CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS DE MAMONA: RESULTADOS PRELIMINARES Daiane Peixoto Vargas1, Vera Lucia Bobrowski 1 e Srgio Delmar dos

Anjos e Silva 2
1

Universidade Federal de Pelotas, vera.bobrowski@ufpel.tche.br, 2Embrapa Centro de Pesquisa Agropecuria Clima Temperado

RESUMO - A mamona uma cultura de grande importncia econmica no Brasil na produo de Biodiesel. Na busca por novas cultivares que atendam os interesses econmicos, a cultura de anteras apresenta-se como grande ferramenta, por reduzir o tempo para a obteno de linhagens homozigticas. Para tanto, correlacionaram-se tamanhos de boto floral, antera e plen, coletados das cultivares: IAC-80, Cafelista e AL-Guarany 2002, classificadas por tamanho: < 2,0; 2,0-2,9; 3,0-3,9; 4,04,9; 5,05,9; > 6,0 mm, fixados em Carnoy e analisadas em microscopia ptica. As relaes entre as medidas das anteras e de plen apresentaram diferenas significativas, o que evidenciou variao morfolgica entre as cultivares. Na cultura de antera, os botes florais de todas as classes da cv. IAC80 desinfestados foram colocados em meios de cultivo, variando adio de carvo ativado (0 e 5g.L-1); 2,4-D (0 e 2mg. L-1) e cido ascrbico (50 e 100mg. L -1). As anteras foram retiradas em cido ascrbico sob esteriomicroscpio. Ocorreu a formao de calos em todos os meios de cultura e nas diferentes classes de boto floral sugerindo que o estdio de desenvolvimento da microsporognese no influenciou a induo de calos. A adio de carvo ativado e o uso de cido ascrbico atuaram como antioxidantes. INTRODUO Dentre as tcnicas auxiliares do melhoramento a cultura de anteras apresenta-se como uma ferramenta de grande utilidade, principalmente por reduzir o tempo necessrio para a obteno de linhagens homozigticas (SARTORETTO et al.,1999; PAL, 2004). Trs pontos so de fundamental importncia na obteno de plantas atravs da cultura de anteras atravs da androgenese indireta: (1) formao de calos a partir de anteras; (2) formao de gemas a partir de calos e (3) obteno de plantas a partir das gemas. A primeira etapa essencial e devemos considerar alguns fatores como o gentipo o meio de cultivo e o estgio de desenvolvimento do gro de plen, que podemos correlacionar com o tamanho do boto floral em muitas espcies (BOBROWSKI et al., 1995; PETERS et al., 1998). A maior dificuldade do uso de cultura de antera nas espcies, consiste na adequao do meio de cultura apropriado, para que ocorra a diviso celular, o processo de ativao e desativao dos genes, no momento e local apropriado e para tanto ajustes na concentrao e tipo de reguladores de crescimento, uso de vitaminas e carvo ativado alm de outros parmetros fsicos devem ser realizados (TEIXEIRA e TORRES, 1998; INGRAM et al., 2000; SALOMOM, 2003).

Este experimento foi realizado visando avaliar o efeito de diferentes meios de cultivo na induo de calos a partir de anteras com diferentes tamanhos. MATERIAL E MTODOS Os botes florais de mamona da cultivar IAC-80 utilizados neste estudo foram procedentes de uma populao em cultivo no campo experimental da Embrapa Clima Temperado, altitude 60m, latitude 3141 Sul e longitude 5221 Oeste, localizada em Pelotas, RS. Os botes coletados foram medidos com auxilio de paqumetro e separados em seis classes de acordo com o tamanho: < 2,0; 2,0-2,9; 3,0-3,9; 4,0-4,9; 5,0-5,9; > 6,0 mm. Os botes florais foram lavados em gua destilada por 5 minutos, desinfestados por imerso em lcool 70% por 3 segundos e aps, em soluo de 20% de hipoclorito comercial por 10 minutos. A seguir, o material foi lavado por trs vezes em gua destilada esterilizada, permanecendo nesta at a transferncia para o meio de cultura. Todos os procedimentos de desinfestao e transferncia para o meio de cultura foram realizados em cmara assptica de fluxo laminar horizontal. Imediatamente aps a inoculao das anteras as diferentes concentraes de cido ascrbico filtrada foram adicionadas sobre os meios M1(50mg. L-1 ); M2 (100mg. L-1 ; M4 (100mg. L-1 ) e M5 (50mg. L-1 ) na quantidade de 2 mL conforme Tabela 1. O meio mineral bsico utilizado para formao de calos foi o meio MS (MURASCHIGE & SKOOG, 1962), variando os tratamentos pela adio de 2,4-D (0 e 2mg. L-1), acido ascrbico (vitamina C) e carvo ativado ( 0 e 5g.L-1 C.A.) de acordo com a Tabela 1 Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para 5,7 1utilizando NAOH(Hidrxido de sdio) 1N ou HCl (cido clordrico) 1N e autoclavados a 120C e 1,2 atm. de presso por 20 minutos. Logo aps o meio foi transferido para placas de Petri estreis em cmara de fluxo laminar. Aps inoculao o material foi mantido em cmara de crescimento a 25 1C no escuro por 30 dias. RESULTADOS E DISCUSSO A avaliao de formao de calos aos 30 dias de cultura no foi possvel devido ao alto ndice de contaminao dos meios de cultura. Como neste experimento as coletas foram realizadas a partir de plantas mantidas a campo estas esto sujeitas a ao de agentes exgenos e devemos considerar tambm que o uso de substncias desinfestantes em concentraes muito altas podem comprometer a viabilidade dos tecidos.

A maior freqncia de anteras oxidadas ocorreu nos meio M3, M4 e M5 quando consideramos todos os tratamentos avaliados. No entanto, o uso de carvo ativado e cido ascrbico nos meios M1 e M2 demonstrou uma menor oxidao quando comparados os resultados com os outros meios de cultura, onde foram avaliados os efeitos do cido ascrbico e carvo ativado independentes, porm no h uma diferena qualitativa quando comparado com do meio M6 (Tab. 2). De acordo com Custdio et al. (2005) a oxidao das anteras pode inibir totalmente a induo de calos podendo este efeito ser minimizado pelo uso de agente antioxidantes ou transferindo a cultura para meio fresco, neste experimento o uso de carvo ativado e soluo de cido ascrbico, a interao destes dois compostos auxiliou prevenindo a oxidao rpida que normalmente ocorre em explantes de mamona. Porm estes autores citam tambm que o tipo de auxina pode interferir, sendo o uso de TDZ melhor em relao a oxidao mas para induo de calos o 2,4 D mais eficiente. Isto pode explicar a ausncia de oxidao no meio M6, sem adio de carvo ativado ou cido ascrbico, e tambm sem 2,4D (Tabs.1 e 2). Podemos visualizar na Tabela 2 que houve formao de calos em quase todos os meios testados e tamanhos de botes florais, sendo as classes extremas (>6mm e < 2,0 mm) as que menos produziram calos. Porm, de acordo com Lannes et al. (2004) outros fatores podem influenciar no desempenho da induo de calos como comprimento do dia, radiao solar e temperaturas noturnas s quais estavam submetidas s plantas doadoras de plen. Quanto a colorao dos calos em meio de cultura, aos 30 dias de cultivo, observou-se que nos meios M1, M5 e M6 apresentavam-se com aspectos translcido, nos meios M3 e M4 com aspecto amarelo-translucido e no meio M2 a amarelados. Com relao a textura os calos formados apresentavam-se globulosos (Fig. 2B) Ashok-Kumar et al. (2003) observaram que calos com aspecto amarelado induziam maior regenerao que os demais. H necessidade de maiores estudos quanto ao potencial de regenerao destes calos e a utilizao de outros agentes antioxidantes para evitar a oxidao dos explantes no meio de induo, mas estes resultados preliminares indicam a potencialidade da tcnica para a mamona. CONCLUSES H variaes morfolgicas entre as cvs. Cafelista, AL-Guarany 2002 e IAC-80 com mesmo tamanho apresentam anteras e gros de plen de tamanhos diferentes evidenciando variao morfolgica entre elas.

Para induo de calos de anteras de mamona cv. IAC-80 o uso de cido ascrbico e carvo ativado no meio e seco de anteras em soluo de cido ascrbico importante por diminuir a oxidao das anteras. A partir de diferentes tamanhos de botes florais em mamona- cv. IAC-80 ocorre formao de calos. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ASHOK-KUMAR, H. G.; MURTHY, H. N.; PAEK, K. Y. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L., Scientia Horticulturae, v.98, n 3,p. 213-222, 2003. BOBROWSKI, V. L.; PETERS, J. A.; AUGUSTIN, E. e VIGAS, J. Efeitos de meios de cultura na formao de calos a partir de anteras de aspargo (Asparagus officinalis L). Acta Bot. Bras., v.9, n 1, p.115-122,1995. CUSTDIO, L., CARNEIRO, M. F., ROMANO, A., Microsporogenesis and anther culture in carob tree (Ceratonia siliqua L.) Scientia Horticulturae, n104, p. 65-77, 2005. INGRAM, H.M.; POWER, J.B.; LOWE, K.C.; DAVEY, M.R. Microspore-derived embryo induction from cultured anthers of wheat, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 60,p. 235-238, 2000. LANNES, S. D.; ZIMMER, P. D.; OLIVEIRA, A. C. de; CARVALHO, F. I. F. de; VIEIRA, E. A.; MAGALHES JR, A. M. DE; KOPP, M. M.; FREITAS, F. A. DE . Regenerao in vitro de anteras de arroz irrigado (Oryza sativa L.) e mapeamento de QTL associado, Cincia Rural, Santa Maria, v. 34, n 5, p.1355-1362, 2004. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plantarum, 15: 473-479,1962. PAL, E. G.; SILVA, A.B. DA; PASQUAL, M. Calognese in vitro em anteras de Coffea arabica L. Cinc. agrotec., Lavras, v. 28, n 4, p. 736-742, jul./ago., 2004 PETERS, J.A.; BOBROWSKI, V.L.; ROSINHA, G.M.S. Produo de haplides e duplohaploides.In: Torres. A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A.. Cultura de tecidos e transformao de plantas. Brasilia, DF: EMBRAPA/SPI.v.1, p.569-612. 1998 SALOMOM, M. V. Trigo: avaliao de linhagens diplides obtidas via cultura de anteras. 2003. 108f. Dissertao (Mestrado em Agronomia) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Universidade de So Paulo, Piracicaba.

SARTORETTO, L.M.; BOBROWSKI, V.L.; AUGUSTIN, E; PETERS, J.A. Influncia do estado fsico do meio de induo de calos e de diferentes meios de regenerao na formao de brotos de aspargo. Agropecuria Clima Temperado, Pelotas, v.2, n1, p.5-11,1999. TEIXEIRA ,S.L. & TORRES, A.C. Organizao de laboratrio de cultura de tecidos de plantas. In: Cultura de Tecidos e Transformao Gentica de Plantas. Braslia: Embrapa, v. 2, 864p, 1998. Tabela 1. Meios de cultura utilizados no cultivo de anteras de mamona (Ricinus comunnis L.). Meio M1: M2: M3: M4: M5: M6: Composio MS+ 2mg. L-1 2,4-D + 50mg. L-1 vit. C +5g.L-1 C.A. MS+2mg. L-1 2,4-D + 100mg. L-1 vit. C + 5g.L-1 C.A. MS+ 2mg. L-1 2,4-D + 5g.L-1 C.A MS + 2mg. L-1 2,4-D + 100mg. L-1 vit. C MS+2mg. L-1 2,4-D + 50mg. L-1vit. C. MS bsico

Tabela 2. Teste preliminar para avaliao do efeito do tamanho de boto floral utilizado e do meio de cultivo na produo de calos aos 15 dias a partir de aglomerados de anteras em cultura. Meio Classe (mm) Formao de calo oxidao M1 < 2,0 X* X 2,0 - 2,9 X 3,0 - 3,9 X 4,0 - 4,9 5,0 - 5,9 > 6,0 M2 < 2,0 X 2,0 - 2,9 X 3,0 - 3,9 X 4,0 - 4,9 X X 5,0 - 5,9 > 6,0 X M3 < 2,0 X X 2,0 - 2,9 X X 3,0 - 3,9 X X 4,0 - 4,9 X X 5,0 - 5,9 X X > 6,0 X M4 < 2,0 X 2,0 - 2,9 X 3,0 - 3,9 X 4,0 - 4,9 X X 5,0 - 5,9 X > 6,0 X M5 < 2,0 X

M6

2,0 - 2,9 3,0 - 3,9 4,0 - 4,9 5,0 - 5,9 > 6,0 < 2,0 2,0 - 2,9 3,0 - 3,9 4,0 - 4,9 5,0 - 5,9 > 6,0

X X X X X X X X

X X X X X