4. REVISIN BIBLIOGRFICA. 4.1 Chile.

Clasificacin Cientfica. Reino: Subreino: Divisin: Clase: Subclase: Orden: Familia: Gnero: Plantae Tracheobionta Magnoliofita Magnoliopsida Asteridae Solanales Solancea Capsicum

El chile o pimiento, es un recurso agrcola en gran parte del mundo, en varios pases incluso forma parte de la cultura, al ser utilizado como saborizante dentro de la dieta diaria y en medicina tradicional. mismo nombre. El chile es el fruto de la planta del Pertenece a la clase embriofita Siphonagema, su gnero El chile

Capsicum, con cinco especies: pubescens (rocoto), annum (serrano, jalapeo, piqun), frutescens (tabasco), baccatum (aj) y chinense (habanero). contiene: agua, carbohidratos, protenas, grasas, fibra, vitaminas A, B1 (tiamina), B2( riboflavina), B6, B12, vitamina C, azufre, calcio, cloro, cobre, fsforo, hierro, magnesio, manganeso, niacina, potasio, sodio y yodo. sus propiedades colorantes. Los pimientos son demandados por su sabor acre y pungente, y por la asociacin de este sabor y

11

El pimiento Capsicum comprende 4 partes principales que son: el pericarpio, placenta, semillas y tallo. El pericarpio es la pared del fruto que conforma aproximadamente el 38% del Capsicum, en l se distinguen 3 capas: el exocarpio es la capa externa, delgada y poco endurecida, el mesocarpio es una capa intermedia y carnosa y el endocarpio que es la capa interior y de consistencia poco leosa. En promedio, la placenta comprende el 2% del chile, 56% de La propiedad que separa a la familia Capsicum de semillas y un 4% de tallos.

otros grupos vegetales, es un grupo de alcaloides denominados capsicinoides. En particular, una sustancia cristalina excepcionalmente potente y acre, que no existe en ninguna otra planta es la capsicina, y es la principal fuente de acritud y pungencia en el pimiento Capsicum.

Figura 2. Anatoma del pimiento o chile.

12

La capsicina es producida por glndulas que se encuentran en el punto de unin de la placenta y la pared del pericarpio. La capsicina se extiende de modo no uniforme a travs del interior del fruto y se concentra mayormente en el tejido placentario y en el pericarpio. El porcentaje de capsicina en la planta de pimiento depende de la especie, del origen geogrfico y de las condiciones climticas. contenido de capsicina en un pimiento Capsicum son 4: Los lmites promedio en

Por 100 g de chile Pericarpio 38

Masa de capsicina (g) 0.2204

mg capsicina / g chile 2.204

% de capsicina

51.80

Placenta

0.154

1.54

36.20

Semilla

56

0.051072

0.51072

12.00

Tallo

Tabla 1. Capsicina contenida en 100 gramos de Capsicum.

www.capstun.com

13

A partir de un kilogramo de pimienta de cayena, por ejemplo, se pueden extraer aproximadamente 2.13 g de capsicina cruda, que es alrededor de 20 veces la cantidad presente en la paprika o pimiento rojo. Los pigmentos o carotenoides son compuestos que regulan directamente el color en los frutos Capsicum. Los carotenoides exclusivos del gnero Capsicum son Los carotenoides son los capsantn, capsoburn y capsantn 5,6-epxido.5

responsables del color tan atractivo de los frutos, cuando son ingeridos, ejercen una accin biolgica importante como antioxidantes y refuerzan el sistema inmunolgico.6 La mayor parte de chiles que se comercializan internacionalmente est compuesta de productos de las variedades C. annum y C. frutescens.

4.1.1 Chile jalapeo.

El chile jalapeo es un fruto alargado de aproximadamente 7.5 cm y su dimetro de 2.5, el color lo define el grado de maduracin que tenga, comenzando en verde, despus amarillo, y hasta llegar a rojo que es la maduracin total y entonces se le conoce como chilpotle. El peso de cada fruto flucta entre los 20 y 30 gramos y es de elevada pungencia, aspecto que los caracteriza.

5 6

Davies,B.; Matthews,S.; Kirk,J. 1970 Hornero,D.; Gmez,R.; Mnguez,M. 2000

14

Jalapeo Nutriente Humedad Cenizas Protena Carbohidratos Fibra cido ascrbico Extracto etreo Aminocidos Triptofano Lisina Fenilalanina g g g 0.015 0.055 0.038 Unidad g g g g g mg g 1 taza 90g 82.89 0.45 1.215 5.319 2.520 67.68 0.117

Jalapeo 1 Chile 14g

Chilpotle 1 taza 90g 13.05 6.21

0.189 0.827 0.392

14.40 42.03 8.64 21.78 5.67

0.002 0.009 0.006

Tabla 2. Composicin nutritiva de chile jalapeo crudo (Capsicum annum L.v.) y chilpotle (Capsicum annum L. dulce Hort.).7

4.2 Capsicinoides
El ingrediente activo de los chiles, considerado en un inicio como una sola sustancia: capsicina, es una mezcla de homlogos di y tri insaturados, como lo demostraron los qumicos japoneses S. Kosuge y Y. Inagaki en 1964. La mezcla

Boruges,H.; Morales,J.; Escobedo,G.; Camacho,I,M. 1996

15

es actualmente llamada capsicinoides.

Los capsicinoides son producidos por

glndulas en la placenta del chile, que es la parte superior justo debajo de tallo.8 Los componentes pungentes del Capsicum annum incluyen por lo menos cinco compuestos conocidos como capsicinoides a los que incluso se les ha valorado su pungencia.

Nombre

Nombre cientfico

Unidades Scoville Porcentaje

Capsicina (C) Dihidrocapsicina (DHC) Nordihidrocapsicina (NDHC) Homodihidrocapsicina (HDHC) Homocapsicina (HC)

trans-8-metil-n-vanilil6-nonamida 8-metil-n-vanililnonamida 7-metil-n-vanililoctamida 9-metil-n-vanilildecamida trans-9-metil-n-vanilil7-decenamida

16,000,000

69 %

16,000,000

22 %

9,100,000

7%

8,600,000

1%

8,600,000

1%

Tabla 3. annum.

Clasificacin de capsicinoides comnmente presentes en Capsicum

La capsicina y dihidrocapsicina son los compuestos ms fuertes y producen ardor por toda la boca. Nordihidrocapsicina es el compuesto menos irritante y poco La homocapsicina produce poco ardor en la dulce; homodihidrocapsicina es un compuesto muy irritante y produce cierto ardor, el ms prolongado en su duracin.

Zewdie Bosland 2000

16

garganta, con una sensacin lenta de pungencia a travs de ella.9 Evidentemente todos los capsicinoides actan juntos para producir la pungencia de los chiles, pero la capsicina es el ms fuerte de todos los compuestos. La frmula molecular de los capsicinoides menos activos en pungencia es:

Figura 3. Molcula de nordihidrocapsicina.

Figura 4. Molcula de homocapsicina.

Figura 5. Molcula de homodihidrocapsicina.

En los frutos Capsicum, los capsicinoides son producidos y sintetizados en glndulas en la parte superior de la placenta. Los capsicinoides son acumulados en las vacuolas de las clulas epidemiales de la placenta, hasta ser
9

Krajewska,A.; Powers,J. 2001

17

metabolizados.

Iwai y col.

10

sugieren, que la produccin de capsicinoides se

incrementa conforme la maduracin del fruto, hasta llegar a un mximo que depende de cada especie, posteriormente sufre cambios bruscos de degradacin hasta un 60%, al igual que el fruto.

4.2.1 Capsicina
El principal ingrediente activo que causa la pungencia en los chiles es un compuesto slido cristalino en forma de agujas llamado capsicina. La capsicina es un alcaloide increblemente poderoso aparentemente inafectable por el fro o el calor, el cual retiene su potencial a pesar del tiempo, cocinado o congelado.

Dado que no tiene sabor, color u olor, solo incita la liberacin de neurotransmisores que estimulan las clulas trigeminales, puntos receptores de dolor, en la lengua, estmago y boca. En respuesta a este estmulo, el cerebro libera endorfinas, las cuales proporcionan al cuerpo una sensacin placentera, se acelera el metabolismo y ritmo cardiaco, se libera ms saliva, se suda y se crea un estado temporal de euforia. 70 millones. aceites. A pesar de que no tiene sabor es uno de los compuestos ms pungentes conocidos, detectable al paladar en diluciones de 1 a Es poco soluble en agua, pero muy soluble en alcohol, grasas y

Este compuesto se vincula a la medicina, a la industria alimenticia, a la de los colorantes y cosmticos y a la de los embutidos, entre otras. La capsicina como una leo resina es demandada en la preparacin de ciertas carnes fras como saborizante, como solucin para salsas con pungencia definida, en la fabricacin de cigarrillos, en la agricultura como repelente y en la ganadera menor contra mamferos depredadores, como sustancia activa de las pinturas marinas para
10

Iwai,K.; Susuki,T.; Fujiwaki,H. 1979

18

rechazar la adherencia de caracolillos, como estimulante en la industria farmacutica y como colorante en la industria de alimentos balanceados en sustitucin de la flor de cempazchitl. La capsicina est disponible en forma natural o sinttica. Se debe tener extremo cuidado con los compuestos sintticos anlogos que se emplean para aumentar la pungencia en extractos de Capsicum y tambin en imitaciones de leo resinas Capsicum para reducir costos de produccin. anlogos conocidos son: N-vanilil octanamida, N-vanilil nonanamida, N-vanilil decanamida,N-vanilil Algunos compuestos sintticos

undecanamida y N-vanilil paiperiacidamida. Estos compuestos son cidos en forma natural y causan serios daos a la salud11.

4.2.1.1 Antecedentes.
P.A. Bucholtz en 1816 descubri por primera vez que el principal agente de pungencia de los chiles se poda extraer con solventes orgnicos. En 1846, L. T. Thresh report en Pharmacy Journal que el principal pungente se extraa en estado cristalino. Fue Thresh quien nombr a la sustancia capsicina. En 1878, el mdico y cientfico hngaro Endre Hogyes extrajo la capsicina a la que llam capsicol y descubri que estimulaba las membranas mucosas de la boca y estmago e incrementaba la secrecin de jugos gstricos. sintetizada por primera vez en 1930 por E. Spath y F.S. Darling. La capsicina fue

11

Contreras,P.; Yahia,E. 1998

19

4.2.1.2 Caractersticas fsico - qumicas.

La capsicina tiene la siguiente frmula: C18H27O3N, con un peso molecular de 305.199 g/g-mol. Forma cristales en forma de aguja, es inodora, con un punto de fusin de 64.5C y un punto de ebullicin de 210 220 C. A una presin absoluta de 0.01 mmHg, se sublima a 115 C y presenta su mxima absorcin en UV a 227 228nm. Es soluble en ter etlico, alcohol etlico, acetona, alcohol metlico, Es insoluble cido actico, tetracloruro de carbono, benceno y lcalis calientes. en agua fra.12

Figura 6. Molcula de capsicina.

La dihidrocapsicina tiene la siguiente frmula condensa: C18H29O3N y un peso molecular de 307.215 g/g-mol, forma cristales de color blanco opaco e inoloro pero con una fuerte pungencia. Su punto de fusin varia entre 65.5 y 65.8 C, presenta su mxima absorbancia en UV por debajo de 230 nm y sus propiedades de solubilidad son idnticas a las de la capsicina.13

12 13

Garca y Ortega. 1996 Iwai,K.; Susuki,T. 1977

20

Figura 7. Molcula de dihidrocapsicina.

4.2.1.3 Mecanismo de accin.

Las sensaciones de ardor y dolor asociadas a la capsicina resultan de las interacciones qumicas de esta sustancia con neuronas primarias sensoriales. La capsicina est relacionada a un receptor celular denominado vaniloide subtipo 1 (VR1), su nombre se debe al componente qumico esencial que constituye a la capsicina y est catalogado como un receptor doloroso general, que responde igualmente al calor y abrasin fsica. Estudios han demostrado que la capsicina estimula a los receptores VR1 incrementando la permeabilidad de la membrana celular para el flujo de cationes hacia el centro de la clula.14
+ + 2+

La secuencia de permeabilidad de iones

2+ 2+ + +

monovalentes y divalentes se presenta de la siguiente manera: Ca > Mg > Na ~ K ~ Cs

(por cada 10 iones Ca , pasa 1 de Na ). Este fenmeno es conocido

como despolarizacin neuronal, estimula el envo de seales al cerebro por medio del sistema nervioso central liberando neuropptidos, incluyendo la sustancia P.

14

Caterina,M.; Shumacher,M.; Tominaga,M.; Rosen,T.; Levine,J.; Julius,D. 1997

21

La liberacin de la sustancia P es la responsable de la sensacin de ardor y dolor irritante.15 Tras un periodo de exposicin, la capsicina genera un dao estructural en la fibra nerviosa, impide el paso de las sustancia P desde el soma de la clula hasta las porciones terminales de la fibra. Las investigaciones muestran que lneas celulares con VR1, mueren despus de varias horas de exposicin con capsicina, sin embargo, existe la posibilidad que de forma natural las clulas puedan regenerarse. La hiptesis de la muerte celular recae en el flujo excesivo y continuo de cationes al interior de la clula.16

4.2.1.4 Aplicaciones farmaceticas.

Extensas investigaciones de capsicina, VR1, y la respuesta fisiolgica a su activacin qumica, aseguran que es un agente efectivo en padecimientos de dolor crnico, sobretodo, aquellos asociados con la espina dorsal, artritis y neuropatologas diabticas. Se ha encontrado que la capsicina estimula selectivamente y destruye la sustancia P en ciertos nervios que terminan en la piel y membranas mucosas. En este sentido, trabaja como un antisensibilizante. Este fenmeno ha sido observado en los sistemas cardiovascular y respiratorio donde hay una relacin en el efecto que provoca la capsicina y la sustancia P. El descubrimiento de la efectividad de las aplicaciones de la capsicina al nervio dental para reducir la sustancia P como un transmisor del dolor de la pulpa dental, justifica el remedio antiguo de emplear chilpes picantes para el tratamiento de ese padecimiento. Actualmente, existen en el mercado, cremas que contienen capsicina y que ayudan a reducir el dolor causado por herpes, es decir, la capsicina es utilizada

15 16

Presti. 1999 Clapham. 1997

22

como un analgsico auxiliar. en la zona afectada.17

La crema es aplicada durante varias veces al da

As mismo, las drogas o medicamentos que se pueden utilizar de forma individual o en combinacin para el tratamiento de reumas, artritis y osteoartritis, se emplean con la finalidad de reducir los sntomas y por lo tanto elevar los ejercicios apropiados al tratamiento. Para estos objetivos, se aplican cremas directamente Por ejemplo, la a la piel como una alternativa de medicina para aliviar el dolor.18

crema Menthacin Arthritic Pain Relief, combina la capsicina y el mentol para combatir el dolor artrtico y al mismo tiempo, no presenta complicaciones por el uso simultneo de medicinas anti-inflamatorias libres de esteroides (NSAIDS). Los estudios del chile como agente teraputico contra el cncer no cesan, por tener altos contenidos de carotenoides, vitamina A y antioxidantes que reducen los riesgos de esta enfermedad. La capsicina es tambin un agente reductor de los niveles de colesterol. Estudios muestran que la capsicina trabaja en dos puntos para reducir los niveles de colesterol: incrementando las enzimas responsables del metabolismo grasoso y disminuyendo la cantidad de colesterol absorbida en el cuerpo. La dihidrocapsicina, eleva los niveles de lipoprotenas de alta densidad de colesterol y disminuye las lipoprotenas de baja densidad, retardando la formacin de depsitos de colesterol en las arterias (arteroesclerosis). La capsicina ayuda a la circulacin por sus efectos vasodilatadores: la presin sangunea baja lo que reduce el riesgo de infartos cardacos.

17 18

Manual MERCK, 2. Ed Manual MERCK, 2. Ed

23

4.2.2 Medicin de pungencia.

La manera ms comn de realizar la prueba de pungencia en los chiles, es probando la vaina. Existe una prueba organolptica: Scoville, basada en la percepcin humana. Esta prueba ha sido utilizada desde 1912 para la determinacin de pungencia. chile puro con una solucin azucarada, la cual La realiz por primera vez Wilbur Scoville, originalmente consista en la mezcla de beban a sorbos los jueces, incrementando la concentracin de dilucin hasta alcanzar el punto en el cual el lquido no provocaba ardor en la boca; entonces se le asignaba un valor numrico basado en la cantidad en que se haba diluido antes de que se perciba alguna pungencia. La escala de Scoville se mide en mltiplos de 100 unidades, y muestra que los chiles ms picantes son los habaneros anaranjados con 210,000 unidades Scoville y los habaneros rojos con 150,000 unidades. Una ppm de concentracin de capsicinoides es igual a 1.5 unidades Scoville.19 La capsicina pura se estima en 15,000,000 unidades Scoville

19

www.chilepepperinstitute.org

24

Nombre Habanero anaranjado Jalapeo

Tipo

Especie

Unidades Scoville 210,000

Habanero

C. chinense

Jalapeo

C. annum

25,000

Cayenne

Cayenne

C. annum

8,000

Pasilla

Pasilla

C. annum

5,500

Serrano

Serrano

C. annum

4,000

Mulato

Ancho

C. annum

1,000

Campana

Campana

C. annum

Tabla 4. Niveles de pungencia relativa en unidades Scoville .

4.3 Mtodos de extraccin de capsicina.

El trmino extraccin, es usado para describir las operaciones de separacin por mtodos de transferencia de masa o mecnicos. diversas tecnologas para la extraccin de capsicina. Actualmente existen

25

4.3.1 Lixiviado.
El lixiviado se refiere a la solucin selectiva de uno o ms constituyentes de una mezcla slida al contacto con un solvente lquido. Este proceso es empleado para separar diversos productos orgnicos naturales de su estructura original, como races, hojas y semillas, al mantenerlos en contacto bajo ciertas condiciones de proceso con solventes orgnicos. En algunos casos, las partculas pequeas de un material soluble estn completamente cubiertas por una capa de material insoluble. El solvente debe penetrar en el slido, la solucin resultante se difunde al exterior antes de que se presente una separacin. La molienda de los slidos puede acelerar la accin del lixiviado, dado que las porciones solubles estarn ms accesibles para el solvente. Sin embargo, cuando la parte soluble est relativamente distribuida de forma uniforme en la estructura slida, la accin de lixiviar puede lograr la formacin de canales para el trasporte de solvente fresco y entonces la molienda no es necesaria. Los vegetales tienen estructuras celulares, frecuentemente las sustancias a ser lixiviadas se encuentran en el interior de clulas. Si la pared celular se mantiene intacta durante la exposicin del solvente indicado, la accin del lixiviado involucra el transporte osmtico del soluto a travs de la pared celular. Para muchos productos farmacuticos extrados de races, tallos y hojas, el material de la planta frecuentemente es secado antes de darle tratamiento, y esto ayuda a la ruptura de la pared celular y libera el soluto para reaccionar directamente con el solvente. Las semillas vegetales son usualmente trituradas o aplanadas en un intervalo de tamao de 0.15 a 0.5 mm. En este paso la clula se rompe y el extracto tiene mayor contacto con el solvente.20

20

Geankoplis,J. 2003

26

Usualmente se hace el lixiviado a la temperatura ms alta posible, debido a que a temperaturas elevadas es mayor la solubilidad del soluto en el solvente, por lo tanto, las altas concentraciones en el licor de lixiviado son posibles, la viscosidad de los lquidos es menor y ms altas las difusividades, permitiendo incrementar las velocidades de lixiviado. Con algunos productos naturales a temperaturas muy altas, puede permitir excesivas cantidades de solutos indeseables en el solvente o el deterioro qumico del slido. La operacin de lixiviado se puede realizar en condiciones batch, semibatch o continua. Existen dos tcnicas aplicables: el espreado del lquido sobre el slido La eleccin del equipo que se o sumergir el slido completamente en el lquido.

emplear depende de la forma fsica del slido, costo y manejo.21

4.3.1.1 Velocidad de lixiviacin.

En la lixiviacin de materiales solubles del interior de una partcula por accin de un disolvente, el proceso en general consiste en que el disolvente se transfiere del volumen de solucin a la superficie del slido. penetra o se difunde en el slido. Despus dicho disolvente El El soluto se disuelve en el disolvente.

soluto se difunde a travs de la mezcla de slido y disolvente hasta la superficie de la partcula. Finalmente, el soluto se transfiere a la solucin general.22 Comnmente, la velocidad de transferencia del disolvente de la solucin general hasta la superficie del slido es bastante rpida, y la velocidad hacia el interior del slido puede ser rpida o lenta. stas no son las etapas que limitan la velocidad del proceso total de lixiviacin. La transferencia de disolventes suelen ocurrir al principio, cuando las partculas se ponen en contacto con el disolvente; aun as, la
21 22

Geankoplis,J. 2003 Treybal,R. 2000

27

disolucin del soluto en el disolvente en el interior del slido puede ser un simple proceso fsico de disolucin o una reaccin qumica que libera al soluto para la disolucin. La velocidad de difusin del soluto a travs del slido, y la del disolvente hasta la superficie del slido suelen ser las resistencias que controlan el proceso global de lixiviacin y dependen de diversos factores. Si el slido est constituido por una estructura inerte porosa, con el soluto y el disolvente localizados en los poros del slido, la difusin a travs del slido poroso se puede describir como una difusividad efectiva. En sustancias biolgicas y naturales, existe una complejidad adicional debido a la presencia de clulas. celular. 23 Para ello es indispensable determinar el tipo de estructura

4.3.1.2 Mtodo de operacin y tipos de equipo.

Las condiciones de operacin existentes son muy variadas, Se pueden llevar Ello

a cabo en lotes o condiciones estacionarias, continuas o no estacionarias. concentracin que se alcancen.

depender del equipo necesario para la operacin y las condiciones de

Cuando los slidos son triturados suelen lixiviarse por percolacin a travs de lechos slidos con fondos perforados para permitir el drenaje del disolvente. As mismo, se puede operar con bateras de extraccin que son tanques en serie, los cuales pueden ser abiertos o cerrados (difusores). La operacin en estos tanques puede ser consecutiva o a contracorriente aadiendo disolvente fresco en la ltima etapa.

23

Geankoplis,J. 2003

28

Se puede operar con equipos de lecho fijo, que comnmente se usan en extraccin de productos farmacuticos fondo para conducirlo al siguiente tanque. de cortezas y semillas. El flujo para lixiviar se introduce en la parte superior a alta temperatura y se recupera en el

Otro mecanismo es la lixiviacin con agitacin del slido, el cual puede triturado o mantenerlo en su estructura original; colocndolo en varios agitadores en serie con tanques de sedimentacin o espesadores entre cada agitador o incorporndolos dentro del mismo tanque. La operacin puede ser continua y

contracorriente con el bombeo de slidos en suspensin entre cada tanque. El tiempo de contacto, la temperatura y la seleccin de equipo dependern de las caractersticas del slido, el equilibrio de fases y el factor econmico. Para el clculo del proceso de lixiviacin se puede hacer referencia al mtodo referido por Badger y Banchero.24

4.3.2 Extraccin supercrtica con dixido de carbono (CO2).

Un fluido supercrtico es una sustancia por arriba de su punto crtico, en el cual la fase lquida de la sustancia no existe. A esta temperatura y presin, el fluido Estas propiedades supercrtico tiene propiedades entre el gas y la fase lquida. caractersticas de alta de transferencia de masa. 25 La extraccin supercrtica con dixido de carbono tiene muchas aplicaciones en los procesos naturales que involucran extraccin de materiales slidos en
24 25

hacen que los solventes de extraccin como fluidos supercrticos tengan

Badger,W.; Banchero,J. 1970. Jarn,G.; Nienaber,U.; Schwartz,S. 1999

29

contenedores a altas presiones en operacin batch o semi-batch. se requiere de condiciones de temperatura media

Para separar

compuestos pungentes y pigmentos de carotenoides de la especies del Capsicum, y presiones muy altas que oscilan entre 100 y 300 bars y el uso de fluidos supercrticos como el dixido de carbono, ya que es un compuesto considerado como no txico y apto para el contacto con productos de consumo humano. Se han realizado trabajos de investigacin de este proceso, en diversas universidades, en su mayora extranjeras, para evaluar el efecto de temperatura y presin sobre hojuelas de chiles. El trabajo experimental bsicamente, se realiza con equipos a escala de laboratorio; contenedores o columnas que van de 0.05 a 60mm de rea de seccin transversal. Lechos fijos con hojuelas secas de chile jalapeo, realizando pruebas con diferentes tamaos de partculas del slido y presin. El dixido de carbono, es el fluido supercrtico y recorre la columna a una velocidad proporcional a las condiciones del sistema. 26

4.4 Mtodo de cuantificacin de capsicina.

La cantidad especfica de capcisinoides presentes en los chiles, puede ser medida por mtodos de laboratorio como High Performance Liquid Chromatography (HPLC). En este procedimiento, el chile debe ser secado y Este mtodo es muy costoso pero

llevar a cabo un proceso de extraccin de capsicinoides; el extracto se inyecta a una columna de HPLC para su anlisis. bastante preciso. del equipo que se tenga disponible. El equipo y procedimientos necesarios dependen de la marca

26

Duarte,C.; Crew,M.; Casimiro,T.; Aguiar,A.; Nunes,M. 2002

30

Otro mtodo efectivo y poco costoso es la cromatografa en placa fina TLC. Consta de placas, generalmente vidrio, con una fase estacionaria en la que se aplica el extracto en forma de bandas de separacin cromatogrfica o puntos. La placa se pone en contacto con una fase mvil para el arrastre de los compuestos de extraccin y la lectura ultravioleta. de las bandas de separacin se realiza con luz

4.4.1 Cromatografa de placa fina.27

La cromatografa de placa fina (TLC thin-layer chromatography) es un tipo de cromatografa lquida en la cual la fase estacionaria es plana, tomando la forma de la superficie en materiales de vidrio, aluminio o plstico. La tcnica de TLC es un mtodo simple y de bajo costo que requiere poca instrumentacin, la TLC es empleada para la separacin de mezclas simples y su identificacin cualitativa y cuantitativa por anlisis visual de las muestras. El proceso para llevar a cabo la cromatografa de placa fina es el siguiente:

27

Sherma,J. 1999

31

Preparacin de la muestra Eleccin de fase mvil y estacionaria Prelavado de placa

Aplicacin de la muestra Derivatizacin in situ Preacondiciona_ miento de placa

Desarrollo cromatograma Zona de deteccin Documentacin foto y/o video

Evaluacin de cromatograma por densitometra para anlisis cuantitativo y cualitativo.

Reporte de resultados

Figura 8. Diagrama esquemtico de los pasos en el anlisis de TLC.

32

Las ventajas de este arreglo y el empleo de placas, son la posibilidad de separar ms de 70 muestras y estndares simultneamente en un solo plato, y la habilidad de construir curvas de calibracin de estndares bajo las mismas condiciones que las muestras; analizar las muestras con mnimas cantidades y sin temor de contaminacin irreversible en la columna como puede suceder en la tcnica de HPLC con inyecciones secuenciales y analizando muestras por pasos de mltiple separacin y procedimientos de deteccin esttica postcromatogrfica. Los platos de TLC, se emplean comnmente con flujo capilar de la fase mvil sin presin, en modo ascendente u horizontal, sin embargo, pueden utilizarse mtodos de flujo forzado para hacer pasar la fase mvil por la placa bombendola bajo presin o con fuerza centrfuga. En el flujo capilar de TLC, la velocidad de migracin de la fase mvil disminuye con el cuadrado de la distancia con la que migra el solvente. La TLC ha sido aplicada en todas las reas de anlisis incluyendo la Qumica, Bioqumica, Biologa, Alimentos, Farmacutica, estudios clnicos, productos naturales, Toxicologa, forenses, ciencia de plantas, Bacteriologa, Parasitologa y Entomologa. Los tipos de compuestos utilizados exitosamente para anlisis en TLC incluyen los farmacuticos y drogas, lpidos neutrales y polares, cidos orgnicos, carbohidratos, amino cidos, pptidos, fenoles, indoles, purinas, esteroides, vitaminas e inorgnicos.

4.4.1.1 Preparacin de la muestra.

La solucin debe estar lo suficientemente concentrada para que el analito pueda ser detectado en el volumen aplicado de muestra y bastante puro para ser separado en una zona discreta y compacta. El solvente en el que la muestra

33

est disuelta, debe ser de viscosidad y volatilidad tales que, humedezca la placa y no limite el potencial de desarrollo de la prueba durante la aplicacin. Las muestras relativamente puras en el extracto concentrado se pueden analizar directamente con TLC, sin embargo, si el analito est presente en bajas concentraciones en la muestra, se debe llevar a cabo una extraccin, purificacin y procedimientos de concentracin de analito antes de realizar un anlisis con TLC. Las impurezas que puedan afectar la deteccin, deben ser eliminadas antes de aplicar esta tcnica. Actualmente, existen placas con zonas preadsorbentes para limpiar la muestra reteniendo algunas sustancias que causan interferencia.

4.4.1.2 Fase estacionaria.

Las placas de TLC comerciales son soportes de vidrio, hojas de plstico o aluminio. Su dimensin es de 20 x 20 cm, 20 x 10 cm y 10 x 10 cm, cuentan con 0.25 mm de placa fina de 12 20 m de tamao de partcula desarrollada de 10 a 12cm. La eleccin de la placa y la fase mvil se hace de acuerdo a la naturaleza de la muestra. La fase de adsorcin normal o forzada en slica gel con una fase mvil menos polar, como cloroformo metanol es la comnmente usada. mejorar la separacin. Las placas se pueden limpiar sumergindolas en metanol antes de la aplicacin de la muestra, especialmente para cuantificar. La slica gel puede ser impregnada con varios solventes, buffers y reactivos selectivos para

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4.4.1.3 Fase mvil.

En TLC, la fase mvil es determinante para la separacin el analito. En esta

tcnica, la fase mvil es evaporada antes de que las zonas sean detectadas, por lo tanto una variedad de solventes pueden utilizarse para preparar la fase mvil. La fase mvil, generalmente consiste de dos a cinco solventes mezclados seleccionados empricamente por personal capacitado o reportes de experimentos previos citados en la literatura. Para una placa normal de slica gel, los siguientes diez solventes son empleados (clasificacin de Snyders): Grupo I: Grupo II: dietil ter isopropanol y etanol

Grupo III: tetrahidrofurano Grupo IV: cido actico Grupo V: diclorometano Grupo VI: acetato de etilo o dioxano Grupo VII: tolueno Grupo VIII: cloroformo En TLC, la fase mvil puede cambiar su composicin durante la prueba, debido a que diferentes constituyentes migran por la placa a diferentes velocidades.

4.4.1.4 Aplicacin de muestras y estndares.

La aplicacin de la muestra en forma de bandas cromatogrficas, es favorable para separaciones de alta resolucin y cuantificacin precisa, utilizando la tcnica

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de alcuotas.

Las bandas se forman incluso, cuando las muestras se aplican

manualmente con una micropipeta en placas que contienen un preadsorbente o zona concentrada. Estas placas, facilitan el anlisis cuantitativo al aplicar diferentes volmenes de la misma solucin estndar que ser aplicada para producir la curva de calibracin densitomtrica. Los tiempos tpicos para el desarrollo del cromatograma oscilan entre 3 y 60 min, el tiempo depende directamente del tipo de placa y la fase mvil.

4.4.1.5 Zona de deteccin.

Despus de pasar la fase mvil, la placa debe ser secada en una campana para evaporar completamente los excesos de la fase mvil. Los compuestos separados son detectados en la placa por su color natural, fluorescencia natural, adsorbancia UV o zonas de fluorescencia despus de reaccionar con un reactivo. Las placas se calientan despus de aplicar el reactivo detector para acelerar la reaccin. Los compuestos que naturalmente tienen color, se aprecian directamente en la placa durante el da, mientras que los compuestos con fluorescencia natural se ven como zonas brillantes en un entorno oscuro bajo luz UV. sobre la placa. Los lquidos cromognicos y fluorognicos selectivos, se aplican por espreado o con gotero

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