BIOENSAYOS Conjunto de elementos y condiciones que permiten determinar la actividad sobre una poblacin de microorganismos.

Tcnica de difusin en gel Se rige por la Ley de Fick y la base para determinar la actividad de la sustancia es la magnitud de los HALOS DE INHIBICION Tcnica de turbidimetria: Se rige por las leyes de Lambert y Beer y se fundamenta en la cuantificacin de la turbidez desarrollada por el cultivo microbiano en un medio lquido expuesto a diferentes dosis de la sustancia biolgicamente activa ACTIVIDAD DE UNA SUSTANCIA Antimicrobiana Promotora de crecimiento CONTROL DE CALIDAD Contenido de activos no se correlaciona con el contenido en masa. Antimicrobianos, Vitaminas, aminocidos AGENTES DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS PRESERVANTES Test de Challenger PROCESOS Determinar la efectividad del proceso. Esterilizacin, radiacin, filtracin Actividad Antimicrobiana. : Amplio espectro Especfica Promotora de crecimiento PROPIEDADES: Espectro de accin: Capacidad sobre uno varios tipos de microorganismos. Antibacteriano-antimictico Difusin en gel Efectividad: Capacidad que tiene el antimicrobiano de inhibir matar un microorganismo Concentracin de la sustancia CMI, CML ELEMENTOS DE LAS VALORACIONES Microorganismo Medio de cultivo Edad y estado fisiolgico AGAR 1.5-2% agarosa estabilidad biolgica agaropectina Velocidad de crecimiento De mantenimiento Sensibilidad De inculo De ensayo

Sustancia Activa Propiedades Fisicoqumicas Solubilidad-Estabilidad durante ensayo Incompatibilidades Interacciones del activo Con iones de Ca Mg y Al Que se encuentren en el medio

el

Condiciones del ensayo Tiempo para puesta del ensayo Incubacin Equipos Temperatura Tiempo Lectura de respuesta

FACTORES QUE AFECTAN EL ENSAYO Densidad del inculo Naturaleza del borde del halo Profundidad del gel Temperatura de Incubacin Concentracin del activo

Composicin del gel: Actividad del compuesto Difusin del compuesto Crecimiento del microorganismo

Caracteristicas de crecimiento del microorganismo Tiempo de incubacin Tiempo de aplicacin del activo Protenas del suero Presencia de otros activos

DIFUSION DEL ACTIVO

DIAGRAMA DE FLUJO DE LOS BIOENSAYOS

Preparacion del inoculo

Microorganismo

Adaptacion

Inoculacion

Homogenizacion

Servir cajas

Dejar solidificar, hacer pozuelos

Preparar diluciones patron y problema

Distribuir en los pozuelos de las cajas

Incubacion

lecturas y calculos

DIFUSION EN GEL

INTERPRETACION DINAMICA DE FORMACION DEL HALO : Concentracin crtica Concentracin del activo en el borde del halo de inhibicin: M No equivale a CMI Tiempo crtico Periodo del crecimiento del microorganismo al cual se alcanza una poblacin crtica N Poblacin del inoculo No Poblacin al momento de la inoculacin Poblacin crtica N Es la poblacin a un tiempo crtico donde un incremento mas alto del tiempo crtico genera un exceso de microorganismos es capaz de absorber el antimicrobiano 2 Log m= Log conc del activo _x _ DTo Coeficiente de difusin La pendiente de la recta del Log de la concentracin Vs dimetro del halo cuando X=0 Concentracin de ACTIVO produce halo de 14mm CONCENTRACIN MINIMA INHIBITORIA CMI Y CONCENTRACIN MINIMA LETAL CML Ensayo de susceptibilidad una vez conocida la actividad de la sustancia activa. Especfica para el microorganismo. CMI Concentracin ms baja del antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible despus de 12 horas de incubacin, y un subcultivo en medio libre de antimicrobiano. Se detectan entre 3 y 4 colonias. CML Concentracin ms baja de antimicrobiano capaz de matar la poblacin despus de 12 horas de incubacin y un subcultivo en medio libre de antimicrobiano. No se detectan colonias. La lectura se basa en la turbidez desarrollada no y se evala por densidad ptica CMI y CML

Potencia microbiolgica. La potencia o actividad de los antibiticos se calcula comparando el grado de inhibicin de MOs sensibles y especficos, producida por concentraciones conocidas del antibitico analizado y una sustancia de referencia. Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias cuya actividad se ha definido por un organismo internacional. En los antibiticos puede haber ligeros cambios qumicos que se traducen en perdida de actividad antimicrobiana que no pueden demostrarse por mtodos qumicos, por esta razn en caso de duda respecto a la actividad de un antibitico, los mtodos de valoracin microbiolgica prevalecen sobre los mtodos qumicos. Sustancia que se pueden cuantificar a travs de ensayo microbiolgico son los antibiticos y vitaminas. Para valorar microbiolgicamente un antibitico, se pueden emplear dos mtodos: Metodo cilindro-placa (mtodo de difusin agar) y Metodo turbidimetrico, ambos comparan la respuesta del MO de prueba, frente a una sustancia de referencia de actividad conocida y una muestra, tratadas en las mismas condiciones. Mtodo de cilindro en placa (difusin en agar). Se basa en la difusin del antibitico desde un cilindro vertical, a travs de una superficie con agar inoculado con el microorganismo de prueba. La difusin origina zonas de inhibicin del microorganismo cuyo tamao (dimetro) est en relacin con la concentracin del antibitico. Mtodo turbidimetrico. Se basa en medir espectrofotomtricamente el crecimiento del microorganismo de prueba en un medio de cultivo lquido que permite su rpido crecimiento y en el que al adicionar crecientes del antibitico se inhibe el crecimiento de forma proporcional a la concentracin adicionada. Ley de Fick. Es una ley cuantitativa en forma de ecuacin diferencial que describe diversos casos de difusin de materia o energa en un medio en el que inicialmente no existe equilibrio qumico o trmico. En situaciones en las que existen gradientes de concentracin de una sustancia, o de una temperatura, se produce un flujo de partculas o de calor que tiende a homogeneizar la disolucin y uniformizar la concentracin o la temperatura. EL flujo homogeneizador es una consecuencia estadstica del movimiento azaroso de las partculas que da lugar al segn principio de la termodinmica, conocido tambin como movimiento trmico casual de las partculas. As los procesos fsicos de difusin pueden ser vistos como procesos fsicos o termodinmicos irreversibles. La ley de difusin de Fick toma en cuenta ciertos criterios para determinar que tan fcil es que difunda una sustancia dada dependiendo de las siguientes caractersticas: Magnitud de gradiente, rea de superficie, Liposolubilidad de la sustancia (entre mas liposoluble, mas rpido difunde), peso molecular (entre menos peso, pasa ms rpido), distancia de difusin J= - D (dc/dr), donde J 2 es el flujo neto de material (gramos o moles que cruzan en cm en un segundo), dc/dr es un gradiente de concentraciones, D es el parmetro molecular denominado coeficiente de difusin, y el signo negativo corresponde al hecho de que el flujo neto es siempre en oposicin. Antibitico. Son compuestos relativamente sencillos, producidos por bacterias u hongos que atacan especficamente a las bacterias. Interfieren en algn paso del metabolismo donde encuentran un blanco adecuado. Su eficacia se ha visto alterada por su uso excesivo o incorrecto, que conduce a la aparicin y diseminacin de bacterias resistentes (impidiendo el ingreso, modificando o inactivando el frmaco, modificando al blanco, o inactivando los sistemas de flujo). La gran capacidad de las bacterias de mutar y transferir genes esencialemente en plasmidos y transposones, contribuyen a su diseminacin tanto entre bacterias emparentadas y/o patgenas como hacia bacterias no patgenas, que son los reservorios de bacterias mas resistentes Curva de crecimiento bacteriano. Referido a cambios en la cosecha de clulas (aumento en la masa total de clulas) ms que a cambios en un organismo individual. El crecimiento denota el crecimiento del nmero o de la masa por encima del inoculo original. El tiempo de generacin es el intervalo de tiempo requerido para que la clula bacteriana se divida o para que la poblacin se duplique. Este tiempo es especfico para la bacteria y de la idoneidad en nutrientes que hay en el medio y de las condiciones fisicoqumicas. Fases del crecimiento bacteriano Fase LAG (latencia) no hay aumento en la poblacin. Las clulas sufren muchos cambios en su composicin qumica Fase LOG (logartmica o exponencial) las clulas se duplican o se dividen a un ritmo constante. Se da la condicin de crecimiento equilibrado, el incremento de la masa bacteriana est directamente relacionado (es proporcional) con el aumento de otros constituyentes celulares tales como el DNA, RNA y la protena Fase estacionaria se acumulan productos txicos y se agotan los nutrientes. Las bacterias compiten por el acceso a los nutrientes. Algunas clulas mueren, otras crecen y se dividen Fase muerte mueren ms clulas de las que se producen, la tasa de muerte acelera. Dependiendo de la especie, todas la clulas mueren en cuestin de das o de horas

Metodologia. Preparacin del material (esterilizacin) Preparacin de la muestra y estndar. Ej Estndar pentrexil ampicilina 0.12 mcg/mL y 0.06 mcg/mL Muestra ampicilina solucin inyectable 1 g 0.06 mcg/mL Preparacin de MO. Empleo de Micrococcus luteus. Reajuste de la suspensin del MO con Solucin Salina estril, se ley a 580 nm y se obtuvo transmitancia de 24% Procedimiento diagrama

Resultados: Graficar log conc Vs. dimetro del halo. Al comparar las dos lneas paralelas cada una corresponde a la muestra o estndar, su diferencia de potencia es revelada por la distancia vertical entre las dos lneas paralelas (ver imagen