UNIVERSIDADE DE SO PAULO INSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA LABORATRIO DE ANAERBIOS

MTODOS DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS ANAERBIAS Prof. Dr. Mario Julio Avila-Campos Homepage: p g www.icb.usp.br/bmm/mariojac p j

ISOLAMENTO DE ANAERBIOS

9 Para que isolar anaerbios? - Conhecer os diferentes tipos microbianos - Informao microbiolgica g completa p e rpida - Identificao dos organismos - Susceptibilidade a antimicrobianos

Isolamento de Anaerbios - Espcimes a serem pesquisados - Leses associadas ao trato gastrointestinal ou genital feminino. - Septicemia. - Infeces crnicas do trato respiratrio superior (sinusites, otite mdia). - Leso supurativa (pneumonia). (pneumonia) do trato respiratrio inferior

- Meningites associadas com infeces crnicas do trato respiratrio superior (fluido crebro crebro-espinal) espinal). - Abscessos superficiais e profundos (cerebral). - Infeces dentais. dentais - Leses por queimaduras e mordidas.

DIFICULDADES NO ESTUDO DA MICROBIOTA ANAERBIA 9 Tcnicas de coleta, transporte e processamento 9 Volume do espcime 9 Diluente e homogeneizao do espcime 9 Meios seletivos e no seletivos, suplementados 9 Microbiota associada mucosa 9 Variaes da dieta, e variao dia a dia da amostragem 9 Interferncia de Antimicrobianos Antimicrobianos.

Indcios clnicos de infeco por anaerbios

Secreo de odor ptrido Infeco na proximidade de mucosa de revestimento. Tecido necrtico, gangrena, formao de pseudomembrana. Gs nos tecidos ou na secreo. Endocardites com hemocultura negativo. Infeces devidas ao uso de aminoglicosdeos Quadro de bacteremia com ictercia. Infeces aps mordidas humanas ou animais animais. Secreo escura e fluorescentes na UV Condies clnicas tais como aborto sptico, infeco aps cirurgia gastro-intestinal, etc.

Indcios bacteriolgicos de infeco por anaerbios Morfologia singular na colorao de Gram Nenhum crescimento em cultura rotineira Vestgio de crescimento em aerobiose Crescimento em 100 g/ml de canamicina ou neomicina, ou 7,5 g/ml de vancomicina. Cultura C com produo de gs e/ou / odor ptrido Colnias fluorescentes sob UV (P. melaninogenica, F. nucleatum

MTODOS DE COLETAS E TRANSPORTE DE ESPCIMES CLNICOS

sondagem

coleta

Coleta em ces com d doena periodontal i d t l

Coleta de leso periodontal

Coleta de polpa necrtica e tecido periimplantar.

Espcime clnico do duodeno

Espcimes p de ala intestinal

Mini-jarra Mini jarra (Tcnica do bombril com CuSO4)

Soluo Ringer-PRAS

Meio VMGA III

Coleta e transporte de espcimes clnicos

MTODOS DE OBTENO DE ANAEROBIOSE 1. SUBSTNCIAS REDUTORAS - Placas de Brewer - Jarras com catalizadores de H2 - Paladium (Gaspak) - Absoro pelo Pirogalol 2. CONSUMO BIOLGICO DO OXIGNIO LIVRE - Tcnica de Fortner 3. PROCESSO MECNICO DE MISTURA DE GASES - 90% N2 + 10% CO2; 5% H2 + 85% N2 + 10% CO2 4. ESTUFAS E CMARAS DE ANAEROBIOSE

Processo mecnico de obteno bt de d anaerobiose por mistura gasosa g (90% N2 /10% CO2)

Jarra de Anaerobiose

Cmara de Anaerobiose

Isolamento e Identificao

Esquema de isolamento e identificao

I S O L A M E N T O

E i Espcime Diluies Meio seletivo No seletivo

G Gram

Tioglicolato

Anaerobiose
Colnia caracterstica Meio no seletivo Cultura pura Teste respiratrio Estocagem Testes presuntivos
Bioqumica Susceptibilidade a antimicrobianos Imunolgicos Testes definitivos Biologia molecular: sondas, PCR... Cromatografia gasosa

Gram

C A R A C T E R I.

Gram

Isolamento e meios de cultivo

Prevotella Porphyromonas Meios seletivos Fusobacterium Bacteroides

gar sangue com canamicina

Omata-Disraely

BBE

Perodo de incubao Tempo de exposio ao ambiente

7-14 dias

3-5 dias

3-5 dias

1 hora

3 horas

72 horas

Identificao Bacteriana Presuntiva

Prevotella Porphyromonas Gram Testes presuntivos Fl Fluorescncia i Hidrlise amido e esculina SIM Fermentao de F d acares Kits comerciais Fermentao de acares Kits comerciais Fermentao de F d acares Kits comerciais Fusobacterium Bacteroides Gram Hidrlise esculina Produo de gs SIM

Gram Hid li esculina Hidrlise li SIM

Testes definitivos

Testes moleculares Testes moleculares Testes moleculares

TESTES PRESUNTIVOS
9 Colorao de Gram: morfologia celular 9 Morfologia colonial 9 Pigmentao natural ou luz UV

B. fragilis

F. nucleatum

C lt Cultura pura d de b bactrias t i produtoras d t de d pigmento i t negro

C. Perfringens : Dupla hemlise

C. difficile: CCFA - cicloserina, cefoxitina, frutose, g gar.

TESTES DEFINITIVOS
9 Aspectos bioqumicos e Fisiolgicos 9 Imunolgicos 9 Cromatografia gasosa 9 Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento 9 Susceptibilidade a drogas antimicrobianas

Sistema Mini-API 32-A (bi M i (bioMrieux) )

Cromatgrafo gasoso

CARACTERIZAO MICROBIANA

Caractersticas fenotpicas

Estabilidade influenciada pela presso seletiva do meio ambiente

Identificao pouco precisa ou especfica

CARACTERIZAO MOLECULAR
9 REA: anlise com enzima de restrio 9 Hibridizao usando sondas de DNA ou RNA 9 RFLP: polimorfismo tamanho fragmentos restrio 9 PFGE: PFGE eletroforese l t f gel l em campo pulsado l d 9 Polymerase Chain Reaction (PCR) 9 Sequenciamento

Mtodos Moleculares
9 Especificidade e sensibilidade 9 Rapidez e facilidade 9 Deteco e identificao simultneas 9 Custo 9 rea fsica

CARACTERIZAO MOLECULAR
Reao em cadeia da polimerase (PCR) (Dcada de 80)

Deteco de genes alvos

Rapidez diagnstico de doenas infecciosas e facilitou estudos epidemiolgicos

Reao em Cadeia da Polimerase - PCR

9 Detecta pequenas quantidades de DNA bacteriano (ng) mesmo em amostras mistas;

9 Permite amplificao de pouco DNA para gerar grandes quantidades q antidades do mesmo;

9 Pode detectar microrganismos em espcimes clnicos estocados;

Reao em Cadeia da Polimerase - PCR

9 Viabilidade microbiana no necessria para a identificao; 9 Identifica e distingue organismos com alta

similaridade fenotpica e genotpica; 9 Detecta organismos difceis de distinguir por cultivo tradicional ou no cultivveis.

Alguns genes estudados em anaerbios de relevncia clnica

Organismos Genes bft (bft1, bft2, bft3) Metodologia PCR; Multiplex-PCR PCR; Nested-PCR PCR; AP-PCR; PFGE PCR; AP-PCR; PFGE PCR; AP-PCR; PFGE

B. fragilis

nanH cepA cfiA/ccrA cfxA

C. difficile

PaLoc (tcdA/tcdB) Toxina binria (cdtA/cdtB) fliC prtC fimA

PCR; Sequenciamento PCR PCR PCR PCR; Sequenciamento

P gingivalis P. i i li

ETBF: subtipos do gene bft (bft1, bft2, bft3)

1 2 3 4 5 6 7 8
bp
287 (bft3) 190 (bft1) 175 (bft2)

Colunas 1, 2, 3 e 5: cepas P13C, P60A, P60C e P60F (bft1 e bft3); coluna 4, cepa B. distasonis; colunas 6 e 7: cepa GAI 97124 e ATCC 43858 (bft2 e bft3); coluna 8: 50 bp. Multiplex-PCR.

H ainda muito que estudar no que se refere estrutura genmica de bactrias anaerbias, e certamente as tcnicas moleculares l l incluindo i l i d a clonagem l e sequenciamento devero contribuir para o esclarecimento das dvidas, ainda existentes nesse grupo microbiano

Consideraes finais
9 Grupo importante e predominante em ecossistemas humanos, animais e ambientais; 9 Propicia equilbrio e manuteno de ecossistemas: versatilidade tilid d metablica t bli e adaptabilidade d t bilid d fisiolgica; fi i l i 9 Participa p de infeces mistas de natureza endgena; g ; 9 No recebe a importncia clnica necessria; 9 Poucos so os grupos que estudam esses organismos: aspectos t fenotpicos f t i e genotpicos. t i