Expresin en Escherichia coli de un Gen sintetizado qumicamente para la hormona somatostatina Resumen.

Un gen de la hormona somatostatina, un pptido de mamfero (de 14 residuos de aminocidos), se sintetiz por mtodos qumicos. Este gen se fusion al gen de Escherichia coli -galactosidasa en el plsmido pBR322. Transformacin de E. coli con el ADN del plsmido quimrico condujo a la sntesis de un polipptido que incluye la secuencia de aminocidos correspondiente a la somatostatina. In vitro, la somatostatina activa se escinde especficamente de la protena quimrica grande por tratamiento con bromuro de ciangeno. Esto representa la primera sntesis de un producto polipptido funcional a partir de un gen de origen que se sintetiza qumicamente. La sntesis qumica de ADN y mtodos de ADN recombinante proporcionan la tecnologa para el diseo y la sntesis de genes que pueden ser fusionados a elementos plsmido para la expresin en Escherichia coli u otras bacterias. Como sistema modelo se han diseado y sintetizado un gen para un pequeo polipeptido de una hormona, la somatostatina (Figs. I y 2). Las principales consideraciones en la eleccin de esta hormona eran su pequeo tamao y su secuencia de aminocidos conocida (1), ensayos biolgicos sensibles y radioinmunes (2), y su intrnseco inters biolgico (3). La somatostatina es un tetradecapptido; que se descubri originalmente en extractos hipotalmicos ovinos pero posteriormente tambin se encontr en significativas cantidades en otras especies y otros tejidos (3). La somatostatina inhibe la secrecin de una serie de hormonas, incluyendo la hormona de crecimiento, insulina y glucagn. El efecto de la somatostatina sobre la secrecin de estas hormonas ha atrado atencin a su valor teraputico potencial en la acromegalia, pancreatitis aguda, y diabetes dependiente de insulina. La construccin global del gen de somatostatina y el plsmido fue diseado para dar lugar a la sntesis in vivo de un precursor de la somatostatina (vase la fig. 1). La protena precursora no se espera que tenga actividad biolgica, pero podra ser convertido a una forma funcional por escisin con bromuro de ciangeno (4) despus de extraccin celular. El gen somatostatina sinttico se fusiona con el opern lac porque los sitios de control de este opern estn bien caracterizados. Dada la secuencia de aminocidos de somatostatina, se pueden disear a partir del cdigo gentico de un fragmento de ADN corto que contiene la informacin para sus 14 aminocidos (Fig. 2). La degeneracin del cdigo permite un gran nmero de posibles secuencias que podan codificar para los mismos 14 aminocidos. Por lo tanto, la eleccin de codones era algo arbitraria a excepcin de las siguientes restricciones. Primero, codones de aminocidos conocidos, a ser favorecida en E. coli para la expresin del genoma MS2 se utilizaron apropiadamente (5). En segundo lugar, dado que la secuencia completa se construye a partir de un nmero de fragmentos solapantes, los fragmentos fueron diseados para eliminar el indeseable emparejamiento inter e intramolecular. Y en tercer lugar, las secuencias ricas en G-C (guanina-citosina) seguida por ricas en secuencias A-T (adenine-timina) se evitaron ya que podran terminar la transcripcin (6).

Ocho oligonucletidos, de diferente longitud de 11 a 16 nucletidos, etiquetados en la figura. 2 como A a H, se sintetizaron por el mtodo del trister (7). Adems a los 14 codones para la informacin estructural de la somatostatina, varias otras caractersticas se han incorporado en el nucletido secuencia. En primer lugar, para facilitar la insercin en ADN plsmido, los extremos cohesivos 5'de una cadena para la Eco RI y Bam HI endonucleasas de restriccin. En segundo lugar, un codn de metionina precede al aminocido NH2-terminal normal de somatostatina, y el codn terminal COOH es seguido por dos codones sin sentido. En la clonacin y expresin del gen de la somatostatina sinttico hemos utilizado dos plsmidos. Cada plsmido tiene un sitio Eco RI sustrato en una regin diferente del gen Galactosidasa estructural (vase las Figs. 3 y 4). La insercin de los fragmento de ADN de somatostatina sinttica en los sitios Eco RI de estos plsmidos lleva la expresin de la informacin gentica en ese fragmento bajo el control del opern lac. Despus de que la insercin del fragmento de somatostatina en estos plsmidos, la traduccin debe resultar en un polipptido de somatostatina precedida ya sea por diez aminocidos (pSOM 1) o por virtualmente toda la estructura de la subunidad, -galactosidasa (pSOM11-3). El esquema de la construccin del plsmido (Fig. 3) comienza con el plsmido pBR322, un bien caracterizado vehculo de clonacin (8). Los elementos de lac se introdujeron a este plsmido mediante la insercin de un fragmento endonucleasa de restriccin Hae III (203 nucletidos) que lleva el promotor lac, sitio de unin gen-protena-activadoracatabolite, operador, sitio de unin al ribosoma, y los primeros siete codones de aminocidos del gen estructural -galactosidasa (9) (Figs. 3 y 4). El fragmento Hae III se deriv del ADN plac5. El plasmido pBR322 fragmentado en Eco RI, que tuvo su ADN polimerasa terminal reparada con T4 y desoxirribonucletidos trifosfato, fue ligada al extremo romo del fragmento Hae III para crear extremos Eco RI terminal en los puntos de insercin. La unin de estos Hae III y extremos reparados Eco RI genero el sitio de restriccin Eco RI (Figs. 3 y 4) en cada extremo. Los transformantes de E. coli RRL (8) con este ADN fueron seleccionados para la resistencia a la tetraciclina (Tc) y ampicilina (Ap) en medio 5-bromo-4-cloro-indolylgalactoside (X-gal) (10). En este medio indicador, las colonias constitutiva para la sntesis de -galactosidasa en virtud del incrementado nmero de lac operadores represor de titulacin, se identificaron por su color azul. Dos orientaciones del fragmento Hae III son posibles, pero estos se distinguen por la ubicacin asimtrica de un sitio de restriccin Hha en el fragmento. El plsmido pBH10 fue modificado para eliminar el sitio de la endonucleasa Eco RI distal para el operador lac (pBH20). Los ocho oligodesoxirribonucletidos sintetizados qumicamente (Fig. 2) se marcaron a los 5' terminal con [-32P] ATP (adenosin triphophatase) por T4 polinucletido quinasa y se unieron con ADN T4 ligasa. A travs de enlaces de hidrgeno entre los fragmentos solapantes, el gen de la somatostatina autoensambla y finalmente se polimeriza en molculas ms grandes debido a la restriccin cohesiva sitio terminal. Los productos ligados se trataron con endonucleasas de restriccin Eco RI y Bam HI para generar el gen de somatostatina (Fig. 2).

El fragmento del gen sinttico de somatostatina con Eco RI y Bam HI terminal se lig al plsmido pBH20, previamente se trat con endonucleasas de restriccin Eco RI y Bam HI y fosfatasa alcalina. El tratamiento con fosfatasa alcalina proporciona una seleccin molecular de plsmidos que llevan el fragmento insertado (11). Los fragmentos resistentes a ampicilina obtenidos con este ADN ligado se seleccionaron para sensibilidad a la tetraciclina, y varios eran examinados para la insercin de un fragmento Eco Rl- Bam HI de apropiado tamao. Ambas hebras de los fragmentos Eco RI-Bam HI de plsmidos de dos clones se analizaron mediante un anlisis de secuencia de nucletidos (12) a partir de la Bam HI y los sitios Eco RI. El anlisis de la secuencia se extendi a los elementos lac-control; la secuencia del fragmento lac estaba intacta, y en un caso, pSOM1, el nucletido secuencia de ambas cadenas fueron independientemente determinadas, cada uno dando la secuencia que se muestra en la figura. 3. En el otro caso, la secuencia era idntica excepto para una delecin de pares de bases (A-T) en una posicin equivalente a la unin de los oligonucletidos B-C en el fragmento de ADN original. La base para la supresin es clara. Los ensayos estndar radioinmune (RIA) para la somatostatina (2) fueron modificados al disminuir el volumen de ensayo y por usar tampn de fosfato (Fig. 6). Esta modificacin demostr ser adecuada para la deteccin de la somatostatina en extractos de E. coli. Los sedimentos bacterianos de clulas, extractos, de los cultivos se trataron durante la noche en 70 % de cido frmico que contiene bromuro de ciangeno (5 mg/ml). El cido frmico y el bromuro de ciangeno se eliminaron a vaco sobre KOH antes del ensayo. Experimentos iniciales con extractos de E. coli cepa RRI (la cepa receptora) (10) indico que menos de 10 pg de somatostatina podra ser fcilmente detectado en presencia de 16, g o ms de protena bacteriana tratada con bromuro de ciangeno tratados. Ms de 2 g de la protena de extractos bacteriales tratados con cido frmico interfiri tanto por el aumento del fondo, pero la escisin de bromuro de ciangeno grandemente redujo esta interferencia. Los experimentos de reconstruccin mostraron que la somatostatina es estable en extractos tratados con bromuro de ciangeno. El anlisis de la secuencia de ADN de pSOM1 indic que el clon que lleva este plsmido debe producir un pptido conteniendo somatostatina. Sin embargo, actualmente todos los intentos de detectar la actividad somatostatina radioinmune de los extractos de sedimentos celulares o sobrenadantes de cultivo han sido infructuosos. Resultados negativos tambin se obtuvieron cuando cultivo en crecimiento se aadi directamente a 70 % de cido frmico y bromuro de ciangeno. Nosotros calculamos que E. coli RRI (pSOM1) contiene menos de seis molculas de somatostatina por clula. En un experimento de reconstruccin hemos observado que somatostatina exgena se degrada muy rpidamente por extractos de E. coli RR1. El fracaso para encontrar la actividad de la somatostatina puede explicarse por la degradacin intracelular por las enzimas proteolticas endgenas.

Si la falta de deteccin de la actividad de somatostatina de pSOM1 era debido a la degradacin proteoltica de la protena pequea (Fig. 4), la unin a una protena grande podra estabilizarla. El gen estructural -galactosidasa tiene un sitio Eco RI cerca en el COOH-terminal (13). La disposicin de datos sobre la secuencia de aminocidos de esta protena (13, 14) sugiri que sera posible insertar el gen somatostatina Eco RI-Bam HI en el sitio y mantener el marco de lectura apropiado para la correcta traduccin del gen de la somatostatina (Fig. 4). La construccin de este plsmido se indica en la figura. 3. El fragmento Eco RI-Pst del plsmido pSOM1, con el elemento lac-control se elimin y remplaz con el fragmento Eco RI-Pst de pBR322 para producir el plsmido pSOM11. El fragmento Eco RI de plac5, llevando la regin control del opern lac y la mayor parte del gen estructural de la galactosidasa, se insert en el Sitio Eco RI de pSOM11. Dos orientaciones del fragmento Eco RI lac de plac5 se esperaban. Una de estas orientaciones sera mantener el adecuado marco de lectura en el gen somatostatina, el otro no lo hara. Un nmero de clones aislados de forma independiente (con designaciones plsmido pSOM11-2 y pSOM11-3) se analizaron para la actividad de la somatostatina, como se describe anteriormente. En contraste con los resultados de experimentos con pSOM1, cuatro clones (pSOM11-3, 11-5, 11-6, y 11-7) se encontr que tenan actividad radioinmune somatostatina fcilmente detectable (Fig. 6, a y b). El anlisis de fragmento de restriccin revelo que pSOM11-3, pSOM11-5, PSOM11-6, y pSOM11-7 tuvo la deseada orientacin del opern lac, mientras que pSOM11-2 y 11-4 tenan orientacin opuesta. Por lo tanto, existe una perfecta correlacin entre la orientacin correcta del opern lac y la produccin de actividad radioinmune de la somatostatina. El diseo del plsmido somatostatina predice que la sntesis de la somatostatina estara bajo el control del opern lac. El gen represor lac no es incluido en el plsmido, y la cepa destinataria (E. coli RR1) contiene gen represor lac de tipo salvaje cromosmico, que produce solamente 10 a 20 molculas represoras por clula (15). El nmero de copias del plsmido (y por lo tanto el nmero de operadores lac) es aproximadamente 20 a 30 por clula y la represin completa es imposible. La actividad especfica de la somatostatina en E. coli RR1 (pSOM11-3) se increment por IPTG, un inductor del opern lac (Tabla I). Como era de esperar, el nivel de induccin fue baja, variando a partir de 2.4-a 7-veces. En el experimento 7 (Tabla 1), la actividad (14), una medida de los primeros 92 aminocidos de -galactosidasa, tambin fue inducida por un factor de 2.

En varios experimentos (Tabla 1 y otros experimentos no mostrados), ninguna actividad radioinmune de somatostatina se detect antes de la escisin con bromuro de ciangeno de la protena celular total. Puesto que el antisuero utilizado en el radioinmunoensayo, S39, requiere de una alanina NH2-terminal libre, no se esperaba antes de la actividad de escisin a bromuro de ciangeno. Despus de la escisin por bromuro de ciangeno extractos, clulas se someti a cromatografa en Sephadex G-50 en 50 % de cido actico (Fig 6c). En este sistema, la somatostatina es as separado de pptidos excluidos grandes y plenamente incluidas en molculas pequeas. Slo extractos de clones positivos para somatostatina exhibieron actividad radioinmune en las fracciones de la columna y eluye esta actividad en la misma posicin que sintetiza qumicamente somatostatina. Las cepas que llevan el fragmento opern lac Eco RI (por ejemplo, pSOM11-2 y pSOM 11-3) segregan con respecto al fenotipo plsmido. Por ejemplo, despus de casi 15 generaciones, alrededor de un medio del cultivo E. coli RR1 (pSOM11-3) era constitutivo por -galactosidasa, es decir, realizada el operador lac, y casi la mitad de colonias non constitutive fueron sensibles a ampicillina. Las cepas positivas (pSOM11-3) y negativa (pSOM11-2) para somatostatina son inestables, y, por lo tanto, la desventaja de crecimiento presumiblemente proviene de la sobreproduccin de la gran pero incompleta e inactiva -galactosidasa. El rendimiento de la somatostatina ha variado desde 0,001 hasta 0,03 % de la protena celular total (Tabla 1) probablemente como resultado de la seleccin de las clulas en el cultivo que tienen plsmidos con una regin lac eliminada. Los rendimientos ms altos de la somatostatina han sido preparados a partir de cultivos donde el crecimiento fue iniciado a partir de una nica colonia, constitutiva Ap-resistente. Incluso en estos casos, 30 % de las clulas en cosecha tenan deleciones de la regin lac. Varias escalas moderadas (hasta 10 litros) se han hecho intentos para purificar la somatostatina a partir de E. coli cepa RR1 (pSQM11-3). El esquema de purificacin inicial se bas en conocida purificacin de -galactosidasa seguida por purificacin del bromuro de ciangeno productos de escisin de la protena quimrica. Sin embargo, esencialmente toda la actividad de somatostatina se encuentra en el extracto crudo que es insoluble y se encuentra en el paquete de la primera centrifugacin a baja velocidad. La actividad puede ser solubilizada en 70 % de cido frmico, 6 M guanidino hydroxiclorado, 8 M Urea, o 2 % de dodecil sulfato de sodio. La actividad de somatostatina se ha enriquecido aproximadamente 100 veces a partir de los restos celulares por escisin del bromuro de ciangeno, y subsiguiente extraccin alcohol ycromatografa en Sephadex G-50 en 50 % ciento de cido actico. Las mejoras recientes en la sntesis qumica de ADN proporcionan la oportunidad para sintetizar rpidamente ADN con inters biolgico para la manipulacin gentica y la experimentacin. Como se ilustra anteriormente (16, 17), las tcnicas de ADN recombinante in vitro y de clonacin molecular mejoran el valor experimental del ADN sintetizado qumicamente. Hay dos mtodos bien establecidos para la sntesis de ADN. El mtodo fosfodister de Khorana y col. (18) y ms recientemente en el mtodo modificado fosfotrister (7). Ambos mtodos son capaces de producir ADN funcional (16, 17, 19, 20),

sin embargo, el mtodo del trister es probablemente ms rpido. Por otra parte, un mtodo para sintetizar rpidamente bloques de trimeros (codones) como unidades de construccin para ms oligodesoxirribonucletidos (21) (Fig. 2b) se ha incrementado la velocidad del mtodo del trister. Desde la biblioteca del bloque trmero, un hexadecadeoxyribonucleotide ahora se puede conseguir en una semana. Hemos establecido aqu que el ADN hecho con esta mejora es funcional. Los datos que justifiquen la sntesis de un polipptido que contiene la secuencia de aminocidos somatostatina se resumen como sigue. (i) La actividad radioinmune de somatostatina est presente en clulas de E. coli que tienen el plsmido pSOM11-3, que contiene un gen somatostatina de secuencia correcta probada y tiene la orientacin correcta del fragmento de ADN lac Eco RI. Clulas con el correspondiente plsmido pSOM11-2, que tiene el mismo gen de la somatostatina pero una orientacin opuesta del Fragmento lac Eco RI, produce no detectable actividad somatostatina. (ii) Como se predijo por el esquema de diseo, no detectable de actividad radioinmune de somatostatina se observa hasta despus del tratamiento del bromuro de ciangeno del extracto celular. (iii) La actividad somatostatina est bajo el control del opern lac como se evidencia por la induccin por IPTG, un inductor del opern lac. (Iv) La actividad cromatografica de somatostatina con la somatostatina conocido en Sephadex G-50. (V) La secuencia de ADN del gen clonado de somatostatina es correcta. Si la traduccin esta fuera de fase, un pptido se hizo que es diferente de somatostatina en cada posicin. Actividad radioinmune se detecta indicando que un pptido estrechamente relacionado con la somatostatina se hace, y la traduccin debe ser en fase. Puesto que la traduccin se produce en fase, el cdigo gentico dicta que un pptido con la secuencia exacta de la somatostatina est hecho. (Vi) Parcialmente purificada las muestras han sido ensayadas independientemente por W. Vale (Salk Institute). l ha confirmado nuestra actividad radioinmune tanto con antisuero S39, que se dirige por el NH2- terminal, y con antisuero S201 que interacta principalmente con somatostatina en posiciones 6 a 14. (Vii) Finalmente, las muestras anteriores de extracto E. coli RR1 (pSOM11-3) inhiben la liberacin de hormona de crecimiento de clulas pituitaria de rata, mientras que las muestras de E. coli RR} (pSOM11-2) preparado en paralelo y con concentracin idntica de protena no tienen ningn efecto sobre la liberacin de hormona de crecimiento (22). Nuestros resultados representan el primer xito en lograr expresin (es decir, la transcripcin en el ARN y la traduccin del ARN en una protena de una secuencia de aminocidos diseada) de un gen de origen qumicamente sintetizado. El gran nmero de molculas de plsmido por clula resulta en una cantidad sustancial (por lo menos 3 %) de la protena celular como el hbrido -galactosidasa de somatostatina. Esta molcula parece ser relativamente resistente a la actividad proteoltica endgena. Hay evidencia que anormalmente cortos pptidos de -Galactosidasa son degradados en E. coli (14) lo que sugiere que la protena hbrida esperada del primer plsmido somatostatina-lac (pSOM1) es tambin degrada rpidamente. La cantidad de somatostatina sintetizados fue variable y un factor de aproximadamente 10 menor que la mxima prevista. Esta variabilidad podra interpretarse en varias maneras.

La degradacin de protena por proteasas endgenas, la incapacidad para solubilizar completamente la protena quimerica, y la seleccin de alteracin de plsmidos que todos podran ser factores contribuyentes a la variabilidad en el rendimiento. Aunque experimentos con ADN recombinante ADN sintetizado qumicamente son inherentemente menos peligrosos que los que tienen ADN a partir de fuentes naturales, la consideracin se debe dar a la posible toxicidad del producto peptdico. Uno de los principales factores en la eleccin de la somatostatina era su baja toxicidad probada (3). Adems, el experimento se dise deliberadamente para que las clulas no producen libre somatostatina, sino ms bien un precursor, que se espera que sea relativamente inactivos. La clonacin y el crecimiento de cultivos de clulas se realizaron en instalaciones con una contencin P-3.