PURIFICACIN DE PROTENAS

La purificacin de una protena a partir de cierto tejido de origen animal o vegetal se inicia moliendo el tejido en una juguera y centrifugando posteriormente. El sobrenadante de la centrifugacin se llama extracto crudo. Posteriormente es necesario separar la protena de inters de otros compuestos (cidos nucleicos, carbohidratos, lpidos, etc.) as como de otras protenas que tambin estn en el extracto crudo. Una purificacin involucra varias etapas consecutivas. Normalmente se inicia la purificacin con una precipitacin selectiva de protenas y posteriormente se realizan diferentes cromatografas en columna. El mtodo de precipitacin ms comun es la precipitacin (salazn) por sulfato de amonio. Las principales tcnicas cromatogrficas son la cromatografa de intercambio inico, la filtracin en gel y la cromatografa de afinidad. En el presente prctico se realizarn dos experimentos: una salazn de protenas del suero sanguneo y una cromatografa de intercambio inico.

SEPARACIN POR SALAZN DE LAS PROTENAS DEL SUERO SANGUINEO OBJETIVO Estudiar la precipitabilidad de las protenas del suero por sulfato de amonio.

INTRODUCCION La precipitacin de protenas por sales neutras en alta concentracin se llama salazn. Esta precipitacin se explica como una deshidratacin de las protenas por la sal. Los iones de la sal interaccionan con las molculas de agua, las que se agrupan a su alrededor, disminuyendo el agua disponible para solvatar a las molculas de protena. Por falta de solvente, se asocian entre si las molculas de protena formando un slido. La concentracin de cierta sal, a la cual precipita una protena es caracterstica para la protena, para condiciones de temperatura y pH constantes. La precipitabilidad de las diferentes protenas es variable, por lo cual la salazn permite separar mezclas de protenas. La salazn ha sido especialmente til en el estudio de las protenas plasmticas. La concentracin del total de protenas del plasma flucta normalmente entre 6,1 y 9,6 g por 100 ml, de los cuales 4,6 y 6,7 g corresponden a la seroalbmina, 1,2 a 2,3 g a las seroglobulinas y 0,3 a 0,6 g al fibringeno. Si al suero se le agrega sulfato de amonio hasta media saturacin (es decir, se llega a la mitad de la concentracin que corresponde a una solucin saturada) precipitan las seroglobulinas, mientras que a saturacin precipita la seroalbmina. Si en cambio al suero se le agrega sulfato de sodio hasta obtener una solucin saturada, precipitan las seroglobulinas pero no la seroalbmina, que queda en solucin.

METODO Precipitacin de la seroglobulina del suero sanguneo con sulfato de amonio.

REACTIVOS Solucin saturada de sulfato de amonio. Suero. Solucin de cido tricloroactico (TCA) al 10%

PROCEDIMIENTO - Coloque 1 ml de suero en un tubo plstico de centrfuga. Agregue lentamente y agitando 1 ml de la solucin saturada de sulfato de amonio (la mezcla estar por lo tanto a media saturacin). Anote el cambio visible.
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- Centrifugue y posteriormente deje escurrir el sobrenadante a un tubo de ensayos. - Al precipitado en el tubo plstico agregue agua por gotas, agitando, para disolverlo. - Estudie la presencia de protenas en el sobrenadante y tambin en el precipitado disuelto, agregando TCA al 10% o calentando la solucin en un bao de agua hirviendo. En ambos mtodos se espera la aparicin de turbidez o cogulos si hay protenas.

INFORME Describa el cambio que observ visualmente al precipitar las protenas. Describa si la precipitacin fue reversible o irreversible. Indique la presencia de protena coagulable por calor o por cido en las diferentes fracciones.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO INICO. INTRODUCCIN Un intercambiador de iones consiste en una matriz insoluble a la cual se han unido covalentemente grupos cargados. De acuerdo a la carga (a pH neutro) de estos grupos se distinguen: Intercambiadores de aniones: Los grupos poseen carga positiva. Se usan principalmente los grupos DEAE (dietilaminoetilo) y QAE (un grupo de amina cuaternaria). Intercambiadores de cationes: Los grupos poseen carga negativa. Se usan principalmente los grupos CM (carboximetilo), fosfato y SP (sulfopropilo). Las matrices ms comunes son los Sephadex, Sepharosas y resinas sintticas (poliestirenos y polifenoles). En la tabla 1 se presentan algunos intercambiadores de iones comunes agrupados segn el tipo de matriz. Tabla 1: Intercambiadores de iones Nombre DEAE-Sepharosa CM-Sepharosa SP-Sepharosa DEAE-Celulosa Fosfo-Celulosa CM-Celulosa Bio-Rex 63 Dowex 50 Matriz Sepharosa Sepharosa Sepharosa Celulosa Celulosa Celulosa Poliestireno Poliestireno Grupo cargado DEAE CM SP DEAE Fosfato CM Fosfato Acido sulfnico (-SO3H)

La interaccin de proteinas con intercambiadores inicos involucra la formacin de uniones inicas mltiples entre los grupos cargados de la protena y los grupos de carga opuesta del intercambiador. La separacin cromatogrfica depende de la elucin diferencial de las protenas retenidas. Una cromatografa de intercambio inico involucra dos etapas: 1. Aplicacin de la muestra y lavado con tampn. Las protenas de carga neta opuesta a la carga de los grupos del intercambiador se unen a este, las dems protenas son eludas.

2. Elucin de las protenas retenidas: esto se logra aumentando la fuerza inica del eluyente (agregando una sal al tampn) o cambiando su pH. (Observacin: el eluyente es la solucin que se hace pasar por la columna). En el primer caso se producir un desplazamiento de las protenas unidas por el correspondiente in de la sal. Las protenas de carga neta mayor estn unidas ms fuertemente y sern eluidas a una fuerza inica mayor que otras de menor carga neta. En el segundo caso se produce un cambio de la carga de las protenas retenidas que permite su elucin. Durante la elucin se logra la separacin de las protenas retenidas. Para la elucin se utiliza un gradiente de varios pasos sucesivos (escalonado) o un gradiente continuo.

PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES - Columna de plstico con DEAE Sepharosa equilibrada con tampn fosfato 20 mM pH 7,0. - Solucin de albmina (BSA), 10 mg/ml en tampn fosfato 20 mM pH 7,0 - Tampn fosfato 20 mM pH 7,0 - Soluciones de NaCl en tampn fosfato 20 mM pH 7,0 de concentracin 0,05 M; 0,1 M y 0,2 M, respectivamente. - Cubetas de cuarzo PROCEDIMIENTO ATENCIN: - durante la cromatografa no se debe secar la superficie del lecho de la columna; - no se debe usar un flujo demasiado rpido. COLOCACION DE LA MUESTRA Y LAVADO Deje escurrir el tampn, abriendo la llave de la columna, hasta que est a punto de empezar a secarse la superficie del lecho de la columna. Cierre la llave. Coloque sobre la superficie del lecho 0,5 ml de la solucin de albmina y abra nuevamente la llave. Una vez que la muestra haya entrado en la columna agregue 9 ml de tampn y recolecte fracciones de aproximadamente 3 ml (abra o cierre la llave segn sea necesario).

ELUCION DE LA MUESTRA Agregue sucesivamente de 15 ml de cada una de las soluciones de NaCl en concentracin creciente. Colecte el eluato de la columna en fracciones de 3 ml.

CUANTIFICACION DE LA MUESTRA EN EL ELUATO Para determinar la concentracin relativa de albmina en las fracciones colectadas mida su absorbancia a 280 nm, calibrando el espectrofotmetro con el tampn (use cubetas de cuarzo).

INFORME El resultado de una cromatografa en columna se presenta en forma de un perfil de elucin, que consiste en un grafico de un parmetro que representa la concentracin de los solutos en funcin del volumen de eluato o nmero de las fracciones recolectadas. El volumen se comienza a medir a partir de la aplicacin de la muestra.

Construya el perfil de elusin graficando la absorbancia de las fracciones (A280) en funcin del nmero de la fraccin. Indique con una flecha los cambios de eluyente efectuados. Alternativamente, puede introducir una segunda ordenada para la concentracin del cloruro de sodio en el lado derecho del grfico y dibujar el gradiente salino escalonado.

CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 5. Qu resultado esperara, si la columna se equilibrara con tampn fosfato 20 mM pH 7,0 y NaCl 500 mM y la muestra aplicada estuviera disuelta en el mismo tampn? Qu resultado esperara Ud. si la columna se equilibrara con tampn de pH 5,0? (el pI de la albmina es 5). Si realizara el mismo experimento utilizando suero como muestra, qu resultados esperara? Podra identificar las fracciones que contienen albmina? Discuta. Se tienen 10 litros de una solucin que contiene una enzima ms hemoglobina. Suponiendo que Ud. estuviera interesado en la enzima, como podra remover la hemoglobina de la solucin, sin usar una columna?

BIBLIOGRAFIA: Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry 2a. Edicin. Editores Freeman & Company.