Rapport - Final Milieu de Culture

Amlioration des qualits nutritionnelles du milieu de culture utilis pour produire Trichoderma, afin den maximiser le potentiel antagoniste
(Projet # 202-T)
Rapport final de recherche
Prsent au CRAAQ (Centre de rfrence en agriculture et agroalimentaire du Qubec)
Prsent par Mmes Johanne Caron et Lucie Laverdire Horti-Protection inc.
fvrier 2003
Table des matires 1. 2. 3. AVANT-PROPOS__________________________________________________________7 INTRODUCTION _________________________________________________________8 MATRIEL ET MTHODES________________________________________________9 3.1 Production de la biomasse de Trichoderma___________________________________9 3.2 Tests de confrontation en Ptri ____________________________________________9 3.3 Tests en serre exprimentale _____________________________________________10 4. RSULTATS ET DISCUSSION _____________________________________________12 4.1 Production de la biomasse de Trichoderma__________________________________12 4.1.1 Exprience #1 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu V-8 conventionnel ____________________________________________________________12 4.1.2 Exprience #2 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu conventionnel mais solide ___________________________________________________12 4.1.3 Exprience #3 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu base de pomme de terre (PDA) _____________________________________________________13 4.1.4 Exprience #4 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu V-8 solide - sans carbonate de calcium ____________________________________________14 4.1.5 Exprience #5 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu eau et agar __________________________________________________________________15 4.1.6 Exprience #6 Effets dune plus grande concentration de cellulose au milieu V-8 solide - sans carbonate de calcium ____________________________________________16 4.1.7 Exprience #7 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8 __________________________________________________________________16 4.1.8 Exprience #8 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu V-8 semi-solide sans CaCO3 ___________________________________________________18 4.1.9 Exprience #9 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8 ________________________________________________________________18 4.1.10 Exprience #10 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 semi-solide et au milieu PDA + jus V-8 ____________________________________________________20 4.1.11 Exprience #11 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 solide_________21 4.1.12 Exprience #12 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 aliment dune source de cellulose ___________________________________________________21 4.1.13 Exprience #13 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 aliment dune source de cellulose ___________________________________________________23
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 2 sur 44 Horti-Protection inc.
4.1.14 Exprience #14 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 aliment de la cellulose raffine (#2) ou fibres moyennes (#3) ____________________________24 4.2 Test de confrontation en Ptri ____________________________________________25 4.2.1 Exprience #1 - Tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathognes sur deux milieux de culture __________________________________________________25 4.3 Tests en serre exprimentale _____________________________________________27 4.3.1 4.3.2 4.3.3 5. Concombre ________________________________________________________27 Tomate____________________________________________________________32 Muflier____________________________________________________________35
CONCLUSIONS__________________________________________________________40
Liste des figures Figure 1. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide. ________________________________________12 Figure 2. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 solide. _____________________________________________13 Figure 3. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu PDA. _________________________________________________14 Figure 4. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. __________________________________15 Figure 5. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu eau et agar. ____________________________________________16 Figure 6. Effet dune plus grande concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. __________________________________17 Figure 7. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu PDA + jus V-8. _________________________________________17 Figure 8. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide sans CaCO3. _____________________________18 Figure 9. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu PDA + jus V-8. _______________________________________19 Figure 10. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source dhydrate de carbone sur la croissance journalire de Trichoderma milieu PDA + 200 ml jus V-8. _________22 Figure 11. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source dhydrate de carbone sur la croissance journalire de Trichoderma milieu PDA + 200 ml jus V-8. _________24 Figure 12. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en absence dagents pathognes _______________________________________________________________28 Figure 13. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en prsence de Rhizoctonia solani _________________________________________________________29 Figure 14. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en prsence de Verticillium dahliae ________________________________________________________30 Figure 15. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en prsence de Pythium aphanidermatum ___________________________________________________30 Figure 16. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en absence dagents pathognes _______________________________________________________________33 Figure 17. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en prsence de Rhizoctonia solani _________________________________________________________34 Figure 18. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en prsence de Verticillium dahliae ________________________________________________________34
Figure 19. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en prsence de Pythium ultimum _________________________________________________________________35 Figure 20. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en absence dagents pathognes _______________________________________________________________36 Figure 21. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en prsence de Rhizoctonia solani _________________________________________________________36 Figure 22. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en prsence de Verticillium dahliae ________________________________________________________37 Figure 23. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en prsence de Pythium ultimum _________________________________________________________________38
Liste des tableaux Tableau 1. Synthse des observations effectues lors des diffrentes exprimentations ralises afin damliorer le milieu nutritionnel traditionnel employ pour multiplier Trichoderma. .20 Tableau 2. Comparaison des pH obtenus aprs ajustement ou non et lajout dune source de glucose ou de sucrose - milieux de culture V-8 semi-solide et PDA + jus V-8..............21 Tableau 3. Effet dune source dhydrate de carbone sur la croissance de Trichoderma milieu V-8 solide...............................................................................................................................21 Tableau 4. Synthse des observations effectues lors des diffrentes exprimentations ralises afin damliorer le milieu nutritionnel traditionnel employ pour multiplier Trichoderma. .23 Tableau 5. Effet dune source dhydrate de carbone et de cellulose sur la croissance de Trichoderma milieu PDA + jus V-8. .................................................................................25 Tableau 6. Taux de croissance moyen journalier (mm) des champignons pathognes et de lagent de lutte biologique Trichoderma ................................................................................25 Tableau 7. Identification et pondration des critres de dcision slectionns pour valuer la performance de Trichoderma la confrontation en Ptri contre diffrents agents pathognes ................................................................................................................................................26 Tableau 8. valuation, in vitro, de lactivit antagoniste de Trichoderma vis--vis les agents pathognes ..............................................................................................................................27 Tableau 9. Isolement des agents pathognes et de Trichoderma partir des systmes racinaires prsentant ou non des symptmes visuels de la maladie .......................................................31 Tableau 10. Isolement de Trichoderma et des agents pathognes partir dchantillons de sol. .32 Tableau 11. Synthse des rsultats obtenus en serre exprimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque compar au tmoin ngatif. 38 Tableau 12. Synthse des rsultats obtenus en serre exprimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque compar au tmoin plante ................................................................................................................................................39
Liste des annexes Annexe 1. Barme de pondration employ lors de l'valuation de Trichoderma suite au test de confrontation en Ptri ______________________________________________________41 Annexe 2. Dispositif exprimental utilis dans la serre exprimentale ____________________43
1.
AVANT-PROPOS
Le projet comportait trois volets soit 1) amlioration de la qualit nutritionnelle du milieu de culture employ pour produire Trichoderma, 2) tests de confrontation en Ptri pour comparer lagressivit de Trichoderma envers des agents pathognes lorsque cultiv sur lancienne et nouvelle formulation et 3) visualiser, en serre exprimentale, le comportement de Trichoderma produit partir du nouveau milieu de culture, lorsque compar lancienne formulation et en prsence dagents pathognes seuls ou en combinaison. Ce projet a t ralis dans le cadre du Programme pour le Fonds vgtal gr par le Centre de Rfrence en Agriculture et Agroalimentaire du Qubec (CRAAQ) et ses partenaires (HortiProtection inc. et lIRDA). Le personnel impliqu Horti-Protection inc. Johanne Caron, M.Sc. Lucie Laverdire, tech. 11, rue des Peupliers Sainte-Hlne de Breakeyville (Qubec) G0S 1E1 Tl. : (418) 832-0546 Fax : (418) 832-0546 hortipro@mediom.qc.ca M. Pierre O. Thibodeau, agr., M.Sc. Institut de recherche et de dveloppement en agroenvironnement (IRDA) 2700, rue Einstein Sainte-Foy (Qubec) G1P 3W8 Tl. : (418) 644-7226 Fax : (418) 644-6855 Pierre-o.thibodeau@irda.qc.ca
2.
INTRODUCTION
Le genre Trichoderma regroupe un ensemble de champignons imparfaits saprophytes qui se retrouvent couramment dans le sol, sur le bois mort et les dbris vgtaux. Trichoderma est un champignon qui dcompose naturellement la cellulose et un degr moindre, la lignine. Cest galement un des agents de lutte biologique le plus connu dans le monde et de nombreux travaux de recherche sont en cours afin de fournir aux producteurs laccs son potentiel antagoniste. Trichoderma trouverait des applications dans diffrents secteurs dactivits comme le domaine des petits fruits et dans le secteur serricole (productions horticoles, plantes ornementales et ppinires forestires). La cellulose est le compos organique le plus synthtis sur la terre. On value plus de 60 90 milliards de tonnes par an la quantit produite par les vgtaux. Cest galement le polymre le plus utilis (bois de construction, pte papier, fibres textiles, etc.). Au niveau de la biosphre, les milliards de tonnes de cellulose synthtise chaque anne sont, malgr sa trs grande rsistance aux enzymes, dgrads, sinon la biomasse saccumulerait dangereusement. Dans les forts, les champignons, souvent associs des bactries, assurent une cellulolyse considrable et efficace. La cellulose est compose de monomres de glucose, qui, lorsquelle est dgrade, fournit une source de nourriture facilement assimilable par les agents dgradeurs. De plus, cest une ressource naturelle importante au Qubec cause de notre conomie forestire. Cette ressource est la porte de la main, disponible et bon march. Des travaux de recherches portant sur Trichoderma ont t entams depuis quelques temps et ils ont permis de dmontrer que des souches indignes de Trichoderma avaient un potentiel de lutte intressant contre les agents pathognes (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, etc) dans les cultures serricoles (productions lgumires et plantes ornementales) et dans les petits fruits. Afin dvaluer les aptitudes antagonistes de Trichoderma, il a fallu mettre au point un mode de production de spores de Trichoderma puisquil est impossible de le multiplier laide dun fermenteur. Notre faon de produire la biomasse de Trichoderma est efficace, simple et facilement ralisable. Par contre, dans le but damliorer et de stimuler davantage lactivit antagoniste de Trichoderma et lui permettre doccuper prioritairement les niches cologiques avant larrive des agents pathognes, qui se doit dtre le crneau de tout agent de lutte biologique, nous dsirons raffiner la qualit nutritionnelle de ce milieu de culture en y amendant une source de cellulose. Lobjectif gnral du projet tait damliorer les qualits nutritionnelles du milieu de culture utilis pour multiplier Trichoderma, agent de lutte biologique potentiel dans les productions serricoles et dans les petits fruits, afin de maximiser son potentiel antagoniste. Les objectifs spcifiques taient : 1) Dterminer si lajout dune source de cellulose amliore les qualits nutritionnelles du milieu de culture actuellement utilis. 2) Dterminer leffet de la source de cellulose sur le comportement de Trichoderma lorsquil est introduit seul dans un substrat en prsence uniquement de plantes. 3) Dterminer leffet du nouveau milieu de culture sur le comportement de Trichoderma lorsquil est introduit dans un substrat, en prsence dun agent pathogne et de plantes sensibles.
3. 3.1
MATRIEL ET MTHODES Production de la biomasse de Trichoderma
En laboratoire, diffrentes formes de cellulose (grossires, moyennes et raffines) ont t amendes au milieu de culture actuellement utilis pour multiplier Trichoderma et compar celui-ci. Le champignon a t produit en Ptri. La technique est simple : il suffit de prparer son milieu de culture et de le striliser. Par la suite, le milieu est vers dans les Ptri et refroidi. Une rondelle de spores de Trichoderma est ensuite dpose au centre de la glose. Avec ce milieu, la confluence du Ptri est atteinte aprs six jours. Le milieu conventionnel tait compos des ingrdients suivants (/litre) : 200 ml de V-8 nonmodifi, 3 g de carbonate de calcium (CaCO3), 8 g dagar et 800 ml deau, autoclav pendant 20 min 121C, 15 PSI. Ce milieu est semi-solide et doit tre manipul avec soin. partir de ce milieu, diffrents tests ont t raliss en laboratoire afin damliorer la rapidit de croissance de Trichoderma soit en ajoutant un ou des ingrdients et/ou en enlevant des ingrdients au milieu conventionnel. Les diffrentes celluloses testes taient : 1) cellulose avec des fibres longues et grossires (Sigma), 2) cellulose raffine (microcristalline de 20 mm, Lab Mat) et 3) cellulose avec des fibres moyennes (Sigma). Pour tous les tests raliss, 3 rptitions par type de cellulose et pour chaque concentration ont t faites. Les Ptri ont t incubs la noirceur, la temprature de la pice (22 2C) et deux mesures de la croissance radiale ont t faites chaque jour partir de la deuxime journe densemencement. La confluence du Ptri est atteinte lorsque la croissance radiale mesure est de 85 mm. 3.2 Tests de confrontation en Ptri
Des tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathognes suivants : Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, P. aphanidermatum et Verticillium dahliae ont t faits in vitro sur deux milieux de culture : 1) PDA + jus V-8 aliment de 1.5 % de cellulose raffine, de 0.1% de sucrose et deau et 2) PDA + jus V-8 aliment de 1% de cellulose raffine, de 0.1% de glucose et deau. Le champignon Pyrenochaeta lycopersicis, responsable de la racine ligeuse chez la tomate, na pas fait lobjet de cette tude puisquil a t impossible dobtenir une souche du champignon. Le test de confrontation consistait placer de faon diamtralement oppose sur les milieux retenus, une souche de Trichoderma et une souche de lagent pathogne tester. La prsence d'une zone d'inhibition au point de contact entre les deux champignons a t note. L'action de comptition et en particulier l'effet "prdateur" de Trichoderma sur l'agent pathogne, en prsence ou en l'absence d'une zone d'inhibition, a galement t considr lors de ce test. Lannexe 1 prsente les critres de dcision utiliss lors de ltude. Les tests ont t raliss la temprature de la pice (22 2C, la noirceur) et les Ptri ont t rpartis alatoirement. Cinq rptitions par souche ont t faites. Le rsultat espr tait que le nouveau milieu de culture favorisait la croissance de Trichoderma au dtriment des agents pathognes.
3.3
Tests en serre exprimentale
En serre exprimentale, la nouvelle formulation pour produire Trichoderma a t compare lancienne mthode. Les aptitudes antagonistes de Trichoderma ont galement t vrifies lorsque confront diffrents agents pathognes, toujours en comparant la nouvelle et lancienne mthode de production de Trichoderma. Nous avions dtermin, lors dexpriences prcdentes, que Trichoderma devait tre introduit au substrat avant larrive des agents pathognes. Dans cette exprience, Trichoderma a mlang au substrat PRO-MIX BX deux semaines avant linoculation des agents pathognes. Ce dlai permet Trichoderma de se multiplier et de coloniser les niches cologiques avant les agents pathognes. Seul un arrosage adquat a t maintenu et une fertilisation (20-20-20) aux deux semaines a t faite. Pour ces expriences, un terreau de culture PRO-MIX BX a t employ et le muflier (Antirrhinum majus), la tomate (Lycopersicon esculentum) et le concombre (Cucumis sativus), ont servi de plantes sensibles, cultives dans des caissettes de fibres biodgradables. Une caissette de fibres (17 cm x 13 cm) contient environ 1 litre de terreau. Six graines ont t semes par caissette, pour chaque plante. Trois rptitions ont t ralises. L'exprience sest droule en serre (22 2C (jour) et 18 2C (nuit); 16:8 L:N). Les plantes ont observes aprs 60 jours de croissance. Le dispositif exprimental tait un split-plot. Les diffrents paramtres tudis pour chaque systme taient : 1) lapparence des plantules saines ou malades (jaunissement, fltrissement, etc...), 2) la croissance de la partie arienne (hauteur et poids frais), 3) le pourcentage de germination, 4) le dveloppement du systme racinaire, 5) lobservation des symptmes la surface du systme racinaire (ncrose, dformation, etc....), 6) le r-isolement de Trichoderma du substrat et 7) le r-isolement de Trichoderma et des agents pathognes des racines. Les rsultats esprs taient : 1) une efficacit optimale de Trichoderma la plus faible concentration et 2) toutes les plantes sensibles ragissent de la mme faon. Pour raliser cette exprience, les traitements taient : J J J J Nouvelle formulation de Trichoderma une concentration de 106 spores/ml Ancienne formulation de Trichoderma une concentration de 106 spores/ml Nouvelle formulation de Trichoderma une concentration de 107 spores/ml Ancienne formulation de Trichoderma une concentration de 107 spores/ml
Pour les confrontations entre Trichoderma et les agents pathognes, les agents pathognes suivants ont t retenus selon la culture vise : Tomate : Pythium ultimum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae Concombre : Pythium aphanidermatum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae
Muflier : Pythium ultimum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae Les racines prsentant ou non des symptmes ont t conserves et dposes sur un milieu de culture SNA++ (Solution Nutrient Agar avec antibiotiques) ou PYT (P5ARP) pour les Pythium pour dtecter si les agents pathognes avaient effectivement infect les plantes. Les Ptri ont t incubs pendant 5 j 24 2C, la noirceur. Les chantillons de sol ont t prpars pour obtenir une dilution 1:10 (10 g de terreau dans 100 ml deau) et 100 ml ont t tals sur un milieu de culture SNA++. Les Ptri ont t incubes 3 5 j 24 2C, la noirceur. La prsence de Trichoderma sur le milieu de culture a alors t value.
4. 4.1
RSULTATS ET DISCUSSION Production de la biomasse de Trichoderma Exprience #1 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu V-8 conventionnel
4.1.1
Dans la littrature, il est mentionn que lajout dune source de cellulose au milieu devrait se situer entre 1.5 et 2%. Dans un premier temps, des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.35 et 1.5% ont t amendes au milieu V-8 conventionnel (milieu semi-solide). La figure 1 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. La croissance maximale a t obtenue aprs 5 jours. Sur Ptri, la croissance de Trichoderma a sembl tre affecte par la prsence de cellulose puisquune alternance de zones concentriques claires et de zones mycliennes tait visible sur la glose.
#1 - 0 #2 - .5 #3 - 1 #1 - .5 #2 - 1 #3 - 1.35 #1 - 1 #2 - 1.35 #3 - 1.5 #1 - 1.35 #2 - 1.5 #1 - 1.5 #3 - 0 #2 - 0 #3 - .5
100
Taux de croissance journalire (mm)
80 60 40 20 0 2 3 4 5
Temps (jour)
Figure 1. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide. 4.1.2 Exprience #2 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu conventionnel mais solide
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu V-8 conventionnel mais solide (15 g dagar ont t ajouts au lieu de 8). Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 7.05 et variait entre 7.01 et 7.17 pour les diffrentes formes de cellulose et concentrations. La figure 2 indique les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. Par contre, aprs 4 jours, la croissance
radiale maximale tait atteinte dans les Ptri aliments de 0.5% de cellulose fibres moyennes (#3) et presque atteinte avec 0.5% de la cellulose grossire (#1 - 81 mm). La quantit dagar supplmentaire na pas permis une meilleure croissance de Trichoderma sauf quil est plus facile de faire les lectures de la croissance radiale.
#1 - 0 #2 - 1.5
#1 - .5 #2 - 2
#1 - 1 #3 - 0
#1 - 1.5 #3 - .5
#1 - 2 #3 - 1
#2 - 0 #3 - 1.5
#2 - .5 #3 - 2
#2 - 1
100
80 60 40 20 0 2 3
Temps (jour)
Figure 2. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 solide.
4.1.3
Exprience #3 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu base de pomme de terre (PDA)
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu PDA (milieu solide avec 15 g dagar / litre). Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 5.70 et variait entre 5.69 et 5.76 pour les diffrentes formes de cellulose et concentrations. Ce milieu est largement utilis en laboratoire pour la croissance de divers champignons. La figure 3 indique les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. Par contre, Trichoderma a atteint la confluence du Ptri aprs seulement 4 jours. Est-ce que le pH du milieu influencerait le dveloppement du champignon?
#1 - 0 #2 - 1.5
#1 - .5 #2 - 2
#1 - 1 #3 - 0
#1 - 1.5 #3 - .5
#1 - 2 #3 - 1
#2 - 0 #3 - 1.5
#2 - .5 #3 - 2
#2 - 1
100
80 60 40 20 0 1 2
Temps (jour)
Figure 3. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu PDA.
4.1.4
Exprience #4 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu V-8 solide sans carbonate de calcium
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu V-8 solide et en absence de carbonate de calcium. Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 4.50 comparativement 4.44 4.65 pour les diffrentes formes de cellulose et concentrations. La figure 4 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. Par contre, Trichoderma a atteint la confluence du Ptri aprs seulement 3 jours. Un milieu acide favorise donc le dveloppement de Trichoderma. Suite ces deux tests, le carbonate de calcium (CaCO3), qui avait comme fonction de rendre le milieu plus basique, a t banni de la recette de base.
#1 - 0 #2 - 1.5
#1 - .5 #2 - 2
#1 - 1 #3 - 0
#1 - 1.5 #3 - .5
#1 - 2 #3 - 1
#2 - 0 #3 - 1.5
#2 - .5 #3 - 2
#2 - 1
100
80 60 40 20 0 2
Temps (jour)
Figure 4. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3.
4.1.5
Exprience #5 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu eau et agar
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu eau et agar. Il est connu que les milieux pauvres en lments nutritifs favorisent la reproduction des spores des champignons afin dassurer leur survie. Cest ce que nous voulions vrifier avec cette exprience. Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 6.05 comparativement 6.04 6.11 pour les diffrentes formes de cellulose et concentrations. La figure 5 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. De plus, Trichoderma a atteint la confluence du Ptri aprs 5 jours et aucune sporulation ntait encore visible sur le milieu. Dans ce cas, la faible valeur nutritive du milieu de culture na pas favoris la croissance et la reproduction de Trichoderma.
#1 - 0 #2 - 1.5
#1 - .5 #2 - 2
#1 - 1 #3 - 0
#1 - 1.5 #3 - .5
#1 - 2 #3 - 1
#2 - 0 #3 - 1.5
#2 - .5 #3 - 2
#2 - 1
100 Taux de croissance journalire (mm) 80 60 40 20 0

2 3 4 5
Temps (jour)
Figure 5. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu eau et agar. 4.1.6 Exprience #6 Effets dune plus grande concentration de cellulose au milieu V-8 solide - sans carbonate de calcium
Diffrentes concentrations de cellulose (0 2.0 2.5 4.0 et 5.0%) ont t amendes au milieu V-8 solide - sans CaCO3. Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 4.44. La figure 6 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. Trichoderma a atteint la confluence du Ptri aprs seulement 3 jours. Une plus forte concentration de cellulose nacclre donc pas la production de spores de Trichoderma puisque le mme rsultat avait t obtenu avec des quantits plus faibles de cellulose (rf. point 4.1.4). Par contre, avec les celluloses grossire (#1) et fine (#2), la sporulation a t plus intense. 4.1.7 Exprience #7 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu PDA fait en remplaant 200 des 1 000 ml deau requis par du jus V-8. Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 4.76. La figure 7 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose. Trichoderma a atteint la confluence du Ptri aprs seulement 3 jours. Lapport de fibres par lajout de jus V-8 ninfluencerait pas le dveloppement de Trichoderma.
#1 - 0 #2 - 4,0
#1 - 2,0 #2 - 5,0
#1 - 2,5 #3 - 0
#1 - 4,0 #3 - 2,0
#1 - 5,0 #3 - 2,5
#2 - 0 #3 - 4,0
#2 - 2,0 #3 - 5,0
#2 - 2,5
100
90 80 70 60 50 40 2
Temps (jour)
Figure 6. Effet dune plus grande concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3.
Concentration #2 - 0 #3 - .5
#1 - 0 #2 - .5 #3 - 1
#1 - .5 #2 - 1 #3 - 1.5
#1 - 1 #2 - 1.5
#1 - 1.5 #2 - 2
#1 - 2 #3 - 0
100
90 80 70 60 50 2
Temps (jour)
Figure 7. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu PDA + jus V-8.
4.1.8
Exprience #8 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu V-8 semisolide sans CaCO3
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu V-8 conventionnel semi-solide mais en absence de CaCO3. Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 4.38. La figure 8 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose.
#1 - 0 #2 - 1.5
#1 - .5 #2 - 2
#1 - 1 #3 - 0
#1 - 1.5 #3 - .5
#1 - 2 #3 - 1
#2 - 0 #3 - 1.5
#2 - .5 #3 - 2
#2 - 1
100
90 80 70 60 50 2
Temps (jour)
Figure 8. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide sans CaCO3.
4.1.9
Exprience #9 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8
Des concentrations de cellulose de 0 0.5 1.0 1.5 et 2.0% ont t amendes au milieu PDA fabriqu avec 200 ml de jus V-8. Aprs la strilisation du milieu, le pH du tmoin tait de 4.63. La figure 9 montre les rsultats et aucune diffrence na t observe entre les diffrentes concentrations et types de cellulose.
#1 - 0 #2 - 1.5
#1 - .5 #2 - 2
#1 - 1 #3 - 0
#1 - 1.5 #3 - .5
#1 - 2 #3 - 1
#2 - 0 #3 - 1.5
#2 - .5 #3 - 2
#2 - 1
100
90 80 70 60 50
Temps (jour)
Figure 9. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalire de Trichoderma - milieu PDA + jus V-8.
Suite ces diffrents tests, il est clairement apparu que le carbonate de calcium devait tre limin du milieu, que des concentrations plus leves de cellulose ntaient pas plus avantageuses et quun milieu solide permettait une meilleure croissance que le milieu semiliquide. De tous ces tests, le temps de croissance a pu tre raccourci de 2 jours, ce qui est nonngligeable. Par contre, les essais raliss ne permettaient pas encore de dterminer quel type de cellulose tait la plus efficace, ni quelle concentration. Le tableau 1 schmatise les rsultats obtenus lors des diffrentes expriences. Dans la littrature, il est galement recommand dajouter des substances telles du glucose, sucrose, glycrol, des peptones, etc afin de stimuler le dveloppement de Trichoderma. Par contre, ces substances ne doivent pas dpasser 10% de la concentration de cellulose prsente et idalement, le pH doit tre maintenu entre 3 et 3.5. Les tests qui ont le mieux russi (en gras dans le tableau 1) ont t repris en ajoutant une dose de sucrose ou de glucose puisque ce sont deux ingrdients peu coteux.
Tableau 1. Synthse des observations effectues lors des diffrentes exprimentations ralises afin damliorer le milieu nutritionnel traditionnel employ pour multiplier Trichoderma. Milieu de culture avec prsence de cellulose V-8 semi-solide avec CaCO3 V-8 solide avec CaCO3 Eau + agar PDA V-8 solide sans CaCO3 et concentration +++ de cellulose V-8 semi-solide sans CaCO3 V-8 solide sans CaCO3 PDA + jus V-8 sans CaCO3 PDA + jus V-8 sans CaCO3
Lgende : --- : n / a car vrifi seulement avec ceux qui ont atteint la croissance radiale maximale aprs 3 jours
Nombre de jours pour atteindre la croissance radiale maximale en Ptri 5 5 5 4 3 3 3 3 3
croissance radiale moyenne aprs 2 jours (mm) rep 1 rep 2

--------50 54 54 58 50 52 54 54 59 47 51 55 54 58 48
rep 3
4.1.10 Exprience #10 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 semi-solide et au milieu PDA + jus V-8 Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) a t amend seul au milieu V-8 semi-solide et au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vrifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Aprs la strilisation, le pH a t ajust entre 3 et 3.5 pour la moiti des Ptri de chaque systme. Le tableau 2 rsume les rsultats obtenus pour les pH et indique la croissance radiale obtenue aprs 2 j; le champignon ayant atteint la confluence du Ptri au troisime jour. Trichoderma a eu une meilleure croissance sur le milieu o le pH ntait pas ajust et la croissance a t lgrement suprieure avec la source de sucrose. Sur milieu V-8 semi-solide, la croissance tait plus diffuse que sur le milieu PDA + jus V-8.
Tableau 2. Comparaison des pH obtenus aprs ajustement ou non et lajout dune source de glucose ou de sucrose - milieux de culture V-8 semi-solide et PDA + jus V-8. Milieu de culture SANS cellulose V-8 semi-solide + glucose V-8 semi-solide + sucrose PDA + jus V-8 + glucose PDA + jus V-8 + sucrose
pH normal / croissance radiale moyenne aprs 2 j 4.45 4.44 4.68 4.66 47 47 48 52 pH ajust / croissance radiale moyenne aprs 2 j cart de pH
3.29 3.41 3.48 3.41
41 40 40 40
1.16 1.03 1.20 1.25
4.1.11 Exprience #11 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 solide Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) a t amend seul au milieu V-8 solide afin de vrifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Le pH na pas t ajust. Mme sil ny a pas de diffrence significative entre les deux sources de sucres, les rsultats obtenus avec le sucrose sont encore lgrement suprieurs ceux obtenus avec le glucose (tab. 3). La vitesse de croissance est un paramtre important dans le choix dun agent de lutte biologique afin de favoriser son installation et en ce sens, le sucrose permettrait une installation plus rapide de Trichoderma que le glucose.
Tableau 3. Effet dune source dhydrate de carbone sur la croissance de Trichoderma milieu V-8 solide. Milieu de culture SANS cellulose V-8 solide + glucose V-8 solide + sucrose
croissance radiale aprs 1 j 20 23 croissance radiale aprs 2 j croissance radiale aprs 3 j
49 52
85 85
4.1.12 Exprience #12 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 aliment dune source de cellulose Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) et diffrentes sources et concentrations de cellulose ont t amends au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vrifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Le pH na pas t ajust. La figure 10 montre les rsultats obtenus. Mme sil ny a pas de diffrence significative entre les deux sources de sucres, les rsultats obtenus avec le
sucrose sont encore lgrement suprieur ceux obtenus avec le glucose (fig. 10). La cellulose grossire (#1) a toujours donn des rsultats infrieurs ceux obtenus avec les celluloses raffines (#2) et de fibres moyennes (#3). Pour les tests subsquents, elle a t abandonne. Le tableau 4 rsume le comportement de Trichoderma, sur diffrents milieux, lorsquil crot en prsence dune source de glucose ou de sucrose. Suite ces tests, le milieu PDA + Jus V-8 offre les meilleures conditions de croissance pour Trichoderma. Cest ce milieu qui a t retenu et il a, par la suite, t test avec diffrentes concentrations des celluloses #2 (raffine) et #3 (moyennes).
2 j-g 3 j-g 2 j-s 3 j-s
100
100 80 60 40 20 0 #1 - #1 - #1 - #1 - #1 - #2 - #2 - #2 - #2 - #2 - #3 - #3 - #3 - #3 - #3 0 .5 1 1.5 2 0 .5 1 1.5 2 0 .5 1 1.5 2
80 60 40 20 0
Concentration (%) et type de cellulose
Figure 10. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source dhydrate de carbone sur la croissance journalire de Trichoderma milieu PDA + 200 ml jus V-8.
Tableau 4. Synthse des observations effectues lors des diffrentes exprimentations ralises afin damliorer le milieu nutritionnel traditionnel employ pour multiplier Trichoderma.
Milieu de culture SANS cellulose V-8 semi-solide + glucose V-8 semi-solide + sucrose PDA + Jus V-8 + glucose PDA + Jus V-8 + sucrose PDA + Jus V-8 + glucose PDA + Jus V-8 + sucrose V-8 solide + glucose V-8 solide + sucrose
Nombre de jours pour atteindre la croissance radiale maximale en Ptri 3 3 3 3 3 3 3 3
croissance radiale moyenne aprs 2 jours (mm) 48 46 47 53 56 61 50 52 45 46 50 51 57 60 48 51 48 48 46 52 57 63 48 53
4.1.13 Exprience #13 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 aliment dune source de cellulose Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) et deux sources et diffrentes concentrations de cellulose ont t amendes au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vrifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Six rptitions par traitement ont t faites. Le pH na pas t ajust. La figure 11 montre les rsultats obtenus. Mme sil ny a pas de diffrence significative entre les deux sources de sucres, les rsultats obtenus avec le glucose sont encore lgrement suprieur ceux obtenus avec le sucrose (fig. 11). Lajout dune source de sucre au milieu ne stimule pas toujours Trichoderma comme en fait foi la figure 11. Lorsque du glucose ou du sucrose est ajout en absence de cellulose, la croissance de Trichoderma est moindre dans certains cas. Avec la cellulose #2, le sucrose donne de meilleurs rsultats que le glucose sauf avec 1 et 2% tandis quavec la cellulose #3, cest le glucose qui donne de meilleurs rsultats sauf 1.5%. Visuellement sur les Ptri, le tmoin sucrose (#3-0) avait une sporulation dense tout comme les traitements #2g - 1% et #2s 1.5%. Suite ce test, les trois traitements suivants ont t retenus : cellulose #2 1% + 0.1% glucose; cellulose #2 1.5% + 0.1% sucrose et cellulose #3 1.5% + 0.1% sucrose. Ils ont fait lobjet dun autre test.
2 j-g
3 j-g
2 j-s
3 j-s
100
100 80 60 40 20 0 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1 #2 - #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - #3 - 2 Tem 1.5 1.5 PDAV8
80 60 40 20 0
Concentration (%) et type de cellulose
Figure 11. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source dhydrate de carbone sur la croissance journalire de Trichoderma milieu PDA + 200 ml jus V-8. 4.1.14 Exprience #14 Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 aliment de la cellulose raffine (#2) ou fibres moyennes (#3) Les traitements 1) cellulose #2 1% + 0.1% glucose, 2) cellulose #2 1.5% + 0.1% sucrose et 3) cellulose #3 1.5% + 0.1% sucrose ont t tudis plus attentivement sur un milieu PDA + 200 ml de jus V-8. Six rptitions par traitement ont t faites. Le pH na pas t ajust. Le tableau 5 montre les rsultats obtenus. Visuellement sur les Ptri, la sporulation tait moindre dans le traitement #3 (1.5%) sucrose que dans le tmoin sucrose et le traitement #2 (1.5%) + sucrose. Pour les tests de confrontation en Ptri, les traitements cellulose raffine (#2 - 1.5%) + sucrose et cellulose raffine (#2 - 1%) + glucose ont t conservs.
Tableau 5. Effet dune source dhydrate de carbone et de cellulose sur la croissance de Trichoderma milieu PDA + jus V-8. Milieu de culture et type de cellulose Tmoin PDA + jus V8 Tem cellulose #2 1% - g cellulose #2 1.5% - s cellulose #3 1.5% - s
croissance radiale croissance radiale croissance radiale croissance radiale aprs 2 j aprs 3 j aprs 2 j aprs 3 j glucose glucose sucrose sucrose 47 46 47
85 85 85 -----
47 47 --50 44
85 85 --85 85
-----
4.2 4.2.1
Test de confrontation en Ptri Exprience #1 - Tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathognes sur deux milieux de culture
Dans un premier temps, la vitesse de croissance des agents pathognes et de Trichoderma a t dtermine et elle est prsente au tableau 6. Trichoderma atteint la confluence du Ptri 3 jours aprs son ensemencement et son taux de croissance moyen journalier est de 14,2 mm. Pythium croit au mme rythme que Trichoderma. Rhizoctonia solani doit tre dpos sur le milieu de culture 1 journe avant Trichoderma tandis que Verticillium dahliae le sera 18 jours avant Trichoderma. Cet agent pathogne pousse trs lentement in vitro ce qui pourrait favoriser lagent de lutte biologique Trichoderma dans le contrle de ces maladies. Par contre, dans le cas de Pythium et R. solani, la lutte devrait tre plus intense puisquils ont un taux de croissance similaire. Dans ces cas, la colonisation rapide des niches cologiques sera dterminante. Tableau 6. Taux de croissance moyen journalier (mm) des champignons pathognes et de lagent de lutte biologique Trichoderma. Champignon Trichoderma Pythium ultimum Pythium aphanidermatum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae Croissance radiale moyenne journalire (mm) 14.2 14.2 14.2 10.7 2.0 Dpt de lagent pathogne (# jour) sur le milieu de culture AVANT Trichoderma 0 0 0 1 18
Suite aux confrontations, Trichoderma a fait l'objet d'une "analyse multicritre simple". Au total, sept critres de dcision qualitatifs et quantitatifs ont t dtermins et ces critres ont permis d'valuer la performance de Trichoderma la confrontation. Le tableau 7 prsente les critres de dcision retenus pour l'analyse. Tableau 7. Identification et pondration des critres de dcision slectionns pour valuer la performance de Trichoderma la confrontation en Ptri contre diffrents agents pathognes. Intervalle des poids 0 20 09 05 02 01 04 03 Critres de dcision* Temps (jour) requis pour obtenir la zone de contact entre les deux champignons La croissance radiale mesure (mm) partir du centre de la pastille de glose de Trichoderma jusqu' la zone de contact Zone d'inhibition entre les deux champignons (intensit de la coloration) Sporulation diffrente et/ou dense au contact entre les deux champignons Zone claire au contact entre les deux champignons Envahissement de Trichoderma sur l'agent phytopathogne ou vice et versa Intensit de la sporulation de Trichoderma sur l'agent phytopathogne ou vice et versa
Remarques : * Consulter l'annexe 1 pour connatre le barme de pondration employ lors de l'valuation.
Cette pondration a t faite de faon favoriser laction de Trichoderma sur les agents pathognes. Le poids le plus grand tant celui du meilleur lors de la confrontation. La confrontation a eu lieu en tenant compte de la vitesse de croissance des champignons, vitesse dtermine lors du test prcdent. Lors de ces tests in vitro, il apparat que Trichoderma a une bonne activit antagoniste contre les champignons tudis (tab. 8). Le milieu cellulose #2 1.5% + sucrose favorise le plus Trichoderma. Cest le milieu qui a t retenu pour les tests en serre exprimentale. La source de sucre seule ninfluence pas rellement le comportement et la croissance des champignons tudis.
Tableau 8. valuation, in vitro, de lactivit antagoniste de Trichoderma vis--vis les agents pathognes. Confrontation PDA(V-8) T20 vs P. ultimum T20 vs P. aphanidermatum T20 vs R. solani T20 vs V. dahliae +22 +22 +23 +20 Milieu de culture PDA(V-8) PDA(V-8) cellulose #2 cellulose #2 +g +s 1% + g 1.5% + s +22 +22 +21 +23 +22 +22 +19 +22 +23 +20 +24 +20 +22 +25 +25 +25
4.3
Tests en serre exprimentale
Trichoderma titrait soit pour 106 ou 107 spores/ml tandis que pour les agents pathognes, les concentrations taient de 3 x 104 (R. solani), 1,6 x 105 (V. dahliae), 2 x 105 (P. aphanidermatum) et 5 x 105 spores/ml (P. ultimum). Le dispositif exprimental est prsent lannexe 2. Les remarques suivantes doivent tre considres : 1) La hauteur minimale et maximale ont t dtermines lors de lvaluation des plants mais afin de mieux visualiser linfluence des traitements sur ce paramtre de croissance, une hauteur moyenne est considre. 2) Le poids sec de la masse arienne des plants na pas t value, tel que prvu au projet, considrant que dans la grande majorit des cas, le poids sec reprsente 10% de la masse foliaire humide et ne permet pas de dterminer de diffrence significative par rapport cette dernire. De plus, au moment de la rcolte, le schoir tait hors dusages. Le tableau 9 prsente les agents pathognes et Trichoderma isols partir des racines chantillonnes tandis que le tableau 10 indique si Trichoderma a t isol partir du sol ramass lors de lvaluation des plantes. Des racines ont t chantillonnes mme si aucun symptme ntait visible sur le systme racinaire. En gnral, hormis les symptmes attribus la fonte des semis, peu de symptmes ont t observs sur les racines des plantes, la plupart de ces cas, un jaunissement des racines tait not (qui peut galement tre attribu lasphyxie racinaire). Trichoderma a t observ dans tous les chantillons de sol mis sur milieu de culture (tab. 10). 4.3.1 Concombre
Concombre vs Trichoderma Lorsque Trichoderma est amend au substrat en labsence dagents pathognes, il permet une meilleure croissance que le tmoin dans tous les traitements et pour tous les paramtres de croissance. Ce fait est particulirement important dans les traitements o Trichoderma a t cultiv sur le nouveau milieu de culture base de cellulose (sur la figure = N) et une dose de 106 ou 107 cfu/ml (fig. 12). De ce fait, nous pouvons supposer que des rsultats intressants
puissent tre obtenus une concentration de Trichoderma de 106 cfu/ml, ce qui confirme des rsultats obtenus antrieurement dans un autre projet.
Hauteur moy (mm) % germination Poids frais (g) 169
200
143
155 94 39 100 43
162 100 46
149 100 43
150
100 48
100 50 0
Concombre
T20-106-A
T20-106-N
T20-107-A
T20-107-N
Traitements
Figure 12. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en absence dagents pathognes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Concombre vs R. solani Le tmoin ngatif R. solani a donn des rsultats lgrement infrieurs au tmoin plante. Pourtant lisolement des racines, R. solani a t dtect en grande quantit sur les milieux de culture, tout comme Trichoderma (tab. 9). La souche de R. solani na peut-tre pas eu le temps de dmontrer pleinement son agressivit sur les racines des plants de concombre. De ce fait, tous les traitements ont donn des rsultats suprieurs lorsque compar au tmoin R. solani. Si R. solani a t actif dans le substrat, nous pouvons supposer que Trichoderma a permis davoir une croissance normale des plants puisque des rsultats gaux ou lgrement suprieurs ceux obtenus avec la plante seule ont t enregistrs. Lorsque Trichoderma est amend au substrat contamin par R. solani une concentration de 107 cfu/ml, les rsultats sont lgrement suprieurs tous les traitements. Le traitement Rs-107-N ayant un faible avantage sur lancienne formulation du milieu de culture Rs-107-A (fig. 13).
Hauteur moy (mm)
% germination
Poids frais (g) 150 153 100 100
175 150 125 100 75 50 25 0
143 129 94 94
147 100
143 100
39
37
42
42
41
44
Concombre
Rs
Rs-106-A
Rs-106-N
Rs-107-A
Rs-107-N
Traitements
Figure 13. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en prsence de Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Concombre vs V. dahliae Le tmoin ngatif V. dahliae a donn des rsultats infrieurs au tmoin plante malgr le fait qu lisolement des racines, V. dahliae avait t dtect dans seulement 3 des 5 traitements (tab. 9). Tous les traitements ont donn des rsultats suprieurs lorsque compar au tmoin V. dahliae et au tmoin plante sauf dans le cas des traitements impliquant la concentration 107 cfu/ml. Les rsultats sont alors gaux au tmoin plante (fig. 14). La prsence de Trichoderma a t note dans tous les traitements lors de lisolement (sauf dans le traitement tmoin). Le traitement Vd-106-N semble assur un bon contrle de V. dahliae sur les racines des plants de concombre.
Hauteur moy (mm)
% germination
Poids frais (g)
250 200 150 100 50 0

94 39 143 119 94 37 94 43 152
209 141 83 47 100 44 142 100 39
Concombre
Vd
Vd-106-A
Vd-106-N
Vd-107-A
Vd-107-N
Traitements
Figure 14. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en prsence de Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Concombre vs P. aphanidermatum Le tmoin ngatif P. aphanidermatum a donn des rsultats lgrement infrieurs au tmoin plante, ce qui peut sexpliquer par labsence ou la faible agressivit de P. aphanidermatum dans le sol puisque lors de lisolement des racines, Pythium a t dtect dans seulement 1 des 5 traitements (tab. 9). De ce fait, tous les traitements ont donn des rsultats suprieurs aux tmoins V. dahliae et au tmoin plante (fig. 15). La concentration Pa-106-N semble assurer un meilleur contrle du champignon que les trois autres traitements.
Hauteur moy (mm)
% germination 168
Poids frais (g)
200
143
150 100 50 0 Concombre

94 39
139 78 34
153 100 47
154 94 45 94 47
151 83 35
Pa
Pa-106-A
Pa-106-N
Pa-107-A
Pa-107-N
Traitements
Figure 15. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en prsence de Pythium aphanidermatum. P.a. = Pythium aphanidermatum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose.
Tableau 9. Isolement des agents pathognes et de Trichoderma partir des systmes racinaires prsentant ou non des symptmes visuels de la maladie. Plantes Tomate --T20 T20 T20 T20 T20 R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. V.d. ------T20 P.u. --P.u. --P.u. n/a n/a n/a n/a n/a
Traitements Tmoin Trichoderma Trichoderma -106-A Trichoderma -106-N Trichoderma -107-A Trichoderma -107-N R. solani R. solani -106-A R. solani -106-N R. solani -107-A R. solani 107-N V. dahliae V. dahliae -106-A V. dahliae -106-N V. dahliae -107-A V. dahliae -107-N P. ultimum P. ultimum -106-A P. ultimum -106-N P. ultimum 107-A P. ultimum -107-N P. aphanidermatum P. aphanidermatum -106-A P. aphanidermatum -106-N P. aphanidermatum 107-A P. aphanidermatum -107-N Lgende
Concombre --T20 T20 T20 T20 T20 R.s. + F T20 + R.s. + F T20 + R.s. + F T20 + R.s. + F T20 + R.s. + F V.d. T20 + V.d. T20 + V.d. T20 + F T20 n/a n/a n/a n/a n/a F --F P.a. + F F
Muflier --T20 T20 T20 T20 T20 R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. V.d. --------P.u. --P.u. --P.u. n/a n/a n/a n/a n/a
n / a = ne sapplique pas --- = aucune dtection du champignon recherch R.s. = Rhizoctonia solani V.d. = Verticillium dahliae
P.u. = Pythium ultimum P.a. = Pythium aphanidermatum F = Fusarium spp. T20 = Trichoderma MAUL-20
Tableau 10. Isolement de Trichoderma et des agents pathognes partir dchantillons de sol. Plantes Tomate --T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 n/a n/a n/a n/a n/a
Traitements Tmoin Trichoderma Trichoderma -106-A Trichoderma -106-N Trichoderma -107-A Trichoderma -107-N R. solani R. solani -106-A R. solani -106-N R. solani -107-A R. solani 107-N V. dahliae V. dahliae -106-A V. dahliae -106-N V. dahliae -107-A V. dahliae -107-N P. ultimum P. ultimum -106-A P. ultimum -106-N P. ultimum 107-A P. ultimum -107-N P. aphanidermatum P. aphanidermatum -106-A P. aphanidermatum -106-N P. aphanidermatum 107-A P. aphanidermatum -107-N Lgende
Concombre --T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 n/a n/a n/a n/a n/a T20 T20 T20 T20 T20
Muflier --T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 n/a n/a n/a n/a n/a
n / a = ne sapplique pas --- = aucune dtection du champignon recherch P. aphanidermatum = Pythium aphanidermatum T20 = Trichoderma MAUL-20 4.3.2 Tomate
P. ultimum = Pythium ultimum R. solani = Rhizoctonia solani V. dahliae = Verticillium dahliae
Tomate vs Trichoderma Lorsque Trichoderma est amend au substrat en labsence dagents pathognes, il permet une bien meilleure croissance des plants que la plante seule et particulirement dans le traitement o
Trichoderma a t cultiv sur le nouveau milieu de culture base de cellulose (sur la figure = N) et appliqu une concentration de 106 cfu/ml (fig. 16). Par contre, le pourcentage de germination des plantes est infrieur au tmoin plante dans tous les traitements et particulirement dans le traitement T20-107-A.
Hauteur moy (mm) % germination Poids frais (g)
200 150 100 50 0 Tomate

132 94
160
161
146 89 25
151
78 19 19
72 25
83 22
T20-106-A
T20-106-N
T20-107-A
T20-107-N
Traitements
Figure 16. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en absence dagents pathognes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose.
Tomate vs R. solani Dans le tmoin ngatif R. solani, le champignon a t trs actif, affectant grandement le dveloppement des plants lorsque compar au tmoin plante. Tous les traitements ont donn des rsultats suprieurs au tmoin R. solani mais infrieurs au tmoin plante. La souche de R. solani a t particulirement active sur les plants de tomate causant 11 cas de fontes de semis, particulirement dans lancienne formulation du milieu de culture (sur la figure = A) et dans le tmoin. Trichoderma a eu combattre activement cet agent pathogne mais aucune perte de plants attribuables Rhizoctonia na t enregistre dans le traitement Nouvelle formulation du milieu de culture (cellulose), ce qui est de bon augure (fig. 17). Par contre, le pourcentage de germination a t assez faible dans tous les traitements lorsque compar au tmoin plante. Lors de lisolement des racines, Trichoderma et R. solani ont t observs abondamment sauf que Trichoderma semble avoir de la difficult lutter efficacement contre cet agent pathogne. Cas de fontes de semis observs sur les plants de tomate Tomate de serre : L 3 cas dans le traitement R. solani - ancienne formulation @ 106 spores/ml L 4 cas dans le traitement R. solani - ancienne formulation @ 107 spores/ml L 4 cas dans le traitement tmoin R. solani
Hauteur moy (mm)
% germination
Poids frais (g)
150 120 90 60 30 0
132 94 54 19 22 1 22 1 93
125 96 73 44 28 9 2 39 5
Tomate
RS
Rs-106-A
Rs-106-N
Rs-107-A
Rs-107-N
Traitements
Figure 17. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en prsence de Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Tomate vs V. dahliae Tous les rsultats sont similaires au tmoin V. dahliae et lgrement suprieurs au tmoin plante, la souche de V. dahliae nayant srement pas t trs active dans le sol puisque aucune diffrence na t enregistre entre les traitements. Selon le tableau 9, Verticillium a t observ uniquement dans le tmoin V. dahliae et mme Trichoderma na pas ou peu t observ.
Hauteur moy (mm) 160 120 80 40 0

19 19 132 94 144 141
% germination
149
Poids frais (g)

146 150
89
89
83 56 21 27 16
94
21
Tomate
Vd
Vd-106-A
Vd-106-N
Vd-107-A
Vd-107-N
Traitements
Figure 18. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en prsence de Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose.
Tomate vs P. ultimum Pythium ultimum a t isol des racines du tmoin P. ultimum et des traitements Pu-106-N et Pu-107-N. Hors, lorsquon consulte la figure 19, ce sont les 3 traitements qui ont le mieux fonctionn. Pythium aurait-il eu un effet de stimulateur de croissance dans ces cas? Est-ce leffet de la nouvelle formulation du milieu de culture? Ou un effet de Trichoderma sur la plante puisque ces valeurs se rapprochent de celles observes lorsque seul Trichoderma est ajout au substrat (fig. 16). Par contre, tous les traitements ont t suprieurs au tmoin plante.
Hauteur moy (mm) 200 150 100 50 0 Tomate Pu Pu-106-A Pu-106-N Pu-107-A Pu-107-N
132 94 78 19 20 170 149
% germination
Poids frais (g)
162
147 94
154 89 24 28
72 18
61 17
Traitements
Figure 19. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en prsence de Pythium ultimum. Pu = Pythium ultimum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. 4.3.3 Muflier
Muflier vs Trichoderma Trichoderma ne semble pas autant stimuler la croissance du muflier lorsque compar au concombre (fig. 12) et la tomate (fig. 16), et mme la concentration de 106 cfu/ml, les rsultats sont infrieurs ou gaux au tmoin plante. Pourtant, lorsquon consulte le tableau 9, Trichoderma tait prsent au niveau racinaire. Le traitement T20-107-A semble le plus efficace.
Hauteur moy (mm) 120 100 80 60 40 20 0 Muflier

5 5 84 89 74 72
% germination
Poids frais (g)
99 85 83
89
97 78
T20-106-A
T20-106-N
T20-107-A
T20-107-N
Traitements
Figure 20. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en absence dagents pathognes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Muflier vs R. solani Sur le muflier, R. solani semble actif tandis que le pouvoir de comptition de Trichoderma envers Rhizoctonia semble amenuis car dans tous les traitements, les rsultats sont infrieurs au tmoin R. solani et au tmoin plante, laissant prsager une forte agressivit de R. solani sur les racines des plants. Pourtant, le tableau 9 spcifie une prsence importante de R. solani et de Trichoderma lors de lisolement racinaire. Peut-tre que Trichoderma a lutt activement contre Rhizoctonia, au dtriment de protger les racines?
Hauteur moy (mm) 100 80 60 40 20 0 Muflier RS Rs-106-A Rs-106-N Rs-107-A Rs-107-N
5 2 4 5 3 4 84 89
% germination
83
Poids frais (g)
76
67
70
61
63
61
72 62
72
Traitements
Figure 21. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en prsence de Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose.
Muflier vs V. dahliae Verticillium a sembl agir seulement dans le tmoin V. dahliae car dans les autres traitements, les rsultats sont suprieurs au tmoin V. dahliae et gaux ou suprieurs au tmoin plante. De plus, la prsence de V. dahliae a t observe uniquement dans le tmoin lors des isolements racinaires (tab. 9). Dans ces cas, on peut supposer une action de Trichoderma au niveau des racines pour combattre lagent pathogne. Par contre, peu de diffrences ont t obtenues entre les traitements mais le traitement Vd-106-N semble un peu plus efficace que les autres.
Hauteur moy (mm) 120
84 89
% germination
Poids frais (g)

100 82 86
94 73 81
94
96
89
89
90 60 30 0
5
10
Muflier
Vd
Vd-106-A
Vd-106-N
Vd-107-A
Vd-107-N
Traitements
Figure 22. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en prsence de Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose.Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Muflier vs P. ultimum Tous les traitements ont dmontr des rendements suprieurs au tmoin Pythium. Par contre, lorsque compar au tmoin plante, les rsultats sont soit infrieurs. Il y a srement une lutte entre les deux antagonistes car les rsultats sont quand mme suprieurs ceux obtenus avec le tmoin Pythium sauf que le dveloppement du muflier semble affect. Des cas de fontes de semis ont dailleurs t nots dans le tmoin Pythium et dans la formulation Pu-106-A. Cas de fontes de semis observs sur les plants de muflier Muflier : L 2 cas dans le traitement tmoin Pythium ultimum L 1 cas dans le traitement P. ultimum - ancienne formulation @ 106 spores/ml
Hauteur moy (mm) 120

84 89
% germination
Poids frais (g)
90 60 30 0
5
83 67
77 78
83
72
81 78
72
83
Muflier
Pu
Pu-106-A
Pu-106-N
Pu-107-A
Pu-107-N
Traitements
Figure 23. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en prsence de Pythium ultimum. Pu = Pythium ultimum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose.Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture base de cellulose. Les tableaux 11 et 12 rsument les rsultats obtenus lorsquon compare les traitements effectus au tmoin ngatif ou au tmoin plante. Trichoderma devrait tre produit sur un milieu de culture contenant de la cellulose (milieu de culture sous la Nouvelle formulation) et la concentration 106 cfu/ml devrait tre privilgie. Dans le cas des tandems Tomate R. solani et Muflier Pythium, les rsultats ngatifs obtenus lorsque compar au tmoin plante suggre que Trichoderma a de la difficult lutter contre lagent pathogne et que la lutte seffectue au dtriment de la plante puisque que son dveloppement est ralenti. Tableau 11. Synthse des rsultats obtenus en serre exprimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque compar au tmoin ngatif. Agent biologique ou pathogne Trichoderma R. solani V. dahliae P. ultimum ou aphanidermatum Lgende Concombre +++ 106 N +++ 107 N +++ 106 N +++ 106 N Tomate +++ 106 N +++ 106 N ----Muflier +++ 107 A --+++ 106 N +++ 106 N
+++ = Les traitements ont donn des rsultats suprieurs au tmoin ngatif --- = Les traitements ont donn des rsultats infrieurs au tmoin ngatif 106 = centration de Trichoderma N = Nouveau milieu de culture base de cellulose A = Ancienne formulation du milieu de culture
Tableau 12. Synthse des rsultats obtenus en serre exprimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque compar au tmoin plante. Agent biologique ou pathogne Trichoderma R. solani V. dahliae P. ultimum ou aphanidermatum Lgende +++ = Les traitements ont donn des rsultats suprieurs au tmoin plante --- = Les traitements ont donn des rsultats infrieurs au tmoin plante Concombre +++ +++ +++ +++ Tomate +++ ----+++ Muflier +++ --+++ ---
5.
CONCLUSIONS
La composition dun milieu de culture pour cultiver les champignons est un facteur important puisquelle influence et la quantit et la qualit des spores. Pour Trichoderma, il tait donc primordial damliorer la qualit nutritionnelle du milieu de base employ pour sa multiplication. Suite ce projet, il apparat que Trichoderma peut tre cultiv en ajoutant au milieu de culture une source de cellulose. En se dgradant, celle-ci libre du glucose qui est facilement assimilable pour lagent dgradeur, dans ce cas-ci, Trichoderma. La cellulose raffine (microcristalline; 22 microns) a fourni de meilleures conditions de croissance que les celluloses de type grossire ou moyenne. En incorporant galement une source de sucre au milieu de base, Trichoderma semble bnficier dune source nutritive supplmentaire, le rendant encore plus performant. La modification du milieu de culture de base a galement permis de supprimer la source de carbonate de calcium qui se trouvait lever le pH et ralentir le dveloppement de Trichoderma. Ainsi, le nouveau milieu nutritif pour cultiver Trichoderma se compose de : PDA (15 g / l), 200 ml de jus V8 non-modifi, 1,5% de cellulose de type raffine, 0,1% de sucrose et de 800 ml deau distille par litre de milieu. Selon la plante, Trichoderma est efficace contre la majorit des agents pathognes tests in vitro et en serre exprimentale. Trichoderma crot galement trs rapidement sur un milieu de culture, ce qui devrait lavantager lors des confrontations in situ et pour la colonisation rapide des niches cologiques. Trichoderma devra tre ajout au substrat une concentration de 106 cfu/g de sol. Trichoderma, lorsquil est ajout au substrat, nest pas pathogne pour les plante; il peut mme stimuler le dveloppement de celles-ci lorsquil est appliqu une concentration suprieure 106 cfu/g de sol. Pour le producteur, il est plus avantageux de permettre lagent de lutte biologique de stablir priori dans les substrats avant larrive des agents pathognes. En permettant Trichoderma de coloniser la rhizosphre en premier lieu, celui-ci pourra crer plus facilement son manchon protecteur autour du systme racinaire empchant ainsi, aux diffrents agents pathognes potentiels, laccs aux sites recherchs. Par le fait mme, la rpression de lennemi combattre est facilite. Par contre, dans le cas de Pythium chez le muflier et de Rhizoctonia chez la tomate, la lutte avec Trichoderma semble plus ardue puisque les traitements ont donn des rsultats infrieurs au tmoin plante mme sils avaient t suprieurs lorsque compar au tmoin ngatif. Chez la tomate, la lutte semble galement inefficace lorsque Verticillium est prsent tandis que chez le muflier, la mme situation est observe avec Rhizoctonia. Dans ces deux cas, la croissance des plantes est ralentie. La prsence dun agent de lutte biologique dans un terreau : Favorise le dveloppement de la plante; Assure une protection accrue du systme racinaire; Prvient des pertes de rendement pour le producteur; Diminue lutilisation de pesticides chimiques de synthse utiliss pour combattre les agents pathognes; Rduit la pollution de lenvironnement.
Annexe 1. Barme de pondration employ lors de l'valuation de Trichoderma suite au test de confrontation en Ptri. Critres de dcision 1. Temps requis pour obtenir la zone de contact Temps (jours) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 8 7 6 5 4 3 2 1
Poids associ 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 2. Mesure (mm) de la zone de contact * Mesure (mm) Poids associ 0-10 9
11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 8 7 6 5 4 3 2 1
* La croissance radiale mesure (mm) partir du centre de la pastille de glose du Trichoderma jusqu la zone de contact entre les deux champignons (Trichoderma et l'agent pathogne). Le diamtre d'une bote de Ptri tant de 85 mm. 3. Zone dinhibition (intensit de la coloration)** Coloration aucune jaune trs ple - ple + ++ +++ ++++ Poids 0 1 2 3 4 5
** La prsence de la zone dinhibition entre les deux champignons (Trichoderma et l'agent pathogne) ltude est note par lintensit de la coloration la zone de contact (aucune coloration orange en passant par diffrentes intensits de jaune)
4. Sporulation dense et/ou diffrente au contact *** Sporulation aucune sporulation dense ou diffrente sporulation dense et diffrente Poids 0 1 2
5. Prsence ou absence de zone claire au contact Zone claire aucune prsence Poids 0 1
*** La sporulation diffrente au contact se manifeste par un aspect floconneux des hyphes de Trichoderma.
6. Envahissement du Trichoderma sur l'agent pathogne ou vice et versa
7. Intensit de sporulation du Trichoderma sur l'agent pathogne **** Intensit aucune faible moyen fort Poids 0 1 2 3
Envahissement aucun par les cts direct mais limit direct mais intense direct mais total
Poids 0 1 2 3 4
**** Le poids associ est ngatif quand cest l'agent pathogne qui envahit Trichoderma.
Annexe 2. Dispositif exprimental utilis dans la serre exprimentale Table 1 Tomate : (1-107 A) (3-106 A) (2-107 N) (T20-106 A) (T20-106 N) (3-106 N) (3-107 A) (1-106 A) (VD) (PU) (2-107 A) (T20-107 A) (T20-107 N) (1-107 N) (2-106 A) (1-106 N) (3-107 N) (1106 N) (RS) (TO) Muflier : (1-107 A) (3-107 A) (2-107 N) (T20-106 A) (PU) (1-107 N) (3-106 A) (T20-106 N) (3-107 N) (T20-107 A) (2-107 A) (RS) (3-106 N) (1-106 A) (VD) (MU) (2-106 A) (1-106 N) (T20-107 N) (1-106 N) Concombre : (PA) (3-106 N) (CO) (T20-106 N) (T20-107 A) (T20-107 N) (3-106 A) (1-106 A) (1-107 A) (1-106 N) (3-107 N) (T20-106 A) (2-107 A) (1-106 N) (VD) (2-106 A) (3-107 A) (2107 N) (1-107 N) (RS) Table 2 Concombre : (2-107 A) (3-106 A) (1-107 N) (2-107 N) (1-106 N) (T20-107 A) (T20-107 N) (3107 A) (T20-106 N) (CO) (T20-106 A) (3-107 N) (2-106 A) (3-106 N) (1-106 A) (RS) (1-106 N) (1-107 A) (PA) (VD) Tomate : (T20-107 A) (TO) (1-106 N) (1-107 N) (3-106 N) (PU) (T20-106 A) (T20-107 N) (1107 A) (RS) (2-106 A) (2-107 N) (3-107 N) (1-106 N) (1-106 A) (3-106 A) (VD) (2-107 A) (3107 A) (T20-106 N) Muflier : (PU) (2-106 A) (1-106 A) (2-107 A) (2-107 N) (1-107 N) (3-107 N) (3-106 N) (RS) (T20-106 A) (3-107 A) (T20-107 A) (1-106 N) (1-107 N) (T20-107 N) (T20-106 N) (VD) (1-107 A) (MU) (3-106 A) Table 3 Muflier : (PU) (RS) (1-106 N) (T20-107 A) (3-106 N) (2-106 A) (3-107 N) (T20-106 N) (1-106 A) (T20-106 A) (1-107 N) (3-106 A) (1-107 A) (VD) (1-107 A) (MU) (2-107 N) (T20-107 N) (2107 A) (3-107 A) Concombre : (2-107 N) (3-107 N) (RS) (T20-106 N) (PA) (1-107 N) (1-106 A) (VD) (2-106 A) (1-106 N) (2-107 A) (3-106 N) (CO) (3-106 A) (T20-106 A) (T20-107 N) (1-106 N) (1-107 A) (3-107 A) (T20-107 A) Tomate : (2-106 A) (RS) (2-107 N) (PU) (1-107 N) (3-106 A) (T20-107 N) (T20-106 N) (1-106 N) (2-107 A) (T20-106 A) (1-106 N) (VD) (1-106 A) (3-107 N) (3-106 N) (T20-107 A) (TO) (1107 A) (3-107 A)
Lgende : Plantes Co = concombre Mu = muflier To = Tomate Agents pathognes R. s. = Rhizoctonia solani V. d. = Verticillium dahliae P. u. = Pythium ultimum P. a. Pythium aphanidermatum systme ltude 1 = Trichoderma + R. solani 2 = Trichoderma + V. dahliae 3 = Trichoderma + P. ultimum ou P. aphanidermatum Concentration 106 = 106 spores / ml 107 = 107 spores / ml A = ancienne formulation N = nouvelle formulation

Rapport - Final Milieu de Culture

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Amlioration des qualits nutritionnelles du milieu de culture utilis pour produire Trichoderma, afin den maximiser le potentiel antagoniste

Rapport final de recherche

Prsent au CRAAQ (Centre de rfrence en agriculture et agroalimentaire du Qubec)

Prsent par Mmes Johanne Caron et Lucie Laverdire Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 3 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 6 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 7 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 8 sur 44 Horti-Protection inc.

MATRIEL ET MTHODES Production de la biomasse de Trichoderma

Tests en serre exprimentale

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 10 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 11 sur 44 Horti-Protection inc.

Taux de croissance journalire (mm)

Taux de croissance journalire (mm)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 13 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 14 sur 44 Horti-Protection inc.

Taux de croissance journalire (mm)

Exprience #5 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu eau et agar

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 15 sur 44 Horti-Protection inc.

100 Taux de croissance journalire (mm) 80 60 40 20 0

Taux de croissance journalire (mm)

Taux de croissance journalire (mm)

Taux de croissance journalire (mm)

Exprience #9 Ajouts de diffrentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 18 sur 44 Horti-Protection inc.

Taux de croissance journalire (mm)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 19 sur 44 Horti-Protection inc.

Nombre de jours pour atteindre la croissance radiale maximale en Ptri 5 5 5 4 3 3 3 3 3

croissance radiale moyenne aprs 2 jours (mm) rep 1 rep 2

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 20 sur 44 Horti-Protection inc.

3.29 3.41 3.48 3.41

1.16 1.03 1.20 1.25

100 80 60 40 20 0 #1 - #1 - #1 - #1 - #1 - #2 - #2 - #2 - #2 - #2 - #3 - #3 - #3 - #3 - #3 0 .5 1 1.5 2 0 .5 1 1.5 2 0 .5 1 1.5 2

Taux de croissance journalire (mm)

Concentration (%) et type de cellulose

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 22 sur 44 Horti-Protection inc.

Nombre de jours pour atteindre la croissance radiale maximale en Ptri 3 3 3 3 3 3 3 3

croissance radiale moyenne aprs 2 jours (mm) 48 46 47 53 56 61 50 52 45 46 50 51 57 60 48 51 48 48 46 52 57 63 48 53

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 23 sur 44 Horti-Protection inc.

100 80 60 40 20 0 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1 #2 - #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - #3 - 2 Tem 1.5 1.5 PDAV8

Taux de croissance journalire (mm)

Concentration (%) et type de cellulose

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 24 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 25 sur 44 Horti-Protection inc.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 26 sur 44 Horti-Protection inc.

Tests en serre exprimentale

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 28 sur 44 Horti-Protection inc.

Hauteur moy (mm)

Poids frais (g) 150 153 100 100

175 150 125 100 75 50 25 0

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 29 sur 44 Horti-Protection inc.

Hauteur moy (mm)

Poids frais (g)

250 200 150 100 50 0

209 141 83 47 100 44 142 100 39

Hauteur moy (mm)

Poids frais (g)

150 100 50 0 Concombre

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 31 sur 44 Horti-Protection inc.

P. ultimum = Pythium ultimum R. solani = Rhizoctonia solani V. dahliae = Verticillium dahliae

200 150 100 50 0 Tomate

Hauteur moy (mm)

Poids frais (g)