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Laboratrio de engenharia bioqumica

Aula 3 exp 2: Produo de Invertase por Saccharomyces cerevisiae em Biorreator de Bancada

Lorena 2013
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Mayra Assumpo Calazans 5989600 Amilcar Pereira Cardoso 6769113

PRODUO DE INVERTASE POR SACCHAROMYCES CEREVISAE EM BIORREATOR DE BANCADA

Relatrio II apresentado disciplina de Laboratrio de Engenharia curso de Bioqumica, engenharia Escola de Lorena de -

Bioqumica, Engenharia

Universidade de So Paulo, com nota parcial da

disciplina.

Prof. Rita de Cassia L.B. Rodrigues Prof. Andr Ferraz

Sumrio
Objetivo ......................................................................................................................................... 4 Introduo ..................................................................................................................................... 4 Materiais ....................................................................................................................................... 7 3.1) Preparo do Inculo e Meio de Cultivo (YEPD): .................................................................. 7 3.2)Produo de Invertase por Sacharomyces cerevisae em biorreator de batelada: ............. 8 3.3) Reagentes........................................................................................................................... 8 Mtodos ........................................................................................................................................ 9 4.1) Mtodo de produo de inoculo realizada dentro de uma cmera de fluxo laminar ....... 9 4.2) Produo de invertase por Saccharomyces cerevisae em biorreator de bancada............ 9 4.3) Mtodos analticos para concentrao celular .................................................................. 9 4.4) Mtodo do cido dinitrosaliclico (DNS) Miller (1959).................................................. 10 Resultados e discusso ................................................................................................................ 11 Concluso .................................................................................................................................... 18 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................................... 19

Objetivo
Apresentar aos alunos os procedimentos bsicos para crescer um inculo da levedura Saccharomyces cerevisiae e a partir de ento, iniciar em um reator de bancada o cultivo desta levedura para se produzir a invertase. Analisou-se o crescimento celular por turbidimetria e consumo da glicose (substrato) por colorimeria, mtodo DNS, do cultivo. Alm disso, analisouse as condies de cultivo, e consumo de substrato da levedura no reator. Com esses dados, pode-se calcular o rendimento em clulas e produtividade celular da reao.

Introduo
Bactrias e fungos realizam os processos fermentativos, que podem ser operados em diferentes modos (descontnuo (batelada), descontnuo alimentado, semi-contnuo e contnuo). As Saccharomyces cerevisiae so as mais importantes leveduras responsveis pela fermentao alcolica, por serem mais viveis, mesmo no sendo as nicas. As Saccharomyces cerevisiae so eucariontes unicelulares com dimetro de 2 a 8 micrmetros so muito exploradas industrialmente, como na industria de panificao e de bebidas. Esse fungo utilizado como fermento biolgico, por liberar dixido de carbono, por exemplo, na massa de po, fazendo-a crescer. No caso das bebidas alcolicas produzidas pelo processo de fermentao, converte o acar em lcool etlico e tambm pode contribuir na formao de constituintes secundrios responsveis pelo sabor - o caso da cerveja, rum e usque. O perfil de crescimento celular pode ser dividido em algumas fases, 1 Fase LAG, 2 Fase LOG, 3 Fase Estacionria, 4 Fase Declnio. Como se v no grfico abaixo.

Figura 1: curva de crescimento microbiano. 1 Fase - LAG- fase de adaptao ou reconhecimento, quanto ao meio ambiente e condies favorveis. Nessa fase no h crescimento. 2 Fase - LOG- O crescimento microbiano exponencial. A bactria est em pleno desenvolvimento, os nutrientes em excesso, permitem uma rpida multiplicao. 3 Fase - Estacionria- O crescimento bacteriano faz uma parada, devido ao esgotamento dos nutrientes. H agora pouco nutriente, maior concorrncia, menor crescimento. A taxa de morte se iguala ao de crescimento, 50%. 4 Fase - Declnio- H excessiva produo de metablito, falta de nutrientes, ocorrendo a perda irreversvel da capacidade de diviso celular (morte celular), originando um decrscimo da concentrao de clulas viveis na populao microbiana. A glicose, por ser uma fonte de carbono elaborada, muito utilizada por microorganismos como fonte muito rica em energia. A partir da via glicoltica temos a degradao da glicose como substrato formando lcool como produto. Alm de energia, devese controlar fatores qumicos (como pH, oxigenao, nutrientes e inibidores) e fsicos (temperatura, presso e agitao), para que o rendimento e a eficincia da transformao do acar em etanol sejam otimizados. A energia utilizada para o crescimento dessas leveduras provm da fermentao alcolica, resultante da oxidao das hexoses que tem como produto etanol e CO2. Abaixo podemos ver como as reaes ocorrem. 5

Figura 2: Via glicoltica

As duas molculas de piruvato formadas na via glicoltica podem seguir caminhos diferentes conforma as condies do meio. Em condies aerbicas, so oxidadas na via do cido ctrico tendo como produto final CO2 e H2O. Mas, em meio anaerbio o piruvato sofre fermentao alcolica tendo como produtos principais CO2 e etanol.

Figura 3: Formao do etanol a partir da molcula de piruvato. Estudando bem um processo fermentativo, e sabendo a bioqumica dessa fermentao, possibilita-se conhecer todos os produtos e subprodutos gerados alm de possibilitar o clculo dos rendimentos do processo.Conforme se conhece a cintica e a curva de ajuste da reao pode comparar os resultados obtidos conforme as diferente variantes do experimento so mudadas.

Figura 4: Grfico do comportamento cintico do comportamento da massa microbiana (X), substrato (S) e Produto (P) ao longo do tempo de fermentao.

Considerando um determinado tempo t de fermentao e os correspondentes valores de X, S e P pode-se calcular os fatores de converso do processo fermentativo: Fator de converso de Substrato em Biomassa: YX/S = dX/dS => YX/S = (X-X0)/(S0-S)

Fator de converso de Substrato em Produto: YP/S = dP/dS => (P-P0) /(S-S0)

Fator de converso de Biomassa em Produto: Yp/x = dP/dX => (P-P0)/ (X0-X) = (massa produto-g)/( biomassa celular (g))

Produtividade em biomassa:produo mdia (clulas ou produto) referente ao tempo total ou final da fermentao PX= dX/tf => PX= (Xm X0)/ tf

Materiais

3.1) Preparo do Inculo e Meio de Cultivo (YEPD): 1) 1 frasco erlenmeyer de 500 mL com rolha de algodo 2)Proveta de 200 mL 3)Pipetas/ponteiras esterilizadas 4)Cubeta de vidro 7

5)Espectrofotmetro Biospectro SP-22 (DO600nm) 6)Cmera assptica (fluxo laminar) 7)Autoclave 8)Vidrarias para preparo dos meios de cultivo 9)Meio de cultivo YEPD esterelizado

3.2)Produo de Invertase por Sacharomyces cerevisae em biorreator de batelada: 1)Vidrarias para preparo dos meios de cultivo e manipulao destes meios para o reator de bancada 2)Fermentador NBS FIOFLO III 3)Eletrodo de pH 4)Sonda de oxignio dissolvido 5)Meio de cultivo YEPD 6)Autoclave 7)Espectrofotmetro Biospectro SP-22 (DO600nm) 8)Cmera assptica (fluxo laminar) 9)Frasco de centrfuga 10)Centrfuga ECCO 11)Frasco para armazenar o sobrenadante 12)Pipetas/ponteiras esterelizadas 13)Cubeta de vidro 14)Funil de vidro

3.3) Reagentes 1)cido dinitrosaliclico (DNS); 2)NaOH 2 N; 3)Tartarato duplo de sdio e potssio (Sal de Rochelle); 4)Glicose ou uma mistura de frutose e glicose (10mM).

Mtodos
4.1) Mtodo de produo de inoculo realizada dentro de uma cmera de fluxo laminar Adicionou-se, em frasco erlenmeyer de 500 mL com tampo de algodo, 100 mL do meio YEPD (esterilizado), cerca de 3,75g de Saccharomyces cerevisae (1/4 de um tablete de 15g) assepticamente homogeneizou-se a soluo e logo em seguida o erlenmeyer foi transferido para um shaker a 30C, agitao 200 rpm, onde passou aproximadamente 18 horas. No dia seguinte, utilizou-se o mesmo meio de cultivo esterilizado como branco no espectrofotmetro. Assepticamente, removeu-se uma pequena quantidade desse inculo que na cubeta de vidro mediu-se a absorbncia das clulas a 600 nm (DO600). Para isso, foram feitas as diluies necessrias, assegurando que o espectrofotmetro SP-22 Bioespectro estavivesse na faixa linear (absorbncia < 0,6). Com o auxilio da curva padro massa seca x absorbncia, chegou-se ao valor desejado de 0,5g/L de clulas. Transferiu-se para o reator de bancada o volume necessrio.

4.2) Produo de invertase por Saccharomyces cerevisae em biorreator de bancada De acordo com o protocolo do EXP1 , preparou-se eoperou-se o biorreator, adicionando-se ao mesmo,de forma assptica, o meio de cultura. Sendo-se que 10.0 ml deste meio foi reservado (sem clulas), para o controle. Para iniciar o processo, seguiu-se novamente o protocolo do EXP 1, para se fazer a calibrao das sondas de pH, do oxignio dissolvido, para se ajustar a agitao a 300 rpm e a aerao para 0,6 vvm. Depois destes passos, inoculo-se o fermentador, anotando-se para controle a hora, pH, temperatura, oxignio dissolvido antes de retirar todas as amostras necessrias. De tempos definidos previamente retirou-se algumas amostras e anotou-se os parmetros necessrios.

4.3) Mtodos analticos para concentrao celular Retirou-se e diluiu-se uma alquota da amostra com clulas (Ti), para que estivesse dentro da linearidade da curva padro, o mesmo foi feito com o branco. O espectrofotmetro foi zerado a 600 nm com gua destilada e foi feito as leituras de ambas amostras. O restante da amostra centrifugou-se, e o sobrenadante guardado em freezer para depois ser analisadoa quantidade de aucares redutores totais (mtodo DNS). Traou-se as curvas de concentrao

celular em funo do tempo de retirada das amostras e com ela calculou-se a fase exponencial de crescimento celular.

4.4) Mtodo do cido dinitrosaliclico (DNS) Miller (1959) 4.4.1) preparao do reagente DNS O reagente DNS preparado adicionando-se 50,0 mL de hidrxido de sdio (NaOH) a 2 N a 2,5 g de DNS e cerca de 125 mL de gua destilada, agitando-se at a dissoluo total. Posteriormente adiciona-se 75 g do sal de Rochelle e completa-se o volume da soluo para 250,0 mL. importante observar que este reagente instvel na presena de luz e CO2.

4.4.2) Obteno da curva padro Conforme a tabela abaixo, aps adio do reagente de DNS, agitou-se a mistura e levou os tubos ao banho-maria a 100C por 5 minutos. Deixou-se esfriar e realizou a leitura no espectrofotmetro a 540 nm, os dados obtidos foram utilizados para a obteno da curva padro.

Tubos 1 2 3 4 5

Glicose (0.225g/L)ml 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

gua (ml) 1.1 0.9 0.7 0.5 0.3

DNS(ml) 3 3 3 3 3

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Resultados e discusso
Neste relatrio os resultados visam quantificar o metabolismo de glicose pela levedura Saccharomyces cerevisae em massa seca. Portanto no foi quantificado o produto dessa fermentao. Neste processo foi utilizada uma concentrao celular 1g/L de inoculo. O primeiro passo feito foi montar o reator de acordo com o protocolo passado e aprendido em aula para iniciar a fermentao. Para poder iniciara fermentao calculamos a quantidade de inoculo a se iniciar o reator. Para isto foi utilizada uma equao (1), que nos foi dada pela professora, para calculara relao entre massa seca e absorbncia. Esta foi obtida atravs de valores conhecidos de concentrao inoculo que foram analisados no espectrofotmetro e pode ser vista no grfico da Figura 1, e : Equao 1: Y = 1,1193*X + 0,0069 , R = 0,9997

onde Y a absorbncia e X a concentrao celular no inoculo em g/L. Uma amostra foi retirada da soluo de inoculo, diluda na proporo 1:500 (1mL de inoculo para 500mL de gua deionizada) e lida no espectrofotmetro. O resultado para a densidade tica obtido foi 0,061 (=Y). Este Y foi substitudo na equao, e multiplicado pela diluio, e a concentrao celular obtida para a concentrao do inoculo foi 24,17g/L.

Para achar o volume necessrio para obter 1g/L foi feito:

Como 0,62mL provavelmente no afetaria significativamente os resultados o volume utilizado foi aproximado para 42 mL, que foi o utilizado, e iniciou-se a fermentao.

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Figura1 - Curva Turbidimtrica


0.6 0.5

Absorbncia 600nm

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Concentrao de clulas (mg/mL) Os resultados e dados recolhidos na fermentao podem ser vistos na Tabela 1.

Tabela 1 Dados experimentais e concentraes celular e de glicose calculada

Te mp o (ho ras) 0

Am ostr a

Volume de amostra (mL)

D.O.600
nm

pH

Tem pera tura (C)

% Oxignio Dissolvid o

Agita o (rpm)

Flux

Concentra Concentra celular o de Glicose (mg/mL)

o de o ar (vvm )

(mg/mL)

Ti

0,0570

5,8 8

30

94

300

0,59 4

0,891

20,000

0,5

t1

6,75

0,0631

5,7

29,9

300

0,60 1

1,002

19,825

t2

6,9

0,0760

5,4 4

30

1,9

299

0,60 1

1,235

20,025

t3

7,3

0,1420

4,9 1

30

0,5

300

0,58 3

2,414

19,225

t4

0,0780

4,2 6

30

0,7

299

0,50 1

3,087

8,475

t5

0,1230

4,1

30,9

0,5

299

0,68

5,186

1,823 12

1 5 t6 6,5 0,1220 4,2 29,9 0,8 300

4 0,50 4 5,142 2,063

t7

7,2

0,1770

4,2 6

30,1

0,7

300

0,59

4,918

0,854

8 10

t8 t9

7 7,5

0,1280 0,1410

4,4 4,6 1

30 30

0,6 0,5

300 300

0,6 0,59 5

5,409 5,990

1,508 1,459

O grfico da Figura 2 relaciona a concentrao celular com o tempo de fermentao. Como pode ser visto h um crescimento celular durante as primeiras 4 horas de fermentao. Porm, entre a 4 e 6 horas h uma pequena queda e o crescimento retomado novamente, de maneira menor e quase estvel, aps a 6 hora. As opes mais viveis que podem ter induzido esta irregularidade so ; uma e foi a adio de antiespumante na 4 hora de fermentao e outra o fato de vrias pessoas terem manipulado e conduzido os experimentos. A segunda pode refletir uma discrepncia devido percepo diferente de cada individuo que recolheu e manipulou a amostra. E por ultimo uma variao no fluxo de ar, como mostra o grfico da Figura 7, pode ter inibido a ao da levedura.

Figura 2 - Perfil de crescimento celular com o tempo


7 6

Concentrao celular (mg/mL)

5 4 3 2 1 0 0 2 Concentrao celular (mg/mL)

Tempo (horas)

10

13

Em uma fermentao caracterstica so esperadas 4 fases caractersticas quando se analisa o crescimento celular, so essas: fase lag, logartmica (ou log), estacionaria e de declnio (ou lise). Porm, como mostra o grfico da Figura 2, observamos claramente apenas a fase log. A fase lag provavelmente no pode ser vista pois a concentrao inicial de inoculo foi muito elevada. As fases estacionaria e de declnio no esto aparentes. Embora a concentrao celular esteja tendendo a uma estabilizao o tempo adotado provavelmente deveria ser mais longo. Alm disso, a irregularidade inesperada apresentada aps 4 horas provavelmente interferiu na fermentao. Para a quantificao da glicose foi feita uma curva padro de DNS, que tem o mesmo principio da curva turbidimtrica, para achar uma equao de reta padro. Para isto foram utilizadas concentraes conhecidas de glicose. O grfico da Figura 3 mostra esta curva que originou a Equao 2. Equao 2: Y = 3,8625X - 0,2538, R2 = 0,9999; sendo Y = absorbncia e X = concentrao de glicose.

Figura 3 - Curva padro de DNS


1.6 1.4 Absorbncia 540 nm 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 mg de glicose

O grfico da Figura 4 apresenta o consumo de glicose e mostra que aps 4 horas a concentrao de glicose esta tendendo ao seu fim, concordando com o grfico da Figura 2 que mostra que aps 4 horas a concentrao celular tende a se estabilizar. Na quinta hora aparece uma anormalidade, que tambm concorda com o grfico da Figura 2, na qual a concentrao de glicose aumenta. Porm esta deve estar relacionada aos mesmos erros explanados acima, a adio de antiespumante, erro humano e/ou inibio pelo aumento do fluxo de ar. A tabela 2 mostra as absorbncias obtidas e que foram substitudas na Equao 2 para a obteno da concentrao de glicose. 14

Tabela 2 Dados e concentrao de glicose obtida Tubo Diluio Volume (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 01:50 01:50 01:50 01:10 01:10 01:10 01:05 01:05 01:05 0,1 0,1 0,1 1 1 1 1 1 1 0,359 0,365 0,245 1,059 0,028 0,065 0,01 0,212 0,197 Absorbncia Concentrao de glicose (mg/mL) 19,825 20,025 19,225 8,475 1,8225 2,0625 0,8538 1,5075 1,4588

Figura 4 - Perfil do consumo de Glicose (mg/mL) com o tempo


25

Concentrao de Glicose (mg/mL)

20

15 Concentrao de Glicose (mg/mL)

10

0 0 2 4 6 8 10 12

Tempo (horas)
Como a fermentao deste experimento alcolica a glicose consumida ser convertida em massa celular, etanol, dixido de carbono e em outros subprodutos, sendo que os ltimos variam de acordo com o meio. Neste experimento foi quantificada apenas a massa celular, e a partir deste dado podemos calcular o fator de rendimento (YX/S) e a produtividade (Px) do processo.

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O fator de rendimento indica que cada 1 grama de substrato metabolizado foi convertido a 0,275 gramas de massa celular, e a produtividade que gerados 0,5095 gramas por litro por hora de massa celular. Conforme pode ser visto na Tabela 1 outros parmetros foram monitorados para garantir a estabilidade da fermentao e confiabilidade dos dados obtidos. As figuras abaixo apresentam grficos que mostram a variao destes. O grfico da Figura 5 mostra que a porcentagem de oxignio dissolvido varia como esperado pois logo aps o inicio do processo j a o consumo pela levedura.

Figura 5 - Variao da porcentagem de oxigenio dissolvido


Porcentagem de oxigenio dissolvido 100 80 60 40 20 0 0 -20 2 4 6 Tempo (horas) 8 10 12

Figura 6 - Variao do pH
7 6 5 pH 4 3 2 1 0 0 2 4 6 Tempo (horas) 8 10 12 pH

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O grfico da Figura 7 mostra uma variao do fluxo de ar durante a 4 hora. Esta variao pode ter causado uma inibio na levedura.

Figura 7 - Variao do fluxo de ar (vvm)


0.8 0.7 Fluxo de ar (VVM) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 Tempo (horas) 8 10 12

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Concluso
Neste experimento foi possivel concluir que para que uma fermentacao ocorra dentro do esperado necessario que todos os cuidados sejam tomados. Assepsia, manuseio, utilizacao dos instrumentos e controle das veriavis, e calculos corretos para formularo meio, utilizar o inoculo e na colheta de dados. O perfil de crescimento celular traado mostrou que o cultivo da Saccharomyces cerevisiae rpido e dependendo da sua concentrao pode no haver fase de lag. Devido a algum fator que no pode ser estabelecido (na adio do antiespumante, erro humano ou na variao do fluxo de ar) houve uma queda e consequente retomada leve no crescimento massa celular. Acreditamos que se as medidas iniciais fossem feitas em intervalos menores de tempo, poderia ser estabelecida a fase lag. O fator de rendimento foi de 0,275g/g, portanto a clula converteu 27,5% do substrato em massa celular e a produtividade foi de 0,5095g/(L*h). Infelizmente estes valores no puderam ser comparados com outros na literatura pois no achamos referencias na literatura. Porm, se comparados com o do outro grupo, que teve rendimento de 0,308g/g e produtividade 0,504 g/(L*h), pode-se dizer que o fator de rendimento foi baixo, porem a produtividade foi similar. Oque significa que houve algum erro experimental de nossa parte, pois as condies eram muito similares.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

VOET, D.; VOET, J. G.; PRATT, C. M. Fundamentos de bioqumica: a vida em nvel molecular. Segunda Edio. Artmed. Porto Alegre, 2008.

CISTERNAS, J. R.; VARGA, J.; MONTE, O. Fundamentos de Bioqumica Experimental. Atheneu. So Paulo, 2005

NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. Fifth Edition. W. H. Freeman and Company. New York, 2008.

LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial, vol. 2 Engenharia Bioquimica. Editora Edgard Blcher Ltda. So Paulo, 2001.

LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial, vol. 3 Processos Fermentativos e Enzimticos. Editora Edgard Blcher Ltda. So Paulo, 2001.

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