Introduo PALESTRA a microscopia eletrnica.

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INTRODUO A MICROSCOPIA ELETRNICA

Silvia Regina Galleti Instituto Biolgico Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal E-mail: galleti@biologico.sp.gov.br O desenvolvimento e aperfeioamento da microscopia eletrnica est intimamente associado ao progresso alcanado pela Biologia, nos ltimos 100 anos. O microscpio eletrnico possibilitou a observao direta de aspectos ultraestruturais das clulas at ento desconhecidos. Como resultado dessas novas observaes, nossa compreenso sobre a organizao dos tecidos vegetais e animais foi enormemente ampliada, e muitas das nossas idias a respeito da construo e funo celulares foram radicalmente alteradas. Tipos de Microscpios Cada tipo de microscpio e cada tcnica de preparao de material para exame oferece vantagens especficas na demonstrao de certos elementos morfolgicos. Os microscpios pertencem, basicamente, a duas categorias: luminoso (ML) e eletrnico (ME). As diferenas esto na radiao utilizada e na maneira como ela refratada. A microscopia de luz utiliza-se da radiao de ondas luminosas, sendo esta refratada atravs de lentes de vidro. O campo microscpico (ou a rea observada) aparece brilhantemente iluminado e os objetos estudados se apresentam mais escuros. Geralmente, os microscpios desse tipo produzem um aumento til de, aproximadamente, 1.000 X. Na microscopia eletrnica a radiao empregada a de feixe de eltrons, sendo ele refratado por meio de lentes eletrnicas. O microscpio eletrnico produz aumentos teis de 200.000 a 400.000X, sendo seu poder resolvente cerca de 100 vezes maior que o do microscpio de luz. A melhoria do poder resolvente do microscpio eletrnico est diretamente relacionada ao curto comprimento de onda apresentado pelos raios eletrnicos utilizados para ampliar o espcimen e a uma maior abertura numrica obtida em funo da diminuio da distncia focal. Em termos bsicos, classificamos o microscpio eletrnico em dois tipos: de transmisso e de varredura. Princpios da microscopia eletrnica Poder resolvente (ou poder de resoluo) Ao empregar um microscpio em um estudo, tem-se como objetivo visualizar mais detalhes do que podemos com a vista desarmada. A ampliao que as lentes nos proporcionam apenas um meio para chegar a esse objetivo, e no ter valor se a imagem produzida no fim no contiver mais detalhes do que podemos ver ou resolver sem o auxlio do microscpio. A limitao bsica no uma questo de aumento, mas de poder resolvente, ou seja, a capacidade de distinguir, distinta e separadamente, dois pontos adjacentes. O poder resolvente de um microscpio funo do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numrica, que uma caracterstica do sistema de lentes. Comprimento de onda Um objeto torna-se visvel ao microscpio como resultado de sua interao com as ondas de luz usadas para ilumin-lo. Essa interao ocasiona um desvio das ondas quando estas passam pelo objeto. Objetos muito pequenos no ocasionaro quaisquer desvios detectveis nas ondas e, portanto, permanecero invisveis (ou no resolvidos). Quanto menor o comprimento de onda da luz, menor ser o objeto que poder ocasionar desvios das ondas e, portanto, melhor ser o poder resolvente do microscpio. Isto significa que a natureza da luz limita a quantidade de detalhes que pode ser resolvida em um microscpio. Abertura numrica O ngulo formado pelo eixo ptico e os raios mais externos ainda cobertos pela objetiva a medida da abertura numrica. O valor da abertura numrica est diretamente relacionada com o ndice de refrao do meio por onda a radiao projetada. Assim, o mximo de abertura numrica para a objetiva a seco menos do que 1, e as objetivas de imerso tm uma abertura numrica ligeiramente maior, na faixa de 1,2 a 1,4. O comprimento de onda da luz utilizada nos microscpios de luz , tambm, limitado; a luz visvel varia entre 400 e 700 nm. O limite de resoluo, isto , o menor objeto que pode ser distintamente visualizado, obtido com o menor comprimento de onda da luz visvel e com objetiva de maior abertura numrica. Portanto, o melhor poder resolvente conseguido com o microscpio de luz de 0,2 mm a abertura numrica no pode ser aumentada, e mesmo usando luz visvel de comprimento de onda mnimo (cerca de 0,45 mm), o poder resolvente no melhora significativamente. A nica maneira de melhorar o poder resolvente consiste em se reduzir o comprimento de

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onda da radiao. Para isso, se fez necessrio desenvolver equipamentos que empreguem outra forma de radiao, e aqui que o desenvolvimento do microscpio eletrnico comea. Componentes do microscpio eletrnico Propriedades ondulatrias dos eltrons Em condies apropriadas, os eltrons apresentam propriedades ondulatrias, que, assim como a luz visvel, encontram-se associados a um comprimento de onda, cujo valor de, aproximadamente, 0,005 nm. Desta forma tem-se uma melhoria correspondente no poder resolvente. A comparao deste valor com o comprimento de onda da luz visvel (0,5 m ou 500 nm) mostra que um feixe eletrnico cerca de 100.000 vezes menor. Considerando apenas este fator, teramos um aumento correspondente no poder resolvente. Porm, o poder resolvente efetivamente conseguido ser discutido aps considerarmos os outros componentes do microscpio eletrnico. Canho eletrnico Canho eletrnico a fonte de iluminao do microscpio eletrnico e consiste de um pequeno fragmento de fio em forma de V. Uma alta voltagem aplicada nesse filamento, fazendo com que uma corrente flua atravs dele e o incandesa, emitindo eltrons. A propriedade de emitir eltrons por aquecimento comum a todos os metais e chama-se emisso termoinica. O comprimento de onda dos eltrons est diretamente relacionado a voltagem aplicada sobre o filamento. Quanto maior for a voltagem menor ser o comprimento de onda dos eltrons, favorecendo o poder resolvente. Lentes eletrnicas Um campo magntico radialmente simtrico como aquele formado por um enrolamento de fio eltrico atravs do qual passa uma corrente atuar como uma lente que pode ser usada para focalizar um feixe eletrnico. Na prtica, a lente eletrnica consiste basicamente de uma bobina, formada por milhares de voltas de fio, atravs da qual passa uma corrente. Microscpio eletrnico de transmisso Esse tipo de microscpio comumente chamado de microscpio eletrnico direto ou de transmisso (MET) pelo fato da imagem do espcimen ser formada simultaneamente passagem do feixe de luz atravs dele. O emprego do MET bastante difundido no estudo de materiais biolgicos, pois ele permite definio de imagens intracelulares, permitindo estudos de morfologia celular, aspectos gerais das organelas e

tambm da interao de parasitas com as clulas, fornecendo informaes sobre alteraes e efeitos citopatticos ocasionados por vrus, fitoplasmas, micoplasmas, bactrias e outros organismos diminutos, de impossvel visualizao na microscopia de luz. Composio A construo do MET robusta, a fim de garantir estabilidade mecnica e evitar perturbaes por vibraes do edifcio. As bobinas das lentes, atravs das quais passam correntes, tenderiam a aquecer-se e, portanto so usualmente resfriadas por gua que circula a sua volta. Isso conseguido com uma unidade de refrigerao de gua interligada ao MET. Nossos olhos no so sensveis a eltrons, por isso a imagem final projetada sobre um anteparo de observao, que recoberto com um material que fluoresce quando irradiado com eltrons, ou sobre uma placa fotogrfica, se pretendemos registrar a imagem de forma permanente. Na prtica, o intervalo de aumentos do MET varia de 1.000 a cerca de 200.000X. As lentes eletrnicas, assim como as lentes de vidro, apresentam defeitos. Esses defeitos interferem no poder resolvente do microscpio eletrnico. A soluo adotada para minimizar esse problema reside em se trabalhar apenas com a poro central da lente, e isso se consegue construindo nela uma abertura de pequeno dimetro. Outro fator que impede que se atinja o poder resolvente terico a estabilidade mecnica do MET. Devido ao fato de se atingir um poder resolvente na ordem de nanmetros, qualquer oscilao em escala semelhante ir interferir no resultado final. Portanto, o poder resolvente obtido na prtica depende essencialmente da qualidade do projeto e construo do ME, da natureza do espcimen, e ainda do cuidado e experincia do operador. Os melhores resultados obtidos para amostras biolgicas situa-se na faixa de 1 nm. Comparando-se com o poder resolvente do microscpio de luz, temos uma melhoria de cerca de 200 vezes. Microscpio eletrnico de varredura No microscpio eletrnico de varredura (MEV) um feixe de eltrons extremamente estreito usado para varrer o espcimen isto , ele movido para diante e para trs enquanto passa atravs do espcimen. O feixe tem vrios efeitos sobre o espcimen, dos quais o principal para nossa finalidade que ele faz com que o prprio espcimen emita eltrons. A imagem construda em sequncia, no tempo, medida que o espcimen varrido. Os MEV apareceram no mercado, pela primeira vez, em 1965, e desde ento se tm revelado indispensveis em muitos tipos de pesquisa biolgica, contribuindo para a classificao e taxonomia de insetos e fungos, estudo da morfologia

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de plens e em pesquisas de superfcies de diversas estruturas de plantas e animais. Composio Os principais componentes do MEV assemelham-se queles do MET. A coluna, com o canho eletrnico e a srie de lentes eletrnicas, e o sistema de alto vcuo, so similares nos dois tipos de equipamentos. Um conjunto de bobinas defletoras faz com que o feixe varra o espcimen. Assim, a imagem montada ponto a ponto, linha por linha, do mesmo modo que a imagem no visor de televiso. A imagem pode ser observada diretamente, ou fotografada. O MEV tem uma srie de aspectos extremamente valiosos. Ele pode ser operado em uma escala ampla de aumentos, desde 10X at 100.000X. Seu alcance assim se estende desde aquele da lupa manual at o de um MET. O MEV tem grande profundidade de foco. Como consequncia, a topografia superficial de objetos slidos pode ser examinada com grande facilidade, e as micrografias tm aspecto tridimensional. A resoluo obtida com o MEV depende de uma srie de fatores. O dimetro da sonda do feixe eletrnico varrendo o espcimen o mais importante de todos, mas a natureza do espcimen e a interao deste com o feixe tambm so influentes, bem como a velocidade de varredura e o nmero de linhas na imagem. Na prtica, uma resoluo de cerca de 10 nm pode ser conseguida sob condies favorveis.

MEV x MET O MET um instrumento admirvel para estudar os detalhes mais finos de uma estrutura celular, ou a organizao molecular de vrus ou constituintes subcelulares. O preo de conseguir alta resoluo, entretanto, que o instrumento complexo, os espcimens devem ser extremamente finos e difcil obter informao sobre estruturas em trs dimenses. O MEV, por outro lado, ideal para estudar a topografia de superfcie de objetos slidos, mas fornece pouca, ou nenhuma informao sobre a estrutura interna. Seu poder separador no se iguala ao do microscpio de transmisso, embora seja adequado para muitos propsitos. Deve-se sempre ter em mente o objetivo da pesquisa que est desenvolvendo, pois, ele que indicar qual equipamento dever ser empregado para se atingir os resultados desejados.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BOZZOLA , J.J. & RU S S E L L , L.D. Electron microscopy. Boston: Jones and Bartlett Publishers, 1999. 670p. GRIMSTONE , A.V. O microscpio eletrnico em biologia . So Paulo: E.P.U./EDUSP, 1980. 70p. ME E K , G.A. Practical electron microscopy for biologists. New York: John Wiley and Sons, 1976. 528p.

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