Você está na página 1de 39

Padrão Internacional ISO 6579

4ª. Edição (15/07/2002)

Microbiologia de Alimentos para consumo humano e de animais Método Horizontal para detecção de Salmonella spp.

Número de referência: ISO 6579:2002 (E)

Conteúdo

 

Prefácio

3

Introdução

4

1 Escopo

5

2 Referências Normativas

5

3 Termos e Definições

6

4 Princípios

6

 

4.1 Geral

6

4.2 Pré-enriquecimento em meio líquido não seletivo

7

4.3 Enriquecimento em meio líquido seletivo

7

4.4 Plaqueamento e identificação

7

4.5 Confirmação da identidade

7

5

Meios de cultura, reagentes e soros

8

 

5.1 Geral

8

5.2 Meios de cultura e reagentes

8

 

5.3 Soros

9

6 Equipamentos e vidraria

9

7 Amostragem

10

8 Preparação das amostras de teste

10

9 Procedimento (Veja diagrama no Anexo A)

11

9.1

Parte do teste e suspensão inicial

11

9.2

Pré-enriquecimento não seletivo

12

9.3

Enriquecimento seletivo

12

9.4

Plaqueamento e identificação

12

9.5

Confirmação

13

10

Expressão de resultados

19

11

Reporte do teste

19

12

Garantia da Qualidade

19

Anexo A (normativa) Diagrama de Procedimento

20

Anexo B (normativa) Composição e preparação de meios de cultura e reagentes

 

21

Anexo C (informativo) Resultados de ensaios interlaboratoriais

34

Bibliografia

39

Prefácio

ISO (a Organização Internacional para Padronização) é uma federação mundial de órgãos nacionais de padronização (organismos membros da ISO). O trabalho de elaboração das Normas Internacionais é geralmente realizado através de comitês técnicos da ISO. Cada organismo membro interessado em um assunto para o qual um comitê técnico foi estabelecido tem o direito de ser representado no comitê. Organizações internacionais, governamentais e não- governamentais, em ligação com a ISO, também tomam parte do trabalho. A ISO colabora estreitamente com a Comissão Eletrotécnica Internacional (CEI - IEC) em todos os assuntos de normalização eletrotécnica.

Normas Internacionais são elaboradas de acordo com as regras estabelecidas nas diretivas ISO / IEC, Parte 3.

A principal tarefa de comitês técnicos é preparar Padrões Internacionais. Os projetos de Padrões Internacionais aprovados pelos comités técnicos são distribuídos aos organismos membros para votação. A publicação como Padrão Internacional exige aprovação de pelo menos 75% dos organismos membros com direito a voto.

Atenção para a possibilidade de que alguns dos elementos do presente Padrão Internacional pode ser objeto de direitos de patente. A ISO não deve ser considerada responsável pela identificação de quaisquer direitos de patente.

A ISO 6579 foi preparada pelo Comitê Técnico ISO/TC 34, Produtos Alimentícios, Subcomitê SC 9, Microbiologia.

Esta quarta edição cancela e substitui a terceira edição (ISO 6579: 1993), que foi tecnicamente revisada.

Os anexos A e B formam a parte normativa deste Padrão Internacional. O anexo C é somente para informação.

Introdução

Por causa da grande variedade de alimentos para consumo humano e animal, este método horizontal pode não ser apropriado em cada detalhe para determinados produtos. Neste caso, métodos diferentes, que sejam específicos para estes produtos, podem ser utilizados se absolutamente necessário por questões técnicas justificadas. No entanto, toda atenção deve ser dada para aplicar este método horizontal, tanto quanto possível.

Quando esta Norma Internacional estiver próximo de ser revisada, serão levadas em consideração todas as informações então disponíveis, considerando a extensão em que este método horizontal tem sido seguido e as razões para desvios deste método em caso de produtos distintos.

A harmonização dos métodos de ensaios não pode ser imediata, e para certos grupos de produtos, Padrões Internacionais e/ou padrões nacionais podem já existir e não estar de acordo com este método horizontal. Espera-se que quando tais normas sejam revisadas elas serão modificadas para estarem em conformidade com este Padrão Internacional e que, eventualmente, somente partidas restantes deste método horizontal sejam necessárias para estabelecer o método.

Microbiologia de Alimentos para consumo humano e de animais Método Horizontal para detecção de Salmonella spp.

AVISO - A fim de preservar a saúde do pessoal de laboratório, é essencial que os testes para a detecção de Salmonella, em especial Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi, só sejam realizados em laboratórios equipados corretamente, sob o controle de um microbiologista qualificado, e que um grande cuidado seja tomado na eliminação de todos os materiais incubados.

1 Escopo

Este Padrão Internacional especifica um método horizontal para a detecção de Salmonella, incluindo Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi.

Sujeito às limitações discutidas na Introdução, esta Norma é aplicável a:

- produtos destinados ao consumo humano e à alimentação de animais

- amostras ambientais na área de produção de alimentos e manipulação de alimentos

AVISO O método pode não recuperar todas as cepas de Salmonella Typhi e Paratyphi.

2 Referências Normativas

Os seguintes documentos normativos contêm disposições que, ao serem citadas neste texto, constituem prescrições para este Padrão Internacional. Para referências datadas, as emendas subseqüentes ou revisões de qualquer uma destas publicações não se aplicam. No entanto, as partes em acordos baseados no presente Padrão Internacional são encorajadas a investigar a possibilidade de aplicarem as edições mais recentes dos documentos normativos indicados abaixo. Para referências não datadas, a última edição do documento normativo referido se aplica. Os membros da ISO e IEC mantém registos de Padrões Internacionais atualmente válidos.

ISO 6887-1, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal - Preparação de amostras de teste, suspensão inicial e diluições decimais para análise microbiológica - Parte 1: Regras gerais para a elaboração da suspensão inicial e das diluições decimais.

ISO 7218:1996, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal Regras Gerais para análises microbiológicas.

ISO 8261, Leite e produtos lácteos Guia geral para a preparação de amostras de teste, suspensões iniciais e diluições decimais para análise microbiológica

3 Termos e Definições

Para as propostas deste Padrão Internacional, os seguintes termos e definições se aplicam.

3.1

Salmonella

microorganismos que formam colônias típicas ou menos típicas em meios sólidos seletivos e que exibem as características bioquímicas e sorológicas descritas quando os testes são realizados em conformidade com o presente Padrão Internacional.

3.2

Detecção de Salmonella

determinação da presença ou ausência de Salmonella (3.1), em uma massa ou volume particular do produto, quando testes são realizados em conformidade com este Padrão Internacional.

4 Princípios

4.1 Gerais

A detecção de Salmonella necessita de quatro estágios sucessivos (veja também Anexo A).

NOTA A Salmonella pode estar presente em pequenos números de colônias e são frequentemente acompanhadas por números consideravelmente maiores de outros micro organismos da família Enterobacteriaceae ou outras famílias. Além disso, o pré-enriquecimento é necessário para permitir a detecção de baixos números de Salmonella ou células injuriadas de Salmonella.

4.2

Pré-enriquecimento em meio líquido não seletivo

A amostra teste é inoculada a temperatura ambiente em água peptonada

tamponada e, então, incubada a 37°C ± 1 °C por 18h ± 2h.

Para certos alimentos, o uso de outros procedimentos de pré-enriquecimentos

é necessário. Veja 9.1.2.

Para grandes quantidades, a água peptonada tamponada deve ser aquecida a 37 °C ± 1 °C antes da inoculação com a amostra teste.

4.3 Enriquecimento em meio líquido seletivo

O meio Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS) e caldo Muller-Kauddmann

tetrationato/novobiocina (caldo MKTTn) são inoculados com a cultura obtida em

4.2.

O

caldo RVS é incubado a 41,5°C ± 1 °C por 24h ± 3h e o caldo MKTTn a 37

°C

± 1 °C por 24 h ± 3 h.

4.4

Plaqueamento e identificação

Para as culturas obtidas em 4.3, dois meios sólidos seletivos são inoculados:

- Agar Xilose Lisina Desoxicolato (Ágar XLD)

- Algum outro meio sólido seletivo complementar ao Agar XLD e especialmente

apropriado para o isolamento de cepas de Salmonella lactose-positivo e Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi; o laboratório pode escolher qual meio usar.

O Agar XLD é incubado a 37 °C ± 1 °C e avaliado após 24 h ± 3 h. O secundo

Agar seletivo é incubado de acordo com as recomendações do fabricante.

NOTA Para informação, o Agar Verde Brilhante (AVB), Agar Bismuto Sulfito, etc., podem ser usados como o segundo meio de plaqueamento.

4.5 Confirmação de identidade

Colônias de Salmonella presuntivas são subcultivadas, então plaqueadas como

descrito em 4.4, e sua identidade é confirmada por meio de testes bioquímicos

e sorológicos apropriados.

5 Meios de cultura, reagentes e soro

5.1 Geral

Para práticas laboratoriais atuais, veja ISO 7218.

5.2 Meios de cultura e reagentes

NOTA - Por causa do grande número de meios de cultura e reagentes, é considerado preferível, por clareza, dar suas composições e preparações no Anexo B.

5.2.1

Meios

de

pré-enriquecimento

não

seletivo:

água

peptonada

tamponada

 

Veja B.1.

5.2.2

Primeiro

meio

de

enriquecimento

seletivo:

meio

Rappaport-

Vassiliadis com soja (caldo RVS).

Veja B.2.

5.2.3 Secundo meio de enriquecimento seletivo: caldo Muller-Kauffman tetrationato novobiocina (caldo MKTTn)

Veja B.3.

5.2.4 Meio sólido seletivo de plaqueamento

5.2.4.1 Primeiro meio: Agar Xilose Lisina Desoxicolato (Agar XLD)

Veja B.4.

5.2.4.2 Segundo meio

A escolha do segundo meio apropriado é deixada ao critério do laboratório de teste. As instruções do fabricante devem ser precisamente seguidas considerando seu preparo para uso.

5.2.5 Agar nutriente

Veja B.5.

5.2.6 Agar Açúcar /ferro triplo (Agar TSI)

Veja B.6

5.2.7 Agar Uréia (Christensen)

Veja B.7.

5.2.8 Meio Descarboxilação L-Lisina

Veja B.8

5.2.9 Reagente para detecção de β-galactosidase (ou preparados de

discos de papel utilizados conforme as instruções do fabricante.

Veja B.9

5.2.10 Reagentes para reação Voges-Proskauer (VP)

Veja B.10

5.2.11Reagentes para reação Indol

Veja B.11

5.2.12 Agar nutriente semi-sólido

Veja B.12

5.2.13 Solução salina fisiológica

Veja B.13

5.3 Soros

Vários tipos de soros aglutinantes contendo anticorpos para um ou vários Antígenos-O estão disponíveis comercialmente; isto é, anti-soros contendo um ou mais grupos "O" (chamado soro monovalente ou polivalente anti-O), soro anti-Vi e anti-soros contendo anticorpos para um ou vários fatores H (chamado soro monovalente ou polivalente anti-H).

Cada tentativa deve ser feita para garantir que os anti-soros utilizados são adequados para fornecer para a detecção de todos os sorotipos de Salmonella. Assistência para este objetivo pode ser obtido utilizando apenas os anti-soros preparados por um fornecedor reconhecido como competente (por exemplo, por uma agência governamental apropriada).

6 Equipamentos e Vidrarias

Aparelho descartável é uma alternativa aceitável para vidrarias reutilizáveis, se ele tem as especificações adequadas. Equipamentos usuais de laboratório de microbiologia (ver ISO 7218) e, em particular, o seguinte

6.1

Equipamento para esterilização a seco (estufa) ou esterilização úmida

(autoclave)

Veja ISO 7218.

6.2 Cabine de secagem ou estufa, ventilado por convecção, capaz de operar

entre 37 °C e 55 °C.

6.3 Incubadora, capaz de operar a 37 °C ± 1 °C

6.4 Banho de água (Banho Maria), capaz de operar a 41,5°C ± 1°C, ou

incubadora, capaz de operar a 41,5 °C ± 1 °C

6.5 Banho de água (Banho Maria), capaz de operar a 44°C a 47°C

6.6 Banho de água (Banho Maria), capaz de operar a 37°C ± 1 °C

É recomendado usar um banho de água (6.4, 6.5 e 6.6) contendo um agente antibacteriano por causa da baixa dose infecciosa de Salmonella.

6.7 Alças estéreis, de aproximadamente 3 mm de diâmetro ou 10 µl ou

pipetas estéreis.

6.8 pHmetro tendo uma precisão de calibração de ± 0,1 unidade de pH de 20°C a 25 °C

6.9 Tubos de ensaio ou frascos de capacidade apropriada

Garrafas ou frascos com roscas metálicas não tóxicas ou de plástico podem ser utilizados

6.10 Pipetas graduadas ou pipetas automáticas de capacidade nominal de 10mL e 1mL graduados respectivamente em divisões de 0,5mL e 0,1mL.

6.11 Placas de Petri, de tamanho pequeno (diâmetro de 90mm a 100mm) e/ou tamanho maior (140mm).

7 Amostragem

É importante que o laboratório receba uma amostra que é verdadeiramente representativa e não tenha sido danificada ou alterada durante o transporte ou armazenamento.

A amostragem não é parte do método especificado neste Padrão Internacional. Veja o Padrão Internacional específico que lida com o produto em questão. Se não há um Padrão Internacional específico, é recomendado que as partes interessadas cheguem a um acordo sobre este assunto.

8

Preparação da amostra de teste

Preparar a amostra de teste de acordo com o Padrão Internacional específico que lida com o produto em questão. Se não houver Padrão Internacional específico, é recomendável que as partes envolvidas cheguem a um acordo sobre este assunto.

9 Procedimento (Veja diagrama Anexo A)

9.1 Parte do teste e suspensão inicial

9.1.1 Geral

Veja ISO 6887-1 e o Padrão Internacional específico que lida com o produto

em causa. Ver ISO 8261 para o leite e produtos lácteos.

Para a preparação da suspensão inicial, no caso geral, usar como como diluente o meio de pré-enriquecimento especificado em 5.2.1(água peptonada tamponada) e item 4.2.

Se a massa especificada da porção de teste é diferente de 25 g, utilizar a

quantidade necessária de meio de pré-enriquecimento para produzir uma diluição 1/10.

Para reduzir o volume de trabalho de análise quando uma porção maior que 25g de um lote específico de alimento tem que ser analisado e quando existem evidências de que a composição (junção das porções de teste) não afeta o resultado para aquele particular alimento, as porções do teste podem ser compostas. Por exemplo, se 10 partes do teste de 25 g estão para ser analisados, combinar as 10 unidades para formar uma porção de teste composta de 250 g e adicionar 2,25L de caldo de pré-enriquecimento. Alternativamente, a porção de 0,1mL (em 10mL de caldo RVS) e 1 mL (em 10

mL de caldo MKTTn) do caldo de pré-enriquecimento a partir das 10 porções

de testes separados (ver 9.3.1) pode ser composta para o enriquecimento em 100 mL de meio de enriquecimento seletivo.

9.1.2 Preparações específicas da suspensão inicial para certos alimentos

NOTA - As seguintes preparações específicas dizem respeito apenas ao caso

de Salmonella. Preparações específicas aplicáveis para a determinação de

quaisquer microorganismos são descritas nas normas ISO 6887-2, ISO 6887-3, 6887-4 ISO e ISO 8261.

9.1.2.1

Cacau e produtos que contenham cacau (i.e., mais que 20%)

Adicionar à água peptonada tamponada (5.2.1), de preferência 50 g/L de caseína (evitar o uso de caseína ácida), ou 100 g/L de leite em pó desnatado estéril e adicionar, após cerca de 2 h de incubação, 0,018 g/L de Verde Brilhante se o alimento é susceptível de ser altamente contaminada com microbiota Gram-positivo.

9.1.2.2 Alimentos ácidos e acidificantes

Assegurar que o pH não cai para baixo de 4,5 durante o pré-enriquecimento. NOTA - O pH dos alimentos ácidos e acidificantes é mais estável se a água peptonada tamponada em concentração dupla é usada.

9.2 Pré-enriquecimento não seletivo

Incubar a suspensão inicial (9.1) a 37°C ± 1 °C por 18 h ± 2 h.

9.3 Enriquecimento seletivo

9.3.1 Transferir 0,1mL da cultura obtida em 9.2 para o tudo contendo 10mL de

caldo RVS (5.2.2). Transferir 1mL da cultura obtida em 9.2 ao tubo contendo 10mL de caldo MKTTn (5.2.3).

9.3.2 Incubar o caldo RVS inoculado (9.3.1) a 41,5°C ± 1°C por 24h ± 3h e o

caldo MKTTn inoculado a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h. Cuidado deve ser dado para que o máximo da temperatura de incubação (42,5°C) não seja excedido.

9.4 Plaqueamento e identificação

9.4.1 Após incubação durante 24h ± 3h, usar a cultura obtida no caldo RVS (9.3.2), inocular por meio de uma alça (6.7) na superfície de uma placa de Petri de maior tamanho (6.11) contendo o primeiro meio de plaqueamento seletivo (Agar XLD,veja 5.2.4.1), de modo que colônias bem isoladas serão obtidas.

Na ausência de grandes placas, utilizar duas pequenas placas, um após a outra, usando a mesma alça.

Proceder da mesma forma com o segundo meio seletivo de plaqueamento (5.2.4.2), utilizando uma alça estéril e placas de Petri como descrito acima.

9.4.2 Após incubação por 24h ± 3h, usar a cultura obtida no caldo MKTTn

(9.3.2), repetir o procedimento descrito em 9.4.1 com os dois meios seletivos de plaqueamento.

9.4.3 Inverta as placas (9.4.1 e 9.4.2) para que o fundo fique no alto e colocá- los então na incubadora (6.3) regulada a 37°C para o primeiro meio de plaqueamento (5.2.4.1). As instruções do fabricante devem ser seguidas para o segundo meio de plaqueamento (5.2.4.2).

9.4.4 Após incubação por 24h ± 3h, analisar as placas (9.4.3) para a presença

de colônias típicas de Salmonella e colônias atípicas que podem ser Salmonella (veja nota). Marcar a sua posição sobre o fundo da placa.

As colônias típicas de Salmonella cultivadas em ágar XLD tem um centro negro e uma zona ligeiramente transparente de cor avermelhada devido à mudança de cor do indicador.

NOTA Variantes de Salmonella H 2 S negativo (por exemplo, S. Paratyphi A) cultivadas em Agar XLD são cor de rosa com um centro rosa escuro. Salmonella Lactose-positivo cultivadas em Agar XLD são de cor amarela, com ou sem o escurecimento.

Incubar o segundo meio sólido seletivo à temperatura apropriada e analisar após o tempo apropriado para verificar a presença de colónias que, por suas características, são consideradas presuntivas para Salmonella.

9.5 Confirmação

9.5.1 Geral

Se demonstrado que são confiáveis, kits de identificação comercialmente disponíveis podem ser usados para a análise bioquímica de Salmonella. A utilização de kits de identificação diz respeito à confirmação bioquímica de colônias. Estes kits devem ser usado seguindo as instruções do fabricante.

NOTA - O reconhecimento de colônias de Salmonella é uma questão de experiência, e sua aparência pode variar um pouco, não só de sorotipo a sorotipo, mas também de lote a lote do meio de cultura seletivo utilizado.

9.5.2 Seleção de colônias para confirmação

Para confirmação, tirar de cada placa (duas placas pequenas ou uma placa grande) de cada meio seletivo (veja 9.4), pelo menos uma colônia considerada típica ou suspeita e mais quatro colônias se a primeira é negativa. É recomendado que pelo menos cinco colônias sejam identificadas no caso de estudos epidemiológicos. Se sobre uma placa existirem menos de cinco colônias típicas ou suspeitas, isolar para confirmação todas as colônias típicas ou suspeitas.

Estriar as colônias selecionadas sobre a superfície de placas pré-secas com ágar nutriente (5.2.5), de maneira que permitirá que colônias bem isoladas se desenvolvam. Incubar as placas inoculadas (9.4.3) a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h. Usar culturas puras para confirmação bioquímica e sorológica.

9.5.3 Confirmação bioquímica

9.5.3.1 Geral

Por meio de uma alça de inoculação, inocular os meios especificados em 9.5.3.2 a 9.5.3.7 com cada uma das culturas obtidas a partir das colônias selecionadas em 9.5.2.

9.5.3.2 Agar TSI (5.2.6)

Estriar a superfície inclinada do Agar e perfurar o fundo. Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h.

Interpretar as alterações no meio como se seguem.

a) Fundo (base)

- Amarelo

- Vermelho ou inalterado

- Negro

- Bolhas ou rachaduras

b) Superfície inclinada -

Amarelo

(Lactose e/ou sacarose utilizada)

- Vermelho ou inalterado

lactose nem sacarose utilizadas).

Glicose positivo (glucose utilizada) Glicose negativo (glicose não utilizada) Formação de sulfeto de hidrogênio Formação de gás da glicose

Lactose

e/ou

sacarose

positivo

Lactose e sacarose não utilizada (Nem

Culturas típicas de Salmonella apresentam superfície inclinada alcalina (vermelho) e ácida (amarelo) no fundo com formação de gás (bolhas) e (cerca de 90% dos casos) a formação de sulfeto de hidrogénio (escurecimento do ágar) (9.5.3.8).

Quando uma Salmonella lactose-positivo é isolada (veja 4.4), a inclinação em TSI é amarela. Assim, a confirmação preliminar de culturas de Salmonella não deve ser baseada nos resultados do teste de Agar TSI somente (ver 9.5.3).

9.5.3.3 Agar Uréia (5.2.7)

Estriar a superfície inclinada do Agar. Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h e analisar em intervalos regulares.

Se a reação for positiva, a quebra da uréia libera amônia, que muda a cor do vermelho de fenol para rosa-pink e mais tarde para cor de cereja profunda. A reação é frequentemente aparente após 2h para 4h.

9.5.3.4

Meio de descarboxilação de L-Lisina (5.2.8)

Inocular logo abaixo da superfície do meio líquido. Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h.

A turbidez e uma cor púrpura, após incubação, indica uma reação positiva. A

cor amarela indica uma reação negativa.

9.5.3.5 Detecção de β-galactosidase (5.2.9)

Suspender uma alça cheia de colônias suspeitas em um tubo contendo 0,25

mL de solução salina (5.2.13).

Adicione 1 gota de tolueno e agitar o tubo. Colocar o tubo num banho de água (6.6) a 37°C e deixar durante vários minutos (aproximadamente 5 min). Adicionar 0,25 mL do reagente para a detecção de β-galactosidase e misturar.

Substituir o tubo em banho de água regulado a 37°C e deixar por 24h ± 3h, examinando o tubo em intervalos regulares.

A cor amarela indica uma reação positiva. A reação é frequentemente aparente

após 20 min.

Se discos de papel preparados (5.2.9) são utilizados, seguir as instruções do

fabricante.

9.5.3.6 Meio para reação de Voges-Proskauer (VP) (5.2.10)

Suspender uma alça cheia de colônias suspeitas num tubo estéril contendo 3

mL do meio VP.

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24h ± 3h. Após a incubação, adicionar duas gotas da solução de creatina, três gotas da

solução alcóolica de 1-naftol e, em seguida, duas gotas de solução de hidróxido de potássio; agitar após a adição de cada reagente.

A formação de uma cor rosa a cor vermelho brilhante dentro de 15 minutos

indica uma reação positiva.

9.5.3.7 Meio para reação Indol (5.2.11)

Inocular um tubo contendo 5 mL do meio de triptona/triptofano com a colônia suspeita. Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h. Após a incubação, adicionar 1 mL do reagente de Kovacs.

A formação de um anel vermelho indica uma reação positiva. Um anel amarelo- marrom indica uma reação negativa.

9.5.3.8 Interpretação de testes bioquímicos

Salmonella geralmente apresenta as reações mostradas na Tabela 1.

9.5.4 Confirmação sorológica e sorotipagem

9.5.4.1 Geral

A detecção da presença de antígenos O, Vi e H de Salmonella é testada por aglutinação com o soro adequado, a partir de colônias puras (9.5.2) e após cepas auto-aglutináveis terem sido eliminadas. Utilizar o anti-soro de acordo com as instruções do fabricante se for diferente da descrição a seguir.

9.5.4.2 Eliminação de cepas auto-aglutináveis

Colocar uma gota da solução salina (5.2.13) cuidadosamente numa lâmina de vidro limpa. Dispersar na gota, por meio de uma alça (6.7), parte da colónia a ser testada, de forma a obter uma suspensão homogénea e turva.

NOTA - É possível também dispersar parte da colónia a ser testada em uma gota de água, e em seguida, misturar a solução com uma gota de solução salina (5.2.13).

Balançar a lâmina suavemente por 30 a 60s. Observar o resultado contra um fundo escuro, de preferência com o auxílio de um lupa.

Se as bactérias estiverem agregadas em unidades mais ou menos distintas, a cepa é considerada como auto-aglutinável e não deve ser submetida aos seguintes testes como a detecção dos antígenos não é possível.

Tabela 1. Interpretação de testes bioquímicos

   

Cepa Salmonella

 

Teste a (9.5.3.2 a

S. Typhi

 

S. Paratyphi

S. Paratyphi

S. Paratyphi

Outras cepas

9.5.3.7)

A

B

C

Reação

%

b

Reação

%

b

Reação

%

c

Reação

%

c

Reação

%

b

TSI ácido de glicose

+

100

+

100

   

+ +

 

+

100

TSI gás de glicose

 

d

0

   

100

         

92

-

+

+ +

+

TSI ácido de lactose

-

2

-

100

   

- -

 

-

1

TSI ácido de sacarose

-

0

-

0

   

- -

 

-

1

TSI sulfeto de hidrogênio produzido

+

97

-

10

   

+ +

 

+

92

Hidrólise de

                   

uréia

-

0

-

0

- -

-

1

Descarboxilação

 

98

 

0

           

95

de Lisina

+

-

+ +

+

Reação β-

 

0

   

0

           

2

e

galactosidase

-

-

- -

-

Reação Voges-

 

0

   

0

           

0

 

Proskauer

-

-

- -

-

Produção de

 

0

   

0

           

1

 

Indol

-

-

- -

-

a Referência [5]

b Esses percentuais indicam que nem todos os isolados do sorotipo Salmonella mostram as reações marcadas como + ou -. Estas percentagens podem variar entre e dentro dos sorotipos advindos de sorotipos de intoxicação alimentar a partir de diferentes locais.

c Os percentuais não são conhecidos na literatura disponível

d Salmonella Typhi é anaerogênica

e A Salmonella enterica subespécie arizonae dá uma reação lactose positivo ou negativo, mas é sempre β-galactosidase positivo. Para o estudo destas cepas isto pode ser útil para realizar testes complementares.

9.5.4.3 Análise de antígenos O

Usando uma colônia pura não-autoaglutinante, proceder de acordo com 9.5.4.2, utilizando uma gota do soro anti-O (5.3) ao invés da solução salina

(5.2.13).

Se aglutinação ocorrer, a reação é considerada positiva.

Utilizar os soros poli e monovalentes um após o outro.

9.5.4.4

Análise de antígenos Vi

Proceder de acordo com 9.5.4.2, mas utilizando uma gota de soro anti-Vi (5.3) ao invés da solução salina.

Se aglutinação ocorrer, a reação é considerada positiva.

9.5.4.5 Análise de antígenos H

Inocular o ágar nutriente semi-sólido (5.2.12) com uma colônia não auto- aglutinável. Incubar o meio a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h.

Utilize esta cultura para análise de antígenos H, procedendo de acordo com 9.5.4.2, mas usando uma gota de soro anti-H (5.3) ao invés da solução salina.

Se aglutinação ocorrer, a reação é considerada positiva.

9.5.5 Interpretação das reações bioquímicas e sorológicas

Tabela 2 dá a interpretação de testes confirmatórios (9.5.3 e 9.5.4) realizados sobre as colônias utilizadas (9.5.2).

Tabela 2. Interpretação de testes confirmatórios

Reações

Auto-aglutinação

Reações

Interpretação

bioquímicas

sorológicas

Típicas

Não

Antígeno O, H ou Vi positivo

Cepas consideradas como Salmonella

Típicas

Não

Todas reações

 

negativas

Típicas

Sim

Não testado (veja

Podem ser

9.5.4.2)

Salmonella

Reações não típicas

Não/Sim

Antígeno O, H ou Vi positivo

Reações não típicas

Não/Sim

Todas reações

Não consideradas como Salmonella

negativas

9.5.6 Confirmação definitiva

As cepas que são considerados como Salmonella, ou que podem ser Salmonella (veja Tabela 2), devem ser enviadas para um reconhecido centro de referência para Salmonella tipificação definitiva.

Esta processo deve ser acompanhado de todas as informações possíveis sobre a cepa (s) e se trata-se de um surto ou alimento.

10. Expressão dos resultados

Em conformidade com os resultados da interpretação, indicar a presença ou ausência de Salmonella na porção de teste de x g ou x mL do produto (veja ISO 7218).

Veja

interlaboratoriais.

o

anexo

C

para

a

precisão

dos

11. Reporte dos resultados

O reporte dos testes deve especificar:

dados

obtidos

de

ensaios

- o método de amostragem utilizado, se conhecido;

- qualquer desvio no meio de enriquecimento ou nas condições de incubação utilizadas

- todas as condições operacionais não especificadas neste Padrão Internacional, ou considerado como opcional, juntamente com os detalhes de quaisquer incidentes que possam ter influenciado os resultados

- os resultados obtidos

O relatório deverá indicar também se um resultado positivo foi obtido usando um meio de plaqueamento (5.2.4) não especificado neste Padrão Internacional.

12. Garantia da Qualidade

Para verificar a capacidade do laboratório para detectar Salmonella com os métodos e os meios descritos no presente Padrão Internacional, introduzir amostras de referência dentro de frascos-controle contendo meio de pré- enriquecimento (veja 5.2.1). Proceder com os frascos-controle como para as culturas de teste.

Anexo A

(Normativa)

Diagrama de procedimento

Anexo A (Normativa) Diagrama de procedimento 20
Anexo A (Normativa) Diagrama de procedimento 20

Anexo B

(Normativa)

Composição e preparação dos meios de cultura e reagentes

B.1 Água peptonada tamponada

B.1.1 Composição

Digestão enzimática de caseína

10,0g

Cloreto de sódio

5,0g

Fosfato de hidrogênio dissódio Dodecahidratado (Na 2 HPO 4 .12H 2 O)

9,0g

Fosfato dihidrogênio de potássio (KH 2 PO 4 )

1,5g

Água

1.000mL

B.1.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, por aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja em 7,0 ± 0,2 a 25°C.

Dispensar o meio em frascos (6.9) de capacidade adequada para se obter as porções necessárias para o teste.

Esterilizar por 15 minutos em autoclave (6.1) a 121° C.

B.2 Meio Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS)

B.2.1 Solução A

B.2.1.1 Composição

Digestão enzimática de soja

5,0g

Cloreto de sódio

8,0g

Fosfato dihidrogênio de potássio (KH 2 PO 4 )

1,4g

Fosfato de hidrogênio dipotássio (K 2 HPO 4 )

0,2g

Água

1.000mL

B.2.1.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, aquecer a 70 °C, se necessário.

A solução deve ser preparada no dia da preparação do meio RVS completo.

B.2.2 Solução B

B.2.2.1 Composição

Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2.6H 2 O)

400g

Água

1.000mL

B.2.2.2 Preparação

Dissolve-se o cloreto de magnésio em água.

Como este sal é muito higroscópico, é aconselhável dissolver todo o conteúdo de MgCl 2 .6H 2 O a partir de um recipiente recém-aberto, de acordo com a fórmula. Por exemplo, 250g de MgCl 2 .6H 2 O é adicionado a 625 mL de água, dando uma solução de volume total de 788mL e uma concentração em massa de cerca de 31,7g por 100mL de MgCl 2 .6H 2 O.

A solução pode ser mantida num frasco de vidro escuro bem fechado com tampa à temperatura ambiente durante pelo menos 2 anos.

B.2.3 Solução C

B.2.3.1 Composição

Oxalato verde de malaquita

Água

0,4g

100mL

B.2.3.2 Preparação

Dissolver o oxalato verde de malaquita em água.

A solução deve ser mantida em frasco de vidro escuro à temperatura ambiente por pelo menos 8 meses.

B.2.4 Meio completo

B.2.4.1 Composição

Solução A (B.2.1)

1.000mL

Solução B (B.2.2)

100mL

Solução C (B.2.3)

10mL

B.2.4.2 Preparação

Adicionar a 1.000 mL de solução A, 100 mL de solução B e 10mL de solução

C.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja em 5,2 ±

0,2.

Antes da utilização, dispensar em tubos de ensaio (6.9) em quantidades de 10

mL.

Esterilizar por 15 min na autoclave (6.1) a 115°C.

Armazene o meio preparado

preparação.

a

3°C

± 2°C.

Use

o

meio

no dia

de sua

NOTA - A composição final do meio é: digestão enzimática de soja, 4,5 g /L; cloreto de sódio, 7,2 g /L; fosfato dihidrogênio de potássio (KH 2 PO 4 + K 2 HPO 4 ), 1,44 g /L; cloreto de magnésio anidro (MgCl 2 ), 13,4 g / l ou cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl 2 . 6H 2 O), 28,6 g /L; oxalato verde de malaquita, 0036

verde.

B.3 Caldo Muller-Kauffmann tetrationato/novobiocina (MKTTn) [7]

B.3.1 Meio Base

B.3.1.1 Composição

Extrato de carne

4,3g

Digestão enzimática de caseína

8,6g

Cloreto de sódio (NaCl)

2,6g

Carbonato de cálcio (CaCO 3 )

38,7g

Tiosulfato de sódio pentahidratado (Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O)

47,8g

Bile bovina para uso bacteriológico

4,78g

Verde brilhante

9,6mg

Água

1000mL

B.3.1.2 Preparação

Dissolver os componentes básicos desidratados ou o meio desidratado completo na água em ebulição por 5 min.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que esteja em 8,2 ± 0,2 a 25°C. Misture bem o meio.

O meio base pode ser armazenado por 4 semanas a 3°C ± 2°C

B.3.2 Solução de iodeto-iodo

B.3.2.1 Composição

Iodo

20g

Iodeto de potássio (KI)

25g

Água

100mL

B.3.2.2 Preparação

Dissolver completamente o iodeto de potássio em 10 mL de água, então adicionar o iodo e diluir até 100 mL com água estéril. Não aqueça. Armazenar a solução preparada no escuro em temperatura ambiente num recipiente hermeticamente fechado.

B.3.3 Solução de Novobiocina

B.3.3.1 Composição

Sal de novobiocina de sódio

0,04g

Água

5mL

B.3.3.2 Preparação

Dissolver o sal de novobiocina de sódio em água e esterilizar por filtração.

Armazenar por até 4 semanas a 3°C ± 2°C.

B.3.4 Meio completo

B.3.4.1 Composição

Meio Base (B.3.1)

1.000mL

Solução Iodeto-Iodo (B.3.2)

20mL

Solução Novobiocina (B.3.3)

5mL

B.3.4.2 Preparação

Adicionar assepticamente 5 mL da solução de novobiocina (B.3.3) para 1.000mL de meio base (B.3.1). Misture, em seguida adicione 20 mL da solução de iodeto- iodo (B.3.2). Misture bem.

Dispensar o meio assepticamente em frascos estéreis (6.9) de capacidade adequada para obter as porções necessárias para o teste.

O meio completo deve ser usado no dia de sua preparação.

B.4 Agar Xilose Lisina Desoxicolato (Agar XLD) [7]

B.4.1 Meio base

B.4.1.1 Composição

Extrato de levedura em pó

3,0g

Cloreto de sódio (NaCl)

5,0g

Xilose

3,75g

Lactose

7,5g

Sacarose

7,5g

Hidrocloreto de L-Lisina

5,0g

Tiosulfato de sódio

6,8g

Citrato amônico de Ferro III

0,8g

Vermelho de fenol

0,08g

Desoxicolato de sódio

1,0g

Ágar

9g a 18g 1)

Água

1.000mL

1) Dependendo da força de geleificação do Agar

B.4.1.2 Preparação

Dissolver os componentes de base desidratados ou a base completa desidratada em água em aquecimento, com frequente agitação, até que o meio comece a ferver. Evitar o sobreaquecimento.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,4 ± 0,2

a 25°C.

Verter a base nos tubos ou frascos (6.9) de capacidade apropriada. Aquecer com agitação frequente até que o meio ferva e o ágar se dissolva. Não sobreaquecer.

B.4.2 Preparação das placas de Agar

Transferir imediatamente para um banho de água (6.5) de 44°C a 47°C, agitar

e verter em placas. Deixa-se solidificar.

Imediatamente antes da utilização, secar as placas de Agar cuidadosamente

(de preferência com as tampas para fora e a superfície de agar para baixo)

na estufa (6.2) entre 37°C e 55°C até que a superfície do agar esteja seca.

Armazenar as placas invertidas até 5 dias a 3°C ± 2°C.

B.5 Agar nutriente

B.5.1 Composição

Extrato de carne

3,0g

Peptona

5,0g

Agar

9g a 18g 1)

Água

1.000mL

1) Dependendo da força de geleificação do Agar

B.5.2 Preparação

Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado em água, com aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que após a esterilização, esteja 7,0 ± 0,2 a

25°C.

Transferir o meio de cultura para os tubos ou frascos (6.9) de capacidade apropriada. Esterilizar por 15 minutos em autoclave (6.1) a 121°C.

B.5.3 Preparação de placas de Agar nutriente

Transferir cerca de 15mL do meio fundido para pequenas placas de Petri estéreis (6.11) e proceder conforme B.4.2

B.6 Agar açúcar/ferro triplo (Agar TSI)

B.6.1 Composição

Extrato de carne

3g

Extrato de levedura

3g

Peptona

20g

Cloreto de sódio (NaCl)

5g

Lactose

10g

Sacarose

10g

Glicose

1g

Citrato de Ferro III

0,3g

Tiosulfato de sódio

0,3g

Vermelho de fenol

0,024g

Ágar

9g a 18g 1)

Água

1.000mL

1) Dependendo da força de geleificação do Agar

B.6.2 Agar uréia (Christensen)

B.7.1 Meio base

B.7.1.1 Composição

Peptona

1g

Glicose

1g

Cloreto de sódio (NaCl)

5g

Fosfato dihidrogênio de potássio (KH 2 PO 4 )

2g

Vermelho de fenol

0,012g

Ágar

9g a 18g 1)

Água

1.000mL

1) Dependendo da força de geleificação do Agar

B.7.1.2 Preparação

Dissolver os componentes ou a base completa desidratada em água, com aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja em 6,8 ± 0,2 a

25°C.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a 121°C.

B.7.2 Solução de uréia

B.7.2.1 Composição

Uréia

400g

Água

1.000mL

B.7.2.2 Preparação

Dissolver a uréia em água. Esterilizar por filtração e checar a esterilidade.

Veja a ISO 7218:1996, 7.3.2.

B.7.3 Meio completo

B.7.3.1 Composição

Base (B.7.1)

950mL

Solução de uréia (B.7.2)

50mL

B.7.3.2 Preparação

Adicionar, sob condições assépticas, a solução de ureia à base, previamente fundidos e então manter a 44°C a 47°C.

Dispensar o meio completo em tubos estéreis (6.9) em quantidades de 10 mL.

Deixe-o numa posição inclinada.

B.8 Meio Descarboxilação L-Lisina

B.8.1 Composição

Monohidrocloreto de L-Lisina

5g

Extrato de levedura

3g

Glicose

1g

Vermelho de bromocresol

0,015g

Água

1.000mL

B.8.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, por aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja em 6,8 ± 0,2 a 25°C.

Transferir o meio em quantidades de 2mL a 5mL para limitar as culturas nos tubos (6.9) com tampas de rosca.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a 121°C.

B.9 Reagente de β-galactosidase

B.9.1 Solução tampão

B.9.1.1 Composição

Fosfato dihidrogênio de sódio (NaH 2 PO 4 )

6,9g

Hidróxido de sódio, solução 10mol/L

3mL

Água para um volume final de

50mL

B.9.1.2 Preparação

Dissolver o fosfato dihidrogênio de sódio em aproximadamente 45mL de água em um frasco volumétrico.

Ajustar o pH a 7,0 ± 0,2 at 25°C com solução de hidróxido de sódio.

Adicionar água para um volume final de 50mL.

B.9.2 Solução ONPG

B.9.2.1 Composição

o-Nitrofenil β-D-galactopiranosídeo

(ONPG)

0,08g

Água

15mL

B.9.2.2 Preparação

Dissolver o ONPG em água a aproximadamente 50°C.

 

Resfriar a solução.

B.9.3 Reagente completo

B.9.3.1 Composição

Solução tampão (B.9.1)

5mL

Solução ONPG (B.9.2)

15mL

B.9.3.2 Preparação

Adicionar a solução tampão à solução ONPG.

 

B.10 Reagentes para reação de Voges-Proskauer (VP)

B.10.1 Meio VP

B.10.1.1 Composição

Peptona

7g

Glicose

5g

Fosfato de hidrogênio dipotássio (K 2 HPO 4 )

5g

Água

1.000mL

B.10.1.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, por aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 6,9 ± 0,2 a 25°C. Transferir o meio para tubos (6.9), em quantidades de 3 mL.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a em 121°C.

B.10.2 Solução de creatina ( N- amidinosarcosina)

B.10.2.1 Composição

Monohidrato de creatina

0,5g

Água

100mL

B.10.2.2 Preparação

 

Dissolver o monohidrato de creatina em água.

B.10.3

1-Naftol, solução etanólica

B.10.3.1 Composição

 

1-Naftol

6g

Etanol, 96% (fração de volume)

100mL

B.10.3.2 Preparação

 

Dissolver o 1-Naftol em etanol.

B.10.4 Solução de hidróxido de potássio

B.10.4.1 Composição

Hidróxido de potássio

40g

Água

100mL

B.10.4.2 Preparação

Dissolver o hidróxido de potássio em água.

B.11 Reagentes para reação Indol

B.11.1 Meio triptona/triptofano

B.11.1.1 Composição

Triptona

10g

Cloreto de sódio (NaCl)

5g

DL-triptofano

1g

Água

1.000mL

B.11.1.2 Preparação

Dissolver os componentes em água em ebulição. Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,5 ± 0,2 a 25°C. Dispensar 5mL do meio em cada um dos vários tubos (6.9). Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a em 121°C.

B.11.2 Reagente de Kovacs B.11.2.1 Composição

4-Dimetilaminobenzaldeído

5g

Ácido clorídrico, D=1,18g/mL a 1,19 g/mL

25mL

2-Metilbutan-2-ol

75mL

B.11.2.2 Preparação Misturar os componentes

B.12 Agar nutriente semi-sólido B.12.1 Composição

Extrato de carne

3g

Peptona

5g

Agar

4g a 9g 1)

Água

1.000mL

1) Dependendo da força de geleificação do Agar

B.12.2 Preparação Dissolver os componentes em água, com aquecimento se necessário

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,0 ± 0,2

a 25°C.

Transferir o meio para frascos (6.9) de capacidade apropriada.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a em 121°C.

.

B.12.3 Preparação de placas de Agar Verter em placas de Petri pequenas e estéreis (6.11) cerca de 15mL de meio preparado recentemente. Não permitir que as placas de Agar sequem.

B.13 Solução salina fisiológica B.13.1 Composição

Cloreto de sódio (NaCl)

8,5g

Água

1.000mL

B.13.2 Preparação

Dissolver o Cloreto de sódio em água. Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,0 ± 0,2

a 25°C.

Dispensar quantidades de solução em frascos ou tubos (6.9) de modo que eles irão conter entre 90mL e 100mL após a esterilização. Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a em 121°C.

Anexo C (Informativo)

Resultados de testes interlaboratoriais

Um teste de colaboração internacional foi organizado em 2000 pela AFSSA- Ploufragan na Europa e Sistemas BioControl nos EUA, no quadro do projeto europeu SMT CT 96 2098 [6]. Esse teste envolveu 11 laboratórios em 9 países da Europa e 10 laboratórios nos EUA, e foi realizado em requeijão fresco, ovo desidratado, carne crua de aves e em um material de referência. As amostras de alimentos foram testadas cada uma em dois níveis diferentes de contaminação, além de um controlo negativo.

Os valores das características de desempenho derivados deste teste colaborativo são mostrados por tipo de amostra nas Tabelas C.1 a C.4. Os dados obtidos por alguns laboratórios foram excluídos dos cálculos apenas com base em razões técnicas claramente identificadas (desvios do protocolo).

Tabela C.1 Resultados dos dados de análise obtidos de amostras de requeijão fresco

 

Requeijão fresco (branco)

Requeijão fresco (baixo nível de contaminação)

Requeijão fresco (alto nível de contaminação)

Número de laboratórios que tiveram resultados retornardos

23

23

23

Número de

     

amostras por

5

5

5

laboratório

Número de

     

laboratórios

2

2

2

excluídos

Número de

     

laboratórios

retidos após

21

21

21

exclusão

Número de amostras aceitas

105

105

105

Precisão

     

(especificidade),

100

-

-

%

Precisão (sensibilidade), %

-

74,3

83,8

Conformidade, %

100

83,8

95,2

Concordância, %

100

60,5

71,7

Tabela C.2 Resultados dos dados de análise obtidos de amostras de ovo desidratado

 

Ovo desidratado (branco)

Ovo desidratado (baixo nível de contaminação)

Ovo desidratado (alto nível de contaminação)

Número de laboratórios que tiveram resultados retornardos

26

26

26

Número de

     

amostras por

5

5

5

laboratório

Número de

     

laboratórios

5

5

5

excluídos

Número de

     

laboratórios

retidos após

21

21

21

exclusão

Número de amostras aceitas

105

105

104

Precisão

     

(especificidade),

100

-

-

%

Precisão (sensibilidade), %

-

98,1

99

Conformidade, %

100

96,2

98,1

Concordância, %

100

96,2

98,1

Tabela C.3 Resultados dos dados de análise obtidos de amostras de carne crua de aves

 

Carne crua de aves (branco)

Carne crua de aves (baixo nível de contaminação)

Carne crua de aves (alto nível de contaminação)

Número de laboratórios que tiveram resultados retornardos

25

25

25

Número de

     

amostras por

5

5

5

laboratório

Número de

     

laboratórios

5

5

5

excluídos

Número de

     

laboratórios

retidos após

20

20

20

exclusão

Número de amostras aceitas

100

99

100

Precisão

     

(especificidade),

100

-

-

%

Precisão (sensibilidade), %

-

98

100

Conformidade, %

100

96,9

100

Concordância, %

100

96

100

Tabela C.4 Resultados dos dados de análise obtidos de amostras de referência

 

Material de referência (cápsulas contendo cerca de 5UFC de S. Typhimurium

Número de laboratórios que tiveram resultados retornardos

26

Número de amostras por laboratório

5

Número de laboratórios excluídos

1

Número de laboratórios retidos após exclusão

25

Número de amostras aceitas

125

Precisão (especificidade), %

-

Precisão (sensibilidade), %

94,4

Conformidade, %

88,8

Concordância, %

89,1

Bibliografia

[1] ISO 6887-2, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal Preparação de amostras de testes, suspensão inicial e diluições decimais para análise microbiológica Parte 2: Regras específicas para o preparo de carnes

e produtos derivados

[2] ISO 6887-3, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal Preparação de amostras de testes, suspensão inicial e diluições decimais para análise microbiológica Parte 3: Regras específicas para o preparo de peixes

e produtos derivados

[3] ISO 6887-4, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal Preparação de amostras de testes, suspensão inicial e diluições decimais para análise microbiológica Parte 4: Regras específicas para o preparo de outros produtos que não sejam leite e produtos derivados, carnes e produtos derivados e peixe e produtos derivados

[4] ISO/TR 11133-1, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal Guia de preparação e produção de meio de cultura Parte 1: Guia

geral sobre garantia da qualidade para a preparação de meio de cultura no

laboratório

[5] Ewing, W. H. And Ball, M. M. As reações bioquímicas do gênero Salmonella. Centro Nacional para Controle e Prevenção de Doenças. Atlanta, Georgia, EUA, 1996.

[6] Feldsine, P. et al. Recuperação de Salmonella em alimentos selecionados pelo procedimento ISO 6579 de cultura de Salmonella e pelo Método de análise Oficial Internacional AOAC: Estudo colaborativo. J. AOAC Int. 2001.

[7] Meio de cultura para microbiologia de alimentos. Em: Progresso em

microbiologia industrial. Vol. 34. (Eds. Corry, J. E. L., Curtis, G. D. W. e Baird,

R. M. Elsevier, Amsterdam, 1995.