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Quim. Nova, Vol. 28, No. 1, 149-152, 2005 EXTRAO DE PIGMENTOS DAS SEMENTES DE Bixa orellana L.

: UMA ALTERNATIVA PARA DISCIPLINAS EXPERIMENTAIS DE QUMICA ORGNICA Charllyton Luis S. da Costa e Mariana H. Chaves* Departamento de Qumica, Centro de Cincia da Natureza, Universidade Federal do Piau, 64049-550 Teresina - PI Recebido em 1/10/03; aceito em 19/5/04; publicado na web em 9/9/04

EXTRACTION OF PIGMENTS FROM SEEDS OF Bixa orellana L.: AN ALTERNATIVE FOR EXPERIMENTAL COURSES IN ORGANIC CHEMISTRY. This paper describes methodologies for the extraction and characterization by TLC, UV-VIS, IR and NMR of bixin from Bixa orellana L. (urucum) seeds. Based on the results, the extraction with NaOH 5% is the fastest, uses lowcost materials, requires two to four laboratory hours and is a useful alternative for an experimental Organic Chemistry discipline. Keywords: Bixa orellana; bixin; urucum.

INTRODUO O uso de aditivos com a inteno de tornar os alimentos visualmente mais atraentes, seja na indstria alimentcia ou no uso domstico cotidiano, bastante comum. O corante extrado do pericarpo das sementes de urucum (Bixa orellana L.), um arbusto nativo do Brasil e de outras regies tropicais do planeta, recebe a denominao internacional de annatto (E160b)1,2 sendo largamente utilizado em vrias partes do mundo em escala industrial, por conferir colorao atraente a uma extensa gama de produtos manufaturados3. O annatto (anato) uma mistura de pigmentos de colorao amarelo-alaranjada em conseqncia da presena de vrios carotenides, com predominncia absoluta de um atpico, conhecido como bixina. Os maiores produtores mundiais de anato so Peru, Brasil e Qunia1,2. No Brasil, alm do amplo emprego na indstria, a preparao comercial contendo 0,20-0,25% de bixina conhecida como colorau, componente indissocivel de inmeros pratos da culinria brasileira. Este produzido a partir das sementes de urucum, previamente aquecidas a 70 C em leo vegetal, seguido de abraso com fub ou farinha de mandioca ou pela mistura destas com urucum em p, obtido por extrao com solventes2,4. A bixina (Figura 1) possui uma cadeia isoprnica de 24 carbonos, contendo um cido carboxlico e um ster metlico nas extremidades, perfazendo assim a frmula molecular C25H30O4. Representa 80% dos pigmentos da Bixa orellana L., ocorrendo apenas nesta espcie e em Aristolochia cymbifera Mart.2,5. A bixina ocorre naturalmente na forma 16-Z, porm durante o processo de extrao isomerizada conduzindo forma 16-E, denominada isobixina5. Vrios outros carotenides (C19, C22, C24, C25, C30, C32) foram isolados e identificados, porm constituem a parcela minoritria dos pigmentos. O constituinte majoritrio das sementes de urucum o geranilgeraniol, representando 1% das sementes secas6. A norbixina (C24H28O4) o derivado desmetilado da bixina que, apesar de ocorrer naturalmente, quase sempre referida como produto da saponificao da bixina, sendo esta a sua forma de obteno para fins comerciais1,7. As preocupaes relacionadas ao impacto da utilizao de corantes sintticos sobre a sade direcionam as atenes para o uso daqueles de origem natural, pela crena de que estes sejam desprovidos de efeitos
*e-mail: mariana@ufpi.br

Figura 1. Substncias presentes em sementes de Bixa orellana

txicos. A no exigncia da apresentao de dados aprofundados referentes a anlises toxicolgicas e qumicas para o registro de aditivos alimentares derivados de fontes naturais2,8, certamente torna as informaes relativas a possveis efeitos indesejveis e/ou atividades farmacolgicas decorrentes do seu uso, muito mais escassas do que se poderia prever diante da importncia do tema. No Brasil, o uso do urucum to rotineiro que sua inocuidade sequer questionada. Estudos toxicolgicos recentes demonstraram que a norbixina, e em ltima instncia a bixina, uma vez que esta desmetilada in vivo, destituda de efeitos deletrios significativos sobre clulas hepticas, renais e da medula ssea de camundongos e ratos2,9 e, embora nenhum efeito embriotxico tenha sido demonstrado em ratos8, um grau considervel de interferncia com o controle metablico da glicose nestes roedores foi percebido 2 e h relatos de uso popular da planta para tratamento do Diabetes mellitus8. Os mtodos de extrao dos pigmentos da Bixa orellana L., seja para determinao da composio qumica ou averiguao de atividades sobre organismos vivos, so realizados com o uso de solventes, tais como propilenoglicol, leo, gua pura e solues alcalinas10. Dependendo do solvente utilizado, a extrao pode ser mais ou menos seletiva, de acordo com as convenincias de cada trabalho1,2,7. Todavia, o extrato obtido necessita passar por um processo de purificao utilizando-se tcnicas, reagentes e equipamentos que tornam tal procedimento demorado, dispendioso e distante dos objetivos de uma disciplina de Qumica Orgnica at mesmo de cursos de graduao.

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Com a inteno de proporcionar uma alternativa prtica, acessvel e com o forte apelo cotidiano que possui o corante de urucum, uma vez que a proximidade do dia-a-dia tende a prender as atenes e despertar interesses, propomos a extrao das sementes de Bixa orellana L. com uma soluo de hidrxido de sdio, sob condies ordinrias e sem necessidade de instrumental especfico. Com exceo da norbixina, que ocorre naturalmente em pequenas quantidades, a bixina, pigmento majoritrio do anato, o nico dos carotenides isolados e identificados (Figura 1) que possui um grupo carboxlico livre1,5,7, sendo ele, portanto, um alvo potencial e seletivo para reao com NaOH e formao do sal da bixina, podendo a forma protonada ser reconstituda pela adio de um cido. A extrao de sementes de urucum com NaOH um procedimento rpido, de fcil execuo e baixo custo, podendo ser executada em aulas prticas de Qumica Orgnica. PARTE EXPERIMENTAL Procedimentos experimentais gerais Sementes de Bixa orellana L. (urucum) foram adquiridas no Mercado Central de Teresina em fevereiro de 2003. Os espectros de UVVis foram obtidos em um espectrofotmetro Hytachi U3000 na regio de 900 a 190 nm, utilizando soluo de 20 ppm do extrato bruto em CHCl3. Os espectros de RMN 1H foram obtidos em espectrmetro Bruker Avance DRX-500 com o uso de CDCl3 como solvente e TMS como padro de referncia interno. O espectro na regio do Infravermelho foi obtido em espectrmetro Bolmem FT-IR, modelo MB-102 utilizando partilhas de KBr. As placas cromatogrficas foram preparadas com camadas de 0,25 mm de gel de slica 60 da Vetec, eludas em hexano-acetato de etila (8:2) e CHCl3-MeOH (9:1). Os cromatogramas foram observados no visvel antes e aps as placas serem borrifadas com soluo de sulfato crico seguido de aquecimento. Extrao das sementes de urucum Mtodo 1: duas amostras de sementes de urucum (10 g) foram submetidas a extrao, uma com acetona (40 mL) e outra com hexano (40 mL), temperatura ambiente, por um perodo de 30 min, sob agitao freqente. Separou-se as sementes por filtrao e evaporouse os solventes em evaporador rotativo. Mtodo 2: sementes de urucum (10 g) foram submetidas a extrao com acetona em aparelhagem Soxhlet por um perodo de 1,5 h. Removeram-se as sementes por filtrao e evaporou-se o solvente em evaporador rotativo. Mtodo 3: duas amostras de sementes de urucum (10 g) foram submetidas a extrao, uma com 40 mL de soluo de NaOH 5% por 5 min e a outra com 40 mL de NaHCO3 10% por 30 min, sob agitao freqente. Separaram-se as sementes por filtrao, adicionou-se HCl concentrado mistura alcalina at pH 4, filtrou-se usando papel

de filtro previamente pesado, lavou-se o slido com gua destilada at o pH neutro e secou-se o extrato em estufa a 70 oC por 30 min. Caracterizao da bixina Os extratos de semente de urucum foram inicialmente analisados por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) usando como eluentes hexano-acetato de etila (8:2) e clorofrmiometanol (9:1). Cerca de 5 mg de cada extrato foram dissolvidos em 1 mL de H2SO4 concentrado para verificao da presena de carotenides10. Aproximadamente 30 mg dos extratos obtidos com soluo de NaOH e com acetona foram analisados por RMN 1H e 13C, usando CDCl3 como solvente. Os extratos das sementes de urucum (10 mg) obtidos por extrao com acetona temperatura ambiente, acetona em Soxhlet e com NaOH foram dissolvidos em clorofrmio e as solues resultantes tiveram seus volumes acertados para 100 mL com o mesmo solvente. Uma alquota de 10 mL de cada soluo foi retirada e diluda at 50 mL com CHCl3, obtendo-se trs solues com concentrao de 20 mg/L. Estas solues foram analisadas no espectrofotmetro UV-Vis entre 900 e 190 nm e os respectivos espectros foram registrados e comparados com os da literatura3. A partir dos espectros obtidos determinou-se a concentrao de bixina utilizando a expresso A = acb, onde A representa a absorbncia da soluo clorofrmica do extrato, lida no espectrofotmetro, c a concentrao de bixina na soluo (g/L), b o caminho tico (1 cm) e a o coeficiente de absoro da bixina em CHCl3 (2826) no max 470 nm descrito por Mercadante4. O rendimento de bixina foi determinado considerando-se a massa do extrato obtida em cada extrao. A relao bixina/geranilgeraniol foi determinada dividindo-se o valor da integrao de um dos sinais de H- aos grupos carboxlicos da bixina pelo valor da integrao do sinal de H-1 do geranilgeraniol e multiplicando-se por 212. RESULTADOS E DISCUSSO A extrao das sementes de B. orellana teve como finalidade escolher qual seria o melhor solvente para a extrao da bixina. O hexano e a soluo de NaHCO3 a 10% no se mostraram eficientes, os rendimentos obtidos foram 0,22 e 1,56%, respectivamente (Tabela 1 e Figura 2). Os solventes que se mostraram mais eficientes foram acetona em Soxhlet e a soluo de NaOH 5%. Apesar do rendimento de extrato bruto obtido com acetona em Soxhlet ter sido o maior (6,160,28), o rendimento de bixina, determinado por espectrometria UV-Vis neste extrato (1,310,43%), foi menor que o determinado no extrato bruto preparado com soluo de NaOH 5% (3,100,09%), conforme apresentado nas Figuras 2 e 3 e Tabela 1. Alm disso, outras substncias extradas com acetona podem afetar a quantificao da bixina, e ainda, o tempo gasto na extrao com acetona em Soxhlet foi superior ao da extrao com soluo de NaOH 5%. Vale ressaltar que outros carotenides podem ser detectados

Tabela 1. Resultados obtidos na extrao das sementes de Bixa orellana por diferentes solventes Mtodo de extrao Acetona Hexano Acetona (Soxhlet) NaOH 5% NaHCO3 10% Massa de sementes/g 10 10 10 10 10 Tempo de extrao/min 30 30 90 5 30 Massa extrada/mg 498,675,86 22 61628,28 493,0731,87 156 Rendimento da extrao/% 4,990,06 0,22 6,160,28 4,930,32 1,56 Rendimento de bixina/%* 1,180,45 ND 1,310,43 3,100,09 ND Relao bixina/ geranilgeraniol 1:3 ND 1:3 1:2 ND

*Determinado por UV-Vis em relao massa de extrato; ND: no determinado; determinada por RMN 1H.

Vol. 28, No. 1

Extrao de Pigmentos das Sementes de Bixa orellana L.

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Figura 2. Grfico da porcentagem de extratos e de bixina das sementes de Bixa orellana obtidos com diferentes solventes

Figura 3. Espectro UV-Vis das solues de extrato das sementes de Bixa orellana; Solvente: CHCl3; NaOH: extrao com soluo de NaOH 5%; Acq.: extrao com acetona em Soxhlet; Acf.: extrao com acetona a frio

concomitantemente com a bixina na anlise por UV-Vis, contudo, como mencionado anteriormente, a ocorrncia desta nas sementes de urucum da ordem de 80% do total dos pigmentos existentes2. A literatura registra uma concentrao mdia de bixina nas sementes de urucum variando entre 1,2-2,3%, no entanto, o rendimento pode estar sujeito ao tipo de solvente usado na extrao e a fatores ambientais, tais como temperatura, iluminao, ndice pluviomtrico e tipo de solo5,10. Os resultados obtidos permitiram eleger a soluo de NaOH 5% como o solvente ideal para a obteno do extrato. O tratamento do extrato com H2SO4 concentrado resultou no desenvolvimento de colorao azul esverdeada, caracterstica da presena de carotenides11. A realizao de CCDC usando como eluente hexano-acetato de etila (8:2) teve por finalidade a verificao da existncia de constituintes menos polares nos extratos, enquanto que o uso de CHCl3MeOH (9:1) foi para eluio dos constituintes mais polares, como a bixina. Para o primeiro cromatograma obtido observou-se que apenas uma pequena parcela do material foi eludo, resultando em uma mancha uniforme, de formato alongado, colorao laranja, com Rf abaixo de 0,5 e que sugere ser de carotenides com grupamento cido. Este resultado permite ainda deduzir que carotenides menos polares, tipo -caroteno, devem estar presentes em pequenas quantidades, uma vez que no se observou manchas com caractersticas deste tipo de substncias. O segundo cromatograma mostrou que grande parte do material foi eludo, originando manchas de formato alongado, colorao laranja, distribudas por toda a placa, ficando a zona de maior concentrao com Rf de aproximadamente 0,4 e colorao vermelho-alaranjada, que sugere ser a bixina. Os espectros de UV-Vis (Figura 3) dos extratos de urucum mostraram-se semelhantes aos relatados para a bixina3. A presena da bixina nos extratos acetnicos e em soluo de NaOH 5% foi comprovada atravs da anlise dos espectros de RMN 1H mediante observao de dois pares de dubletos em 5,89/ 7,98 (J=15,8 Hz) e 5,93/7,47 (J=15,5 Hz) atribudos, respectivamente, a H-/H- aos grupos carboxlicos do cido livre e do ster, juntamente com o singleto em 3,80 de metoxila de ster5. O espectro de RMN 13C tambm confirmou a presena da bixina, pelos sinais de carbono da metoxila de ster ( 51,6), e dois sinais em 171,8 e 168,0 referentes s carbonilas de cido e ster, respectivamente5. Os espectros de RMN dos extratos acetnicos e em soluo de NaOH 5% mostraram que o diterpenide geranilgeraniol foi o componente majoritrio das sementes de urucum, conforme relatado na

literatura6. Os sinais observados no espectro de RMN 1H que caracterizam o geranilgeraniol (Figura 4) so: 4,18 (d, 6,7 Hz, H-1), 5,43 (tl, 6,8 Hz, H-2), 5,12 (sl, H-6, H-10 e H-14), 1,62 (s, 3CH3) e 1,70 (s, 2CH3), contudo, no espectro de RMN 13C os sinais caractersticos para esta substncia ocorrem em 59,4 (CH2, C-1), 139,9, 135,4, 134,0, e 131,3 (carbonos olefnicos no hidrogenados), 124,4, 124,2, 123,7 e 123,2 (carbonos metnicos olefnicos) e os situados entre 39,7-16,0 (carbonos saturados no oxigenados)6,13.

Figura 4. Espectro de RMN 1H do extrato de sementes de Bixa orellana em soluo de NaOH 5% (CDCl3, 500 MHz)

A relao bixina/geranilgeraniol, determinada atravs do espectro de RMN 1H, foi 1:3 nos extratos acetnicos e 1:2 no extrato preparado com soluo de NaOH (Tabela 1). Estes resultados foram compatveis com o percentual de bixina determinada por UV-Vis nos extratos, considerando-se que devem existir outras substncias alm da bixina e geranilgeraniol no extrato de urucum. O espectro na regio do infravermelho (IV) do extrato obtido com soluo de NaOH 5% de sementes de urucum (Figura 5) apresenta banda larga e forte na regio de 3500-2500 cm-1 de estiramento O-H de lcool, atribudo ao geranilgeraniol, sobreposta banda de

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estiramento O-H de cido. Esta ltima juntamente com a banda forte de estiramento de carbonila de ster ,-insaturado (1717 cm-1) contendo um ombro que sugere ser de outra carbonila, so indicativos da presena de bixina. O espectro apresenta ainda, entre outras, bandas de estiramento C=C (1608, 1600 e 1563 cm-1), C-H sp3 (2856, 2919 e 2969 cm-1), C-H sp2 (3031 cm-1), C-O de lcool primrio (1161 cm-1) e deformao C-H de olefinas (1006 e 964 cm-1). Estes dados mostraram-se compatveis com os relatados na literatura para as duas substncias5,6.

CONCLUSO O mtodo de extrao de sementes de urucum com soluo de hidrxido de sdio descrito neste trabalho conduziu ao melhor rendimento de bixina quando comparado extrao com acetona, temperatura ambiente e em Soxhlet, e permite sua implementao em disciplinas que dispem de perodos curtos de aula, ficando a caracterizao da bixina por UV-Vis, RMN e IV e a discusso para serem realizadas em aulas posteriores. Alm disso, somente a extrao no necessita de instrumentao sofisticada, podendo ser realizada inclusive no ensino mdio utilizando materiais de baixo custo e de fcil aquisio. De forma opcional, o experimento pode ser montado incluindo tambm a extrao com acetona temperatura ambiente e em Soxhlet, a ser executado por diferentes equipes, com o objetivo de comparar os rendimentos e com enfoque na discusso dos conceitos de extrao contnua e macerao com solvente quimicamente ativo. AGRADECIMENTOS CAPES/PROCAD pelo apoio financeiro e bolsa de C. L. S. da Costa; ao Centro Nordestino de Aplicao e Uso da RMN (CENAUREMN/UFC) pela execuo dos espectros.

Figura 5. Espectro na regio do infravermelho do extrato de sementes de Bixa orellana

REFERNCIAS
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A extrao do geranilgeraniol, uma substncia neutra, da semente de urucum, com solvente quimicamente ativo pode ser questionada, porm, este fato pode ser justificado considerando que esta substncia foi arrastada, por ao de lavagem, pela soluo de hidrxido de sdio10. O experimento da forma como est sendo proposto neste trabalho, iniciando-se com a extrao seguida de anlise por UV-Vis, RMN e IV, poder ser executado em aulas de Qumica Orgnica e Qumica Analtica de cursos de graduao. Opcionalmente, quando no se dispuser do equipamento, poder ser omitida a anlise por RMN, pois a espectrometria na regio do infravermelho permite confirmar a presena de bixina e geranilgeraniol no extrato. A simples extrao das sementes com determinao do rendimento, como forma de adaptao s condies locais, poder ser realizada at mesmo em aulas do ensino mdio, usando materiais alternativos como soda custica e lcool ou acetona comerciais. Alm dos clculos sobre o rendimento da bixina e a relao bixina/geranil-geraniol, alguns questionamentos podero ser levantados para discusso em sala, tais como o porqu da bixina ter sido extrada em maior concentrao com soluo de NaOH; as razes pelas quais a bixina absorve luz com max 470 nm; a cor observada para bixina, considerando a cor e o comprimento de onda da luz absorvida14 e as razes de se observar colorao azul pelo tratamento do extrato de urucum com cido sulfrico concentrado15.