Pez+Cebra+Expuesto+a+Xenobioticos Desbloqueado

UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
INSTITUTO DE CIENCIAS BSICAS E INGENIERA REA ACADMICA DE BIOLOGA LICENCIATURA EN BIOLOGA DETERMINACIN DE LA FRECUENCIA DE MALFORMACIONES EN COLUMNA VERTEBRAL, OPRCULO Y ALETA EN Danio rerio Hamilton, 1822, COMO POSIBLES BIOMARCADORES EN LA VALORACIN DE DAO TERATOGNICO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:
LICENCIADO EN BIOLOGA
PRESENTA: INGRID VANIA RIVERA CASTILLO
ASESORES:
Dr. JUAN CARLOS GAYTN OYARZN M. en C. ESTELA PREZ CRUZ
PACHUCA DE SOTO, HIDALGO JUNIO 2006
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
A Dios A ti Padre Santo por darme el Don de la vida, por ser la fuerza que me alienta para alcanzar una meta, a ti Seor que nunca me abandonas y siempre me guas.
A mi esposo Guillermo Estrada Contreras Por ser el gran complemento de mi vida que junto con mi carrera dan sentido a mi vida y una razn ms para seguir a delante. Porque contigo he aprendido a compartir sueos y luchar por ellos.
A mis padres Filogonio Rivera Garca y Alina Castillo Torres Que me ensearon que lo que vale realmente en la vida es slo aquello que se consigue con sacrificio, trabajo, dedicacin y amor. Les Agradezco infinitamente todo el apoyo que me han brindado a lo largo de mi vida.
A mi hermano Julio Csar Rivera Castillo Por formar parte de mi vida y por estar conmigo en todo momento T.Q.M.
Ingrid Vania Rivera Castillo
Agradecimientos
A mis Directores de Tesis M. en C. Juan Carlos Gaytn Oyarzn M. en C. Estela Prez Cruz Con gratitud infinita, por su invaluable apoyo y aportacin para la elaboracin de esta Tesis, por compartir sus conocimientos conmigo, por su paciencia, tiempo y dedicacin.
A mis sinodales Dr. Alberto Jos Gordillo Martnez M. en C. Mario Segura Almaraz Dra. Mara del Carmen Snchez Hernndez Dra. Katia Adriana Gonzlez Rodrguez Dr. William Scott Monks Sheets Dra. Griselda Pulido Flores Por la dedicacin y apoyo que cada uno de ustedes me brind, gracias por formar parte en una etapa ms en mi vida.
A los catedrticos del Acuario de la facultad de ciencias de la UNAM Bil. Humberto Olvera Quezada M. en C. Ignacio Andrs Morales Salas Por su apoyo incondicional, sus consejos y tiempo brindado en la elaboracin de esta tesis, gracias por compartir conmigo sus conocimientos y ensearme tantas cosas de los peces. Al licenciado Marcelo Quiterio Por la asesora en los anlisis estadsticos
Agradecimientos
A mis amigos Jorge Juriana Chuy Irving Luis Lorena Mireya Prof. Bertha Por compartir momentos inolvidables y por ensearme el verdadero significado de la amistad, gracias por hacerme sentir parte importante de sus vidas.
Gracias a todas las personas que creyeron en m.
Dedicatoria
DEDICATORIA
Esta Tesis es en honor de aquellas personas que en ningn momento me dejaron llegar sola:
A mi esposo Guillermo Estrada Contreras A mis padres Filogonio Rivera Garca y Alina Castillo Torres A mi hermano Julio Csar Rivera Castillo Especialmente a un ngel Que en todo momento estuvo a mi lado y que es la estrella que ilumina mi sendero, quien siempre vivir en mi corazn como algo sagrado.
ndice
NDICE Pg. RESUMEN 1 1. INTRODUCCIN 1 1.1. CONTAMINANTES AMBIENTALES ............ 1.2. EVALUACIN DEL EFECTO BIOLGICO 1.3. INDICADORES BIOLGICOS 8 1.4. BIOMARCADORES 9 1.5. BIOLOGA DE Danio rerio 12 1.6. TERATOGNESIS 14 2. JUSTIFICACIN 16 3. OBJETIVOS 16 3.1. OBJETIVO GENERAL 17 3.2. OBJETIVOS PARTICULARES 18 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1. ADQUISICIN Y DESINFECCIN DE ORGANISMOS EXPERIMENTALES 4.2. TRANSFERENCIA A UN ACUARIO DE MANTENIMIENTO 4.3. MANTENIMIENTO DE LOS PECES 4.4. ESTABLECIMIENTO DE LOS CRITERIOS DE SELECCIN PARA LOTES REPRODUCTIVOS 22 18 18 21 3 5
ndice
4.5. NMERO DE INDIVIDUOS EN LOS LOTES REPRODUCTIVOS 4.6. CALIBRACIN DEL NMERO DE OVOPOSICIONES 4.7. FRECUENCIA DE APARICIN DE MALFORMACIONES EN COLUMNA VERTEBRAL, OPRCULO Y ALETA 4.8. SELECCIN DEL MEJOR BIOMARCADOR CON BASE EN LA EVALUACIN DE DAO TERATOGNICO INDUCIDO 4.9. ANLISIS ESTADSTICOS 5. RESULTADOS 5.1. CONDICIONES FISICAS Y QUMICAS 5.2. ESTABLECIMIENTO DEL LOTE EXPERIMENTAL 5.3. INDUCCIN DE OVOPOSICIN Y DETERMINACIN DE TAMAOS DE MUESTRAS EXPERIMENTALES 5.4. ESTABLECIMIENTO DE CURVAS DE TOXICIDAD 5.5. EVALUACIN DEL EFECTO TERATOGNICO 5.6. MALFORMACIONES ESPONTNEAS 6. DISCUSIN 7. CONCLUSIN 8. GLOSARIO 9. BIBLIOGRAFA. 34 37 39 49 51 55 57 67 26 27 29 29 33 24 22 23
...........................................................................................................
ndice de Figuras
NDICE DE FIGURAS Pg. Figura 1. Proceso de transporte y transformacin de un txico (Modificado de Pea y col., 2001) Figura 2. Danio rerio en el acuario Figura 3. Dimorfismo sexual en Danio rerio. En la parte superior de la imagen se muestra a la hembra y en la parte inferior al macho Figura 4. Pecera de reproduccin, de Danio rerio con red de maternidad Figura 5. Proceso experimental de HgCl2 en bao mara con calentador y oxgeno adecuado 25 10 23 5 10
Figura 6. Lote experimental con peceras de mantenimiento, reproduccin y con agua en reposo Figura 7. (a) Huevo contaminado por hongo y (b c) huevo contaminado por alimento Figura 8. Embrin con proliferacin de protozoarios Figura 9. Curva de toxicidad con trixido de cromo (CrO3) en adultos de pez cebra Figura 10. Concentracin letal 50 de trixido de cromo en huevos de Danio rerio Figura 11. Concentracin letal 50 de cloruro de mercurio en huevos de Danio rerio 38 37 38 35 35 33
ndice de Figuras
Figura 12. Divisin de malformaciones por zonas del cuerpo de Danio rerio Figura 13. (a) Malformacin sencilla, en la zona ceflica en forma lateral (b) posicin normal de la columna con respecto a la cabeza en Danio rerio Figura 14. (a) Posicin normal de la columna vertebral en Danio rerio (b), Malformacin doble en la zona media de la columna vertebral y en la zona caudal Figura 15. (a) Posicin normal de la columna vertebral en Danio rerio, (b) Malformacin en zona ceflica lateral y zona caudal dorsal Figura 16. (a) Malformaciones curvas en la zona media de la columna vertebral (b) columna vertebral de Danio rerio en posicin normal Figura 17. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal (b) malformacin en zona caudal en espiral Figura 18. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal, (b) Malformaciones en zona caudal muy pronunciada Figura 19. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal (b-c) Malformaciones en gancho en la zona media de la columna vertebral y en la zona caudal Figura 20. Ausencia de melanocitos en peces de Danio rerio con enanismo Figura 21. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal (b) Malformaciones en el sistema seo
42
43
44
44
45
46
46
47 48
48
ndice de Figuras
Figura 22. (a) Posicin normal del oprculo en Danio rerio (b) Ausencia de oprculo Figura 23. (a) Posicin normal de la mandbula del Danio rerio (b) Ausencia de la misma Figura 24. (a) Patrn normal con bandas longitudinales de Danio rerio, (b) patrn anormal de bandas longitudinales 50 50 49
ndice de Tablas
INDICE DE TABLAS Pg. Tabla 1. Condiciones fsicas y qumicas del agua utilizada en los acuarios Tabla 2. Anlisis del pH del agua utilizada en los acuarios de Danio rerio Tabla 3. Temperatura ptima establecida experimentalmente por etapa de desarrollo de Danio rerio Tabla 4. Datos dentro de la pecera con tiempo de duracin del desarrollo embrionario de Danio rerio Tabla 5. Resultados de viabilidad y mortandad de Danio rerio Tabla 6. Huevos de Danio rerio obtenidos por lote reproductivo Tabla 7. Ovoposiciones de Danio rerio con base en la temperatura Tabla 8. Malformaciones presentes en Danio rerio por concentracin de HgCl2 Tabla 9. Parmetro de frecuencias de malformaciones en Danio rerio 41 42 31 32 36 37 30 20 20
Resumen
RESUMEN
En la actualidad, los organismos interactan de manera constante con una gran cantidad de substancias, tanto de origen natural como antropognico, muchas de stas pueden ser txicas y/o presentar efectos nocivos para la salud. En la gentica toxicolgica se utiliza una variedad de organismos que manifiestan alteraciones bioqumicas, morfolgicas, fisiolgicas y genticas entre otras, como respuesta a las alteraciones en el medio. Para valorar la calidad ambiental a travs del impacto biolgico y evaluar el riesgo a la exposicin de agentes contaminantes, se requiere de indicadores biolgicos y de su correlacin con anlisis qumicos ambientales. Existiendo organismos sensibles a los agentes qumicos, los cuales manifiestan una serie de cambios medibles y fcilmente visibles, denominados biomarcadores. stos son reproducibles e inducibles, de tal manera que se puede asociar a ellos, la exposicin a un Agente Xenobitico. Con base en lo anterior, actualmente se utiliza una gran cantidad de ejemplares en la evaluacin del ambiente, y siempre se est en la bsqueda de ms y mejores indicadores biolgicos que refleje la calidad ambiental. En el presente trabajo se propone a la frecuencia de malformaciones en columna vertebral, oprculo y aleta del Danio rerio como biomarcadores en la valoracin del efecto teratognico inducido por contaminantes ambientales, as mismo se proponen otras estructuras que se presenten de manera natural.
Resumen
En el procedimiento experimental, inicialmente se adecuaron las condiciones fsicas y qumicas para asegurar la viabilidad y desarrollo de los peces, posteriormente, se realizaron curvas de toxicidad con dos teratgenos positivos de referencia, el trixido de cromo (CrO3) y el cloruro de mercurio (HgCl2), exponiendo a 500 adultos y 6000 huevos del pez cebra para establecer la sensibilidad del bioensayo, registrando la concentracin letal 50 en partes por milln para establecer dosis subtxicas. La exposicin del pez cebra al trixido de cromo no present algn efecto desde el punto de vista genotxico, al menos en las concentraciones y condiciones probadas tanto en adultos como huevos. El HgCl2 en dosis subtxicas provoca un efecto teratgeno,
principalmente en la columna vertebral. En los biomarcadores restantes, oprculo y aleta del pez cebra no se encontr ninguna malformacin en el momento de la eclosin. La temperatura es una variable importante que influye de manera significativa en cada etapa de vida de los organismos, principalmente en la ovoposicin, encontrando que, a mayor temperatura, mayor nmero de huevos.
Introduccin
1. INTRODUCCIN
1.1. CONTAMINANTES AMBIENTALES La contaminacin ambiental, se define como aquella alteracin del medio causada por la energa o los materiales de desecho descargados al ambiente, en donde pueden daar la salud humana, as como a los ecosistemas, llegando de varias maneras: por descargas a la atmsfera y/o al agua, por la disposicin de materiales contaminantes en el suelo mismo, e incluso a travs de cadenas trficas tanto simples como complejas. Por lo tanto, la contaminacin puede surgir a partir de ciertas manifestaciones de la naturaleza (fuentes naturales) o bien, debido a los diferentes procesos productivos del hombre (fuentes antropognicas) que conforman las actividades de la vida diaria (Holdgate, 1979; Canter, 1986 y Odum, 1995). La manera de conocer el impacto de la contaminacin en el ambiente, es a travs de la identificacin de los diferentes tipos de contaminantes, su concentracin, origen, cintica ambiental, efectos biolgicos y ecolgicos; estimando el efecto que pueda causar a diferentes niveles y la posibilidad de que ocurra (evaluacin de riesgo o risk assement), estableciendo probabilidad y gravedad de los posibles efectos adversos, para, as poder estimar el peligro. ste ltimo se determina por medio de un balance entre el riesgo y la probabilidad de interactuar con algn agente nocivo a la salud (Canter, 1986 y Ferncola, 1992a). De acuerdo con lo anterior, la evaluacin de riesgo se determina en cuatro pasos (Ferncola, 1992a):
Ingrid Vania Rivera Castillo 1
Introduccin
1) Identificacin de peligro con base al efecto, 2) Evaluacin de la dosis respuesta, 3) Evaluacin de la va y tipos de exposicin, 4) Identificacin del riesgo (posibilidad de interaccin). Mediante el uso de la evaluacin de riesgo como una herramienta analtica para la toma de decisiones, se brinda soporte a la gestin de riesgo, en el registro y creacin de bases de datos de agentes nocivos para la salud. Una vez conocido el proceso de la valoracin de riesgo se procede a la evaluacin del efecto, el cual depende de la concentracin del agente qumico, as como del tiempo (aguda y/o crnica), del tipo (directa o indirecta) y de la va de exposicin (oral, drmica, respiratoria y especial); para que posteriormente se realicen pruebas de toxicidad que permitan establecer dosis subtxicas a travs de la Cl50 (concentracin letal 50), que, d lugar a realizar una gestin de riesgo (risk management), la cual permite establecer las polticas y alternativas en la eleccin de acciones legales, preventivas y/o correctivas ante una contingencia de un problema ambiental (Ferncola, 1992a). Toda medida preventiva y/o correctiva se puede realizar siempre y cuando est sustentada en una evaluacin del impacto biolgico, debido a que sta se basa en un monitoreo ambiental sistemtico permanente, para advertir seales tempranas de alguna alteracin en el ecosistema, teniendo una estrecha relacin entre estresores y respuestas biolgicas, a travs de la identificacin de las
Introduccin
causas del efecto producido en los organismos (impacto biolgico), debido a que se puede presentar una accin txica por los contaminantes, determinada por su accesibilidad al organismo (biodisponibilidad) as como por la serie de reacciones bioqumicas y fisiolgicas que se manifiestan como signos o sntomas de intoxicacin propios de cada especie (Vega, 1985a; Canter, 1986 y Ferncola, 1992b). 1.2. EVALUACIN DEL EFECTO BIOLGICO La evaluacin de este efecto producido por los contaminantes a nivel biolgico se determina por medio de la toxicologa, en donde su objetivo principal es: establecer el uso seguro de los agentes qumicos y minimizar sus efectos deletreos en poblaciones expuestas (Trimbell, 1989; Cant, 2000 y Vera y col., 2001). De sta rea de estudio se desprenden ramas tales como la ecotoxicologa y la toxicologa gentica, la primera no solo se limita a la identificacin del agente contaminante ya sea fsico, qumico y/o biolgico, sino que tambin a su origen, concentracin, cintica y consecuencias tanto a nivel individual como ecolgico, para lo cual, es necesario identificar la naturaleza, probabilidad y magnitud de los efectos adversos que puedan existir sobre un ecosistema al exponerse a un cierto estrs ambiental (Vettorazzi, 1992a y Vera y col., 2001). Para que un txico ambiental cause un dao, primeramente, se debe estar expuesto a l, y posteriormente, el txico debe vencer las defensas y barreras del organismo que tratan de impedirle que llegue al tejido en su forma activa.
Introduccin
Las defensas consisten fundamentalmente en mecanismos que restringen la movilidad disminuyendo el periodo de exposicin. Esto se logra, a travs de presentar barreras fsicas, qumicas y/o metablicas al desplazamiento y absorcin (Vega, 1985b). La Toxocintica o farmacocintica, trata a los agentes xenobiticos que son biotransformados en el organismo, su acumulacin, as tambin los procesos de cundo y cmo son excretados del mismo, centrndose inicialmente en seis etapas: exposicin, absorcin, distribucin, acumulacin, metabolismo y
excrecin. Un rea de la farmacocintica que se encarga de correlacionar la cintica del contaminante en el interior del organismo con los efectos biolgicos que ste pueda manifestar es la Toxicodinmica o Farmacodinmica, la cual permite ampliar el conocimiento del impacto biolgico que existe a la exposicin a un agente exgeno (Vega, 1985c). Para caracterizar el proceso de transporte y transformaciones, que experimenta el txico, desde la superficie epitelial de contacto hasta llegar a los rganos en los que se almacenan y en los que causa lesiones, se consideran cuatro pasos: Absorcin, Distribucin, Metabolismo y Excrecin (Figura 1). El proceso se conoce por sus siglas ADME (Pea y col., 2001 y Vera y col., 2001).
Introduccin
Fig.1. Proceso de transporte y transformacin de un txico (Modificado de Pea y col., 2001) Por lo tanto, la interaccin dinmica de todos los procesos que contribuyen el ADME, determina el tiempo que permanecer un agente dentro del organismo despus de que ste se ha expuesto a una dosis determinada. De acuerdo a esto, la toxicidad se puede comprobar por medio de indicadores biolgicos para evaluar la calidad del medio (Pea y col., 2001). 1.3. INDICADORES BIOLGICOS La evaluacin de los efectos detrimentales de los contaminantes a nivel biolgico, es difcil de estimar directamente en un ecosistema, debido a que stos son complejos, multivariados y simultneamente expuestos a una gran variedad de estresores con efectos acumulativos que son escasamente entendidos debido a su difcil reproduccin en pruebas con animales de laboratorio, para determinar la calidad del ambiente con diferentes procedencias.
Introduccin
Adems, se debe apoyar forzosamente con anlisis qumicos cuantitativos y cualitativos, que permitan correlacionar la concentracin y movilidad de los contaminantes con los efectos biolgicos (Ferncola, 1992a; Butterworth y col., 1995 y Figueroa y Pinzn, 2000). En cambio, el uso de organismos en la evaluacin del efecto biolgico es ms sencillo, debido a que son organismos sensibles a los cambios ambientales, permitiendo la cuantificacin de la magnitud del estrs (Ferncola, 1992a). En diversos pases, el uso de indicadores biolgicos es empleado en la evaluacin de la salud del ecosistema y en la determinacin del impacto potencial en el humano, a travs de la estimacin de la evaluacin de riesgo y efecto de los mismos (Ferncola, 1992b). Un indicador biolgico, es un organismo seleccionado por el grado de su sensibilidad o tolerancia a diversos tipos de contaminacin o sus efectos. Segn Cairns y Dickson (1971) el uso de indicadores biolgicos brinda dos beneficios para la evaluacin de la calidad ambiental: 1.) Los datos biolgicos son fcilmente accesibles como los fsicos y qumicos; 2.) La informacin ser expresada numricamente, para que facilite la evaluacin con mtodos estadsticos. En el caso particular de los sistemas acuticos, existen diversos indicadores de calidad del agua y criterios para cada uno de ellos. Como por ejemplo, los peces, que son animales usados comnmente como indicadores en
Introduccin
programas de monitoreo biolgico, de acuerdo a las siguientes ventajas y caractersticas (De la Lanza y col., 2000): 1.- Cuando es necesario el traslado de los peces al laboratorio, el tiempo de manipulacin y procesamiento es relativamente menor, en comparacin con otros grupos taxonmicos, 2.- Son principalmente afectados por factores ambientales, fciles de ubicar, 3.- Los peces son de vida larga y por lo tanto se puede realizar una evaluacin en cada etapa, 4.Se identifican los cambios en la anatoma de un pez, cuando se ha
sometido a algn tipo de influencia anmala, son reflejados en la produccin de lesiones, tumores y/o deformidades en el cuerpo y aleta, 5.- El uso de peces como bioindicadores puede ser relacionado directamente en el establecimiento de polticas de pesca y manejo de los ambientes acuticos. Adems los indicadores biolgicos pueden revelar el efecto producido despus de la absorcin de cierta dosis de agentes qumicos y el lugar donde ste ejerce el efecto dentro del organismo. Los indicadores de exposicin permiten tener una estimacin indirecta, es decir, el efecto que provoca un qumico en un tiempo. De acuerdo a esto, los indicadores de acumulacin proveen una evaluacin de la concentracin de la sustancia retenida en rganos pudiendo identificar alteraciones tempranas y totalmente reversibles por el organismo (Ferncola, 1992c).
Introduccin
1.4. BIOMARCADORES Los biomarcadores son aquellos que detectan la presencia y la ausencia de dao; as como la magnitud de ste, por medio de cambios mersticos, ya sean bioqumicos, morfolgicos o fisiolgicos, que se pueden asociar a la exposicin de un txico (Ferncola, 1992b y Guzmn, 1997). Los biomarcadores se utilizan para detectar la presencia de una exposicin, determinar las consecuencias biolgicas de la exposicin, manifestar los estados iniciales e intermedios de un proceso patolgico, identificar a los individuos sensibles de una poblacin y fundamentar la decisin de intervenir, tanto a nivel individual como ambiental (Butterworth, 1995). Cuando se utiliza un organismo como bioindicador en la determinacin del efecto txico de algn factor, se debe valorar las ventajas que ste produce al realizar el anlisis de los efectos producidos por los contaminantes ambientales. Cuando se estudian peces que provienen de aguas contaminadas (ros, lagos, mares o de establecimientos acuicultores), se identifica a un organismo con daos secundarios por la contaminacin, mientras los bioindicadores que se analizan dan a conocer alteraciones sustanciales. El estado en el que se encuentran los peces, generalmente permite presumir que cualquier desequilibrio agudo de la concentracin de oxgeno, aumento de temperatura del agua o modificaciones en la masa de agua, pueden ocasionar dramticas consecuencias para la supervivencia de stos animales (Butterworth, 1995).
Introduccin
1.5. BIOLOGA DE Danio rerio Hamilton, 1822 En la Universidad de Oregon en los aos 70 y 80, se constituy el principal portal que da acceso a las tecnologas desarrolladas, en la red internacional del pez cebra Danio rerio Hamilton, 1822 (Westerfield, 1995 y Kimmel y col., 1995). Danio rerio es una de las especies de peces ms resistentes a cambios ambientales, ste es de ambiente bentopelgico de agua dulce con pH de 6 a 8, as mismo los intervalos de dureza son de 5 a 19, Es de clima tropical con una temperatura de 18 a 24C y es quizs el pez ms fcil de criar entre los ovparos, se distribuye en Asia: Pakistan, India, Bangladesh, Nepal y Myanmar (Kimmel y col., 1995; Aqua Gua, 2004, y Froese y Paulv, 2006). Su morfologa es fusiforme y alargada, presenta un par de barbillas en ambos lados de la boca que le permite mover los fondos en busca de comida. Ostenta de 31 a 32 vrtebras; el color de su cuerpo es dorado o plateado (segn el sexo), sobre los flancos y longitudinalmente se presenta de cinco a nueve bandas de color azul oscuro que empiezan desde el oprculo y llegan hasta el final de la aleta caudal. El oprculo es azulado y la zona ventral de un tono blanquecino rosado. Danio rerio habita en corrientes de agua, canales, y charcas. Se alimenta de gusanos y pequeos crustceos y de larvas de insectos (Figura 2).
Introduccin
Fig.2 Danio rerio en el acuario (Tomado de www.bbe-moldaenke.de/ img/zebrafish.jpg) Los ejemplares de Danio rerio presentan dimorfismo sexual bajo los siguientes criterios (Figura 3): Hembras: son de mayor tamao que los machos y en el abdomen, las lneas presentan curvaturas. Machos: de menor tamao que las hembras, no presentan curvaturas en las lneas de su cuerpo por que no hay prolongacin de abdomen.
Fig. 3. Dimorfismo sexual en Danio rerio. En la parte superior de la imagen se muestra a la hembra y en la parte inferior al macho
10
Introduccin
ste organismo en condiciones de laboratorio presenta diversas ventajas sobre otros organismos como: una salud ptima, controlndola por medio de cambios de temperatura y limpieza de la pecera. Puede mantenerse muy bien alimentado con comida comercial de marca Wardley y Tetra Min y as mismo comida liofilizada de Tubifex y Artemia; su mantenimiento es de bajo costo; as mismo, ocupa un espacio reducido, por ejemplo, en una pecera de 20 litros se pueden tener 30 individuos, debido a su talla de 5 cm. Otra de las ventajas importantes es que su reproduccin sexual inicia a los 4 meses, despus de la eclosin, su reproduccin puede inducirse por factores de luz y es controlable por alimentacin. En el cortejo, hembras y machos se persiguen mutuamente para ser los machos los que acaban arrinconando a las hembras para provocar el desove; ste se produce cuando los peces estn muy excitados, el macho llega a golpear el lomo de la hembra para que esta expulse los huevos para fecundarlos. Su descendencia oscila entre 200-400 huevos en tan slo dos semanas y su desarrollo embrionario va de dos a cuatro das, conformado por siete periodos en la embriognesis: cigoto, hendidura, blstula, gstrula, segmentacin, farngula y eclosin (Weinberg, 1992; Sohn, 1994; Kimmel y col., 1995 y Froese y Paulv, 2006). Una caracterstica que no se debe dejar de mencionar, es que el huevo tiene una cubierta delgada, semipermeable y transparente, que permite observar cualquier alteracin durante el desarrollo embrionario, como malformaciones congnitas producidas por agentes teratgenos (Vega, 1985c; Galicia y col., 1998 y Rocha y col., 2001).
Introduccin
1.6. TERATOGNESIS El termino teratognesis proviene del griego teratos que significa monstruo, sta palabra se refiere a malformaciones anatmicas macroscpicas. En donde, un teratgeno, es cualquier agente qumico, fsico o infeccioso, actuando durante el desarrollo embrionario, que sea capaz de producir una alteracin morfolgica o funcional en el periodo postnatal (Hughes, 1996). Un ejemplo es el caso del cromo, el cual es un agente teratognico positivo, ampliamente distribuido en la corteza terrestre (Hughes, 1996). En condiciones naturales el cromo se presenta casi siempre en forma trivalente mientras que el cromo Vl es generado por las actividades
antropognicas, el cual es un agente oxidante que en contacto con la materia orgnica se reduce a cromo III (Vera y col., 2001). El cromo principalmente se presenta en las aguas superficiales y muy poco en agua potable, por lo que las concentraciones elevadas de cromo en el agua es consecuencia de las actividades industriales o de aguas servidas. Las pruebas in vitro han mostrado que el cromo Vl es mutagnico mientras que el cromo III no (Vega, 1985d y Vera y col., 2001). Otro de los teratgenos relevantes por sus efectos es el mercurio, siendo un elemento qumico presente en el ambiente, se origina de los escapes industriales, del empleo de combustibles fsiles (principalmente carbn, lignita, petrleo y gas natural), de la desgasificacin natural de la corteza terrestre y de los ocanos (Galvo y col., 1987).
12
Introduccin
El mercurio se puede presentar de forma metlica, sales inorgnicas y orgnicas. En su forma metlica, en mamferos atraviesa fcilmente la barrera hematoenceflica y la placenta; mientras que las sales inorgnicas de mercurio como por ejemplo el cloruro de mercurio (HgCl2) son compuestos corrosivos y que en bajas concentraciones se absorben por va gstrica. En la piel el mercurio causa irritaciones graves. Despus de la absorcin estos compuestos pasan a tejidos sanguneos; distribuyndose por igual entre el plasma y los eritrocitos. Por otra parte, la afinidad del mercurio metlico y las sales inorgnicas de mercurio por el rin se debe a la protena metalotionena de bajo peso molecular (Galvo y col., 1987).
13
Justificacin
2. JUSTIFICACIN
En la actualidad, varios trabajos proponen al pez cebra como un buen indicador biolgico en ambientes acuticos, debido a que puede reflejar retrospectivamente y/o prospectivamente las modificaciones a travs del impacto biolgico. Existe una gran diversidad de datos, en donde se utiliza el bioenzayo de Danio rerio como un bioindicador de calidad ambiental. Un ejemplo es el trabajo de Gong, y col., (2003) en donde crearon peces genticamente modificados que cambian de color en presencia de aguas contaminadas. Desde 1986 se sugiri al pez cebra como un modelo con mltiples ventajas para el anlisis gentico del desarrollo embrionario en vertebrados, lo cual, sustent estudios de ecotoxicologa que proponen el uso de embriones de ste organismo para evaluar dao teratognico inducido por contaminantes ambientales. sta propuesta ha evolucionado, a travs de varios ensayos que culminan en la prueba denominada Danio rerio Taratology Assay DarTa (Dietrich y col., 1998, Oberemm, 2000 y Nagel, 2002). El uso del modelo DarTa permite evaluar la calidad ambiental a travs de malformaciones en biomarcadores como columna vertebral, oprculo, aleta y corazn, entre otros; que se expresan de manera natural y que puede influir en su frecuencia de malformaciones a travs de la exposicin a agentes xenobinticos. Llegando a considerar al Danio rerio como la Drosophila para los vertebrados; debido al
14
Justificacin
amplio grado de conocimiento que se tiene de su genoma, la anatoma y su desarrollo, de ah su amplia aplicacin en estudios de la calidad ambiental.
15
Objetivos
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL Determinar la frecuencia de malformaciones en columna vertebral, oprculo y aleta en Danio rerio, para postularlos como posibles biomarcadores en la valoracin de dao teratognico.
16
Objetivos
3.2. OBJETIVOS PARTICULARES
Adecuar las condiciones fsicas y qumicas de cada una de las etapas de desarrollo embrionario, de Danio rerio que asegure la viabilidad de huevos y alevines para su posterior anlisis.
Establecer condiciones fsicas, qumicas y biolgicas, que aseguren la conducta reproductiva de Danio rerio para calendarizar periodos de ovoposicin y tamaos de muestra.
Determinar dao congnitas ms
con un evidentes,
teratgeno registrando
positivo
y malformaciones de aparicin,
frecuencia
variabilidad, porcentaje de eclosin y porcentaje de sobrevivencia, que permitan detectar efectos letales de exposicin temprana y tarda, para elegir cual es el mejor biomarcador propuesto, de columna vertebral, oprculo y aleta del pez cebra.
17
Procedimiento experimental
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1. ADQUISICIN Y DESINFECCIN DE ORGANISMOS PERIMENTALES La desinfeccin de los organismos experimentales Danio rerio adquiridos comercialmente, se llev a cabo en un periodo de dos semanas agregando previamente 6 gotas de azul de metileno y un gramo de granos de sales marinas, sta desinfeccin se realiz con el propsito de eliminar todo aquel pez que presentara alguna enfermedad, as como para lograr la eliminacin de parsitos. sta etapa se llev a cabo en una pecera de 70 litros de capacidad, con un filtro biolgico de (grava y tezontle), calentador de temperatura controlada, entre 26 C + 2 C y bombas de oxgeno. Posteriormente, los peces cebra se separaron de acuerdo a su sexo, en dos peceras bajo las mismas condiciones mencionadas anteriormente, para que llegado el momento se colocaran en una pecera de reproduccin,
identificndolos morfolgicamente gracias a que presentan dimorfismo sexual. 4.2. TRANSFERENCIA A ACUARIO DE MANTENIMIENTO. Las condiciones para el mantenimiento de los peces no radica en querer reproducir al mximo en el laboratorio su ambiente natural, sino proporcionarles un medio suficientemente aceptable cuyas caractersticas se encuentren cercanos a las condiciones fsicas y qumicas en cuestin para los organismos empleados; debido a esto, se colocaron en un lote experimental el cual est constituido por:
18
El primer compartimiento, cuenta con una pecera de 70 litros con agua en reposo, durante 24 h, con aireacin constante (bomba de oxgeno) y un calentador automtico con la finalidad de eliminar cloro. En el segundo compartimiento se coloc el lote de mantenimiento en una pecera con el mismo volumen, filtro biolgico que consiste en una capa de tezontle y una capa de grava, calentador automtico y bomba de oxgeno. En el tercer compartimiento se colocaron dos peceras de cuatro litros de capacidad las cuales fueron nombradas peceras de reproduccin, contando con redes de maternidad, un calentador y oxgeno. Por ltimo, en el cuarto compartimiento se colocaron dos peceras de cuatro litros de capacidad llamadas peceras de maternidad, con un calentador y aireacin constante, para el mantenimiento de los embriones obtenidos. Por otra parte, los huevos y alevines se colocaron en diversos frascos debidamente etiquetados con el nmero de individuos, fecha de ovoposicin y la pecera de maternidad de donde provienen, estos frascos se cubrieron con una malla delgada para que no se revuelvan con los dems y as poder llevar un registro de viabilidad de cada pecera de maternidad. Las condiciones fsicas y qumicas de los lotes de mantenimiento se establecieron con base en Gonzlez, (2005) y Baez y col., (2004 y 2005), (ver tabla 1 y 2) las cuales marcan los siguientes factores como determinantes: luz solar y temperatura, siendo agentes importantes que inciden en los ritmos biolgicos de las especies, teniendo un efecto directo en sus hbitos
conductuales, alimenticios y reproductivos. Por otra parte, tambin se fijaron las condiciones de aireacin, tamao del estanque y ubicacin dentro del laboratorio para evitar la alteracin de la viabilidad y fecundidad de los organismos experimentales (Galicia y col.1998). Para el seguimiento de condiciones fsicas y qumicas se monitore diariamente la temperatura, presencia de aireacin, pH mensual y presencia de luz (12 h/luz y 12 h/oscuridad). Tabla 1. Condiciones fsicas y qumicas del agua utilizada en los acuarios VARIABLE ILUMINACIN CONDICIONES RECOMENDADAS No recomendada de manera directa al acuario La temperatura recomendada es de 28C Los acuarios deben permanecer alejados de equipos que produzcan exceso de calor (parrilla, estufa, etc.) pH 7 Mantener ventanas cerradas o cualquier orificio El equipo a utilizar debe estar en condiciones favorables Suficiente para que se pueda manipular con mayor facilidad a las peceras
TEMPERATURA
pH CORRIENTES DE AIRE INSTALACIONES ESPACIO
Tabla 2. Anlisis del pH del agua utilizada en los acuarios de Danio rerio MESES pH FEB 8.16 MAR 7.14 ABR 10.36 MAY 7.75 JUN 7.36 JUL 8.22 SEP 7.91 NOV 8.32 DIC 8.13 ENE 8.08
20
4.3. MANTENIMIENTO DE LOS PECES CEBRA. El monitoreo de las condiciones ptimas recomendadas
bibliogrficamente se realiz de forma sistemtica y permanente cada da. Se eliminaron los desechos orgnicos producidos por los peces despus de cada alimento para evitar contaminacin de microorganismos. El alimento se administr en funcin de los requerimientos nutricionales especficos de los peces, es decir, de acuerdo a la etapa de desarrollo en el que se encontraban, por lo que se aliment a los organismos adultos tres veces al da con alimento seco, agregndoles la cantidad necesaria para alimentarlos durante cinco minutos con Wardley y Tetra Min; para la etapa de reproduccin se requiere un mayor aporte de lpidos y carbohidratos, es por ello que su dieta se complement con alimento vivo (Artemia sp.) para obtener mayor nmero de huevos en cada ovoposicin y as cumplir con los nutrientes necesarios. Por otro lado, los alevines recin eclosionados tienen una reserva de vitelo que proveer por un periodo una alimentacin endgena. Posteriormente se alimentaron con tetramin especial para alevines, el cual proporcion protenas, carbohidratos, grasas y fibras. As mismos, se realiz un cambio de agua en cada pecera, eliminando el 50% de la misma y agregando agua en reposo para el llenado, este recambio se llev a cabo una vez a la semana, en la pecera donde se encontraba el lote de mantenimiento y dos veces a la semana en las peceras con lotes reproductivos.
21
4.4. ESTABLECIMIENTO DE LOS CRITERIOS DE SELECCIN PARA LOTES REPRODUCTIVOS Como criterio de seleccin de los organismos experimentales se estableci que: 1.- Los ejemplares Danio rerio fueron adultos de aproximadamente 3 meses de edad. 2.- La seleccin de machos y hembras se realiz con base en el dimorfismo sexual de la especie. 3.- Se consider que todos los ejemplares de Danio rerio no presentaran alguna malformacin evidente y/o alguna evidencia de enfermedad. 4.5. NMERO DE INDIVIDUOS EN LOS LOTES REPRODUCTIVOS Los peces se colocaron en las peceras de reproduccin de cuatro litros de capacidad con una malla pequea, en una proporcin 3:2 macho - hembra respectivamente, con la finalidad de obtener suficiente nmero de huevos para someterlos a la etapa experimental (Figura 4). Cuando el nmero de huevos obtenidos con la proporcin 3:2 no fue suficiente, se realizaron cruzas masivas, utilizando una red de maternidad grande, colocada en una pecera de 70 litros de capacidad, con 50 hembras y 70 machos, para obtener el mayor nmero de huevos posibles.
22
Fig. 4. Pecera de reproduccin, de Danio rerio con red de maternidad
4.6. CALIBRACIN DEL NMERO DE OVOPOSICIONES
Se determin el nmero promedio de ovoposiciones (huevos) por lote reproductivo y as mismo calendarizando el tiempo en que una hembra puede seguir ovopositando. En la maana del da siguiente del desove se recolectaron los huevos del fondo de la pecera con un sifn. Posteriormente, los huevos se colocaron en cajas Petri, para ser analizados y determinar el nmero de huevos viables y el nmero de ovoposiciones de cada lote reproductivo, manteniendo la temperatura de los lotes reproductivos entre 27 C a 28 C, ya que es la temperatura idnea para el desove de los peces.
23
Posteriormente, se colocaron cien huevos de cada ovoposicin en peceras de 5 litros a temperatura, aireacin y luz ptima, para favorecer su desarrollo, evitando siempre el contacto de los adultos con los huevos para evitar conductas de canibalismo.
4.7. FRECUENCIA DE APARICIN DE MALFORMACIONES EN OPRCULO, ALETA Y COLUMNA VERTEBRAL Una vez determinadas las condiciones fsicas y qumicas de mantenimiento as como las de induccin de la conducta reproductiva, se estableci la frecuencia de dao teratognico inducido por agentes qumicos de referencia, como el Trixido de Cromo (CrO3) y Cloruro de Mercurio (HgCl2). Para ello, previamente, se disearon varios experimentos que permitieron establecer las concentraciones subtxicas a partir de la concentracin letal (=Cl50), la cual evala un dao teratognico sin que los efectos txicos lo oculten, partiendo de las concentraciones mximas permisibles por la norma oficial Mexicana NOM001 Ecol. 1996, para agua potable 0.001 ppm en HgCl2 y CrO3 0.05 ppm.
4.7.1| CURVAS DE TOXICIDAD: Para determinar la concentracin letal 50 (Cl50) del trixido de cromo y cloruro de mercurio se necesit iniciar calculndola en adultos, y a partir de sta, tomarla como referencia, para determinar en huevos recin ovopositados. Para ello, inicialmente se utilizaron 30 organismos adultos hembras por cada
24
concentracin elegidas al azar (0, 10, 100 y 1000 ppm), realizndose en cada caso tres repeticiones concurrentes. Dependiendo de los resultados obtenidos con las cuatro concentraciones antes mencionadas con base en el porcentaje de individuos sobrevivientes a las 24 h en organismos adultos, y de todo el desarrollo embrionario, se realizaron ms experimentos con concentraciones intermedias hasta determinar la Cl50 en cada caso y a partir de ella identificar dos dosis subtxicas (Cl25 y Cl12.5). Los adultos se colocaron en frascos de 1000 ml con boca ancha y se cubrieron con una malla alrededor del vaso sujeta con una liga para evitar que los peces brincaran debido al estrs ocasionado por la manipulacin; as mismo, se utiliz la liga para sujetar la manguera que adiciona oxgeno en cada vaso, estos se colocaron en bao mara para mantener la temperatura constante a 24 + 2 C por medio de un calentador de 10 watts (Figura 6). En el caso de los huevos, la nica variante, es que el recipiente utilizado fue de 60 ml por cada tratamiento y se dej hasta la eclosin.
Fig. 5. Proceso experimental de HgCl2 en bao mara con calentador y oxgeno adecuado
25
4.8. SELECCIN DEL MEJOR BIOMARCADOR CON BASE EN LA EVALUACIN DE DAO TERATOGNICO INDUCIDO Despus de determinar las concentraciones subtxicas a las que se puede exponer los huevos de Danio rerio para evaluar el dao teratognico, sin que la toxicidad del compuesto encubra dichos efectos; se procedi a tratar entre 180 a 200 huevos crnicamente durante todo su desarrollo embrionario con trixido de cromo a las concentraciones letales de 50, 25 y 12.5 respectivamente, en lotes de 30 huevos por frasco para evitar contaminacin por protozoarios, con las condiciones fsicas y qumicas antes mencionadas. Despus de la eclosin se evalu en los embriones las malformaciones en columna vertebral, oprculo y aleta, seleccionando al mejor biomarcador con base en:
Frecuencia de huevos ovopositados (fertilidad). Frecuencia de huevos eclosionados (Viabilidad del embrin). Duracin de la eclosin. Nmero y tipo de malformaciones evidentes al momento de la eclosin (Frecuencia de dao y variabilidad de expresin).
Facilidad de registro y evaluacin de las malformaciones.
Y se colocaron en peceras para su posterior desarrollo, hasta la etapa juvenil para determinar:
26
Frecuencia de alevines que llegan a la etapa juvenil (Viabilidad de alevn).
Nmero y tipo de malformaciones evidentes hasta la etapa juvenil (tardas).
Facilidad de registro y evaluacin de las malformaciones
4.9. ANLISIS ESTADSTICOS Los datos obtenidos en la elaboracin de cada experimento se sometieron a un anlisis estadstico, utilizando las pruebas recomendadas bibliogrficamente: a) Prueba de Kruskall-Wallis: sta prueba estadstica es la alternativa no paramtrica del mtodo ANOVA, que permite determinar, si existe diferencia significativa entre alguno de los tratamientos, mediante las siguientes hiptesis (Ronal y Myers, 1999): Hiptesis nula (Ho): control = 0.1Cl12.5 = 0.2 = 0.3 Cl25 = 04 = 0.5Cl50 = 0.6 = 0.7 = 0.8. Todas las concentraciones son iguales al control. Hiptesis alternativa (Ha): control 0.1Cl12.5 0.2 0.3Cl25 04 0.5Cl50 0.6 0.7 0.8. Al menos una de las concentraciones es distinta al control, existiendo diferencias significativas. b) Prueba de Dunnett: Esta segunda prueba se llev a cabo cuando el anlisis estadstico de Kruskall-Wallis result positivo, es decir, si existen diferencias significativas entre los tratamientos.
27
Siendo una prueba estadstica de comparacin mltiple, la cual sirve para determinar que tratamientos o concentraciones son significativamente
diferentes con respecto al control (Canavos, 1988 y Ronal y col. 1999). c) Prueba de t de student: Es un anlisis para variables cuantitativas y se sustenta en datos de medias y varianzas de dos conjuntos de datos, que permiten determinar, si existe diferencia significativa entre el nmero de huevos ovopositados a diferentes temperaturas, mediante las siguientes hiptesis (Sokal y Rohlf, 1999): Hiptesis nula (Ho): Experimental = control. El nmero de huevos ovopositados no varia con respecto al control, independientemente de que se cambie la temperatura. Hiptesis alternativa (Ha): Experimental control. El nmero de huevos ovopositados vara con respecto al control, cuando se cambia la temperatura.
28
Resultados
5. RESULTADOS 5.1. CONDICIONES FSICAS Y QUMICAS Una vez culminada la etapa de desinfeccin, se aplicaron los criterios de inclusin mencionados en la metodologa; encontrndose que estos permiten una salud ptima de los organismos experimentales y de reproduccin; existiendo una restriccin del 50 % del uso de azul de metileno, debido a que tiende a acumularse en el abdomen de los alevines, provocando su muerte. En cuanto a las variables fsicas y qumicas utilizadas en los lotes de mantenimiento y reproduccin, es importante resaltar que aunque existe una gran variedad de estudios realizados con Danio rerio, marcando un parmetro de temperatura de 24 a 28 C, ste solo es aplicable a los organismos adultos en las peceras de mantenimiento; en cuanto a las peceras de reproduccin la temperatura se tuvo que modificar de acuerdo a su desarrollo de vida, es decir, los organismos se mantuvieron a 28 C debido a que se logr inducir una mayor ovoposicin por lote reproductivo; as mismo, los huevos requieren de igual temperatura durante todo su desarrollo embrionario para facilitar la eclosin. Finalmente los alevines se encontraron expuestos entre 26 a 28 C para una mayor viabilidad. Por lo tanto, si la temperatura excede de los 28 C existe una mayor proliferacin de micro algas, evaporacin y formacin de protozoarios, por otro lado, si disminuye de 24C se presenta un letargo en el desarrollo de los peces (Tabla 3).
29
Resultados
Tabla 3. Temperatura ptima establecida experimentalmente por etapa de desarrollo de Danio rerio ETAPA DEL PEZ CEBRA Adultos hembras y machos (lote de mantenimiento) Adultos hembras y machos (lote de mantenimiento) Huevos Alevines CRITERIOS DE SELECCIN Viabilidad (100%) % de ovoposicin (100%) % eclosin (80%) Viabilidad (50%) TEMPERATURA ADECUADA 24C a 28C 28C 28C 26C a 28C
En las condiciones fsicas y qumicas de luz solar y pH, se encontr que al colocar a las peceras de manera directa con la primera condicin se fomentaba la evaporacin del agua, y, por lo tanto, la generacin de sales en los bordes de las peceras alterando condiciones como el pH, el cual favoreca la proliferacin de micro algas y protozoarios, principalmente en los meses de marzo, mayo y septiembre. Con base en la bibliografa, el pH recomendado es en condicin neutra, sin embargo en el presente trabajo, se encontr que es una condicin difcil de mantener debido a que los desechos orgnicos aumenta el pH entre 7.5 y 8, condicin que aparentemente no afect la ovoposicin y el desarrollo de los organismos; lo anterior es posible siempre y cuando, las peceras se laven cada tercer da, eliminando el 50 % del volumen de agua y llenndolas con agua en reposo. Si ste proceso no se lleva a cabo, el pH se incrementa hasta intervalos cercanos a 10 por lo que se recomienda realizar estudios posteriores que
Resultados
indiquen claramente los efectos del pH en el porcentaje de ovoposiciones, as como la viabilidad de huevos y alevines. En cuanto al flujo de corrientes de aire, se pudo observar que stas favorecen la contaminacin por polvos y partculas; as mismo, la evaporacin. La ltima variable considerada, es el espacio tanto dentro de la pecera como fuera de ella; en el primer caso, se considera como un equilibrio entre el volumen del agua y el nmero de organismos; en donde se encontr prcticamente que la sobrevivencia y desarrollo de los organismos, se favoreca teniendo una proporcin de 10 peces por cada litro de agua, debido a que se observ que los organismos no se desarrollaban satisfactoriamente y sufran un letargo en su desarrollo si el nmero de peces era mayor (Tabla 4). Tabla 4. Datos dentro de la pecera con tiempo de duracin del desarrollo embrionario de Danio rerio
CAPACIDAD DE LA PECERA 70 litros 4 litros 4 litros NMERO DE ORGANISMOS 250 peces machos y hembras juveniles 60 peces machos y hembras alevines 100 huevos TIEMPO DE CRECIMIENTO 5 meses 3 meses 7 das TIEMPO DE CRECIMIENTO NORMAL 3 meses 1 mes 3 das
Con base a la prctica y a lo antes mencionado, se recomienda para una mejor manipulacin; establecer como mnimo: un espacio de un metro lineal y colocar dos peceras de 4 litros o bien una de 70 litros de capacidad.
31
Resultados
Como se muestra en la tabla 5, en el momento de establecer cada una de las condiciones fsico qumicas antes mencionadas, se obtuvo un porcentaje muy alto de mortandad de adultos y alevines, una vez establecida cada condicin, las cifras de viabilidad cambiaron satisfactoriamente a un 90 %. Tabla 5. Resultados de viabilidad y mortandad de Danio rerio
PECERAS
TOTAL DE HUEVOS (Equivalencia 100%)
VIABILIDAD ALEVINES TOTAL EQUIV. % 2.00% 0.63% 3.63% 0.00% 0.00% 41 10 42 0 0 27 44 19 0 0 ADULTOS TOTAL EQUIV. % 1.32% 2.79% 1.64% 0.00% 0.00%
MORTANDAD TOTAL 1982 1521 1096 101 0 EQUIV. % 96.68% 96.57% 94.73% 100.00% 0.00%
A B C D E
2050 1575 1157 101 154
32
Resultados
5.2.
ESTABLECIMIENTO DEL LOTE EXPERIMENTAL Como se mencion en la metodologa, para el montaje de cada una de
las etapas de mantenimiento, reproduccin, tratamiento y desarrollo de alevines; se necesit de un conjunto mnimo de peceras denominadas Lote experimental (Figura 6), el cual, fue funcional en el presente proyecto, como se postul inicialmente, pero con base en la experiencia, se requiere de al menos una pecera por cada ovoposicin para realizar observaciones a lo largo de su desarrollo, y as poder detectar alteraciones que no sean evidentes en el momento de la eclosin.
Fig. 6. Lote experimental con peceras de mantenimiento, reproduccin y con agua en reposo
33
Resultados
5.3. INDUCCIN DE OVOPOSICIN Y DETERMINACIN DE TAMAOS DE MUESTRAS EXPERIMENTALES El criterio de seleccin preestablecido, de tres machos y dos hembras por lote reproductivo fue satisfactorio, debido a que se obtuvo un buen nmero de ovoposiciones por lote reproductivo (100 a 200 huevos cada tercer da). As mismo, con base en la experiencia adquirida de montaje de maternidades durante la realizacin del presente trabajo, se encontr que las ovoposiciones mejoraban cuando se colocaban a los organismos adultos hembras y machos en las redes de maternidad un da antes del experimento, agregando unas gotas de azul de metileno y sales marinas, debido a que se aumenta la conductividad, se favorece que el agua tenga una menor proporcin de aniones y cationes. En cuanto a la sobrevivencia de los huevos, se detect a travs de la frecuencia de eclosin, que sta se favoreca cuando los huevos eran sifoneados a un cristalizador, inmediatamente despus de la ovoposicin en un intervalo no mayor de 3 h; periodo en que se eliminan los huevos no viables que se presentan en cada ovoposicin de manera natural; as mismo, el exceso de comida y heces, provoc la proliferacin biolgica de hongos y protozoarios (Figura 7).
34
Resultados
a)
b)
c)
Fig. 7. (a) Huevo contaminado por hongo y (b c) huevo contaminado por alimento Independientemente del aseo peridico de las peceras, tambin se observ que a temperaturas mayores de 28 C, se registr una alta proliferacin de protozoarios, los cuales penetraron el corion y se comieron al embrin de Danio rerio, afectando significativamente el porcentaje de huevos viables (Figura 8).
Fig. 8. Embrin con proliferacin de protozoarios
35
Resultados
La ovoposicin es un factor importante que cabe mencionar, puede influir en el nmero de huevos obtenidos por cada lote reproductivo, debido a que se observ que existe una estrecha relacin entre huevos ovopositados y nmero de ovoposiciones, por eso es recomendable que, los peces en etapa reproductiva se cambien por otros adultos en un trmino de cada 15 das para obtener mejores desoves (Tabla 6). Tabla 6. Huevos de Danio rerio obtenidos por lote reproductivo NMERO DE OVOPOSICIONES 1 2 3 4 ovoposicin ovoposicin ovoposicin ovoposicin HUEVOS OVOPOSITADOS X + 1S 212 + 10 185 + 6 151 + 14 88 + 24
Como se observa en la tabla 7, tambin se registr, que la temperatura es un factor que contribuye a la formacin de la ovopocicin variaba durante el periodo de ovoposicin, el nmero de huevos se modific estadsticamente, lo cual indic despus de ser sometidos los datos a un prueba de t student para aceptar la hiptesis alternativa (ha): donde al menos una de las temperaturas es diferente al control, es decir, a una mayor temperatura mayor ovoposicin.
36
Resultados
Tabla 7. Ovoposiciones de Danio rerio con base en la temperatura TEMPERATURA ( C) (-) 24 (-) 25 (-) 6 (+) 27 28 (Control) HUEVOS OVOPOSITADOS X + 1S 43 + 17 43 + 17 99 + 13 218 + 3 226 + 2
(+) = positivo, (-) = negativo. Prueba estadstica de t student (Prueba estadstica de una cola)
5.4. ESTABLECIMIENTO DE CURVAS DE TOXICIDAD Como parte de los resultados de este trabajo, se obtuvieron tres curvas de toxicidad: la concentracin letal 50 del trixido de cromo en adultos y huevos, por otro lado, no se realiz la curva de toxicidad en adultos debido a que solo se necesitaba la concentracin letal en huevos. 1.- Trixido de cromo CrO3 En la figura 9, se observa que la concentracin letal 50 se encontr en 235 ppm de CrO3 en organismos adultos.
120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 10 ppm 100 ppm 125 ppm 200 ppm 235 ppm 250 ppm 500 1000 ppm ppm
% Mortandad
Concentracin
Figura 9. Curva de toxicidad con trixido de cromo (CrO3) en adultos de pez cebra
37
Resultados
Por lo tanto, el parmetro para obtener las dosis subtxicas con CrO3 en huevos, fue la concentracin letal 50 en adultos (235 ppm), a partir de la cual, se utiliz como la concentracin ms alta para determinar la concentracin letal 50 en huevos siendo 50 ppm (Figura 10).
Figura 10. Concentracin letal 50 de trixido de cromo en huevos de Danio rerio 2.- Cloruro de mercurio HgCl2 Como se puede observar en la figura 11, se determin que la concentracin letal 50 de cloruro de mercurio (HgCl2) se registr a una concentracin de 0.5 ppm en huevos.
% Mortandad
80% 60% 40% 20% 0%
pp m 0, 3
1p p
pp m
0, 0
0, 1
Concentracin
Figura 11. Concentracin letal 50 de cloruro de mercurio en huevos de Danio rerio
0, 5
pp m
38
Resultados
5.5. EVALUACIN DEL EFECTO TERATOGNICO 1.- Trixido de cromo CrO3 Partiendo de la concentracin letal 50 (50 ppm) en huevos, se procedi a montar los lotes experimentales con tres dosis subtxicas 12.5, 25 y 50 ppm, correspondientes a las concentraciones letales 12.5, 25 y 50 respectivamente, como se mencion en el procedimiento experimental, cada tratamiento se llev hasta completar 180 huevos por concentracin y un control. Al no registrarse ninguna malformacin inducida por el trixido de cromo, se puede deducir que ste es inocuo para este bioensayo, para las concentraciones de 12.5, 25 y 50 ppm en la induccin de dao teratognico. Cabe mencionar que a concentraciones mayores a 50 ppm, se registr un efecto letal, el cual encubre cualquier otro efecto secundario que pudiera manifestarse. 2.- Cloruro de mercurio HgCl2 Al igual que con el compuesto anterior, se parti de la concentracin letal 50 (50 ppm) determinada en huevos con CrO3 para establecer la concentracin letal 50 (0.5 ppm) con HgCl2, posteriormente se procedi a montar los lotes experimentales con tres dosis subtxicas 0.1, 0.3 y 0.5 ppm, correspondientes a las concentraciones letales 12.5, 25 y 50 respectivamente. Como se mencion en el procedimiento experimental, cada tratamiento se llev hasta completar 180 huevos por concentracin y un control, las cuales presentaron una gama de malformaciones en columna vertebral al igual que, en todas las concentraciones evaluadas desde la curva de toxicidad (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y
39
Resultados
1 ppm), siendo estadsticamente significativa la induccin de stas, lo que lleva a aceptar la hiptesis alternativa (Ha), despus de realizar la prueba de Kruskall-Wallis, comprobndose que al menos a las concentraciones evaluadas con cloruro de mercurio (HgCl2) es capaz de inducir un efecto teratgeno a nivel del desarrollo de la columna vertebral. El registro positivo de sta prueba, se realiz la prueba de Dunnett, obteniendo como resultado que slo las malformaciones mltiples, espiral y aleta caudal no presentan diferencia significativa con respecto al control (Tabla 8). Por otro lado, no se registr en stas concentraciones y con este tamao de muestra, ninguna malformacin en oprculo ni aletas, lo que no excluye algn efecto teratgeno por ste compuesto.
40
Resultados
Tabla 8. Malformaciones presentes en Danio rerio por concentracin de HgCl2

No. De peces utilizado s por ( ) MALFORMACIONES EN COLUMNA VERTEBRAL Senc . (#) y % (20) 11.1 1%(+ ) (8) 4.4 % (-) (12) 6.6 % (+) (2) 1.1 % (-) (6) 3.3 % (-) (3) 1.6 % (-) (2) 1.1 % (-) (3) 1.6 % (-) 0% (i) Dob. (#) y % 0% (i) Mult. (#) y % 0% (i) Curv . (#) y % (9) 5% (+) (12) 6.6 % (+) (10) 5.5 % (+) (3) 1.6 % (-) (6) 33.3 % (-) (3) 1.6 % (-) 0% (-) (2) 1.1% (-) 0% (-) Espiral (#) y % Aleta Caudal (#) y % (1) 0.5 % (-) 0% (-) Ganch o (#) y % (12) 16.6 % (+) 0% (-) Alteracin de Pigmento (#) y % (6) 3.3 % (+) 0% (-) Malf. en Sist. seo (#) y % (13) 7.2 % (+) (3) 1.6 % (-) (7) 3.8 % (-) (8) 4.4 % (-) (6) 3.3 % (-) (15) 8.3 % (+) (7) 3.8 % (-) (4) 2.2 % (-) 0% (-)
[ ] en ppm.
0.1 Cl12.5
180
(1) 0.5 % (-) 0% (-)
0.2
180
(3) 1.6 % (+) 0% (i)
0% (-)
0.3 Cl25
180
0% (-)
0% (-)
(4) 2.2 % (-) (2) 1.1 % (-) (3) 1.6 % (-) 0% (-) 0% (-) (3) 1.6 % (-) 0% (-)
(15) 1.5 % (+) (2) 1.1 % (-) (3) 1.6 % (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-)
0% (-)
0.4
180
0% (i) 0% (i) 0% (i) 0% (i) 0% (i) 0% (i)
(2) 1.1 % (-) (2) 1.1 % (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-)
0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-)
0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-) 0% (-)
0.5 Cl50
180
0.6
180
0.7
180
0.8 control
180 180
Prueba de Dunnett: (+) = positivo, (-) = negativo, (i)= Indeterminado Nivel de probabilidad: alfa = beta = 0.05 Senc.= sencilla, dob.=doble, mult.=mltiple y curv.= curva
Para llevar a cabo una mejor identificacin de las malformaciones presentes en el pez cebra, se realiz una divisin imaginaria del cuerpo en tres zonas: ceflica, zona media de la columna vertebral y caudal. La zona ceflica comprende el inicio de la cabeza hasta el final de la mxima prolongacin del vitelo, la zona media de la columna vertebral empieza desde el vitelo reducido,
Resultados
hasta un tercio de la columna y la zona caudal se localiza en la cuarta parte de la columna hasta el final de la aleta caudal (Figura 12).
ZONA CEFLICA
ZONA MEDIA DE LA COLUMNA VERTEBRAL
ZONA CAUDAL
Fig.12. Divisin de malformaciones por zonas del cuerpo de Danio rerio El registro de las malformaciones no se present igual, su expresin vario de dos formas: dorsal o lateral; as mismo, las malformaciones fueron tenues o pronunciadas, donde la primera fue poco evidente menos de 45 y la segunda se identific con mayor facilidad debido a que present un ngulo mayor de 46. Por otro lado, la frecuencia de aparicin de cada malformacin se clasific en baja, media y alta frecuencia, de acuerdo a su porcentaje de aparicin (Tabla 9). Tabla 9. Parmetro de frecuencias de malformaciones en Danio rerio FRECUENCIA FRECUENCIA BAJA FRECUENCIA MEDIA FRECUENCIA ALTA PORCENTAJE APARICIN 1 a 20 % 21 a 50 % 51 a 100 % DE
42
Resultados
En cuanto a la diversidad de malformaciones en columna vertebral registradas, se clasificaron bajo los siguientes criterios: La malformacin sencilla (Senc.), es aquella que present un solo doblez en la zona ceflica, zona caudal del pez y/o zona media de la columna vertebral, ya sea lateral o dorsal, existiendo una malformacin tenue y/o muy pronunciada, con una frecuencia de aparicin alta (Figura 13).
(a)
(b)
Fig. 13. (a) Malformacin sencilla, en la zona ceflica en forma lateral, (b) Posicin normal de la columna con respecto a la cabeza en Danio rerio
Malformacin doble (Dob.), es aquella que present dos dobleces, uno en la zona media de la columna vertebral y otro en la zona caudal del pez. Puede ser lateral o dorsal, existiendo al igual que en el anterior, una variabilidad de tenues a pronunciadas, con una frecuencia de aparicin baja (Figura 14).
43
Resultados
(a)
(b) Fig. 14. (a) Posicin normal de la columna vertebral en Danio rerio, (b) Malformacin doble en la zona media de la columna vertebral y en la zona caudal Malformacin mltiple (Mult.), es aquella que present tres o ms dobleces en la zona ceflica, zona caudal y zona media de la columna vertebral, puede ser lateral, dorsal, tenue o pronunciada, con una frecuencia baja (Figura 15).
(a)
(b)
Fig. 15. (a) Posicin normal de la columna vertebral en Danio rerio, (b) Malformacin en zona ceflica lateral y zona caudal dorsal
44
Resultados
Malformacin curva (Curv.), como su nombre lo dice, present una curvatura en la zona ceflica, zona caudal del pez o zona media de la columna vertebral. Puede ser lateral, relativamente frecuente en comparacin de las anteriores y provoca que los alevines naden en crculo, presentndose con una frecuencia de aparicin media (Figura 16).
(a)
(b)
Fig. 16. (a) Malformaciones curvas en la zona media de la columna vertebral (b) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal
Malformacin en espiral como su nombre lo indica, se presenta a lo largo de la zona caudal, en forma espiral, se registr en baja frecuencia con respecto a la malformacin doble y sta malformacin es poco viable (Figura 17).
45
Resultados
(a)
(b) Fig. 17. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal, (b) Malformacin en zona caudal en espiral Malformacin en aleta caudal del pez cebra, consiste en un pequeo doblez en la zona caudal, con una baja frecuencia de aparicin (Figura 18).
(a)
(b)
Fig. 18. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal, (b) Malformaciones en zona caudal muy pronunciada
46
Resultados
Malformacin en gancho sta malformacin se puede observar en la zona media de la columna vertebral o bien, en la zona caudal, presentando una frecuencia de aparicin media (Figura 19).
(a)
(b)
(c)
Fig. 19. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal, (b-c) Malformaciones en gancho en la zona media de la columna vertebral y en la zona caudal Otra de las alteraciones registradas en biomarcadores no propuestos o considerados, como parte de ste estudio es la ausencia de melanocitos (pigmentacin) (Figura 20), donde sta alteracin se present en una baja frecuencia de aparicin, otra de las alteraciones registradas fue en el sistema
Resultados
seo llamado enanismo, con una frecuencia alta de aparicin (Figura 21), el cual sta asociado con un efecto letal para cada ejemplar que present ste tipo de malformacin.
Fig. 20. Ausencia de melanocitos en peces de Danio rerio con enanismo
(a)
(b)
Fig. 21. (a) Columna vertebral de Danio rerio en posicin normal, (b) Malformaciones en el sistema seo
48
Resultados
5.6. MALFORMACIONES ESPONTNEAS Independientemente que la seleccin de los tres biomarcadores antes mencionados (columna vertebral, oprculo y aleta) se registraron,
malformaciones espontneas que aparecieron durante el desarrollo del presente trabajo con los mismos criterios, sustentado en la hiptesis de que cualquiera de las malformaciones que se presente en nuestro organismo experimental pueden ser sujetas a evaluarse para determinar su sensibilidad como biomarcador para la calidad ambiental. Debido a esto, dentro de los lotes de mantenimiento del pez cebra, previos a la exposicin de HgCl2, se pudo observar un dao espontneo en las siguientes estructuras de su cuerpo: oprculo (Figura 22), ausencia de
mandbula (Figura 23) y dao en la columna vertebral (Figura 24); sta ltima, se present con un grado muy ligero de alteracin, poco evidente, en el patrn de pigmentacin de las bandas laterales de los ejemplares.
(a)
(b)
Fig. 22. (a) Posicin normal del oprculo en Danio rerio, (b) Ausencia de oprculo
49
Resultados
(a) (b) Ausencia de la misma
(b)
Fig. 23. (a) Posicin normal de la mandbula del Danio rerio,
(a)
(b)
Fig. 24. (a) Patrn normal con bandas longitudinales de Danio rerio, (b) patrn anormal de bandas longitudinales Bajo los criterios de exclusin, estos ejemplares fueron eliminados y no contemplados para la etapa experimental, debido a que la frecuencia de aparicin de estas malformaciones fue muy baja. En caso de que se hubiera obtenido una frecuencia alta de malformaciones espontneas previas al experimento, se eliminara por completo el lote adquirido. Esto permiti asumir que las malformaciones pueden estar asociadas a una endogamia o bien a que estos embriones fueron ovopositados por padres viejos (ms de un ao de vida).
50
Discusin
6. DISCUSIN
El objetivo del presente trabajo, fue determinar la frecuencia de malformaciones en columna vertebral, oprculo y aleta de Danio rerio, como posibles biomarcadores en la valoracin de dao teratognico por
contaminantes ambientales. Ello implica un constante monitoreo de condiciones fsicas y qumicas del agua para mantener las condiciones favorables de sobrevivencia y reproduccin. La temperatura es un factor determinante en el desarrollo y viabilidad del pez. sta fue modificada experimentalmente de acuerdo a cada etapa de vida, en un intervalo de 24 a 28 C, es decir, los peces de mantenimiento adultos hembras y machos se mantuvieron bajo ese intervalo, de acuerdo a Gonzlez (2005), mientras que los peces en etapa reproductiva se mantuvieron a 28 C para tener una mayor ovoposicin y los alevines a una temperatura de 26 a 28 C El pez cebra es un bioensayo que ofrece varias ventajas sobre otros organismos. Por ejemplo: es un organismo acutico, el huevo presenta una permeabilidad selectiva, cuenta con biomarcadores fciles de evaluar y se puede inducir las ovoposiciones, entre otras (Weinberg, 1992; Kimmel y col., 1995 y Galicia y col., 1998). Para evaluar dao teratognico durante cualquier etapa del desarrollo embrionario, el cual se utiliza recientemente para apoyar estudios de ecotoxicologa en donde el uso de ste organismo ha evolucionado, en varias
Discusin
metodologas utilizando diversos biomarcadores como son ojo, corazn, columna vertebral y cabeza entre otros, que, en conjunto, han permitido culminar recientemente en el proceso de validacin de la prueba denominada Danio rerio Taratology Assay (DarTa), la cual evala el dao teratognico inducido en embriones de pez cebra (Dietrich y col., 1998, Oberemm, 2000 y Nagel, 2002). Se utilizaron dos teratgenos de referencia trixido de cromo y cloruro de mercurio, el primero de ellos no present sensibilidad alguna, el segundo fue capaz de inducir malformaciones en columna vertebral y no en aleta y oprculo del pez cebra. Por lo tanto, dentro de los biomarcadores evaluados, la columna tuvo una mayor frecuencia, estadsticamente significativa, adems de que present varias ventajas de anlisis, registro y diversidad con respecto a los otros dos biomarcadores. Entre las ventajas ms sobresalientes para utilizar a la columna vertebral como el mejor biomarcador destacan las siguientes: Permite evaluar malformaciones presentes en estadios previos y posteriores a la eclosin del desarrollo embrionario (Galicia y col., 1998). De los tres biomarcadores propuestos slo en la columna vertebral se lograron realizar observaciones en el desarrollo embrionario gracias a que el corion tiene una cubierta delgada y transparente, hasta que se lleve a cabo el proceso de eclosin (Galicia y col., 1998).
52
Discusin
Permite evaluar una gran diversidad de malformaciones, analizando mecanismos de accin de los agentes qumicos que se exponen del organismo.
En las tres concentraciones subtxicas 0.1, 0.3 y 0.5 ppm de cloruro de mercurio, se encontr malformaciones de siete formas diferentes en la columna vertebral, con alta frecuencia de aparicin. Esto permiti un registro eficiente, sin embargo, en los biomarcadores propuestos oprculo y aleta no se logr inducir a travs del compuesto cloruro de mercurio alguna malformacin, solo fueron evidentes de manera espontnea en el lote de mantenimiento. Estas estructuras son de difcil anlisis debido a que en el oprculo solo se puede realizar observaciones despus de 4 semanas y en cuanto a las aletas son translucidas y no se distingue claramente. Por lo anterior, se sugiere utilizar una variable del pez cebra llamado cola de velo, en experimentos posteriores para, ver si con este biomarcador es ms fcil expresar alguna malformacin. En el caso de la aleta y oprculo, el anlisis debe esperar hasta una etapa juvenil, debido a que existe mortandad natural en los alevines recin eclosionados que llegan a la etapa juvenil, lo que implica tener que aumentar el tamao de muestra, aunado esto, a su baja frecuencia de expresin y a su difcil identificacin. Por otra parte, en ste trabajo se evaluaron alevines recin eclosionados, mientras que en otros trabajos tales como el de Dietrich y col., (1998) se han empleado embriones no descorionizados.
53
Discusin
Las ventajas de utilizar alevines recin eclosionados permite describir puntualmente las malformaciones presentes de columna vertebral debido a que es la estructura que primero se identifica y es ms fcil de evaluar, en comparacin con la aleta y el oprculo, debido a que dichas estructuras se podran evaluar solo hasta una etapa juvenil, lo que da una ventaja considerable a la columna vertebrar con respecto al tiempo para realizar una evaluacin biolgica de las alteraciones provocadas por el teratgeno utilizado, permitirn de la misma forma profundizar en los diferentes mecanismos de accin de agentes xenobiticos.
54
Conclusin
7. CONCLUSIN
En este trabajo, se dio el establecimiento de las condiciones fsicas y qumicas por cada una de las etapas del desarrollo embrionario para el mantenimiento y su reproduccin de las fases experimentales. Otro de los alcances del presente trabajo es que Danio rerio presenta ventajas para evaluar dao toxicolgico en un organismo no mamfero. En cuanto a la evaluacin de los tres biomarcadores elegidos, la columna vertebral es sensible al cloruro de mercurio a dosis subtxicas manifestndose una gran diversidad de malformaciones y diferentes frecuencias de expresin. Las ventajas presentes en la evaluacin de malformaciones en columna vertebral de organismos recin eclosionados, en comparacin, con estudios previos en organismos no eclosionados es evidente, dando apertura al desarrollo de trabajos posteriores, permitiendo tambin, tener mayor
sensibilidad debido a que se pueden evaluar de est forma malformaciones pequeas, mltiples y con ms diversidad. Se requiere continuar validando el bioensayo y los biomarcadores propuestos, as como otros no contemplados, con distintos teratgenos de referencia, para encontrar un mejor biomarcador que sea sensible a diferentes compuestos qumicos, que sea fcil de identificar y de evaluar, y que refleje mecanismos de accin de los agentes contaminantes y, por lo tanto, de la calidad ambiental.
55
Conclusin
Utilizar el Danio rerio como un buen indicador trae diversas ventajas debido a que: evala sistemas acuticos, sus estructuras pueden ser utilizadas como biomarcadores y al organismo como un bioensayo, su mantenimiento es sumamente econmico; as mismo, presenta una descendencia abundante, ovoposiciones inducibles y por lo tanto se pueden programar o calendarizar cada ovoposicin. Los huevos son manipulables, transparentes y
semipermeables, esto ltimo permite que no exista manipulacin al aplicar un compuesto.
56
Glosario
8. GLOSARIO
ABSORCIN: Es cuando una sustancia xenobintica atraviesa las membranas biolgicas dependiendo de su concentracin, de sus propiedades fsicas y qumicas de la sustancia. Por ejemplo la solubilidad, el tamao de la partcula, si son o no ionizadas y las eficiencias de los mecanismos de absorcin, metabolismo y excrecin, pueden variar de un organismo a otro y afectar el proceso de absorcin (Vega, 1985a). ACUMULACIN: Sucesivas retenciones de una sustancia por un organismo, un rgano o parte del ambiente, que conducen a un aumento de la cantidad o la concentracin de la sustancia en los mismos (Vega, 1985b). AGENTES EXGENOS: Que resulta o procede de materiales externos al organismo (Vettorazzi, 1992b). BIOACUMULACIN: Aumento progresivo de la cantidad de una sustancia de un organismo, o parte de l como consecuencia de que el ritmo de absorcin supera la capacidad del organismo para eliminar la sustancia (Hughes, 1996). BIODISPONIBILIDAD: Capacidad de un agente xenobitico de
interactuar con el sistema biolgico (Vega, 1985a). BIOENSAYO: Son indicadores biolgicos que pueden ser desde virus hasta cultivo de tejidos humanos, que en condiciones controladas (in vivo e in
57
Glosario
vitro) permiten correlacionar el efecto del agente fsico y/o qumico a nivel biolgico (Markert y col., 1995). BIOINDICADORES: Son organismos los cuales son el reflejo fiel del medio en el que crecen, y se desarrollan siendo indicadores de la calidad o de las caractersticas del medio, estos nos proporcionan informacin de tipo cualitativo (Markert y col., 1995). BIOMARCADORES: Es cualquier alteracin biolgica que puede ser medible en tejidos, clulas, o fluidos corporales. Estas alteraciones pueden ser usadas como indicadores de exposicin ambiental que reflejan los efectos adversos tempranos tales como dao celular (Guzmn, 1997). BIOMONITORES: Son organismos que se utilizan como sistemas de alerta entre cambios ambientales generados por la presencia de diversos compuestos txicos de origen natural o antropognico, a concentraciones mayores a las normales, estos nos proporcionan informacin de manera cuantitativa de la calidad ambiental y de su efecto biolgico (Markert y col., 1995).
BIOTRANSFORMACIN: Cualquier transformacin qumica de una sustancia en el interior de un organismo a travs de un proceso biolgico (Vega, 1985b).
58
Glosario
BLSTULA: Perodo del desarrollo embrionario consecutivo a la segmentacin del huevo constituido por el blastodermo que rodea una cavidad central (Kimmel y col., 1995). CALIDAD AMBIENTAL: Es el estado actual o previsible de algn componente bsico, que permite al ambiente desempee adecuadamente (Vega, 1985a). CARCINGENO: Agente qumico, fsico o biolgico relacionado con el origen y la incidencia de neoplasias malignas (Klug y Commings, 1998).
CIGOTO: Huevo fecundado originado por la unin de dos gametos con fusin de sus ncleos, hasta el momento de pasar a la forma de blastocisto y su implantacin en el tero (Kimmel y col., 1995). CINTICA AMBIENTAL: Es la movilidad, dispersin e interaccin de un contaminante con los elementos del ambiente (Vega, 1985a). CL50: Es la concentracin a la cual el 50% de la poblacin de organismos ensayados produce una respuesta en un perodo definido de tiempo, generalmente 12, 24 96 horas (Vega, 1985c). CONTAMINACIN: Se define como la presencia en el ambiente de cualquier agente qumico, fsico y/o biolgico o de una combinacin de varios agentes, en lugares, formas y concentraciones tales que sean o puedan ser nocivos para la salud y seguridad de sistemas biolgicos (Gonzlez, 1998).
59
Glosario
DarTa: Prueba que utiliza los huevos fertilizados del pez cebra (Brachydanio rerio) para detectar efectos nocivos por sustancias xenobiticas (Nagel, 2002). DESARROLLO EMBRIONARIO: Proceso de desarrollo de un embrin desde el estado de cigoto (Hoillon, 1977). DISPERSIN: Es la capacidad de distribucin de un contaminante en el ambiente (Vega, 1885a). DISTRIBUCIN: Fase de una sustancia que es absorbida por un organismo, rgano o el ambiente; que va desde la absorcin o introduccin al sistema hasta alcanzar el equilibrio de concentraciones; si se produce almacenamiento puede ocurrir una redistribucin antes de la eliminacin (Vega, 1985b). DOSIS SUBTXICAS: Son todas las concentraciones menores al valor de Cl 50, las cuales van a causar un efecto nocivo (Vega, 1985c). ECLOSIN: nacimiento del alevn del saco (Kimmel y col., 1995). ECOTOXICOLOGA: Rama de la toxicologa que trata del estudio de qumicos persistentes que pueden ejercer varios efectos txicos en varios sitios de un ecosistema (Silano, 1985).
60
Glosario
EFECTO
AMBIENTAL:
Una
consecuencia
medible
sobre
algn
componente bsico del ambiente, provocada o inducida por cualquier accin del hombre (Ferncola, 1992a). EFECTO: Es el cambio biolgico producido por la exposicin a un factor externo, qumico, fsico o biolgico (Vega, 1985c). EMBRIN: Producto de la concepcin, desde el momento de la implantacin del vulo fertilizado hasta el final de la semana sptima u octava en que pasa a denominarse feto (Kimmel y col., 1995). ESTADO: Se le llama as a cada una de las etapas marcadas que se observan en un proceso de desarrollo embrionario de los organismos (Kimmel y col., 1995). EVALUACIN AMBIENTAL: Es la actividad sistemtica, continua o repetitiva, relacionada con la medicin de agentes contaminantes en el ambiente, a fin de evaluar la exposicin y el riesgo que representan para la salud cuando se compara con una referencia apropiada (Ferncola, 1992a). EVALUACIN BIOLGICA: Es la medida y evaluacin de los agentes qumicos y/o de sus productos de biotransformacin, en tejidos, secreciones, excreciones, aire exhalado o alguna combinacin de stos; para estimar la exposicin o riesgo a la salud cuando son comparados con alguna referencia apropiada (Ferncola, 1992a).
61
Glosario
EVALUACIN DE RIESGO: Uso de datos obtenidos de hechos reales, para definir los efectos sobre la salud en la exposicin de individuos o poblaciones a sustancias o situaciones peligrosas (Ferncola, 1992b). EXCRECIN: Es el proceso de eliminacin del producto original y/o de sus metabolitos del cuerpo, mediante vas urinarias, sudoracin, lagrimeo, leche materna e intestinal (Vega, 1985a).
EXPOSICIN: Situacin en la cual una sustancia puede incidir, por cualquier va, sobre una poblacin, organismo, rgano, tejido o clula; usualmente se expresa en trminos de cuantitativos de concentracin, duracin y frecuencia (para a agentes qumicos y microbiolgicos) y de intensidad (para a gentes fsicos) (Vega, 1985b). EXPOSICIN AGUDA: Es aquella que se produce por la administracin de cantidades elevadas de un agente qumico en una o varias exposiciones, en un periodo de 24 horas, produciendo un efecto nocivo inmediato (Vega, 1985 b). EXPOSICIN CRNICA: Es aquella que se produce por la
administracin de pequeas cantidades de un agente qumico durante periodos largos, pudiendo aparecer efectos nocivos inmediatamente despus de cada aplicacin o efectos crnicos (Vega, 1985b).
62
Glosario
FARNGULA: Etapa del desarrollo embrionario que se caracteriza por la formacin del aparato digestivo (Kimmel y col., 1995). FARMACOCINTICA: es la ciencia que estudia el paso de los frmacos a travs del cuerpo, mide la velocidad del paso del frmaco dentro de un organismo as como la reaccin que tiene el organismo bajo los frmacos (Brailowsky, 1995). FECUNDACIN: Fusin de los ncleos de dos gametos para formar un cigoto diploide (Kimmel y col., 1995). FOTOPERIODO: Ciclo da-noche de luz y oscuridad. Sumamente necesario para conservar psquicamente saludable e un animal en cautiverio (Kimmel y col., 1995). GASTRULA: Forma de embrin primitivo formado por la invaginacin de la blstula y se compone de una capa externa de ectodermo y una interna de mesodermo, que ms adelante se diferencia en el mesodermo y el endodermo y dos cavidades, una entre las dos capas y otra formada por una invaginacin del endodermo (arquentern) que comunica con el exterior por una abertura (blastoporo) (Kimmel y col., 1995). HENDIDURA: Etapa intermedia de la blstula y gstrula, se caracteriza por migracin celular del polo animal hacia los lados del huevo, adelgazndose
63
Glosario
ligeramente en la parte central y ensanchndose hacia los lados (Kimmel y col., 1995). IMPACTO BIOLGICO: Es una forma de medicin del efecto de un agente xenobitico a nivel biolgico (Vega, 1985a). INOCUIDAD: Caracterstica de una sustancia o compuesto de no producir dao o efecto alguno en los sistemas biolgicos (Vega, 1985c). in vitro: Estudio de laboratorio realizado sobre clulas, tejidos, u rganos aislados o con sistemas subcelulares o bioqumicos (enzimas) (Hughes, 1996). in vivo: Estudio de laboratorio realizado en organismos vivos (Hughes, 1996). MALFORMACIONES CONGNITAS: Es una anomala en la estructura, funcionamiento o metabolismo presente desde el nacimiento que provoca una discapacidad fsica o mental, o incluso la muerte en algunos casos (Klug y Commings, 1998). MERCURIO: (Hg) Es un elemento qumico, con nmero atmico 80 y peso atmico 200.59, puede encontrarse en una diversidad de minerales y en una gran variedad de estados fsicos y qumicos (Pea y Subarzo, 1975). METALES PESADOS: Son metales que tienen una densidad mayor a 5, y estn conformados por un grupo de 40 elementos qumicos (Vega, 1985c).
64
Glosario
MONITOREO AMBIENTAL: La recoleccin, el anlisis y la evaluacin sistemtica de muestras ambientales, tales como aire, agua o alimentos, en busca de contaminantes (Lewtas, 2000). MUTGENO: Capacidad de un agente biolgico, qumico o fsico para inducir cambios heredables (mutaciones) (Klug y Commings, 1998). TERATOGNESIS: Proceso a travs del cual se forman alteraciones fisiolgicas, conductuales y anomalas estructurales graves durante el desarrollo fetal; ya sea de manera espontnea o inducida por agentes xenobiticos (Klug y Commings, 1998). OVOPSICIN: En peces corresponde a la expulsin de las ovas (huevos) por parte de la hembra (kimmel y col., 1995). SEGMENTACIN: Etapa del desarrollo embrionario que se caracteriza por la formacin media del cuerpo de un organismo durante el desarrollo embrionario (Kimmel y col., 1995). TERATGENO: Cualquier sustancia qumica, agente fsico, o agente infeccioso que actuando durante el periodo embrionario o fetal es capaz de producir una alteracin (Hughes, 1996). TERATOLOGA: Ciencia que estudia cualquier dao gentico,
morfolgico o fisiolgico que ocurra durante el desarrollo embrionario ya sea de manera espontnea o inducida por teratgenos (Hughes, 1996).
65
Glosario
TOXICIDAD: Capacidad inherente de un agente xenobitico de producir un efecto nocivo sobre los organismos (Ferncola, 1992c). TOXICOCINTICA: Es el estudio de los cambios que ocurren a travs del tiempo en la absorcin, distribucin y eliminacin de toda sustancia txica en el organismo (Vega, 1885b). TOXODINMICA: Es el estudio de la salud de un organismo causado por un txico, correlacionado con su toxicocintica (Hughes, 1996). VALORACIN TOXICOLGICA: Es la determinacin del potencial toxico de una sustancia xenobitica (Vettorazzi, 1992a). XENOBITICO: Sustancia que no aparece naturalmente en el organismo, o est a diferentes concentraciones de lo normal (Vettorazzi, 1992 b).
66
Bibliografa
9. BIBLIOGRAFA
Aqua Gua, (2004) Danios y Brachydanios. Ed. Antrtica. Mxico. Dir. Gral. Ral Tawil Abadi Dir. C. Editorial M.V.Z. Carlos Ortiz Guzmn. 24 pp. Bez-Ramrez, O. A., y F. Prieto-Garca. (2005). Genotoxic damage in zabra fish (Danio rerio) by arsenic in waters from Zimapn, Hidalgo, Mxico. Mutagenesis 20:291-295. Bez-Ramrez, O. A., y F. Prieto-Garca, y C. A. Galn-Vidal. (2004). Bioacumulacin y Dao genotxico en pez cebra (Danio rerio) por arsnico en aguas de Zimapn, Hidalgo (Mxico). Enzayos en cortos plazos. AquaTIC 21:62-70 Brailowsky, S. (1995). Las sustancias de los sueos:
Neuropsicofarmacologa. Ed. Omega. Mxico, D. F. 280 pp. Butterwort, F. (1995). Biomonitor and Biomarkers as Indicators of Enviromental Change. Plenum Prees. New York. 313 pp. Canavos, G. (1988). Probabilidad y estadstica. Ed. Mc. Graw Hill. Mxico. 651 pp. Canter, L. (1986). Environmental Health Impact Assessment. Mxico: PAHO/WHO. 345 pp. Cant, M. (2000). Toxicologa. Revista Salud Pblica y Nutricin (FASPYN). Monterrey, Nuevo Len. Mxico. 1 (2): 1-8
67
Bibliografa
De la Lanza, E. G., Hernndez, P. S. y Carvajal, P. L. (2000). Organismos Indicadores de la Calidad del Agua y de la Contaminacin (Bioindicadores) Ed. Secretaria de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca. SEMARNAP. p. 915 Dietrich, D., Prietz, A. y Kiamos, M. (1998). Danio rerio embryotoxicity and teratogenicity assay (DRETA) for detecting waterborne embryo-toxicants and teratogens. Toxicologist 42: 259-260. Ferncola, G. (1992a). Evaluacin de Riesgo. Centro Panamericano de Ecologa Humana y Salud, Organizacin Panamericana de la Salud. Metepec, Mxico. p. 23-30. Ferncola, G. (1992b). Evaluacin Biolgica de la Exposicin Humana en: Toxicologa Prospectiva y Seguridad Qumica: Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Qumicas (PISSQ/PNUMA-OIT-OMS). Reyes, F. y A. Waldemar. Ed. ECO. Mxico. p. 23-34 Ferncola, G. (1992c) Nociones Bsicas de Toxicologa. Centro
Panamericano de Ecologa Humana y Salud, Organizacin Panamericana de la Salud. Metepec, Mxico. 113 pp. Figueroa G. y Pinzn, N. S. (2000). Evaluacin de la calidad del agua utilizando macroinvertebrados bnticos en la zona de Atlixco, Puebla. Tesis profesional para obtener el titulo de licenciatura en Biologa, especialidad en ecologa. Universidad de las Amricas, Puebla. Escuela de Ciencias, departamento de qumica y biologa. Mxico. 122 pp. Froese, R. y Paulv,.D. (2006) FishBase. Word wide web electronic publication. www.fishbase.org.version (02/2006).
68
Bibliografa
Galicia, L., Gaytn J. C., Prez M. E., Olvera H. Y Ramos, P. (1998). Avances de la calibracin para evaluar el dao teratognico por contaminantes ambientales en pez cebra (Brachydanio rerio). III Congreso Nacional Estudiantil de Toxicologa Gentica. Toluca Edo. Mxico. 3-6 Mayo. Res. 28 pp. Galvo, C. y Corey, G. (1987) Serie vigilancia 7: Mercurio. Centro Panamericano de Ecologa Humana y salud. Metepec, Mxico. 79 pp. Gonzlez, A. J. (1998) Los efectos biolgicos de las dosis bajas de radiacin ionizante. Edicin N 15 Marzo. Ed. Seguridad Radiolgica, Madrid. 364 pp. Gonzlez, L. L. (2005). Evaluacin del efecto del cloruro de mercurio (HgCl2) en la induccin de malformaciones de columna vertebral del pez cebra (Danio rerio; Hamilton 1822) durante diferentes etapas del desarrollo embrionario. Tesis de licenciatura en Biologa. Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo. Mxico. Gong, Z., H. Wan, T. L. Tay, H. Wang, M. Chen, y T. Yan. (2003). Development of transgenic fish for ornamental and bioreactor by strong expression of fluorescent proteins in the skeletal muscle. Biochemical and Biophysical Research Communications 308:58-63. Guzmn, D. (1997). Evaluacin de la frecuencia de microncleos en clulas epiteliales como prueba para detectar exposicin crnica al arsnico. Tesis profesional para obtener el Grado de Maestra (Biologa). UNAM. Mxico. 227 pp.
69
Bibliografa
Hoillon, C. (1977). Embriologa. Ed. Omega. Barcelona. 184 pp. Holdgate, M. W. (1979). A perspective of environmental pollution. UK: Cambridge University Press. 214 pp. Hughes, W. (1996). Essentials of Environmental Toxicology; The Effects of Environmentally Hazardous Substances on Human Health. Ed. Taylor & Francis. California, EUA. 176 pp. Kimmel, C. B., Balla, W.W., Kimmel, S. R., Ullmann, B. y Schilling, T. S. (1995). Stage of embryonic develomental of the zebrafish. Develomental Dynamics. 203:253-310. Klug, W. y Cummings, M. (1998). Conceptos de Gentica. Ed. Prentice Hall. Espaa. 814 pp. Lewtas, J. (2000). Environmental Monitoring Using Genetic Bioassays. in: Genetic Toxicology. Ed, CRC. Florida, EUA. p. 359 374. Markert, B., Ochlmann, J. y Roth, M. (1995). General Aspects of Heavy Metal Monitoring by Plants and Animals en: Environmental Biomonitoring: Exposure Assessment and Specimen Banking. Subramanian, K y G. Iyengar. Ed. American Chemical Society. Washington. EUA. p. 19-29. Nagel, R. (2002). DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio general model in ecotoxicology and toxicology. Altex 19:38-48. Nom(1996). Norma Oficial Mexicana Nom-001. ECOL. Calidad de agua. Limites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilizacin. Publicado en el Diario Oficial de la Federacin el lunes 6 de enero de 1996.
70
Bibliografa
Oberemm, A. (2000). The use of a refined zebrafish embryo biossay for the assessment of aquatic toxicity. Lab Animal. 29 (7):32-40. Odum, E. P. (1995). Ecologa: El vinculo entre las ciencias naturales y las sociales. Ed. CECSA. Mxico. 295 pp. Pea, P. y Subarzo, P. (1975). La contaminacin por mercurio. Tesis profesional. Mxico, Facultad de Ciencias, UNAM. 94 pp. Pea, E. C., Carter, E. y Ayala-Fierro, A. (2001). Toxicologa ambiental: evaluacin del riesgo y restauracin ambiental. The University of Arizona, Center For Toxicology. Superfound. 37 pp. Ronal, W. y Myers R. (1999). Probabilidad y estadstica para ingenieros. Ed. Prentice Hill, Hispanoamericana S. A. Mxico. 739 pp. Silano, V. (1985). Evaluacin de riesgo para la salud pblica asociados con accidentes causados por agentes qumicos; Centro Panamericano de Ecologa Humana y Salud ECO/OPS, Mxico, 120 pp. Sokal, R. y Rohlf, J. (1999). Introduccin a la bioestadstica. Ed. Revert S. A. Espaa. 362 pp. Sohn, J. (1994). Tropical Fish Hobbgist: Development of the fish embryo. Vol. XLll, p.70-75 Trimbell, J. (1989). Introduction to toxicology. Taylor & Francis Inc. p. 94110.
71
Bibliografa
Vega, S. G. (1985a). Toxicologa 111: Aspectos especficos de la toxicologa de algunos contaminantes. Ed. Centro panamericano de ecologa humana y salud. Mxico. 198 pp. Vega, S. G. (1985b). Toxicologa VI: Evaluacin del riesgo en la exposicin a sustancias txicas en: Evaluacin Epidemiolgica de Riesgos Causados por Agentes Qumicos Ambientales. Ed. Centro panamericano de ecologa humana y salud. Mxico. 18 pp. Vega, S. G. (1985c). Toxicologa V: Genotoxicidad y dao al sistema reproductor. Ed. Centro panamericano de ecologa humana y salud. Mxico. 47 pp.
Vega, S. G. (1985d). Toxicologa l: Cintica y efectos de los contaminantes txicos del ambiente. Ed. ECO. Mxico, D.F. 133 pp. Vera, G., Tam, J., Vera, V. y Pinto, E. (2001). Pruebas ecotoxicologcas con cadmio y cromo usando postlarvas del pejerrey Odontesthes (Austromenidia) regia regia Hildebrand. Facultad de Ciencia Biolgicas UNMSM. 8(2):1-9 Vettorazzi, G. (1992a). Toxicologa Prospectiva: base lgica, manera de abordar y aplicaciones prcticas en: Toxicologa Prospectiva y Seguridad Qumica: Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Qumicas (PISSQ/PNUMA-OIT-OMS). Reyes, F. y A. Waldemar. Ed. ECO. Mxico. p. 9-21 Vettorazzi, G. (1992b). Xenobiotic substances harmonization of toxicological conclusions. en: Toxicologa Prospectiva y Seguridad Qumica: Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Qumicas (PISSQ/PNUMAOIT-OMS). Reyes, F. y Waldemar, A. Ed. ECO. Mxico. p. 97-105
72
Bibliografa
Weinberg, E. S. (1992). Analysis of early development in the zebra fish embryo. Results. Prob. Cell. Dif. 18:91-150 Westerfield, M. (1995). El libro de zebrafish: Una gua para el uso del laboratorio del rerio de Danio del zebrafish (Brachydanio). Instituto de la neurologa. Universidad de Oregon.
73

Pez+Cebra+Expuesto+a+Xenobioticos Desbloqueado

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Pez+Cebra+Expuesto+a+Xenobioticos Desbloqueado

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:

Dr. JUAN CARLOS GAYTN OYARZN M. en C. ESTELA PREZ CRUZ

PACHUCA DE SOTO, HIDALGO JUNIO 2006

Gracias a todas las personas que creyeron en m.

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

3.2. OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar dao congnitas ms

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

pH CORRIENTES DE AIRE INSTALACIONES ESPACIO

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Fig. 4. Pecera de reproduccin, de Danio rerio con red de maternidad

4.6. CALIBRACIN DEL NMERO DE OVOPOSICIONES

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Facilidad de registro y evaluacin de las malformaciones.

Ingrid Vania Rivera Castillo

Frecuencia de alevines que llegan a la etapa juvenil (Viabilidad de alevn).

Nmero y tipo de malformaciones evidentes hasta la etapa juvenil (tardas).

Facilidad de registro y evaluacin de las malformaciones

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

TOTAL DE HUEVOS (Equivalencia 100%)

2050 1575 1157 101 154

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Fig. 8. Embrin con proliferacin de protozoarios

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

80% 60% 40% 20% 0%

Figura 11. Concentracin letal 50 de cloruro de mercurio en huevos de Danio rerio

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo

Ingrid Vania Rivera Castillo