PROTOCOLO

BIOQUMICA E METABOLISMO
ANO LECTIVO 2012/13

ATIVIDADE DA CATALASE
Durao Sala 2 horas 26.2.10 06-11 06-11 07-11 07-11 07-11 07-11 13-11 13-11 14-11 14-11 14-11 14:00 -16:00 16:00-18:00 13:00- 15:00 09:00-11:00 11:00-13:00 13:00-15:00 14:00-16:00 16:00-18:00 18:00-20:00 9:00 -11:00 11:00-13:00 P7 P8 P6 P1 P3 P5 P9 P10 P2 P4 P6

Horrio

DOCENTE
Virglia Sofia Silva vsilva@ua.pt

INTRODUO
A catalase (EC 1.11.1.6; 2H2O2 oxidoredutase) uma enzima antioxidante ubqua que est presente na maioria das clulas aerbias. A catalase (CAT) est envolvida na remoo do perxido de hidrognio (H2O2), um tipo de oxignio reactivo (ROS), que um produto txico do metabolismo aerbio. Esta enzima catalisa a converso de duas molculas de H 2O2 em oxignio molecular e duas molculas de gua (actividade cataltica). A CAT tambm evidencia actividade de peroxidao, onde alcois de baixo peso molecular funcionam como dadores de electres, produzindo gua e formaldedo de baixo peso molecular, que oxida o Purpald (4-Amino-3-hydrazina-5-mercapto-1,2,4-triazole).
Actividade cataltica: Actividade de peroxidao: Reaco do ensaio: 2H2O2 -------Catalase-----------> O2 + 2H2O H2O2 + AH2 ---------Catalase-------> A + 2H2O

H2O2 +CH3OH (metanol) ----Catalase---> CH2O (formaldedo) + 2H2O

Este mtodo baseado na reaco da enzima com o metanol na presena de uma concentrao optimizada de H2O2. O formaldedo produzido determinado espectrotofometricamente com o Purpald como cromgeneo. Para obter um composto corado, o produto da reaco entre o formaldedo e o purpald oxidado pelo periodato de potssio. Na forma oxidada o Purpald passa de incolor a prpura. A absorvncia pode ser lida a 540 nm.

OBJECTIVOS
Determinar a actividade da catalase da batata.

MATERIAL E REAGENTES
Tampo Fosfato 100 mM; pH=7,0 Tampo de amostra: fosfato de potssio 25 mM; EDTA 1mM; BSA 0,1% (1 mg.ml-1); pH=7,0 Formaldedo 4,25 mM Catalase 40 mg/ml KOH 10M Purpald 34,2 mM Periodato de Potssio 65,2 mM

Metanol H2O2 35,28 mM Diluir 40 l de H2O2 (30%) em 9,96 ml de dH2O. Estvel durante 2 horas.

PROCEDIMENTO
Preparao de catalase de batata 1. 100 g batata descascada 2. Adicionar 50 ml de dH2O gelada e 50 ml de gelo 3. Triturar durante 60 seg. a 4C 4. Filtrar (passar por 4 pedaos de gase) 5. Centrifugar 1.300xg durante 10 min. a 4C 6. Recolher o sobrenadante 7. Guardar no escuro a 4C
NOTA: A catalase mantm-se activa apenas durante algumas horas, aps o isolamento.

Determinao da actividade da CAT 1. Preparao dos padres:

Juntar o formaldedo 4,25 mM e o tampo de amostra em cada tubo de acordo com a Tabela I.

Tabela I Tubo A B C D E F G Tampo de amostra (l) 1000 990 970 940 910 880 850 Padro de Formaldedo 4,25 mM (l) 0 10 30 60 90 120 150 [Formaldedo]final (M) 0 5 15 30 45 60 75

2. Adicionar 250 l tampo fosfato 100 mM, 75 l de metanol e 50 l de padro (dos tubos A a G) aos tubos P1 a P7. 3. Adicionar 250 l tampo fosfato 100 mM, 75 l de metanol e 50 l de CAT (diluda para 0,2 mg/ml) ao tubo CP (controlo positivo). 4. Adicionar 250 l tampo fosfato 100 mM, 75 l de metanol e 50 l de amostra (diluda 100x) a cada um dos tubos A1; A2; A3. 5. Iniciar as reaces, adicionando 50 l H2O2 diludo (40 l de H2O2 30% em 9,96 ml de dH2O). 3

Nota: Anotar a hora exacta da incio da reaco e adicionar a todos os tubos o H2O2 o mais rapidamente possvel.

6. Incubar durante 20 min. temperatura ambiente num agitador. 7. Adicionar 75 l de hidrxido de potssio 10 M, para terminar a reaco. 8. Adicionar 75 l de Purpald. 9. Incubar durante 10 min. temperatura ambiente num agitador. 10. Adicionar 25 l de periodato de potssio 65,2 mM a cada tubo. 11. Incubar durante 5 min. temperatura ambiente num agitador. Ver tabela II. Tabela II
Tampo fosfato 100 mM Metanol Padro A a G CAT diluda Amostra diluda H2O2 diludo Hidrxido de Potssio 10 M Purpald Periodato de potssio 65,2 mM Tubos P1 a P7 250 l 75 l 50 l 50 l 75 l 75 l 25 l Tubo CP 250 l 75 l 50 l 50 l 75 l 75 l 25 l Tubos A1 a A3 250 l 75 l 50 l 50 l 75 l 75 l 25 l

Incubar 20 min temperatura ambiente

Incubar 10 min temperatura ambiente Incubar 5 min temperatura ambiente

12. Ler a absorvncia a 540 nm.

ANLISE DE RESULTADOS
1. Calcule a concentrao de formaldedo das amostras. 2. Calcule a actividade da catalase nas amostras.

BIBLIOGRAFIA BASE
Quintas A.; Freire A.P. & Halpern M.J. Bioqumica Organizao molecular da vida. Lidel, Lisboa, 2008.

Lista de reagentes
BSA (A-7906 Sigma p 105; 10 g) Formaldedo (37%) (F-1635 Sigma p 860; 500 ml) Purpald (P-3021 Sigma p 144; 5 g) Catalase (C-9322 Sigma p 391 ; 1 g) Metanol (M-3641 Sigma p 1308; 500 ml) Periodato de Potssio (P-0517 Sigma p 1695; 100 g) H2O2 (30%) (H-1009 Sigma p 1057; 100 ml) EDTANa2 Na2HPO4 KH2PO4 KOH HCl

Preparao das Solues

I EDTA 100mM 10 ml Dissolver 0.37722(4)g de EDTA-Na2 em 10 ml de dH2O. II Solues para acertar o pH NaOH 1M 100ml Dissolver 4g de NaOH em 90 ml de dH2O. Perfazer o volume at 100 ml com dH2O. KOH 0.1N 100ml Dissolver 0.5611g de KOH em 90 ml de dH2O. Perfazer o volume at 100 ml com dH2O. HCl 0.1N 100ml Diluir 0,652 ml de HCl a 37% em dH2O. III Tampo Fosfato 100 mM; pH=7,0 200ml Dissolver 2,724 g de KH2PO4 em 190 ml de H2O. Ajustar o pH a 7,0 com NaOH 1M. Ajustar o volume a 200ml com dH2O.

IV Tampo de amostra (tampo fosfato 25 mM; EDTA 1mM; BSA 0,1% (1mg.ml-1); pH=7,0) 200ml Pipetar 50ml da soluo III,.adicionar 2 ml de EDTA (100 mM/sol.I) e 0,2 g de BSA. Ajustar o pH a 7.0 com NaOH 1M ou com HCl 0,1N. Ajustar o volume a 200ml com dH2O. V Formaldedo 4,25 M 10ml Diluir 3,165 ml de Formaldedo (37%, 30,03 FW, d=1090) em 6,835 ml de tampo fosfato 100 mM pH 7,0 (sol,III). Diluir na hora para a concentrao de 4,25 mM (10 l de formaldedo 4,25 M + 9,99 ml de tampo de amostra (sol,IV). VI Catalase (0,04 g/ml) 2,5 ml Dissolver 0,1 g de catalase em 2,5 ml de soluo tampo de amostra (sol,IV). Armazenar a -20C at um ms. Diluir na hora para a concentrao 4 g/ml (1 l de CAT + 10 ml de tampo de amostra (sol,IV). Nota: Verificar se o nmero de unidades entre 2000 a 5000 por mg de protena ou se 2 a 5 U/mg. VII Soluo de KOH 10M 10 ml Dissolver 5,611g de KOH em 9 ml de dH2O. Perfazer o volume at 10 ml com dH2O. VIII H2O2 (35,28 mM) 10 ml Diluir na hora 40 l de H2O2 (30%) em 9,96 ml de dH2O. Estvel durante 2 horas. IX Purpald 34,2 mM 100 ml Dissolver 0.4999g de Purpald em 100 ml de HCl 0,5 M. X - Periodato de Potssio 65.2 mM 50ml Dissolver 0,7498g de Periodato de Potssio em 50 ml de soluo de KOH 0,5M.