253 ,385 ,524 ,674 ,842 1,036 1,282 1,645 1,960 2,326 2,576 3,291


Tabela 4 Razo de varincias (F) Pontos de p=0,05


GL1\GL2 1 2 3 4 5 6 8 12 24
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10

11
12
13
14
15

16
17
18
19
20

21
22
23
24
25

26
27
28
29
161.4
18.51
10.13
7.71
6.61

5.99
5.59
5.32
5.12
4.96

4.84
4.75
4.67
4.60
4.54

4.49
4.45
4.41
4.38
4.35

4.32
4.3
4.28
4.26
4.24

4.22
4.21
4.20
4.18
199.5
19.00
9.55
6.94
5.79

5.14
4.74
4.46
4.26
4.10

3.98
3.88
3.80
3.74
3.68

3.63
3.59
3.55
3.52
3.49

3.47
3.44
3.42
3.40
3.38

3.37
3.35
3.34
3.33
215.7
19.16
9.28
6.59
5.41

4.76
4.35
4.07
3.86
3.71

3.59
3.49
3.41
3.34
3.29

3.24
3.20
3.16
3.13
3.10

3.07
3.05
3.03
3.01
2.99

2.98
2.96
2.95
2.93
224.6
19.25
9.12
6.39
5.19

4.53
4.12
3.84
3.63
3.48

3.36
3.26
3.18
3.11
3.06

3.01
2.96
2.93
2.90
2.87

2.84
2.82
2.80
2.78
2.76

2.74
2.73
2.71
2.70
230.2
19.30
9.01
6.26
5.05

4.39
3.97
3.69
3.48
3.33

3.20
3.11
3.02
2.96
2.90

2.85
2.81
2.77
2.74
2.71

2.68
2.66
2.64
2.62
2.60

2.59
2.57
2.56
5.54
234.0
19.33
8.84
6.04
4.82

4.15
3.73
3.44
3.23
3.07

3.09
3.00
2.92
2.85
2.79

2.74
2.70
2.6632.6
3
2.60

2.57
2.55
2.53
2.51
2.49

2.47
2.46
2.44
2.43
238.9
19.37
8.84
6.04
4.82

4.15
3.73
3.44
3.23
3.07

2.95
2.85
2.77
2.70
2.64

2.59
2.55
2.51
2.48
2.45

2.42
2.40
2.38
2.36
2.34

2.32
2.30
2.29
2.28
243.9
19.41
8.74
5.91
4.68

4.00
3.57
3.28
3.07
2.91

2.79
2.69
2.60
2.53
2.48

2.42
2.38
2.34
2.31
2.28

2.25
2.23
2.20
2.18
2.16

2.15
2.13
2.12
2.10
249.0
19.45
8.64
5.77
4.63

3.84
3.41
3.12
2.90
2.74

2.61
2.50
2.42
2.35
2.29

2.24
2.19
2.15
2.11
2.08

2.05
20.3
2.00
1.98
1.96

1.95
1.93
1.91
1.90
254.3
19.5
8.53
5.63
4.36

3.67
3.23
2.93
2.71
2.64

2.40
2.30
2.21
2.13
2.07

2.01
1.96
1.92
1.88
1.84

1.81
1.78
1.76
1.73
1.71

1.69
1.67
1.65
1.64
Vigilncia Sanitria Digital 216
30

40
60
120

4.17

4.08
4.00
3.92
3.84
3.32

3.23
3.15
3.07
2.99
2.92

2.84
2.76
2.68
2.60
2.69

2.61
2.52
2.45
2.37
2.53

2.45
2.37
2.29
2.17
2.42

2.34
2.25
2.17
2.10
2.27

2.18
2.10
2.02
1.94
2.09

2.00
1.92
1.83
1.76
1.89

1.79
1.70
1.61
1.52
1.62

1.51
1.39
1.25
1.00

Tabela 5 Razo de varincias (F) Pontos de p=0,01

GL1\GL2 1 2 3 4 5 6 8 12 24
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10

11
12
13
14
15

16
17
18
19
20

21
22
23
24
25

26
27
28
29
30

40
60
120

4052
98.50
34.12
21.20
16.26

13.74
12.25
11.26
10.56
10.04

9.65
9.33
9.07
8.86
8.68

8.53
8.40
8.28
8.18
8.10

8.02
7.94
7.88
7.82
7.77

7.72
7.68
7.64
7.60
7.56

7.31
7.08
6.85
6.64
4999
99.00
30.82
18.00
13.27

10.92
9.55
8.05
8.02
7.56

7.20
6.93
6.70
6.51
6.36

6.23
6.11
6.01
5.93
5.85

5.78
5.72
5.66
5.61
5.57

5.53
5.49
5.45
5.42
5.39

8
4.98
4.79
4.60
5403
99.17
29.46
16.69
12.06

9.78
8.45
7.59
6.99
6.55

6.22
5.95
5.74
5.56
5.42

5.29
5.18
5.09
5.01
4.94

4.87
4.82
4.76
4.72
4.68

4.64
4.60
4.57
4.54
4.51

4.31
4.13
3.95
3.78
5625
99.25
28.71
15.98
11.39

9.15
7.85
7.01
6.42
5.99

5.67
5.41
5.20
5.03
4.89

4.77
4.67
4.58
4.50
4.43

4.37
4.31
4.20
4.22
4.18

4.14
4.11
4.07
4.04
4.02

3.83
3.65
3.48
3.32
5764
99.30
28.24
15.52
10.97

8.75
7.46
6.63
6.06
5.64

5.32
5.06
4.86
4.69
4.56

4.44
4.34
4.25
4.17
4.10

4.04
3.99
3.94
3.90
3.86

3.82
3.78
3.75
3.73
3.70

3.51
3.34
3.17
3.02
5859
99.33
27.91
15.21
10.67

8.47
7.19
6.37
5.80
5.39

5.07
4.82
4.62
4.46
4.32

4.20
4.10
4.01
3.94
3.87

3.81
3.76
3.71
3.67
3.63

3.59
3.56
3.53
3.50
3.47

3.29
3.12
2.96
2.80
5982
99.37
27.49
14.80
10.29

8.10
6.84
6.03
5.47
5.06

4.74
4.50
4.30
4.14
4.00

3.89
3.79
3.71
3.63
3.56

3.51
3.45
3.41
3.36
3.32

3.29
3.26
3.23
3.20
3.17

2.99
2.82
2.66
2.51
6106
99.42
27.05
14.37
9.89

7.72
6.47
5.67
5.11
4.71

4.40
4.16
3.96
3.80
3.67

3.55
3.45
3.37
3.30
3.23

3.17
3.12
3.07
3.03
2.99

2.96
2.93
2.90
2.87
2.84

2.66
2.50
2.34
2.18
6234
99.46
26.60
13.93
9.47

7.31
6.07
5.28
4.73
4.33

4.02
3.78
3.59
3.43
3.29

3.18
3.08
3.00
2.92
2.86

2.80
2.75
2.70
2.66
2.02

2.58
2.55
2.52
2.49
2.47

2.29
2.12
1.95
1.79
6366
99.50
26.12
13.46
9.02

6.88
5.65
4.86
4.31
3.91

3.60
3.36
3.16
3.00
2.87

2.75
2.65
2.57
2.49
2.42

2.36
2.31
2.26
2.21
2.17

2.13
2.10
2.06
2.03
2.01

1.80
1.60
1.38
1.00

Tabela 6 Ordem de doses nos ensaios cruzados


Grupo

Duplo cruzado

Triplo cruzado

Fase
I
Fase
II
Fase
I
Fase
II
1
2
3
p
1

p
2

a
1

a
2

a
1

p
2

P
1

p
2

p
3

a
3

a
2

a
1

Vigilncia Sanitria Digital 217
4
5
6
a
2

-
-

p
1

-
-

a
1

a
2

a
3

p
3

p
2

p
1



Tabela 7 Exemplo de ordem de doses
no quadrado Latino

a
2
p
1
a
1
p
2

p
2
a
1
p
1
a
2

a
1
a
2
p
2
p
1

p
1
p
2
a
2
a
1


Tabela 8 Frmulas para ensaios com duas doses de cada preparao

Padro
(p)
1 Amostra
(A)
Amostra h-1
(Z)
Dose menor
(soma de
respostas)

Dose maior
(soma de
respostas)

Por preparao
(soma de
respostas)

Contraste
Linear
P
1




P
2




P
1
+P
2
=P



P
2
-P
1
=LP
A
1




A2



A
1
+A
2
=A



A
2
-A
1
=LA
Z
1




Z
2




Z
1
+Z
2
=Z



Z
1
-Z
2
=LZ


Tabela 9 Frmulas para ensaios com trs doses de cada preparao

Padro
(p)
1 Amostra
(A)
Amostra h-1
(Z)
Dose menor
(soma de
respostas)

Dose mdia
(soma de
respostas)

Dose maior


Por
preparao(som
a de respostas)

Contraste linear


Contraste
quadrtico
P
1




P
2




P
3



P
1
+P
2
+P
3
=P



P
3
-P
1
=LP


P
1
-2P
2
+P
3
=QP
A
1




A
2




A
3



A
1
+A
2
+A
3
=A



A
3
-A
1
=LA


A
1
-2A
2
+A
2
=QA
Z
1




Z
3




Z
3



Z
1
+Z
2
+Z
3
=Z



Z
3
-Z
1
=LZ


Z
1
-2Z
2
+Z
3
=QZ

Tabela 10 Testes de validade (anlise de varincia)

Vigilncia Sanitria Digital 218

Fonte de
variao

Graus de
liberdade
Soma dos quadrados reduzida
Ensaio de duas doses Ensaio de trs doses
Preparaes



Regresso



Paralelismo



Quantitativo



Diferena de
Quadrticos
h-1



1



h-1



1



h-1
P
2
+A
2
+...+Z
2

------------------------- -K
2n

(L
P
+L
A
+...+L
Z
)
2

--------------------- = E
2nh

(L
P
2
+L
A
3
+...+L
Z
2
)
----------------------- -E
2n

----------------



-----------------
P
2
+A
2
+...+Z
2

------------------------ - K
3n

(L
P
+L
A
+...+L
Z
)2
------------------------- = E
2nh

(L
P
2
+L
A
2+...+L
Z
2
)
---------------------------- -E
2n

(Q
P
+Q
A
+...+Q
Z
)
2

---------------------- = Q
6nh

Q
2
p
+Q
2
A
+ +Q
2
Z

------------------------ - Q
6n

Tabela 11 Estimativa do erro residual

Fontes de
variao
Graus de
liberdade
(gl)
Soma do quadrados reduzida
Delineamento ao
acaso
Blocos ao acaso Quadrado Latino


Tratamentos


Bloco (filas)



Blocos
(colunas)


Erro residual



TOTAL


k-1


n-1



n-1



Por
diferena


N-1

P
2
1
+ P
2
2
+ + Z2d
-------------------- -K
n

-----



----



-



Ey
2
- k

P
2
1
+ P
2
3
+ + Z
3
d

------------------------ -K
n

F
2
1
+ F
2
3
+ + F
n
2

----------------------- -K
k

----



-



y
2
- K
P
3
1
+ P
2
2
++Z
2
d

-------------------- - K
n


F
2
1
+ F
2
2
+F
2
n
-------------------------------
- K
k

C
2
1
+ C
2
2
+ + F
2
n

--------------------- -K
k

-



y
2
- K
- Obtida subtraindo da soma de quadrados reduzida total, todas as outras somas de
quadrados reduzidas calculadas para o delineamento correspondente.

Tabela 12 Tabela de t para comparao bicaudal entre(4-1) amostras e um padro para um
coeficiente de confiana conjunto de p=0,95


g/
1
= (h-1) = nmero de amostras (incluindo padro)

g/
2



1 2 3 4 5 6 7 8 9

5 2.57 3.03 3.29 3.48 3.62 3.73 3.82 3.90 3.97
Vigilncia Sanitria Digital 219
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
24
30
40
60
120

2.45
2.36
2.31
2.26
2.23
2.20
2.18
2.16
2.14
2.13
2.12
2.11
2.11
2.09
2.09
2.06
2.04
2.02
2.00
1.98
1.96
2.86
2.75
2.67
2.61
2.57
2.53
2.51
2.48
2.46
2.44
2.42
2.41
2.40
2.39
2.38
2.35
2.32
2.29
2.27
2.24
2.21
3.10
2.97
2.88
2.81
2.76
2.72
2.68
2.65
2.63
2.61
2.59
2.58
2.56
2.55
2.54
2.51
2.47
2.44
2.41
2.38
2.35
3.26
3.12
3.02
2.95
2.89
2.84
2.81
2.78
2.75
2.73
2.71
2.69
2.68
2.66
2.65
2.61
2.58
2.54
2.51
2.47
2.44
3.39
3.24
3.13
3.05
2.99
2.94
2.90
2.87
2.84
2.82
2.80
2.78
2.76
2.75
2.73
2.70
2.66
2.62
2.58
2.55
2.51
3.49
3.33
3.22
3.14
3.07
3.02
2.98
2.94
2.91
2.89
2.87
2.85
2.83
2.81
2.80
2.76
2.72
2.68
2.64
2.60
2.57
3.57
3.41
3.29
3.20
3.14
3.08
3.04
3.00
2.97
2.95
2.92
2.90
2.89
2.87
2.86
2.81
2.77
2.73
2.69
2.65
2.61
3.64
3.47
3.35
3.26
3.19
3.14
3.09
3.06
3.02
3.00
2.97
2.95
2.94
2.92
2.90
2.86
2.82
2.77
2.73
2.09
2.65
3.71
3.53
3.41
3.32
3.24
3.19
3.14
3.10
3.07
3.04
3.02
3.00
2.98
2.96
2.95
2.90
2.86
2.81
2.77
2.73
2.69

Tabela 13 Totais e contraste em ensaios com delineamento duplo cruzado

Padro P Amostra A Total
Fase I
Dose menor
(soma de respostas)

Dose maior
(soma de respostas)

Total

Fase II
Dose menor

Dose maior
(soma de respostas)
Total

Por preparao
(soma de respostas)

Contraste linear

Fase I

Fase II

Total

P
11



P
21



P
1



P
111


P
211


P
11


P




P
21
P
11
=Lp
1


P
211
P
111
= L
p11


P
2
+ P
1
= L
P


A
11



A
21



A
1



A
111


A
211


A
11


A




A
21
A
11
= L
AI


A
211
A
111
= L
A11


A
2
+ A
1
= L
A



-


-


P
1
+ A
1
= F
1



-

-

P
11
+A
11
= F
11


y




Lp
1
+ L
AI
=L
1


Lp
11
+ L
A11
=L
11


L
p
+ L
A
= EL


Tabela 14 Testes de validade em ensaio duplo cruzado

Pontos de variao Graus de liberdade Soma de quadrados reduzida

Paralelismo



1



L
2
p
+ L
2
A

---------------------- -E
2n
Vigilncia Sanitria Digital 220

Fases X preparaes



Fases X regresso



Erro 1

1



1



Diferena

P
2
1
+ P
2
11
+ A
2
1
+ A
2
11

------------------------------ - K -\
n
Fases preparaes
L
2
1
+ L
3
11

-------------------- -E
2n

Blocos Paralelismo (Fases
X Preparaes) Fases
regresso

Blocos (animais)



Preparaes



Regresso



Fases




Fases x paralelismo


Erro II

M 1







1



1




1___


Diferena

B
2
1
+ B
2
2
+... + B
2
2A

------------------------------ -K
2

P
2
+ A
2

----------------- -K
2n

(L
p
+ L
A
)
------------------- =E
N

F
2
1
+ F
2
11

--------------------- -K
2n

L
2
PI
+ L
2
PII
+ L
2
AI
+ L
2
AII

------------------------------------- - E-
n

Paralelismo (Fases X
Regresso)
Total - Blocos Preparaes
Regresso Fase: - (Fases X
Paralelismo)
Total N 1 E(y
2
) - k

K = (Ey)
2
/N
N = nmero total de respostas
n = nmero de rplicas por dose includas as duas fases
Bl = nmero de blocos (animais)
y = soma das duas respostas para cada bloco (animal)


Tabela 15 Constante usada na Frmula para os limites de confiana

Dose de cada preparao (d) Nmero de amostras ensaiadas (h 1) c
2





3
1
2
3
4
5

1
2
3
4
1
3/2
2
5/2
3

8/3
4
16/3
20/3
Vigilncia Sanitria Digital 221
6 8

Tabela 16 Probitos correspondentes porcentagem

% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-
3.72
4.16
4.48
4.77
5.00
5.25
5.52
5.84
6.28
2.67
3.77
4.19
4.50
4.77
5.03
5.28
5.55
5.88
6.34
2.95
3.82
4.23
4.53
4.80
5.05
5.31
5.58
5.92
6.81
3.12
3.87
4.26
4.56
4.82
5.08
5.33
5.61
5.95
6.48
3.25
3.92
4.29
4.59
4.85
5.10
5.36
5.64
5.99
6.55
3.36
3.96
4.33
4.61
4.87
5.13
5.39
5.67
6.04
6.64
3.45
4.01
4.36
4.64
4.90
5.15
5.41
5.71
6.08
6.75
3.52
4.05
4.39
4.67
4.92
5.18
5.44
5.74
6.13
6.88
3.59
4.08
4.42
4.69
4.95
5.20
5.47
5.77
6.18
7.05
3.66
4.12
4.45
4.72
4.97
5.23
5.50
5.81
6.23
7.33
% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
97
98
99
6.88
7.07
7.33
6.90
7.07
7.37
6.91
7.12
7.46
6.93
7.12
7.46
6.94
7.14
7.51
6.96
7.17
7.58
6.98
7.20
7.65
7.00
7.23
7.75
7.01
7.26
7.88
7.03
7.29
8.09

Tabela 17 Coeficientes de ponderao para probitos

Probitos 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1
2
3
4
5
6
7
8
0.001
0.015
0.131
0.439
0.637
0.439
0.131
0.015
0.001
0.019
0.154
0.471
0.634
0.405
0.110
0.011
0.001
0.025
0.180
0.503
0.627
0.370
0.092
0.008
0.002
0.031
0.208
0.532
0.616
0.336
0.076
0.006
0.002
0.040
0.238
0.558
0.601
0.302
0.062
0.005
0.003
0.050
0.269
0.581
0.581
0.269
0.050
0.003
0.005
0.062
0.302
0.601
0.558
0.238
0.040
0.002
0.006
0.076
0.336
0.616
0.532
0.208
0.031
0.002
0.008
0.092
0.370
0.627
0.503
0.180
0.025
0.001
0.011
0.110
0.405
0.634
0.471
0.154
0.019
0.001

Tabela 18 Valores de X (p=0,05)

g/ X
2
g/ X
2

1
2
3
4
5
6
7
8

3.84
5.09
7.81
9.49
11.07
12.59
14.07
15.51
9
10
11
12
13
14
15
20
26
16.92
18.31
19.67
21.03
22.36
23.09
25.00
31.41
37.65

VI .10. EXEMPLOS DE ENSAIOS ESTATSTICOS
VI .10.1. EXEMPLO DE ENSAIO DIRETO

Exemplo 1 : Ensaio direto com uma Amostra
Ensaio de digital pelo mtodo da parada cardaca em cobaia

A soluo do padro foi usada na concentrao de 0,0658 Ul/ml.
Uma diluio equivalente de amostra foi preparada sobre a base de uma potncia suposta s
A
=
1,3 U1/100mg.

As cobaias foram perfundidas aleatoriamente com soluo padro ou amostra,
registrando-se o volume justamente necessrio para produzir a parada cardaca em cada animal.
As respostas encontram-se na Tabela 19.

Clculo da estimativa da potncia e limites de confiana
Vigilncia Sanitria Digital 222

Da equao 1 : M = 1,3974 1,4089 = - 0,0115
Da equao 6 : M = - 0,0115 + log 1,3 = 0,1024
Da equao 5 : R = antilog 0,1024 = 1,27

Da equao 3 : 19,5641
2

S
2
x
= 1/22 [(1,4404
2
+ ... + 1,3304
2
- --------------------).
14

14,0890
2

+ (1,5317
2
+ ... + 1,4072
2
- ------------- )]
10
= 1/22 27,3829 - 27,3396 + 19,8879 - 19,8500
= 0,003691

Da equao 2 :
S
2
M
= 0,003691 (-
1
- + -
1
-) = 0,000632
14 10

S
M
= 0,000632 = 0,0251

Para p = 0,05 com 22 gl, t = 2,07 (Tabela 3)

Da equao 7 :
Rs = antilog [0,1024 + ou (2,07 x 0,0251)]
Ri
Rs = antilog [0,1024 + (2,07 x 0,0251)] = 1,43
Ri = antilog [0,1024 - (2,07 x 0,0251)] = 1,12
A estimativa mdia da potncia da amostra de digital 1,27 Ul/100 mg. Os limites de
confiana (p=0,05) para a verdadeira potncia so 1,12 Ul/100 mg e 1,43 Ul/100 mg.

Tabela 19 Exemplo 1: Doses eficazes para produzir parada cardaca

Padro P Amostra A
Dose letal
ml/kg
Log doses letal
x
p

Dose letal
ml/kg
Log doses letal
x
A

27.57
25.97
27.74
30.94
28.31
27.29
22.13
23.63
21.39
22.13
20.97
29.23
23.78
21.40

1.4404
1.4145
1.4431
1.4905
1.4519
1.4360
1.3450
1.3735
1.3302
1.3450
1.3216
1.4658
1.3762
1.3304
34.02
21.90
28.33
24.87
27.56
24.73
21.67
21.30
29.10
25.54
1.5317
1.3404
1.4523
1.3957
1.4403
1.3932
1.3350
1.3284
1.4639
1.4072
2x
x
2x
2

s
2

N
19.5641
1.3974
27.3829
0.003331
14

14.0890
1.4089
19.8879
0.004211
10

Exemplo 2: Ensaio com trs doses, delineamento completamente ao acaso

Vigilncia Sanitria Digital 223
Ensaio de gonodotrofina humana pelo mtodo do aumento de peso de vesculas seminais
As doses utilizadas do padro foram p1 = 1,0 ul/ml, p2 = 2,0 ul/ml e p3 = 4,0 Ul/ml. Doses
equivalentes da amostra foram preparadas sobre a base de uma potncia suposta S
A
= 3000
Ul/mg.
Os ratos foram injetados subcutaneamente com 0,20 ml da soluo respectiva, durante
dias consecutivos, num total de 0,6 ml/rato.
Os pesos das vesculas seminais encontram-se na Tabela 20.

Tabela 20 Exemplo 2: Pesos de vesculas seminais (mg)

P1 P2 P3 A1 A2 A3
8.5
10.4
11.4
11.6
10.2
9.1
9.5
7.7
12.5
13.1
8.3
13.1
9.0
14.4
11.7
11.72*
14.8
14.1
14.9
13.8
14.6
15.2
12.3
15.5
10.5
10.5
9.1
9.9
10.5
8.4
10.1
10.1
16.8
14.3
14.9
12.3
15.4
14.9
12.8
10.0
16.7
16.9
18.8
16.7
12.7
16.2
17.3
12.8
* Valor perdido substitudo pela mdia do tratamento.

Tabela 21 Exemplo 2: Totais e contrastes

Padro P Amostra A
Dose maior
Dose mdia
Dose maior
Preparao
Contraste linear
Contraste quadrtico
P
1
= 78.40
P
2
= 93.82
P
3
= 115.20
P= 287.42
L
P
= 36.80
Q
P
= 5.96

A
1
= 79.10
A
2
= 111.40
A
3
= 128.10
A= 318.60
L
A
= 49.00
Q
A
= - 15.60


* Resultados obtidos com as frmulas da Tabela 9.

Tabela 22 Exemplo 2: Anlise de varincia

Fonte de
variao

g/
Soma de
quadrados
Quadrado
mdio
F

P

Preparaes
Regresso
Paralelismo
Quadrticos
Diferena de
quadrticos

Tratamentos
Erro

Total
1
1
1
1
1


5
41*

47
20.26
230.05
4.65
.97
4.84


260.77
119.18

379.95
20.26
230.05
4.65
0.97
4.84


52.15
S
1
= 2.91



79.05
1.60
0.33
1.66

<0.01
>0.05
>0.05
>0.05
* Retirado um grau de liberdade por Ter sido substitudo um valor perdido.

As somas de quadrados foram obtidas empregando-se as frmulas das Tabelas 9, 10 e
11.
N = 48
n = 8
K = (Ey)
2

Ey
2

287.42
2
+ 318.6
2

Preparaes = ---------------------- - 7 651.25 = 20.26
Vigilncia Sanitria Digital 224
24

(36.8 + 49.0)
2

Regresso = ------------------ - 230.05 = E
32

36.8
2
+ 49.0
2

Paralelismo = ------------------ - 230.05 = 4.65
16

[5.96 + (- 15.6)]
2

Quadrtico = ------------------------- = 0.97 = Q
96


5.96
2
+ (- 15.6)
2

Diferena de quadrticos = ------------------------ - 0.97 = 4.84
48

78.40
2
+ 93.83
2
+ ..+ 128.10
2

Tratamentos = ------------------------------------------ - 7 651.25 = 260.77
8

Total = 8 031.21 7 651.25 = 379.95
Erro = 379.95 260.77 = 119.18.

Validade do ensaio

O ensaio cumpre as condies de validade:
a)regresso significativa, F calculado 79.05 maior que o valor crtico da Tabela 5 para
p=0.01, gl1 = 1 e gl2 = 41;
b)desvio de paralelismo no significativo, F calculado 1.60 menor que o valor crtico da
Tabela 4 p=0.05, gl1 = 1 e gl2 = 41 e
c)desvio de linearidade no significativo, F = 0.33 e 1.66.

Clculo da estimativa de potncia e limites de confiana utilizar frmulas 10 a 15.
I = log 2.0 = 0.3010
t = 2.02 com 41 gl da Tabela 3
36.8 + 49.0
b = --------------- = 8.90
2x0,0301x8x2

318.60
yA = ------------ = 13.27
24

287.42
yp = ------------- = 11.97
24
13.27 11.97
M = ------------------ = 0.1460
8.90

SA = 3.000 log Sa = 3.4771
M = 0.1460 + 3.4771 = 3.6231
R = antilog 3.6231 = 4.198.56 Ul/mg

230.05
C = --------------------------- = 1.05
230.05 2.91 (2.02)
2

Vigilncia Sanitria Digital 225

C = 8/3, da Tabela 15
M s
= 1.05 x 0.146 + ou

Mi
+ ou (1.05 1) [1.05 (0.146)
2
+ 8/3 (0.3010)
2
]
M = 0.2676
Mi = 0.0381
Logaritmo dos limites de confiana da potncia
Ms = 0.2679 + 3.4771 = 3.7449
Mi = 0.0381 + 3.4771 = 3.5151
Limites de confiana da potncia
Rs = antilog 3.7745 = 5552.64 Ul/mg
Ri = antilog 3.5151 = 3274.16 Ul/mg

Exemplo 3: Ensaio com trs doses, delineamento blocos ao acaso

Ensaio de antibitico usando placas de Petri
As doses utilizadas do padro foram: P
1
= 0.25 Ul/ml, P
2
= 0.50Ul/ml e P
3
= 1.00 Ul/ml.

Doses equivalentes da amostra foram preparadas com base na potncia suposta S
A
=
1650 Ul/mg.
Os dimetros dos halos de inibio encontram-se na Tabela 23.

Tabela 23 Exemplo 3: Dimetro de halos de inibio

Placas
(Blocos)
Padro P Amostra A Total
Bloco P
1
P
2
P
3
A
1
A
2
A
3

1
2
3
4
5
6
7
17.0
14.9
15.0
14.6
14.7
14.4
14.9
20.4
19.7
10.6
18.3
18.0
19.1
19.0
24.0
22.7
22.0
22.4
22.3
23.3
22.5
17.4
14.9
15.0
14.8
14.4
14.5
15.0
20.7
19.3
18.0
19.0
17.8
19.3
19.4
24.4
22.2
22.3
22.2
22.6
23.0
22.4
123.9
113.7
110.9
111.3
109.8
113.6
113.2

Tabela 24 Exemplo 3: Totais e contrastes

Padro P Amostra A
Dose maior
Dose mdia
Dose maior
Preparao
Contraste linear
Contraste quadrtico
P
1
= 105.5
P
2
= 133.1
P
3
= 159.2
P = 397.8
L
P
= 53.7
Q
P
= -1.5

A
1
= 106.0
A
2
= 133.5
A
3
= 159.1
A = 398.6
L
A
= 53.1
Q
A
= - 1.9


Resultados obtidos com as frmulas da Tabela 9.

Tabela 25 Exemplo 3: Anlise de varincia

Fonte de
Variao
g/ Soma de
Quadrados
Quadrado
mdio
F

P

Preparaes
Regresso
Paralelismo
Quadrticos
Diferena de
quadrticos
1
1
1
1
1

0.0150
407.3657
0.0129
0.1376
0.0019

0.0150
407.3657
0.0129
0.1376
0.0019

0.09
2396
0.08
0.81
0.01

>0.05
<0.01
>0.05
>0.05
>0.05

Vigilncia Sanitria Digital 226

Tratamentos
Placas(Blocos)
Erro

5
6
30

15101.26
22.18
4.99

3020.25
3.70
s
2
= 0.17



21.8


<0.01
As somas de quadrados foram obtidas empregando-se as frmulas das Tabelas 9, 10 e
11.
N = 42
n = 7
K = (Ey)
2
/N = 15 101.26

Ey
2
= 15 535.96

397.8
2
+ 398.6
2

Preparaes = ---------------------- - 15 101.2610 = 0.0152
21

(53.7 + 53.1)
2

Regresso = ------------------ - 407.3657 = E
28

53.7
2
+ 53.1
2

Paralelismo = ------------------ - 407.3657 = 0.0129
14

[- 1.5 + (- 1.9)]
2

Quadrtico = ------------------------ = 0.1376 = Q
84


- 1.5
2
+ (- 1.9)
2

Diferena de quadrticos = ------------------------ - 0.1376 = 0.0019
42

105.5
2
+ 133.1
2
+ ... + 159.1
2

Tratamentos = ------------------------------------------- - 15 101.261 = 407.53
7

123.9
2
+ 113.7
2
+ ... +113.2
2

Blocos (Placas) = --------------------------------------- - 15 101.261 = 22.18
6
Total = 15 535.96 15 101.261 = 434,7
Erro = 434.7 22.18 407.53 = 4,99

Validade do ensaio

O ensaio cumpre as condies de validade:
a)regresso significativa, F calculado 2390 maior que o valor crtico da Tabela 5 para
p=0.01, g/1 = 1 e gl2 = 30;
b)desvio de paralelismo no significativo, F calculado 0.08 menor que o valor crtico da
Tabela 4 p= 0.05, gl1 = 1 e gl2 = 30 e
c)desvio de linearidade no significativo, F calculados = 0.81 e 0.01.

Clculo da estimativa de potncia e limites de confiana utilizar frmulas 10 a 15.
I = log 1.00 - log 0.50 = 0.301
t = 2.04 com 30 gl da Tabela 3.

53.7 + 53.1
b = --------------- = 12.67
28 x 0.301
Vigilncia Sanitria Digital 227

398.6
yA = ------------ = 18.98
21

397.8
yp = ------------- = 18.94
21

18.98 18.94
M = ------------------ = 0.003157
12.672

SA = 1650 Ul/mg
M = M + log 1650 = 0.003157 + 3.217480 = 3.2206
R = antilog 3.2206 = 1662
C = 407.3657/[407.3657 0.17(2.04)]
2
= 1.0017
C = 8/3, da Tabela 15
M s
= 1.0017x0.003157+ou- (1.0017-1) [1.0017x(0.003157)
2
+ 8/3 (0.301)
2
]

M i
M s = 0.0235
M i = 0.0171
Logaritmo dos limites de confiana da potncia
Ms = 0.0235+ 3.2175 = 3.2410
Mi = 0.0171 + 3.2175 = 3.2004
Limites de confiana da potncia
Rs = antilog 3.2410 = 17.42 Ul/mg
Ri = antilog 3.2004 = 1586 Ul/mg

Exemplo 4: Ensaio com trs doses, delineamento quadrado latino
Ensaio de oxitocina mtodo da contrao do tero isolado da rata
As doses administradas do padro foram: P
1
= 0.2 ml, P
2
= 0.25ml de soluo contendo
0.02Ul/ml.
Doses equivalentes da amostra foram preparadas com base na potncia suposta de 10
ul/ml diluda 1:500.

Tabela 26 Exemplo 4: Ordem de adio das doses

Filas Colunas
1 2 3 4
1
2
3
4
p
1

p
2

a
1

a
2

P
2

P
1

A
2

A
1

a
1

a
2

p
1

p
2

a
2

a
1

p
2

p
1


Tabela 27 Exemplo 4: Registros de contraes em mm

Filas Colunas Total
Filas 1 2 3 4
1
2
3
4
38
38
39
45
43
30
45
38
35
44
37
45
40
38
40
37
F
1
= 156
F
2
= 150
F
3
= 161
F
4
= 165
Total
Coluna
C
1
= 160 C
2
= 156 C
3
= 161 C
4
= 155
Total
Das Doses
P
1
= 142 P
2
= 166 A
1
= 150 A
2
= 174

Vigilncia Sanitria Digital 228
Tabela 28 Exemplo 4: Totais e contrastes

Padro Amostra
Dose menor
Dose maior
Preparao
Contraste linear
P
1
= 142
P
2
= 166
P = 308
L
P
= 24
A
1
= 150
A
2
= 174
A = 324
L
A
= 24
* Resultados obtidos com as frmulas da Tabela 8.

Tabela 29 Exemplo 4: Anlise de varincia

Fonte de
Variao
gl Soma dos
Quadrados
Quadrado mdio F P
Preparaes
Regresso
Paralelismo
1
1
1
16.0
144.0
0.0
16.0
144.0
0.0
1.65
14.89
0.00
>0.05
<0.01
>0.05
Tratamento
Filas
Colunas
Erro
3
3
3
6
160.0
31.5
6.5
58.0

10.5
2.2
- 9.67

1.08
0.23


>0.05
>0.05
Total 15 256.0

As soma de quadrados foram obtidos empregando-se as frmulas das Tabelas 8, 10 e 11.
N = 16
n = 4

K = (Ey)
2
/N = 632
2
/16 = 24964

308
2
+ 324
2

Preparaes = --------------- - 24964.0 = 16.0
8

(24 + 24)
2

Regresso = --------------- = 144.0 = E
2 x 4 x 2

24
2
+ 24
2

Paralelismo = --------------- - 144 = 0
2 x 4

142
2
+ 166
2
+ 150
2
+ 174
2

Tratamentos = ------------------------------------ - 24 964 = 160.0
4

156
2
+ 150
2
+ 161
2
+ 165
2

F i l a s = ------------------------------------- - 24 964 = 31.5
4

160
2
+ 156
2
+ 161
2
+ 155
2

Colunas = -------------------------------------- - 24 964 = 6.5
4
Total = 25 220 24 964 = 256.0
Erro = 256.0 160.0 31.5 6.5 = 58,0
A anlise no apresentou diferena significativas (p= 0,05) entre filas e entre colunas.
Validade do ensaio

O ensaio cumpre com a condies de validade:
a) regresso significativa, F calculado 14.9 maior que o valor crtico da Tabela 5 para
p=0.01, gl1 = 1 e gl2 = 6 e
Vigilncia Sanitria Digital 229
b) desvio de paralelismo no significativo, F calculado 0.0 menor que o valor crtico da
Tabela 4 p=0.05, gl1 = 1 e gl2 = 6 .

Clculo da estimativa de potncia e limites de confiana utilizar frmulas 10 a 15.
I = log 0.25 - log 0.20 = 0.0969
t = 0.2.45 com 6 gl da Tabela 3.

24 + 24
b = ---------------------- = 61.91
0.0969 x 4 x 2

324
yA = ------------ = 40.5
8

308
yp = ------------- = 38.5
8
40.5 - 38.5
M = ------------------ = 0.0323
61.91

S
A
= 10 log SA = 1
M = 0.0323 + 1 = 1.0323
R = antilog 1.0323 = 10.8 Ul/ml = Potncia estimada
144.0
C = -------------------------- = 1.67
2
144.0 9.67 x 2.45
C = 1, da Tabela 15
M s
= 1.67 x 0.323 + ou - (1.67 1.0) [1.67 (0.0323
2
+ 1(0.09691)
2
]
Mi
M s = 0.1402
Mi = 0.0324

Logaritmo dos limites de confiana da potncia
Ms = 0.1402 + 1 = 1.1402
Mi = 0.0324 + 1 = 0.9676

Limites de confiana da potncia
Rs = antilog 1.1402 = 13.81 Ul/ml
Ri = antilog 0.9676 = 9.28 Ul/m/4l

Exemplo 5: Ensaio duplo cruzado

Ensaio de insulina em camundongos

As doses utilizadas do padro foram: p1 = 60m Ul/ml e p2 = 120m Ul/ml. Foram
preparadas doses equivalentes da amostra, a1 = 60m Ul/ml e a2 = 120m Ul/ml a partir da
potncia suposta S
A
= 27.4 Ul/ml.
Os camundongos foram injetados com 0,1 ml da soluo respectiva para cada 10g de
peso mdio, de acordo com a Tabela 6.
As respostas encontram-se na Tabela 30.


Tabela 30 Exemplo 5: Concentrao de glicose sangnea (mg/100ml), quarenta
minutos aps injeo

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Vigilncia Sanitria Digital 230
p
1
a
2
total p
2
a
1
Total a
1
p
2
Total a
2
p
1
Total
37.1
35.2
43.1
41.3
54.2
41.4
48.6
57.8
71.1
60.8
78.2
76.1
16.6
40.1
33.9
10.2
33.2
13.1
32.2
50.4
47.3
26.1
50.9
54.4
53.7
75.3
77.0
57.5
87.4
54.5
81.3
108.2
118.4
86.9
129.1
130.5
32.4
35.2
35.3
32.9
31.9
51.2
38.2
39.7
37.0
38.9
42.6
30.4
48.4
73.8
73.1
45.2
33.1
62.4
76.2
50.1
73.8
64.6
54.6
49.6
80.8
109.0
108.4
78.1
65.0
113.6
114.4
89.8
110.8
103.5
97.2
80.0
36.8
53.2
71.2
37.1
45.9
82.2
64.8
49.1
44.1
64.7
88.0
90.1
17.0
24.9
58.2
24.8
22.7
42.7
33.9
37.6
10.4
34.7
61.6
60.3
53.8
78.1
129.4
61.9
68.6
124.9
98.7
86.7
54.5
99.4
149.6
150.4
30.9
27.8
35.4
49.8
28.2
49.0
28.3
39.6
32.2
55.1
40.6
43.5
52.1
59.4
39.1
79.0
37.3
51.1
59.5
55.8
40.6
68.2
61.4
52.8
83.0
87.2
74.5
128.8
65.5
101.0
87.8
95.4
72.8
123.3
102.0
96.3

Tabela 31 Exemplo 5: Totais e contrastes

Padro P Amostra A Total
Fase I
Dose menor
Dose maior
Total

Fase II
Dose menor
Dose maior
Total

Preparao
Contraste linear
Fase I
Fase II
Total

P
11
= 644.9
P
21
= 445.7
P
1
= 1090.6


P
111
= 656.3
P
211
= 428.8
P
11
= 1085.1

P = 2175.7

Lp
1
= -199.2
Lp
1
= -227.5
Lp
11
= -426.7

A
11
= 727.2
A
21
= 461.3
A
1
= 1188.5


A
111
= 704.9
A
211
= 414.9
A
11
= 1119.8

A = 2308.3

L
A1
= -265.9
L
A11
= -290.0
L
A
= -555.9



F
1
= 2279.1




F
11
2204.9

Ey = 4484.0

LI = -465.1
L
11
= -517.5
EL = -982.6
*Resultados obtidos com as frmulas da tabela 13

Tabela 32 Exemplo 5: Anlise de varincia

Fonte de
Variao
g/ Soma dos
Quadrados
Quadrado mdio F P
Paralelismo
Fases x
preparaes
Fases x
regresso
Erro I
1
1

1

44
173.8
41.64

28.60

14 545.64
173.8
41.61

28.60

330.58
0.53
0.13

0.09


>0.05
>0.05

>0.05

Blocos
(camundongos)
Preparaes
Regresso
Fases
Fases x
Paralelismo
Erro II
47

1
1
1
1

44
14 789.73

183.15
10 057.32
57.35
0.19

2 673.39
314.67

183.15
10 057.32
57.35
0.19

60.76


3.01
165.52
0.94
0.00



>0.05
<0.01
>0.05
>0.05


Total 95 27 761.13

As soma de quadrados foram obtidos empregando-se as frmulas das Tabelas 13 e 14.

N = 96
n = 24
K = (Ey)
2
/N = 4 484.0
2
/96 = 209 440.17
Ey2 = 237 201.30
Vigilncia Sanitria Digital 231
Total = 237 201.30 209 440.17 = 27 761.13

448 959.8
Blocos = ----------------- - 209 440.17 = 14 789.73
2

2175.7
2
+ 2308.3
2

Preparaes = ------------------------ - 209 440.17 = 183.15
48

2279.1
2
+ 2204.9
2

Fases = ----------------------- - 209 440.17 = 57.35
48

[(-426.7) + (-555.9)]
2

Regresso = ------------------------------ = 10 057.32 = E
96

(-426.7)
2
+ (-555.9)
2

Paralelismo = ------------------------------ - 10 057.32 = 173.88
48

(- 465.1)
2
+ (- 517.5)
2

Fases x regresso = ------------------------------- - 10 057.32 = 28.60
48

(-199.2)
2
+ (-227.5)
2
+ (-265.9)
2
+ (-290.0)
2
Fases x paralelismo = ----------------------------------------------------------- 10 057.32 - 173.88 - 28.60 =
0.19
24

1090.6
2
+ 1085.1
2
+ 1188.5
2
+ 1119.8
2

Fases x preparaes = --------------------------------------------------------- 209 440.17 - 57.35 - 183.15 =
41.61
24

Erro I = 14 789.73 173.88 41.61 28.60 = 14 545.64
Erro II = 27 761.13 14 789.73 183.15 10 057.32 57.32 0.19 = 2 673.39

Validade do ensaio
O ensaio cumpre as condies de validade:
a) regresso significativa, F calculado 162.52 menor que o valor crtico da Tabela 5,
para p=0.01, gl1 = 1 e gl2 = 44;
b) paralelismo no significativo, F calculado 0.53 menor que o valor crtico da Tabela 4,
para p=0.05, gl1 = 1 e gl2 = 44, e
c)nenhuma das trs interaes foi significativa, os trs valores de F calculados: 0.13, 0.09
e 0.00 foram menores que o valor crtico da Tabela 4 para p=0.05, gl1 = 1 e gl2 = 44.
Clculo da estimativa de potncia e limites de confiana utilizar frmulas 10 a 15.

I = log 120 log 60 = 2.0792 1.7782 = 0.301
t = 2.01 com 44 g/ da Tabela 3.
(-426.7) + (-555.9)
b = ------------------------- = 68.01
24 x 2 x 0.301

2175.7
Yp = ------------ = 45.33
2 x 24

2308.3
Vigilncia Sanitria Digital 232
YA = ------------- = 48.09
2 x 24

48.09 45.33
M = ---------------------- = 0.0406
- 68.01
SA = 27.4 log SA = 1.4377
M = 0.0406 + 1.4377 = 1.3971
Potncia estimada: R = antilog 1.3971 = 24.95 Ul/ml
10 057.32
C = ---------------------------------- = 1.025
[10 057.32 60.76 (2.01)
2
]
C = 1, da Tabela 15
M s
= 1.025 (-0.0406) + ou - (1.025-1) [1.025 (-0.0406)
2
+ 1 (0.301)
2
]
Mi
M s = 0.0064
M i = 0.0896
Logaritmo dos limites de confiana
Ms = 0.0064 + 1.4377 = 1.4441
Mi = 0.0896 + 1.4377 + 1.3481
Limites de confiana da potncia
Rs = antilog 1.4441 = 27.80 Ul/ml
Ri = antilog 1.3481 = 22.29 Ul/ml

Exemplo 6: Mdias mveis

Ensaio de heparina pelo mtodo de inibio da coagulao de plasma ovino citrato
As doses utilizadas do padro, em ml foram: p1 = 0.78; p2 = 0.76; p3 = 0.74; p4 = 0.72; p5
= 0.70 e p6 = 0.68. Doses equivalentes (a) da amostra foram preparadas com base na potncia
suposta SA = 140.6 Ul/mg.
O ensaio foi desenvolvido conforme est descrito no mtodo de avaliao de heparina
neste volume.

Foram realizados trs ensaios. A ttulo de exemplo do clculo de M, somente se
desenvolver o ensaio N.1.
Os graus de coagulao encontra-se na tabela 33.

Tabela 33 Exemplo 6: Graus de coagulao = 7


Tubos
Padro P Amostra A
P
ml

y
a
ml

y
1
2
3
4
5
6
0,78
0,76
0,74
0,72
0,70
0,68
0,00
0,00
0,50
0,75
1,00
1,00
0,78
0,76
0,74
0,72
0,70
0,68
0,00
0,25
0,75
1,00
1,00
1,00

Tabela 34 Exemplo 6: Mdias emparelhada


Tubo
Padro P Amostra A
log dose
(ml x 10)
x
P


mdias
log dose
x
iP

mdias
grau coagulao
y
iP

log dose
(ml x 10)
x
A

mdias
log dose
x
iA

mdias
grau coagulao
y
iA

Vigilncia Sanitria Digital 233
1
2
3
4
5
6
0,8921
0,8928
0,8092
0,8573
0,8451
0,8325
-
0,8807
0,8691
0,8572
0,8450
-
-
0,167
0,417
0,750
0,917
-
0,8921
0,8928
0,8092
0,8573
0,8451
0,8325
-
0,8807
0,8691
0,8572
0,8450
-
-
0,333
0,667
0,917
1,000
-

Clculo da estimativa de potncia e limite de confiana utilizar frmula 27.28 e 40 a 45.

xip = 0,8691 yip = 0,417
x
(i + 1) P
= 0,8572 y
(i + 1) P
= 0,750

0,8572
xp = 0,8691 + (0,417 - 0,5) ----------------------
0,417 0,750

xiA = 0,8807 yiA = 0,333
x = 0,8691 y = 0,667

271
(i + 1)A (i + 1)A 0,8691 0,8807
xA = 0,8807 + (0,333 0,5 ) ---------------------- = 0,8749
0.333 - 0,667
SA = 140,6 Ul/mg
M1 = 0,8661 0,8749 + log 140,6
M1 = 2,1392
Supondo que outros dois ensaios realizados com a mesma amostra
Forneceram as estimativas :
M2 = 2,1995 e m3 = 2,1805, calcular M
M = (2,1392 + 2,1995 + 2,1805) /3 = 2,1731
R = antilog M = 149.0 Ul/mg

Calcular a varincia do erro
s2 = (14,1686 42,4999/3) /2

s2 = 0,001 s = 0,001 = 0,0316
n = 3
t = 4.3 (Tabela 3 gl = 2)
Calcular o intervalo de confiana
2 x 0.0316 x 4.3
L = ----------------------- 0.1569
1.7321

L/2 = 0,0784
Ms = 2,1731 + 0,0784 = 2,2515
Mi = 2,1731 0,0784 = 2,0947
Rs = 178,4
Ri = 124,4
Tabelas 33 e 34.

VI.10.3. EXEMPLO DE ENSAIO INDIRETO * TUDO OU NADA *

Exemplo 7: Ensaio dicotmico de duas doses, mtodo de probitos simplificado
Ensaio de insulina pelo mtodo de convulso em camundongos

As doses utilizadas do padro foram p1 = 18mUI/camundongo e p2 =
30mUI/camundongo.
Doses equivalentes da amostra (ai = 18mUI/camundongo e a2 = 30mUI/camundongo)
foram preparadas com base na potncia suposta SA = 40UI/ml.
Vigilncia Sanitria Digital 234
Os camundongos foram injetados subcutaneamente com 0.25ml/camundongo da soluo
respectiva. Previamente foram divididos ao acaso em quatro grupos, que receberam,
respectivamente, cada dose do ensaio conforme est descrito no ensaio de insulina, neste
volume.

Tabela 35 Exemplo 7: Respostas (% de camundongos em convulso)

Padro P

Amostra A
p1 p2 a1 a2
Nmero de camundongos
Injetados (n)
Nmero de camundongos
em convulso
porcentagem de
respostas (%)

30

9

30.0

28

17

60.7

28

11

39.3

24

18

75.0

9.75
2
+ 10.4
2

Preparaes = ------------------------- - 101.5056= 0.1056
2

(0.79 + 0.94)
2

regresso = ------------------------- - 0.7482 = E
4

0.79
2
+ 0.94
2

Paralelismo = ------------------------- - 0.748 = 0.0056
2
s
2

Ewn
K
= ------------------------------------------------------------- = 0.0616
30(0.576) + 28(0.619) + 28(0.619) + 24(0.540)

Validade do ensaio

O ensaio cumpre as condies de validade:
a) regresso significativa, F calculada 12.15 maior que o valor crtico da Tabela 5;
para p = 0.01, gl
1
= 1 e gl
2
= infinito.
e

Tabela 36 Exemplo 7: Transformao em probitos, totais e contrastes



Padro P Amostra A
p
1
p
2
a
1
a
2

Probito (Tabela 16)
Ponderao w (Tabela 17)
Preparao
Contraste linear
P
1
= 4,48
0,576
p = 9,75
L
p
= 0,79
p
2
= 5,27
0,619
A1 = 4,73
0,619
a = 10,4
L
A
= 0,94
A
2
= 5,67
0,540
Ey = 20,15
EL = 1,73
Resultados obtidos com as frmula da Tabela 8.

Tabela 37 Exemplo 7: Anlise de varincia

Fonte da variao gl Soma de quadrados Quadrado mdio F P
Preparaes
Regresso
Paralelismo
Erro
1
1
1
infinito
0,1056
0,7482
0,0056

0,1056
0,7482
0,0056
2
s = 0,0616
1,71
12,15
0,09
>0,05
<0,01
>0,05
As somas de quadrados foram obtidas empregando-se
as frmulas da Tabela 10, formando n = 1.

Vigilncia Sanitria Digital 235
b) desvio de paralelismo no significativo, F calculado 0.09 menor que o
valor crtico da Tabela 4, para p = 0,05; gl1 = 1 e gl2 = infinito.

Clculo da estimativa de potncia e limites de confiana

Utilizar frmulas 10 e 15
I = log 30 log 18 = 1,4771 1,2553 = 0,2219
t = 1,96 com gl = infinito e p = 0,05 (da Tabela 3)

0,79 + 0,94
b = -------------- = 3,9318
2(0,2219)

9,75
yp = --------- = 4,87
2
10.4
y -------- = 5,20
2

5,20 4,87
M = -------------- = 0,0839
3,9318

SA = 40,0 log SA = 1,6021
M = 0,0839 + 1,6021 = 1,6860
RA = antilog 1,6860 = 48.53 Ul/ml = Potncia estimada

0.7482
c = ----------------------------= 1,4625
[0,7482 0,0616(1,96)
2
]
c = 1 (da Tabela 15)

Ms
= 1,46125 x 0,0839 + ou - 0,4625 [1,4625 (0,0839)
2
+ (0,2219)
2
|
Mi
Ms
= 0,1227 + ou 0,1658
Mi
Ms = 0,2885 Mi = 0,0431
Logaritmo dos limites de confiana
Ms = 0,2885 + 1,6021 = 1,8906
Mi = 0,0431 + 1,6021 = 1,5590
Limites de confiana da potncia
Rs = 77,73Ul/ml
Ri = 36,22Ul/ml
Usando o mtodo completo de anlise de probitos, obteve-se uma estimativa de potncia
de 48.48 com limites de 35.9 e 75.92Ul/ml.

VI.10.4. EXEMPLO DE COMBINAO DE ESTIMATIVA DE POTNCIA

Exemplo 8: Combinao de estimativa de potncia

Combinao de ensaio de corticotrofina pelo mtodo de depleo de cido ascrbico supra-renal
em ratas hipofisectomizadas

Trs ensaios independentes de mesma amostra foram realizados conforme procedimento
descrito neste volume (VI.8). Os resultados de ensaios se encontram na Tabela 38.

Tabela 38
Vigilncia Sanitria Digital 236
Clculo da potncia mdia ponderada
E M w 2058,6174
M = ----------- = --------------- = 1,3966
E w 1474,0148
R = antilog 1,3966 = 24,9
Teste de homogeneidade dos log das estimativas de potncia.

X
2
= E w (M M)
2
= 5.5
M
2
X
gl
= 2 p = 0.05 (Tabela 18) = 5,9

Como x
2
calculado maior que o valor crtico, no se tem elementos para suspeitas de
heterogeneidade.

Clculo dos limites de confiana

s
M
= 1/Ew = 1/1474,0198 = 0,0260

Ms
= M + ou 1,98 x 0,0260
Mi
Ms = 1,4226
Mi = 1,3700
Rs = 26,5
Ri = 23,5
VII. RADIOFRMACOS

Radiofrmacos so preparaes contendo um ou mais radionucldeos. Alm de atender
s especificaes farmacopicas, os radiofrmacos tem a sua produo, suprimento, estocagem,
uso e despejo regulamentados por outras normas governamentais pertinentes em vigor.

Nucldeo Espcie de tomo caracterizado pelo nmero de prtons e nutrons contidos
em seu ncleo (ou seja, pelo seu nmero atmico e pela massa atmica).
Istopos Nucldeos do mesmo elemento qumico, isto , como o mesmo nmero
atmico e massa atmica diferente.
Radioistopos Istopos radiativos.
Radionucldeo Nucldeo radiativos.
Radiatividade (ou atividade) propriedade que certos nucldeos tem de emitirem
radiao por transformao espontneas de seus ncleos. A radiatividade de uma preparao o
nmero de transformaes nucleares por unidade de tempo que ocorre numa determinada
quantidade da preparao. Estas transformaes podem envolver a emisso de partculas
carregadas, captura de eltrons ou transio isomrica. As partculas carregadas emitidas do
ncleo podem ser partculas alfa (ncleos de hlio, de nmero de massa 4) ou partculas beta
(eltrons de carga negativa ou positiva, respectivamente B- ngatron ou B+ - psitron). A
emisso de partculas carregadas pode ser acompanhada de raios gama, os quais tambm so
emitidos no processo de transio isomrica. Esta emisso de raios gama pode ser parcialmente
substituda pela ejeo de eltrons, conhecidos como eltrons de converso interna. Esse
fenmeno, assim como o processo de captura de eltrons, causa emisso secundria de raios x,
devido reorganizao de eltrons no tomo. Esta emisso secundria pode, por si mesma, ser
substituda parcialmente pela ejeo de eltrons conhecidos como eltrons Auger. Raios x,
eventualmente acompanhados pelos raios gama, so emitidos no processo de captura de
eltrons. Partculas B+ so aniquiladas em contato com a matria; este processo acompanhado
pela emisso de raios gama com energia de 0.511MeV.
Desintegrao Transformao na qual o ncleo emite uma ou mais partculas.
Tempo de meia vida - Tempo no qual a quantidade de radionacldeos decai metade
do valor inicial. A meia vida relacionada constante de decaimento () pela equao:

0.693
T
1/2
= -------------
Vigilncia Sanitria Digital 237


Decaimento radiativo A radiatividade decai em razo exponencial, que caracterstica
para cada radionucldeo. A atividade em qualquer tempo, pode ser calculada pela expresso

A = A
O
e
- t


em que
A = atividade no tempo,
A
O
= atividade inicial,
= constante de decaimento (tambm denominada de desintegrao ou constante de
transformao, i .e. , a frao de tomos radiativos que sofrem transformaes na unidade de
tempo, desde que este tempo seja curto em comparao com a meia vida),
t = tempo decorrido,
e = base de logaritmos neperianos.

Atividade especfica (ou radiatividade especfica) - Radiatividade do radionucldeo
relacionada massa unitria do elemento ou composto; comumente referida atividade de 1g
da substncia especificada na monografia:
N x 0.693
S = -------------------- desintegrao /s/g
w ou M x T1/2
em que
s = radiatividade especfica,
N = nmero de Avogadro,
w = peso atmico,
M = peso molecular.

Concentrao radiativa A concentrao radiativa da soluo a radiatividade do
radionucldeo contida no volume unitrio e geralmente referida como atividade por 1ml.
Como ocorre com todas as especificaes envolvendo radionucldeos, necessrio
declarar a data e, no caso de radionucldeos com meia vida curta, a hora na qual a
concentrao radiativa foi determinada.
Carreador Istopo estvel do radionucldeos em questo adicionado preparao
radiativa na forma qumica idntica quela na qual radionucldeos est presente.
Pureza radiativa razo, expressa em porcentagem, da radiatividade do radionucldeo
relacionada com o total da radiatividade da fonte.
Pureza radioqumica Razo, expressa em porcentagem, da radiatividade do
radionucldeo em questo presente na fonte na forma qumica declarada, relacionada ao total da
radiatividade do radionucldeo presente na fonte.
Pureza qumica Razo, em porcentagem, da massa da substncia presente na forma
qumica declarada e o total da massa contida na fonte, desprezados expicientes ou solventes.
Identificao de radionucldeos Um radionucldeo identificado pelo tempo de meia
vida, pela natureza e energia da sua radiao, conforme descrito na monografia.
Medida do tempo de meia vida A meia vida medida com auxlio de aparelhos de
deteco, tais como cmara de ionizao, contador Geiger-Mieller ou contador de cintilaes. Os
radiofrmacos podem ser utilizados diretamente, secos ou aps diluio conveniente. A
quantidade de radiatividade, consideradas as condies experimentais, deve ser suficientemente
alta para permitir a deteco durante vrias meias vidas presumveis, porm no alta demais,
para evitar o fenmeno de perda de contagens devida, por exemplo, no tempo morto do tubo
Geiger-Mueller.
A fonte radiativa preparada de modo a evitar perdas durante sua manipulao.
Amostras lquidas devem ser examinadas e contidas em frascos ou tubos selados. Produtos
slidos devem ser protegidos por copa de folha adesiva de acetato de celulose, ou outro material
cuja massa por unidade de rea seja suficientemente pequena para no atenuar quantidade
significativa da radiao em estudo. A massa fonte medida em condies geomtricas idnticas
e em intervalos que correspondem usualmente metade da meia vida e pelo tempo
correspondente a, aproximadamente, trs meias vidas. O funcionamento correto do
equipamento verificado atravs do uso de uma fonte permanente e as variaes da contagem
so corrigidas, se necessrio, conforme descrito em medida da radiatividade. Traa-se uma
Vigilncia Sanitria Digital 238
curva, lanando-se o tempo no eixo das abcissas e, no eixo das ordenadas, o logaritmo do
nmero de impulsos contado por unidade de tempo, ou a corrente eltrica, conforme o tipo do
equipamento usado. A meia vida calculada a partir desta curva no deve diferir por mais de 5%
do especificado na respectiva monografia.

Determinaes da natureza e da energia da radiao A natureza e a energia da
radiao emitida podem ser determinadas por diversos procedimentos, que incluem a elaborao
da curva de atenuao usada geralmente para a determinao da energia da radiao beta; a
espectrometrias usada, principalmente, para determinao da energia da radiao gama.
Curva de atenuao Elaborada para emissores beta puros ou para emissores beta-
gama, quando no h disponibilidade de espectrmetro de raios gama. Este mtodo de
determinao de energia mxima da radiao beta fornece apenas valores aproximados.
A fonte, montada convenientemente para proporcionar condies geomtricas
constantes, colocada em frente janela delgada do contador Geiger-Mueller e protegida
conforme descrito em Medida do tempo meia vida. A contagem da fonte , ento, medida. Entre
a fonte e o contador so colocados, nesta ordem, pelo menos seis telas de alumnio, de massa
crescente por unidade de rea, dentre de limites tais que para o absorvedor de maior massa por
unidade de rea seja obtida velocidade constante de contagem. Com emissores beta puros a
velocidade de contagem no afetada pelo acrscimo de absorveres adicionais.
Os absorvedores so inseridos de modo tal que as condies geomtricas sejam
mantidas constantes.
Constri-se uma curva colocando em abcissas a massa por unidade de rea do
absorvedor expressa em mg/cm e, em ordenadas, o logaritmo do nmero de impulsos contados
por unidade de tempo para cada um dos absorvedores utilizados. Curva idntica elaborada
utilizando-se o padro. O resultado calculado em relao parte mediana praticamente
retilnea, das curva.
Clculo do coeficiente de atenuao da massa O coeficiente de atenuao da massa
em cm por mg, depende da energia da emisso beta e das propriedades fsicas e qumicas do
absorvedor. Isto permite a identificao de emisso beta e o coeficiente calculado, a partir de
curvas construdas como descrito anteriormente, pela

Expresso
2,303
m = --------- (log A1 log A2)
m
2
m
1

em que

m1 = massa, por unidade de rea, do absorvedor mais leve,
m2 = massa, por unidade de rea, do absorvedor mais pesado (medir ml em m2 dentro da
parteretilnea da curva),
A1 = velocidade de contagem para massa por unidade de rea m1,
A2 = velocidade de contagem para massa por unidade de rea m2.

O coeficiente de atenuao assim calculado no deve diferir por mais de 10% do
coeficiente obtido em condies idnticas com o padro do mesmo radionucldeo.
Espectrometriagama Baseia-se na propriedade que certas substncias (cintiladores)
tem de emitirem luz quando bombardeadas por raios gama. O nmero de ftons produzidos
proporcional energia absorvida pelo cintilador. A luz transformada em impulsos eltricos de
amplitude aproximadamente proporcional energia dissipada pelos ftons gama. A anlise dos
impulsos de sada fornece, com auxlio do analisador de pulsos, o espectro de energia da fonte.
Os espectros de cintilao de raios gama mostram u ou mais picos caractersticos
correspondentes s energias da radiao gama na fonte. Estes picos so acompanhados por
outros, mais ou menos largos, devidos a efeitos secundrios da radiao no cintilador ou ao
material em torno do mesmo. A forma do espectro varia de acordo com o equipamento utilizado,
tornando-se necessrio calibr-lo com auxlio de padro do radionucldeo em questo.
O espectro de raios gama do radionucldeo que os emite prprio do mesmo, sendo
caracterizado pelo nmero de raios gama de energia individualizada por transformao. Esta
propriedade pode ser utilizada para identificar quais radionucldeos esto presentes na fonte e as
quantidades de cada um deles. Possibilita, tambm, avaliar o grau de impurezas presentes, pela
deteco dos picos estranhos queles esperados.
Vigilncia Sanitria Digital 239
O detector preferido para a espectrometria de raios gama um detector semicondutor de
energia ativado com ltio. Tais equipamentos podem ter resoluo (largura total) do pico meia
altura mxima de 2.0 a 2.5 keV em 1.3 MeV, possibilitando a identificao dos picos que se
distanciam por 5 keV no espectro de raios gama. Os detectores de cintilao de iodeto de sdio
ativados com tlio. Tambm podem ser usados, porm, com resoluo menor (50 keV,
aproximadamente). A sada de cada um destes detectores ocorre na forma de pulsos eltricos,
cuja a amplitude proporcional dos raios gama detectados. Aps amplificao, estes pulsos
so analisados em analisador multicanal, que fornece o espectro de energia gama da fonte. A
relao entre energia gama e o nmero do canal pode ser facilmente estabelecida utilizando-se
fontes de raios gama de energia conhecida. O sistema de deteco deve ser calibrado, pois a
eficincia do detector funo da energia da radiao gama, da forma da fonte e da distncia da
fonte ao detector. A eficincia da deteco pode ser medida com auxlio de fonte calibrada do
radionucldeo em questo ou, para trabalho mais genrico, pode ser construda uma curva de
eficincia versus energia gama a partir de uma srie de fonte calibradas de vrios radionucldeos.
A utilizao de detector de baixa resoluo poder trazer alguma dificuldade em
identificar as impurezas, pois os picos no espectro podem no estar resolvidos. Neste caso
recomendvel a determinao da meia vida por medidas repetitivas na amostra.
possvel estabelecer a razo do decaimento da radiatividade no espectro desde que os
picos diminuam em amplitude em funo da meia vida. Se, numa fonte, a impureza radiativa de
meia vida mais longa estiver presente, a massa facilmente detectvel pelo isolamento e
identificao de picos caractersticos, cuja amplitude decrescem em velocidades diferentes
daquelas do radionucldeo esperado. A determinao da meia vida de picos interferentes por
medidas repetitivas na amostra ajudar na identificao da impureza.
Medida de radiatividade A medida da radiatividade de uma amostra somente pode ser
efetuada se o esquema de decaimento do nucldeo conhecido e est baseado no mtodo de
coincidncia, no qual a emisso beta e a emisso gama so contadas em separado e em
coincidncia, com auxlio de equipamento apropriado. Trs medidas so suficientes para detectar
a eficincia dos contadores e as velocidades absolutas de desintegrao. Na pratica, muitas
correes podem ser necessrias para obter resultados precisos.
mais comum utilizar medidas comparativas de solues contra fonte padro. Utilizando
contador Geiger-Mueller, contador proporcional, contador de cintilao ou cmara de ionizao. O
contador Geiger-Mueller utilizado para medir emissores beta e beta gama. Contadores de
cintilao e semicondutores so utilizados para medir raios gama; emissores beta de baixa
energia necessitam de contador de cintilao lquido. Alternativamente, pode ser usado um
instrumento calibrado pela referncia a uma fonte padro.
Qualquer que seja o equipamento usado, essencial que se trabalhe em condies
geomtricas extremamente bem definidas, de modo que a fonte radiativa esteja sempre na
mesma posio no aparelho e, consequentemente, sua distncia do dispositivo de medio seja
constante e permanea a mesma enquanto a amostra substituda pelo padro.
Solues de radiofrmacos contendo emissores de raios gama podem ser medidas
diretamente com auxlio de aparelhos com a cmara de ionizao ou detector de cintilao de
poo. Entretanto, para emissores beta de energia alta e moderada podem ser empregados o
contador Geiger-Mueller e o contador de cintilador de cristal plano, sendo tambm comum a
contagem no resduo aps evaporao. Recomenda-se cobrir o resduo seco com fita adesiva de
acetato celulose, cuja massa por unidade de rea seja inferior a 10mg por cm
2
, de modo que a
absoro da radiatividade seja desprezvel.
O resduo de evaporao da soluo padro deve ser tanto quanto possvel idntico ao
da soluo em exame. Isto , as duas solues devem conter os mesmos sais nas mesmas
concentraes e a evaporao deve ser conduzida nas mesmas condies, idnticas dimenses
de superfcie e de mesmo material. Quando estas precaues so tomadas os resultados obtidos
so satisfatrios, qualquer que seja o equipamento. necessrio assegurar que a eficincia do
equipamento de medio permanea constante durante o tempo de medio, verificada pelo uso
de fonte secundria, ou seja, radionucldeo de vida longa.
Emissores beta de baixa energia podem ser medidos por um detector lquido de
cintilaes. A amostra na soluo de uma ou mais (geralmente duas) substncias orgnicas
fluorescentes (cintiladores primrios e secundrios), que convertem parte da energia de
desintegrao em ftons de luz, os quais so detectados e convertidos em impulsos eltricos no
fotomultiplicador. Quando se utiliza o contador de cintilao lquida, medidas comparativas devem
ser corrigidas devido aos efeitos de interferncia da luz. medidas diretas devem ser feitas em
Vigilncia Sanitria Digital 240
condies que assegurem que as condies geomtricas sejam constantes (volumes idnticos
dos recipientes e solues).
Todas as medidas de radiatividade devem ser corrigidas pela subtrao da atividade da
radiao de fundo, devido radiatividade do meio e aos sinais esprios gerados no prprio
aparelho. Em certos equipamentos, nos quais a contagem feita em altos nveis de atividade, a
correo pode ser necessria, em razo das perdas por coincidncia, devidas ao tempo de
resoluo do detector e do equipamento eletrnico associado.
Para sistema com tempo de paralisao fixo (), aps cada contagem a correo dada
pela equao
No
N = --------------
1 No
em que
N = contagem de velocidade por secundo,
No = contagem por segundo medido,
= tempo de paralisao em segundos.

evidente que esta correo ser aceitavelmente pequena somente se o produto No
for muito pequeno. Com equipamentos mais modernos a correo feita automaticamente.
Correes da perda por coincidncia devem ser feitas antes das correes para radiao de
fundo.
Determinaes de radiatividade mostram variaes estatsticas porque esto
relacionadas probabilidade de desintegrao nuclear. Nmero suficiente de contagens deve ser
feito para compensar variaes no nmero de desintegrao por unidade de tempo. Pelo menos
10.000 registros so necessrios para obter desvio padro de no mais de 1%.

Teor de radiatividade

As quantidades de radiatividade no Sistema Internacional (SI) so medidas em unidades
becquerel (Bq), que igual a 1 transformao nuclear por segundo (equivalente a
aproximadamente 2,7 x 10 curies).
A atividade decai em razo exponencial, que caracterstica de cada radionucldeo. A
determinao da atividade somente verdadeira no tempo de referncia especificado. A
radiatividade em outros tempos pode ser calculada a partir da equao exponencial ou pela
tabela ou, ainda pode ser obtida graficamente da curva estabelecida para cada radionucldeo.
Todas as determinaes do teor de radiatividade devem ser acompanhadas de declarao da
data, e, se necessrio, da hora em que as medidas foram feitas. A medida da radiatividade de
amostra em soluo calculada em relao ao volume original da mesma e expressa por unidade
de volume concentrao radiativa.

Pureza radionucldica

Para estabelecer a pureza radionucldica da preparao, a radiatividade e a identidade de
cada radionucldeo presente devem ser conhecidas. O mtodo mais comumente utilizado para
examinar a pureza radionucldica o da espectrometria gama. No mtodo totalmente preciso
porque as impurezas beta-emissoras geralmente no so detectveis e, quando so empregados
detectores de iodeto de sdio, os picos devidos s impurezas so freqentemente encobertos
pelo espectro do radionucldeo principal.
A monografia estabelece as exigncias gerais para a pureza radionucldica (por exemplo,
o espectro de raios gama no deve diferir significativamente daquele da fonte padro) e pode
estabelecer limites para impurezas radionucldicas especficas (por exemplo, cobalto 60 em
cobalto 57). Estas exigncias so necessrias, embora elas por si s no sejam suficientes para
assegurar que a pureza radionucldica da preparao suficiente para uso humano. O fabricante
deve examinar seus produtos em pormenores e, especialmente, as preparaes de
radionucldeos de vida curta devem ser analisadas quanto presena de impurezas de vida
longa, aps perodo conveniente de decaimento. Desta maneira, podem ser obtidas informaes
sobre a convenincia dos processos de fabricao e a adequao dos procedimentos de controle.

Pureza radioqumica

Vigilncia Sanitria Digital 241
A determinao da pureza radioqumica consiste na separao de substncia qumicas
diferentes que o radionucldeo contm e a medida da radiatividade ligada substncia qumica
declarada.
Consequentemente, na determinao da pureza radioqumica podem ser usados todos os
mtodos de separao analtica. Entretanto, consideraes sobre presteza e simplicidade levam a
preferir a cromatografia em papel ou em camada delgada e, em certos casos, a eletroforese em
papel ou filme de acetato de celulose. Devido radiatividade devem ser tomadas precaues
adicionais.
Na cromatografia, na linha de partida deve ser depositado volume igual a 10 l ou menor,
como descrito em procedimentos gerais.
prefervel no diluir a preparao em exame, mas importante evitar depositar
quantidade tal que perdas de contagem por coincidncia venham ocorrer durante a medida da
radiatividade.
Considerando as massas muito pequenas do material radiativo aplicado aos
cromatogramas, o uso de carreadores , s vezes, necessrio e os mesmos podem ser
adicionados quando a monografia assim o prescrever.
Aps o desenvolvimento, o suporte seco e as posies das reas radiativas so
detectadas ou pela auto-radiografia ou pela medida da radiatividade ao longo do cromatograma,
com auxlio de contadores devidamente colimados, pelo corte das faixas e contagem de cada
uma delas ou por qualquer outro mtodo adequado.
As posies das manchas ou reas permitem identificao qumica por comparao com
solues das mesmas substncias qumicas (no radiativas), visualizadas por reao de cor ou
exames sob luz ultravioleta. A visualizao pela reao de cor direta da amostra radiativa nem
sempre possvel ou desejvel, j que o borrifamento com reagente de visualizao pode causar
difuso da substncia radiativa para alm das manchas ou reas identificadas.
Medidas de radiatividade podem ser feitas por integrao, utilizando-se equipamento
automtico ou contador digital. As propores das reas abaixo dos picos fornecem as relaes
das concentraes radiativas das substncias qumicas. Quando as tiras so cortadas em
pores, as razes das quantidades de radiatividade medidas fornecem as propores das
concentraes de espcies qumicas radiativas.

Atividade especfica
A atividade especfica calculada relacionando-se a concentrao radiativa (radiatividade
por unidade de volume) com a concentrao da substncia qumica em exame, aps a verificao
de que a radiatividade somente atribuvel ao radionucldeo (pureza radionucldica) e espcie
qumica (pureza radioqumica), em questo.

Esterilidade

Radiofrmacos para administrao parenteral devem ser preparados com precaues
que visem a excluir contaminaes bacteriana e assegurar esterelidade, devendo corresponder
ao Teste para Esterilidade da farmacopia.(V.5.1.1). Entretanto, dificuldades especiais podem
surgir no caso de radiofrmacos que so preparados em pequenos lotes e para os quais a
execuo do teste de esterilidade apresenta certo grau de risco radiolgico, esta considerao
especial deve ser levada em conta pelo fabricante na determinao do nmero de recipientes a
serem testados. Por causa das caractersticas radioativas das preparaes nem sempre
possvel aguardar o resultado do teste de esterilidade para liberar o lote para uso. O teste
constitui controle de qualidade da produo.

Pirognios

Algumas preparaes devem corresponder ao teste de pirognio, tomando-se as
precaues necessrias para evitar irradiao do pessoal envolvido no teste. Entretanto, por
causa da meiavida usualmente curta do radionucldeo presente na preparao e da radiatividade
relativamente alta que estas podem conter, difcil realizar o teste antes da liberao do lote ao
realizar o teste antes da liberao do lote ao consumo. Para evitar hipertermia, que pode ser
causada pelos pirognios, mas pela radiatividade da preparao, s vezes necessrio esperar
at que a radiatividade tenha decado a nveis previstos na monografia. Conduzido nestas
condies, o teste constitui controle de qualidade da produo.
Vigilncia Sanitria Digital 242
Recomenda-se ao produtor verificar previamente a ausncia de pirognios nas solues
que sero utilizadas como matria-prima na preparao.
O teste oficial pode no ser adequado para alguns radiofrmacos; por exemplo, pode no
ser suficientemente sensvel para aqueles destinados administrao por qualquer via que d
acesso ao fludo cerebroespinal. Neste caso o teste, aps liberao ao uso, pode ser inaceitvel.
Nestas circunstncias, pode ser utilizado o teste que emprega o lisado de lmulus do amebcito.

ESTABILIDADE E ARMAZENAGEM

Proteo

Os radiofrmacos devem ser mantidos em recipientes bem vedados e em local
suficientemente protegido para evitar irradiao do pessoal por emisses primrias ou
secundrias, de acordo com regulamentos nacionais e internacionais sobre manuseio de
substncias radiativas.
O poder penetrante de cada radiao varia consideravelmente de acordo com sua
natureza e energia. Partculas alfa so completamente absorvidas por espessuras de slidos ou
lquidos que variam de alguns a dezenas de micrometros; partculas beta so absorvidas
completamente na espessura de alguns mm a vrios cm. Raios gama no so completamente
absorvidos, mas somente atenuados, e uma reduo de 10 vezes pode requerer, por exemplo,
alguns cm de chumbo. Quanto mais denso o absorvente, menor o alcance de partculas alfa e
tambm maior a atenuao de raios gama.

Decomposio induzida pela radiao As preparaes de radiofrmacos tendem a ser
menos estveis do que os seus correspondentes inativos, ocorrendo a sua decomposio por
auto-irradiao e, por isto, devem ser utilizadas dentro de prazo curto. Os efeitos da radiao
primria incluem a desintegrao do tomo radiativo e a decomposio de molculas quando a
frao de energia de partcula emitida ou do raio gama absorvida por estas mesmas molculas
(efeito externo). Muitos fatores esto envolvidos, incluindo a energia e a natureza da radiao, a
atividade especfica e o tempo de armazenagem.
Os efeitos de radiao primria podem induzir efeitos secundrios devidos formao de
espcies excitadas, que podem degradar outras molculas presentes; por exemplo, as dos
solventes ou conservantes.
Tambm deve ser considerada a sucetibilidade oxidao e reduo de pequena
quantidade de espcies qumicas presentes. A excluso inicial de todos os traos de agentes de
oxidao e reduo nem sempre suficiente porque tais agentes podem formar-se
continuamente, por efeitos da radiao. Por isto, o tiossulfato de sdio includo na soluo de
iodeto de sdio (13
I
) para manter o iodeto na forma reduzida.
Durante o armazenamento, recipientes e solues podem escurecer devido
radiatividade emitida. Tal fato no determina, necessariamente, a deteriorao da preparao.

Conservantes

No obrigatria a adio de conservantes preparaes radiofarmacuticas
apresentadas em recipientes de doses mltiplas, exceto quando especificada na monografia
respectiva. Variaes nas dosagens, alteraes da dose com o tempo, em virtude do decaimento
da radiatividade, e a necessidade de reter, dentro de recipiente prprio, qualquer material para
uso futuro, requerem recipientes de doses mltiplas para muitas preparaes radiofacuticas. Os
conservantes antimicrobianos sofrem decomposio pela influncia da radiao e isto elimina seu
uso para radiofrmacos injetveis. Pode ser necessrio distribuir tais preparaes em frascos de
doses mltiplas, sem incorporao de conservantes antimicrobianos. Nestes casos, a no ser que
parte do contedo seja usada e a retirada de doses subsequentes seja necessrio, o recipiente
dever ser submetido a processo de esterilizao posterior, to logo quanto possvel, aps o uso
inicial e em seguida a cada um dos usos subsequentes. O importante verificar se as
caractersticas do material no foram adversamente afetadas.

Diluies

No caso em que sejam necessrias diluies prefervel utilizar veculos de mesma
composio que os presentes na preparao.
Vigilncia Sanitria Digital 243
Tais veculos e todo o equipamento usado devem estar isentos de poeiras e traos de
matria orgnica.
A quantidade de material radiativo presente na preparao , freqentemente, muito
pequena para ser medida pelos mtodos qumicos ou fsicos normais.

Considerando a frmula

1.16 x 10
26
B q g
- 1

s = --------------------------
w x t
1/2


em que
s
max
= atividade especfica mxima,
w = peso atmico,
t
1/2
= tempo de meiavida em horas.

Verifica-se que, por exemplo, para soluo de pertecnetato de sdio (99m
Tc
) com a concentrao
radiativa de 37 MBq (1 mC) por ml, a concentrao do pertecnetato pode ser to baixa quanto3 x
10
- 10
g/ml.

O comportamento de massas to pequenas em solues muito diludas pode requerer
consideraes especiais. s vezes, a adio de carregador inerte pode ser necessria para limitar
a absoro das superfcies do recipiente. Por este motivo, a injeo de fosfato de sdio (32
P
)
requer adio de fosfato.

Rotulagem

O rtulo de radiofrmacos deve conter as seguintes declaraes:
1) nome sob o qual descrito na monografia ou sininmia aprovada;
2) indicao de que o produto radiativo; a radiatividade total existente na data e hora indicadas;
3) para preparaes lquidas, a radiatividade total do recipiente ou a concentrao da
radiatividade por ml, na data e hora declaradas e o volume do lquido no recipiente; para slidos,
tais como liofilizados, a radiatividade total; para cpsulas, a radiatividade de cada cpsula e o total
de cpsulas por recipiente;
4) nome e endereo do fabricante;
5) referncia que consiste em figuras ou letras ou ainda uma combinao de letras e figuras pela
qual pode ser acompanhado o histrico da preparao;
6) data limite e o perodo de utilizao do produto;
7) referncia de que se trata de produto para uso mdico;
8) via de administrao;
9) nome e concentrao de estabilizadores ou conservantes antimicrobianos e
10) condies de armazenamento.

VII. RADIOFRMACOS

Radiofrmacos so preparaes contendo um ou mais radionucldeos. Alm de atender
s especificaes farmacopicas, os radiofrmacos tem a sua produo, suprimento, estocagem,
uso e despejo regulamentados por outras normas governamentais pertinentes em vigor.

Nucldeo Espcie de tomo caracterizado pelo nmero de prtons e nutrons contidos
em seu ncleo (ou seja, pelo seu nmero atmico e pela massa atmica).
Istopos Nucldeos do mesmo elemento qumico, isto , como o mesmo nmero
atmico e massa atmica diferente.
Radioistopos Istopos radiativos.
Radionucldeo Nucldeo radiativos.
Radiatividade (ou atividade) propriedade que certos nucldeos tem de emitirem
radiao por transformao espontneas de seus ncleos. A radiatividade de uma preparao o
nmero de transformaes nucleares por unidade de tempo que ocorre numa determinada
quantidade da preparao. Estas transformaes podem envolver a emisso de partculas
carregadas, captura de eltrons ou transio isomrica. As partculas carregadas emitidas do
Vigilncia Sanitria Digital 244
ncleo podem ser partculas alfa (ncleos de hlio, de nmero de massa 4) ou partculas beta
(eltrons de carga negativa ou positiva, respectivamente B- ngatron ou B+ - psitron). A
emisso de partculas carregadas pode ser acompanhada de raios gama, os quais tambm so
emitidos no processo de transio isomrica. Esta emisso de raios gama pode ser parcialmente
substituda pela ejeo de eltrons, conhecidos como eltrons de converso interna. Esse
fenmeno, assim como o processo de captura de eltrons, causa emisso secundria de raios x,
devido reorganizao de eltrons no tomo. Esta emisso secundria pode, por si mesma, ser
substituda parcialmente pela ejeo de eltrons conhecidos como eltrons Auger. Raios x,
eventualmente acompanhados pelos raios gama, so emitidos no processo de captura de
eltrons. Partculas B+ so aniquiladas em contato com a matria; este processo acompanhado
pela emisso de raios gama com energia de 0.511MeV.
Desintegrao Transformao na qual o ncleo emite uma ou mais partculas.
Tempo de meiavida - Tempo no qual a quantidade de radionacldeos decai metade do
valor inicial. A meiavida relacionada constante de decaimento () pela equao:

0.693
T
1/2
= -------------


Decaimento radiativo A radiatividade decai em razo exponencial, que caracterstica
para cada radionucldeo. A atividade em qualquer tempo, pode ser calculada pela expresso

A
O
= A e
- t


em que
A = atividade no tempo t,
A
O
= atividade inicial,
= constante de decaimento (tambm denominada de desintegrao ou constante de
transformao, i .e, a frao de tomos radiativos que sofrem transformaes na unidade de
tempo, desde que este tempo seja curto em comparao com a meia vida),
t = tempo decorrido,
e = base de logaritmos neperianos.

Atividade especfica (ou radiatividade especfica) - Radiatividade do radionucldeo
relacionada massa unitria do elemento ou composto; comumente referida atividade de 1g
da substncia especificada na monografia:
N x 0.693
S = -------------------- desintegrao /s/g
w ou M x T1/2

em que
s = radiatividade especfica,
N = nmero de Advogado,
w = peso atmico,
M = peso molecular.

Concentrao radiativa A concentrao radiativa da soluo a radiatividade do
radionucldeo contida no volume unitrio e geralmente referida como atividade por 1ml.
Como ocorre com todas as especificaes envolvendo radionucldeos, necessrio
declarar a data e, no caso de radionucldeos com meia vida curta, a hora na qual a
concentrao radiativa foi determinada.
Carreador Istopo estvel do radionucldeos em questo adicionado preparao
radiativa na forma qumica idntica quela na qual radionucldeos est presente.
Pureza radiativa razo, expressa em porcentagem, da radiatividade do radionucldeo
relacionada com o total da radiatividade da fonte.
Pureza radioqumica Razo, expressa em porcentagem, da radiatividade do
radionucldeo em questo presente na fonte na forma qumica declarada, relacionada ao total da
radiatividade do radionucldeo presente na fonte.
Pureza qumica Razo, em porcentagem, da massa da substncia presente na forma
qumica declarada e o total da massa contida na fonte, desprezados expicientes ou solventes.
Vigilncia Sanitria Digital 245
Identificao de radionucldeos Um radionucldeo identificado pelo tempo de meia
vida, pela natureza e energia da sua radiao, conforme descrito na monografia.
Medida do tempo de meiavida A meiavida medida com auxlio de aparelhos de
deteco, tais como cmara de ionizao, contador Geiger-Mieller ou contador de cintilaes. Os
radiofrmacos podem ser utilizados diretamente, secos ou aps diluio conveniente. A
quantidade de radiatividade, consideradas as condies experimentais, deve ser suficientemente
alta para permitir a deteco durante vrias meiasvidas presumveis, porm no alta demais,
para evitar o fenmeno de perda de contagens devida, por exemplo, no tempo morto do tubo
Geiger-Mueller.
A fonte radiativa preparada de modo a evitar perdas durante sua manipulao.
Amostras lquidas devem ser examinadas e contidas em frascos ou tubos selados. Produtos
slidos devem ser protegidos por copa de folha adesiva de acetato de celulose, ou outro material
cuja massa por unidade de rea seja suficientemente pequena para no atenuar quantidade
significativa da radiao em estudo. A massa fonte medida em condies geomtricas idnticas
e em intervalos que correspondem usualmente metade da meiavida e pelo tempo
correspondente a, aproximadamente, trs meiasvidas. O funcionamento correto do equipamento
verificado atravs do uso de uma fonte permanente e as variaes da contagem so corrigidas,
se necessrio, conforme descrito em medida da radiatividade. Traa-se uma curva, lanando-se o
tempo no eixo das abcissas e, no eixo das ordenadas, o logaritmo do nmero de impulsos
contado por unidade de tempo, ou a corrente eltrica, conforme o tipo do equipamento usado. A
meiavida calculada a partir desta curva no deve diferir por mais de 5% do especificado na
respectiva monografia.
Determinaes da natureza e da energia da radiao A natureza e a energia da
radiao emitida podem ser determinadas por diversos procedimentos, que incluem a elaborao
da curva de atenuao usada geralmente para a determinao da energia da radiao beta; a
espectrometrias usada, principalmente, para determinao da energia da radiao gama.
Curva de atenuao Elaborada para emissores beta puros ou para emissores beta-
gama, quando no h disponibilidade de espectrmetro de raios gama. Este mtodo de
determinao de energia mxima da radiao beta fornece apenas valores aproximados.
A fonte, montada convenientemente para proporcionar condies geomtricas
constantes, colocada em frente janela delgada do contador Geiger-Mueller e protegida
conforme descrito em Medida do tempo meiavida. A contagem da fonte , ento, medida. Entre
a fonte e o contador so colocados, nesta ordem, pelo menos seis telas de alumnio, de massa
crescente por unidade de rea, dentre de limites tais que para o absorvedor de maior massa por
unidade de rea seja obtida velocidade constante de contagem. Com emissores beta puros a
velocidade de contagem no afetada pelo acrscimo de absorveres adicionais.
Os absorvedores so inseridos de modo tal que as condies geomtricas sejam
mantidas constantes.
Constri-se uma curva colocando em abcissas a massa por unidade de rea do
absorvedor expressa em mg/cm e, em ordenadas, o logaritmo do nmero de impulsos contados
por unidade de tempo para cada um dos absorvedores utilizados. Curva idntica elaborada
utilizando-se o padro. O resultado calculado em relao parte mediana praticamente
retilnea, das curva.
Clculo do coeficiente de atenuao da massa O coeficiente de atenuao da massa
em cm por mg, depende da energia da emisso beta e das propriedades fsicas e qumicas do
absorvedor. Isto permite a identificao de emisso beta e o coeficiente calculado, a partir de
curvas construdas como descrito anteriormente, pela

Expresso
2.303
m = --------- (log A1 log A2)
m2 m1
em que
m1 = massa, por unidade de rea, do absorvedor mais leve,
m2 = massa, por unidade de rea, do absorvedor mais pesado (medir ml em m2 dentro da parte
retilnea da curva),
A1 = velocidade de contagem para massa por unidade de rea m1,
A2 = velocidade de contagem para massa por unidade de rea m2.

Vigilncia Sanitria Digital 246
O coeficiente de atenuao assim calculado no deve diferir por mais de 10% do
coeficiente obtido em condies idnticas com o padro do mesmo radionucldeo.
Espectrometriagama Baseia-se na propriedade que certas substncias (cintiladores)
tem de emitirem luz quando bombardeadas por raios gama. O nmero de ftons produzidos
proporcional energia absorvida pelo cintilador. A luz transformada em impulsos eltricos de
amplitude aproximadamente proporcional energia dissipada pelos ftons gama. A anlise dos
impulsos de sada fornece, com auxlio do analisador de pulsos, o espectro de energia da fonte.
Os espectros de cintilao de raios gama mostram u ou mais picos caractersticos
correspondentes s energias da radiao gama na fonte. Estes picos so acompanhados por
outros, mais ou menos largos, devidos a efeitos secundrios da radiao no cintilador ou ao
material em torno do mesmo. A forma do espectro varia de acordo com o equipamento utilizado,
tornando-se necessrio calibr-lo com auxlio de padro do radionucldeo em questo.
O espectro de raios gama do radionucldeo que os emite prprio do mesmo, sendo
caracterizado pelo nmero de raios gama de energia individualizada por transformao. Esta
propriedade pode ser utilizada para identificar quais radionucldeos esto presentes na fonte e as
quantidades de cada um deles. Possibilita, tambm, avaliar o grau de impurezas presentes, pela
deteco dos picos estranhos queles esperados.
O detector preferido para a espectrometria de raios gama um detector semicondutor de
energia ativado com ltio. Tais equipamentos podem ter resoluo (largura total) do pico meia
altura mxima de 2.0 a 2.5 keV em 1.3 MeV, possibilitando a identificao dos picos que se
distanciam por 5 keV no espectro de raios gama. Os detectores de cintilao de iodeto de sdio
ativados com tlio. Tambm podem ser usados, porm, com resoluo menor (50 keV,
aproximadamente). A sada de cada um destes detectores ocorre na forma de pulsos eltricos,
cuja a amplitude proporcional dos raios gama detectados. Aps amplificao, estes pulsos
so analisados em analisador multicanal, que fornece o espectro de energia gama da fonte. A
relao entre energia gama e o nmero do canal pode ser facilmente estabelecida utilizando-se
fontes de raios gama de energia conhecida. O sistema de deteco deve ser calibrado, pois a
eficincia do detector funo da energia da radiao gama, da forma da fonte e da distncia da
fonte ao detector. A eficincia da deteco pode ser medida com auxlio de fonte calibrada do
radionucldeo em questo ou, para trabalho mais genrico, pode ser construda uma curva de
eficincia versus energia gama a partir de uma srie de fonte calibradas de vrios radionucldeos.
A utilizao de detector de baixa resoluo poder trazer alguma dificuldade em
identificar as impurezas, pois os picos no espectro podem no estar resolvidos. Neste caso
recomendvel a determinao da meia vida por medidas repetitivas na amostra.
possvel estabelecer a razo do decaimento da radiatividade no espectro desde que os
picos diminuam em amplitude em funo da meiavida. Se, numa fonte, a impureza radiativa de
meiavida mais longa estiver presente, a massa facilmente detectvel pelo isolamento e
identificao de picos caractersticos, cuja amplitude decrescem em velocidades diferentes
daquelas do radionucldeo esperado. A determinao da meiavida de picos interferentes por
medidas repetitivas na amostra ajudar na identificao da impureza.
Medida de radiatividade A medida da radiatividade de uma amostra somente pode ser
efetuada se o esquema de decaimento do nucldeo conhecido e est baseado no mtodo de
coincidncia, no qual a emisso beta e a emisso gama so contadas em separado e em
coincidncia, com auxlio de equipamento apropriado. Trs medidas so suficientes para detectar
a eficincia dos contadores e as velocidades absolutas de desintegrao. Na pratica, muitas
correes podem ser necessrias para obter resultados precisos.
mais comum utilizar medidas comparativas de solues contra fonte padro. Utilizando
contador Geiger-Mueller, contador proporcional, contador de cintilao ou cmara de ionizao. O
contador Geiger-Mueller utilizado para medir emissores beta e beta gama. Contadores de
cintilao e semicondutores so utilizados para medir raios gama; emissores beta de baixa
energia necessitam de contador de cintilao lquido. Alternativamente, pode ser usado um
instrumento calibrado pela referncia a uma fonte padro.
Qualquer que seja o equipamento usado, essencial que se trabalhe em condies
geomtricas extremamente bem definidas, de modo que a fonte radiativa esteja sempre na
mesma posio no aparelho e, consequentemente, sua distncia do dispositivo de medio seja
constante e permanea a mesma enquanto a amostra substituda pelo padro.
Solues de radiofrmacos contendo emissores de raios gama podem ser medidas
diretamente com auxlio de aparelhos com a cmara de ionizao ou detector de cintilao de
poo. Entretanto, para emissores beta de energia alta e moderada podem ser empregados o
contador Geiger-Mueller e o contador de cintilador de cristal plano, sendo tambm comum a
Vigilncia Sanitria Digital 247
contagem no resduo aps evaporao. Recomenda-se cobrir o resduo seco com fita adesiva de
acetato celulose, cuja massa por unidade de rea seja inferior a 10mg por cm
2
, de modo que a
absoro da radiatividade seja desprezvel.
O resduo de evaporao da soluo padro deve ser tanto quanto possvel idntico ao
da soluo em exame. Isto , as duas solues devem conter os mesmos sais nas mesmas
concentraes e a evaporao deve ser conduzida nas mesmas condies, idnticas dimenses
de superfcie e de mesmo material. Quando estas precaues so tomadas os resultados obtidos
so satisfatrios, qualquer que seja o equipamento. necessrio assegurar que a eficincia do
equipamento de medio permanea constante durante o tempo de medio, verificada pelo uso
de fonte secundria, ou seja, radionucldeo de vida longa.
Emissores beta de baixa energia podem ser medidos por um detector lquido de
cintilaes. A amostra na soluo de uma ou mais (geralmente duas) substncias orgnicas
fluorescentes (cintiladores primrios e secundrios), que convertem parte da energia de
desintegrao em ftons de luz, os quais so detectados e convertidos em impulsos eltricos no
fotomultiplicador. Quando se utiliza o contador de cintilao lquida, medidas comparativas devem
ser corrigidas devido aos efeitos de interferncia da luz. medidas diretas devem ser feitas em
condies que assegurem que as condies geomtricas sejam constantes (volumes idnticos
dos recipientes e solues ).
Todas as medidas de radiatividade devem ser corrigidas pela subtrao da atividade da
radiao de fundo, devido radiatividade do meio e aos sinais esprios gerados no prprio
aparelho. Em certos equipamentos, nos quais a contagem feita em altos nveis de atividade, a
correo pode ser necessria, em razo das perdas por coincidncia, devidas ao tempo de
resoluo do detector e do equipamento eletrnico associado.
Para sistema com tempo de paralisao fixo (), aps cada contagem a correo dada
pela equao
No
N = --------------
1 No
t

em que
N = contagem de velocidade por secundo,
No = contagem por segundo medido,
t = tempo de paralisao em segundos.
evidente que esta correo ser aceitavelmente pequena somente se o produto No t for
muito pequeno. Com equipamentos mais modernos a correo feita automaticamente.
Correes da perda por coincidncia devem ser feitas antes das correes para radiao de
fundo.
Determinaes de radiatividade mostram variaes estatsticas porque esto
relacionadas probabilidade de desintegrao nuclear. Nmero suficiente de contagens deve ser
feito para compensar variaes no nmero de desintegrao por unidade de tempo. Pelo menos
10 000 registros so necessrios para obter desvio padro de no mais de 1%.

Teor de radiatividade

As quantidades de radiatividade no Sistema Internacional (SI) so medidas em unidades
becquerel (Bq), que igual a 1 transformao nuclear por segundo (equivalente a
aproximadamente 2,7 x 10
- 11
curies).
A atividade decai em razo exponencial, que caracterstica de cada radionucldeo. A
determinao da atividade somente verdadeira no tempo de referncia especificado. A
radiatividade em outros tempos pode ser calculada a partir da equao exponencial ou pela
tabela ou, ainda pode ser obtida graficamente da curva estabelecida para cada radionucldeo.
Todas as determinaes do teor de radiatividade devem ser acompanhadas de declarao da
data, e, se necessrio, da hora em que as medidas foram feitas. A medida da radiatividade de
amostra em soluo calculada em relao ao volume original da mesma e expressa por unidade
de volume concentrao radiativa.

Pureza radionucldica

Para estabelecer a pureza radionucldica da preparao, a radiatividade e a identidade de
cada radionucldeo presente devem ser conhecidas. O mtodo mais comumente utilizado para
examinar a pureza radionucldica o da espectrometria gama. No mtodo totalmente preciso
Vigilncia Sanitria Digital 248
porque as impurezas beta-emissoras geralmente no so detectveis e, quando so empregados
detectores de iodeto de sdio, os picos devidos s impurezas so freqentemente encobertos
pelo espectro do radionucldeo principal.
A monografia estabelece as exigncias gerais para a pureza radionucldica (por exemplo,
o espectro de raios gama no deve diferir significativamente daquele da fonte padro) e pode
estabelecer limites para impurezas radionucldicas especficas (por exemplo, cobalto 60 em
cobalto 57). Estas exigncias so necessrias, embora elas por si s no sejam suficientes para
assegurar que a pureza radionucldica da preparao suficiente para uso humano. O fabricante
deve examinar seus produtos em pormenores e, especialmente, as preparaes de
radionucldeos de vida curta devem ser analisadas quanto presena de impurezas de vida
longa, aps perodo conveniente de decaimento. Desta maneira, podem ser obtidas informaes
sobre a convenincia dos processos de fabricao e a adequao dos procedimentos de controle.

Pureza radioqumica

A determinao da pureza radioqumica consiste na separao de substncia qumicas
diferentes que o radionucldeo contm e a medida da radiatividade ligada substncia qumica
declarada.
Consequentemente, na determinao da pureza radioqumica podem ser usados todos os
mtodos de separao analtica. Entretanto, consideraes sobre presteza e simplicidade levam a
preferir a cromatografia em papel ou em camada delgada e, em certos casos, a eletroforese em
papel ou filme de acetato de celulose. Devido radiatividade devem ser tomadas precaues
adicionais.
Na cromatografia, na linha de partida deve ser depositado volume igual a 10 l ou menor,
como descrito em procedimentos gerais.
prefervel no diluir a preparao em exame, mas importante evitar depositar
quantidade tal que perdas de contagem por coincidncia venham ocorrer durante a medida da
radiatividade.
Considerando as massas muito pequenas do material radiativo aplicado aos
cromatogramas, o uso de carreadores , s vezes, necessrio e os mesmos podem ser
adicionados quando a monografia assim o prescrever.
Aps o desenvolvimento, o suporte seco e as posies das reas radiativas so
detectadas ou pela auto-radiografia ou pela medida da radiatividade ao longo do cromatograma,
com auxlio de contadores devidamente colimados, pelo corte das faixas e contagem de cada
uma delas ou por qualquer outro mtodo adequado.
As posies das manchas ou reas permitem identificao qumica por comparao com
solues das mesmas substncias qumicas (no radiativas), visualizadas por reao de cor ou
exames sob luz ultravioleta. A visualizao pela reao de cor direta da amostra radiativa nem
sempre possvel ou desejvel, j que o borrifamento com reagente de visualizao pode causar
difuso da substncia radiativa para alm das manchas ou reas identificadas.
Medidas de radiatividade podem ser feitas por integrao, utilizando-se equipamento
automtico ou contador digital. As propores das reas abaixo dos picos fornecem as relaes
das concentraes radiativas das substncias qumicas. Quando as tiras so cortadas em
pores, as razes das quantidades de radiatividade medidas fornecem as propores das
concentraes de espcies qumicas radiativas.

Atividade especfica
A atividade especfica calculada relacionando-se a concentrao radiativa (radiatividade
por unidade de volume) com a concentrao da substncia qumica em exame, aps a verificao
de que