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TESE PROF.

. DANIEL GRANATO ANTIOXIDANTES E ESTRESSE OXIDATIVO Uma vez que os radicais livres tm relao, como causa ou conseqncia, com praticamente todas as enfermidades degenerativas crnicas, o que abrange cerca de 95% das patologias observadas em pessoas acima de 35 anos, tem crescido o interesse por substncias antioxidantes, como forma de tratamento e at mesmo de preveno dessas enfermidades. O oxignio molecular e seus radicais so os reagentes mais importantes na bioqumica dos radicais livres nas clulas aerbicas. O termo "espcies reativas de oxignio" (ROS) inclui os radicais livres contendo oxignio, como o nion superxido (O 2-), o radical hidroxila (HO.), o radical peroxila (ROO.) e espcies no radicalares como o perxido de hidrognio (H 2O2) e o oxignio singlete ( 1O2), os quais so frequentemente gerados como subprodutos de reaes biolgicas ou por fatores exgenos (GLCIN et al., 2003). Estas ROS podem causar um grande nmero de desordens celulares ao reagir com lipdeos, protenas, carboidratos e cidos nuclicos, estando envolvidas tanto no processo de envelhecimento, como tambm em muitas complicaes biolgicas, incluindo inflamao crnica, problemas respiratrios, doenas neurodegenerativas, Diabetes mellitus, aterosclerose, doenas autoimunes das glndulas endcrinas, doenas cardiovasculares, carcinognese e mutagnese (GLCIN et al., 2003; CHANWITHEESUK; TEERAWUTGULRAG; RAKARIYATHAM, 2005). Antioxidantes so substncias que retardam ou previnem significativamente a oxidao de lipdios, protenas ou de outras molculas ao inibirem a iniciao ou a propagao da reao de oxidao em cadeia (MOREIRA et al., 2002; WU et al., 2005; LIMA et al., 2006), alm de prevenirem ou repararem danos ocasionados s clulas pelas ROS (CHANWITHEESUK et al., 2005). As substncias com ncleo fenlico, como os flavonides e cidos fenlicos, apresentam destaque especial como antioxidantes, por atuarem como eficientes captadores de ROS, alm de reduzirem e quelarem ons frrico que catalisam a peroxidao lipdica atravs da degradao dos hidroperxidos (NAHAR & SARKER, 2005; DELAZAR et al., 2006). Os fenis presentes nos vinhos como a miricetina, quercetina, rutina, e antocianinas apresentam comprovada atividade antioxidante, uma vez que podem seqestrar radicais livres e, portanto, minimizar danos celulares oriundos do estresse oxidativo, explicando a proteo observada por epidemiologistas contra doenas degenerativas no-transmissveis (DCNT) (VILLANO et al., 2005). Os fenlicos so produtos do metabolismo secundrio das plantas derivados da fenilanina (SHAHIDI & NACZK, 2004). A fenilanina desaminada at cido cinmico, o qual entra na via fenilpropanol, sendo que o passo chave nesta via metablica a introduo de um ou mais grupos hidroxila no anel fenil, produzindo assim os fenis. Como resultado, os compostos fenlicos so derivados de uma mesma estrutura: a unidade fenilpropanol (HOLLMAN, 2001).

2.1.1 Estresse oxidativo O oxignio vital para a maioria dos organismos, mas, paradoxalmente pode ser fonte de molculas capazes de danificar stios biolgicos essenciais. Espcies reativas de oxignio (ROS), de carbono e nitrognio so continuamente produzidas por meio da gerao de energia atravs da cadeia transportadora de eltrons microssomal e mitocondrial. Fontes exgenas de formao de ROS so representadas pelo tabagismo, poluio, exerccio fsico intenso, consumo excessivo de lcool e agrotxicos, dentre outros (FRANKEL, 2005). As ROS so tomos, molculas ou ons que contm um eltron no pareado em seu ltimo orbital. Apresentam grande instabilidade e, consequentemente, elevada reatividade (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 2000). Tendem a ligar o eltron no pareado com outros presentes em estruturas prximas de sua formao, comportando-se como receptores ou como doadores de eltrons. As principais ROS so hidroxila (HO ), nion superxido (O2), radical peroxila (ROO), hidroperoxila (HO2) e alcoxila (RO) e os no-radicalares: oxignio singleto, e perxido de hidrognio (LAURINDO, 2005). Quando presentes em excesso, os radicais livres podem promover alteraes em molculas de DNA, protenas, carboidratos e lipdios. A oxidao das biomolculas pode levar a apoptose ou a leso em tecidos. Evidncias epidemiolgicas sugerem que essas alteraes esto associadas ao desenvolvimento e evoluo de diversas patologias como doena de Alzheimer, artrite reumatide, esclerose, cataratognese, diversas doenas cardiovasculares e alguns tipos de cncer (SUGIYAMA et al., 2003; NAISSIDES et al., 2004; KAUR et al., 2007; LEE & RENNAKER, 2010). Algumas outras doenas que podem ser associadas aos efeitos deletrios das ROS esto mostradas na Figura 2.

Figura 1: Espectro de doenas humanas que podem ser desencadeadas pelo excesso de espcies reativas de oxignio. (Adaptada de HALLIWEL, 1987 e HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).

A oxidao lipdica pode ser iniciada pelas ROS afetando cidos graxos poliinsaturados. Na iniciao, espcies reativas ou iniciadores (In ) promovem a quebra homoltica da ligao hidrogniocarbono na dupla ligao do cido graxo, com a abstrao de um hidrognio allico na extremidade carboxlico da cadeia, formando um radical acila (L ) (MIYASHITA, 2008). Na presena de oxignio, este reage diretamente com o radical acil (L ), produzindo um radical peroxila (LOO ), caracterizando assim a etapa de propagao da oxidao. Esses radicais reagem posteriormente com molculas de lipdios formando os hidroperxidos (LOOH) ou podem ser neutralizados por antioxidantes, como o tocoferol e os polifenis. Alternativamente, eles podem reagir com outros radicais lipdicos formando produtos no-radicalares, caracterizando a reao de terminao (FRANKEL, 2005). O esquema abaixo resume cada uma das etapas do processo de oxidao (CHAIYASIT et al., 2007): Iniciao: Propagao: In + LH L + O2 LOO + LH Terminao: InH + L LOO LOOH + L LOOL + O2 LOOR LL

LOO + LOO L + LOO L + L

A lipoperoxidao provavelmente o processo induzido por radicais livres mais extensivamente investigado, sendo que os mecanismos, dinmica e produtos da lipoperoxidao in vitro tm sido estudados, compreendidos e documentados. Entretanto, os efeitos biolgicos e fisiolgicos da lipoperoxidao e seus produtos ainda no foram completamente elucidados (NIKI, 2009). A presena abundante de fosfolipdios de membrana em locais onde os radicais livres so formados, tornam-os alvos endgenos facilmente acessveis e rapidamente afetados pelos radicais livres (de ZWART et al., 1999). Dessa forma, a lipoperoxidao promove alteraes na integridade, fluidez, e permeabilidade das membranas, levando perda de sua funo, alm de gerar produtos potencialmente adversos sade (NIKI, 2009). Quando os nveis de ROS oriundos da lipoperoxidao e de outras reaes qumicas no organismo esto aumentados ou quando os mecanismos antioxidantes no so acessveis ou perdem a eficincia para tamponar o efeito dessas espcies, ocorre o estresse oxidativo (LAURINDO, 2005). O estresse oxidativo modifica o balano redox por meio de potenciais oxidativos, podendo causar danos s molculas biolgicas e consequentes alteraes da funo celular ou mesmo a morte das clulas.

Em caso de aumento de ROS, as clulas respondem com um eficiente e sofisticado sistema de defesa antioxidante controlando a formao de radicais livres e limitando seus efeitos prejudiciais. No citoplasma, os principais mecanismos de defesa so enzimticos, enquanto no plasma, pequenas molculas respondem pela maior parte do poder antioxidante (FRSTERMANN, 2008). Esse sistema de defesa conta com a participao de protenas quelantes de metais, enzimas antioxidantes, as protenas de choque trmico e agentes de baixo peso molecular que apresentam atividade scavenger de ROS, como glutationa, -tocoferol, cido ascrbico, bilirrubina, cido rico e compostos polifenlicos, como os flavonides e cidos benzicos (FRSTERMANN, 2008).

2.1.2 Antioxidantes Antioxidantes so quaisquer substncias que, quando presentes em baixas concentraes em relao ao substrato oxidvel, retardam ou inibem a oxidao desse substrato, impedindo ou diminuindo o estresse oxidativo e o conseqente dano celular (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000). Compostos com atividade antioxidante esto presentes nas clulas e nos tecidos. Alguns so sintetizados pelo organismo, enquanto outros podem ser obtidos de fontes exgenas, tais como dieta. Entre os principais antioxidantes exgenos conhecidos esto o cido ascrbico e os tocoferis, os carotenides, e os compostos fenlicos (MOREIRA et al., 2002; LI et al., 2008). A atividade dos antioxidantes frente s ROS pode ser na forma de radical scavengers, chainbreaking ou mesmo os dois combinados, dependendo do composto e da matriz em oxidao (KALIORA & DEDOUSSIS, 2007). Compostos com ao radical scavenger atuam na inativao de espcies reativas na fase de iniciao, enquanto os chain-breaking reagem com os radicais lipdicos j formados, interrompendo a fase de propagao. Alm de doar tomos de hidrognio aos radicais livres, os antioxidantes podem atuar como quelantes de ons metlicos que tambm esto envolvidos na produo de ROS (CHAILLOU & NAZARENO, 2006). A atividade antioxidante dos compostos fenlicos encontrados no vinho tinto deve-se principalmente s suas propriedades redutoras e estrutura qumica nucleoflica, sendo que alguns mecanismos tm sido propostos: interrupo da reao em cadeia da peroxidao lipdica, por meio da sua reao com algumas espcies radicalares; reao com metais pr-oxidantes, tais como ferro e cobre, que so conhecidos por favorecer a formao dos radicais livres; supresso da peroxidao lipdica pela reciclagem de outros antioxidantes como o tocoferol e a preservao da atividade da paraoxonase associada lipoprotena de alta densidade (HDL), a qual capaz de proteger a lipoprotena de baixa densidade (LDL) contra a oxidao (KALIORA; DEDOUSSIS; SCHMIDT, 2006). Estas caractersticas desempenham um papel importante na neutralizao ou seqestro de radicais livres e quelao de metais de transio, agindo tanto na etapa de iniciao como na propagao do

processo oxidativo. Os intermedirios formados pela ao de antioxidantes fenlicos so relativamente estveis, devido ressonncia do anel aromtico presente na estrutura destas substncias (SOUSA et al., 2007). Os antioxidantes participam de reaes adicionais que removem radicais livres do sistema. Isto significa que cada molcula de antioxidante pode inativar pelo menos dois radicais livres: o primeiro sendo inativado quando o antioxidante ( AH) doa um hidrognio para um radical peroxila ( LOO), e o segundo quando o radical antioxidante ( A) entra em uma reao de terminao com outro radical peroxila (LOO), formando um composto estvel, fazendo assim que essas espcies altamente deletrias sejam neutralizadas (DECKER, 2002). Flavonides e outros compostos fenlicos como os cidos cinmicos e benzicos, possuem pelo menos uma hidroxila ligada ao anel benznico, o que caracteriza esses compostos como sendo nucleoflicos, ou seja, compostos fenlicos ricos em eltrons doam eltrons aos compostos eletroflicos, no caso os radicais livres, caracterizando os compostos fenlicos do vinho como hbeis antioxidantes (AL-AZZAWIE & MOHAMED-SAIEL, 2006). Os organismos aerbios somente conseguem sobreviver na presena do oxignio devido s defesas antioxidantes. Essas defesas diferem de tecido para tecido e de clula para clula. As defesas antioxidantes podem ser induzidas por exposio do organismo s ROS e por sinais celulares de molculas, tais como as citocinas. No entanto, essa defesa pode ser incompleta, ou seja, no previne completamente o dano oxidativo (BLOKHINA; VIROLAINEN; FAGERSTEDT, 2003). Os mecanismos de defesa antioxidante endgenos so formados por enzimas, tais como a superxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST) e outras que no participam diretamente do processo, mas fornecem suporte GPx, como a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6DP) e a glutationa redutase (GR). Alm dessa defesa enzimtica, existem ainda antioxidantes no-enzimticos, como o -tocoferol (vitamina E), cido ascrbico (vitamina C), flavonides e outras molculas, como o -caroteno e N-acetilcistena (RITTER et al., 2004).