MICROBIOLOGA INDUSTRIAL UNIDAD I MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Historia de la microbiologa industrial Perodo de ignorancia (Antes de 1800) Caverncolas: almacenaban carne para mejorar su sabor; producan bebidas intoxicantes a partir de frutas y granos (Fig.1). Perodo a. C.: Diversas civilizaciones producan queso, yogurt y salsas de leguminosas. Ao 4000 a. C.: pan, vino y cerveza. (48) Perodo de descubrimiento (1800 1900)
Fig.1 Caverncolas

Siglo XVIII: desarrollo del microscopio y descubrimiento de los microorganismos. Thenard sugiere que los microorganismos producen el alcohol del vino. Siglo XIX: Pasteur demostr que eran correctas las ideas de Thenard. Hansen aisl y propag cultivos de levadura (cervecera Carlsberg). Se descubre que algunas enfermedades son causadas por microorganismos, Emmerich y Low aislaron de bacterias la fiocianasa (primer antibitico). Primeros pasos para tratar aguas residuales con microorganismos. (48) Perodo de desarrollo industrial (Posterior a 1900) 1900 - 1950: desarrollo de procesos fermentativos industriales: fermentaciones alcohlicas, produccin de cidos actico, lctico, ctrico y glucnico, acetona, butanol y glicerol. Procesos aerbicos y anaerbicos. Durante la Segunda Guerra Mundial: produccin de penicilina. Durante la post-guerra: Se present un retroceso debido al crecimiento de la industria petroqumica Aos 60s: Avance importante debido a la investigacin para la produccin de masa microbiana como fuente de protena, por parte de compaas multinacionales. ltima fase de desarrollo: inicia con el desarrollo de las manipulaciones genticas de microorganismos in vitro, dando origen a la ingeniera gentica. (48) Calendario de eventos (segn Houwink, 1984) (48) 1 La era pre-Pasteur (antes de 1865): Bebidas alcohlicas (cerveza, vino) Productos lcteos (queso, yogurt) Otros alimentos fermentados UNIDAD I MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 1

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 2 La era Pasteur (1865-1940): Etanol, butanol, acetona, glicerol cidos orgnicos (cido ctrico) Tratamiento aerobio de agua residuales La era de los antibiticos (1940-1960): Penicilinas: tecnologa de la fermentacin sumergida Gran variedad de antibiticos Tecnologa de la estructura de la clula animal: vacunas contra virus Transformaciones microbiolgicas de esteroides La era de los post-antibiticos (1960-1975): Aminocidos Protena celular Enzimas (detergentes) Tecnologa de las clulas y las enzimas inmovilizadas (glucosa isomerasa) Tratamiento anaerobio de aguas de desecho Polisacridos bacterianos La era de la nueva biotecnologa (1975 -): Tecnologa de los hibridomas: anticuerpos monoclonales Pruebas diagnsticas con anticuerpos monoclonales (1980) Ingeniera gentica (1974) Vacunas de origen animal contra la diarrea (1982) Insulina humana (1982)

1.1 CONCEPTO Hace miles de aos cuando el hombre pasa de ser nmada a sedentario, una de sus principales preocupaciones fue contar con un abastecimiento seguro de alimentos y para lograr ese objetivo empieza a almacenarlos. Este mtodo con el cual trataba de mantener la existencia constante de alimentos debi causarle sorpresas y desilusiones por los procesos que siglos ms tarde conocera con el nombre de putrefaccin y fermentacin. (48) Los cambios que se producen en la fermentacin de diversos alimentos fueron pasando a formar parte de costumbres alimenticias de los pueblos antiguos. Como ya en el siglo XVII a.C. los sumerios producan una cerveza derivada de la cebada y otros cereales, era de esperarse que antes apareciera otra bebida fermentada a partir de agua y miel. El origen del vino se remota posiblemente antes del siglo XII a.C., pues ya en el siglo XI antes de nuestra Era el Faran Ramss III haba mandado plantar grandes viedos sobre Egipto. (48) Casi a la par de la aparicin de la agricultura, aparece la elaboracin del pan, la cual involucra una fermentacin por levaduras. De igual modo el yogurt y el queso requieren de la fermentacin de la leche. De esta manera, durante muchos siglos la humanidad consumi alimentos transformados por procesos de fermentacin sin llegar a tener idea de los agentes que producan los cambios de color, UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 2

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL olor, consistencia y sabor. Si bien se admita una transformacin de la materia, pues los sumerios llamaban bisurra a un tipo de cerveza (sur se traduce como fermentado). (48) Para el ao 1176 los alquimistas Salernus y Albertus Magnus ya hacan destilaciones para la obtencin del alcohol. A pesar de todo esto, an no tenan idea alguna de los agentes de transformacin ni de los productos que se originaban. Hoy en da, sabemos que la fermentacin implica una serie de reacciones xido-reduccin, gracias a las cuales los microorganismos obtienen su energa en condiciones anaerobias. Los anaerobios facultativos aprovechan la presencia de oxgeno para oxidar los productos de la fase anaerobia. Pero para llegar a la comprensin de estos conocimientos tuvieron que pasar siglos. (48) A finales del siglo XVI, en 1595 Libavius (Fig.2) propone la distincin entre putrefaccin y fermentacin.
(48)

Fig. 2 Libavius Fig. 3 Johan Joachim Becher

Un siglo despus el qumico Becher (Fig.3) expresa tales diferencias como procesos diferentes que empeoran o mejoran el sustrato. (48) En 1648, Helmont (Fig.4) seala la presencia de un gas que se desprenda durante la elaboracin del vino, al cual llamaron vinorium y que aos despus Wren identific como dixido de carbono, para entonces ya se aceptaba la presencia de azcares como parte fundamental del sustrato fermentativo. (48)
Fig.4 Helmont

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Fig.5 Anthon Van Leeuwenhoek

Fue Anthon Van Leeuwenhoek (Fig.5) (1632-1723), quien con su invencin del microscopio (Fig.6), di inicio al descubrimiento del maravilloso mundo de los microbios, describiendo una serie de animculos en forma de esferas, bastoncillos y espirilos, permitiendo con ello el desarrollo de la Microbiologa.
(48)

Fig.6 Microscopio

Fig. 7 Sthal

En el siglo XVII, se desarrollan diferentes teoras que se acercaban a la realidad como la de Sthal (Fig.7), que quera explicar la fermentacin como un proceso mecnico (48) : Un cuerpo atacado por la putrefaccin puede producir la descomposicin de otro todava no atacado por dicho proceso, as puede tal cuerpo, atacado ya por el movimiento interno, atacar a otro todava en reposo pero propenso a l

La palabra microbiologa esta formada por tres vocablos, micro, que viene del griego micros, pequeo; bio, que proviene del griego bios, que significa vida y loga de logos, cuyo significado se refiere al estudio o tratado. Por lo tanto Microbiologa Industrial es la ciencia que estudia los microorganismos y sus actividades dedicadas a la transformacin de materias primas (sustratos) en productos o subproductos de inters industrial con propsitos tiles y bien definidos.
(48)

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Mitscherlinch (Fig.8) y Helmholtz (Fig. 9) en el siglo XIX separan al agente fermentativo del vino por filtracin y reconocieron que se trataba de una levadura. La importancia de este hecho es que por fin se contaba con un mtodo, base de la investigacin y desarrollo cientfico.
Fig. 8 Mitscherlinch
(48)

Fig. 9 Helmholtz Fig.10 Luis Pasteur

Fu Pasteur (Fig.10), quien demuestra experimentalmente que tomando como base un filtrado de levaduras era posible la fermentacin en una solucin estril. Con esto no solo cambia el concepto de proceso de fermentacin, sino que al lograr caracterizar fisiolgicamente las bacterias y levaduras, introduce mtodos aspticos, medios mnimos de cultivos, requerimientos de oxgeno y nutrientes, y con esto d inicio a la qumica de las fermentaciones (Pirt 1975). De esta manera se descubre el misterio milenario de la fermentacin y se establecen los principios de la Microbiologa Industrial. (48)

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Fig. 11 Diferentes equipos utilizados por Pasteur

Los avances cientficos de finales del siglo XIX y principios del XX, permiten en 1928, a un mdico ingls, el profesor Fleming (Fig.12), observar como la contaminacin por un hongo en un cultivo de estafilococos detena la multiplicacin de este, segregaba una sustancia no solo capaz de detener el crecimiento de los estafilococos, sino tambin de un gran nmero de bacterias, este nuevo producto fue llamado penicilina (Fig. 13) y d principio a la industria de los antibiticos. (48)
Fig. 12 Alexander Fleming

Ya para entonces, funcionaba en los Estados Unidos de Norteamrica la primera industria bioqumica de fermentacin; Pfizer, que produca cido ctrico por fermentacin con Aspergillus nger como productor de este. Esta compaa, junto con Merck y Squibb, trabajaron durante la segunda Guerra Mundial con Penicillium crisogenum en tanques de cultivo consiguiendo aumentar 200 veces la produccin.
(48)

Fig. 13 Contenedor de Penicillium utilizado por Fleming

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Fig. 14 Aspergillus niger Fig. 15

Penicillium crisogenum

Fig. 16 Se muestra el inicio de la industria de los antibiticos.

Fig. 17 Diferentes etapas de crecimiento de Aspergillus niger.

No solo los antibiticos y el alcohol se producen por fermentacin. Desde un punto de vista tcnico se suele definir la fermentacin, como un conjunto de operaciones que permiten cultivar microorganismos y controlar sus actividades biosintticas, produccin de biomasa, enzimas, metabolitos y otras molculas orgnicas. (48) La fermentacin se define como un proceso producido por microorganismos que se multiplican, segregando productos de importancia para el hombre. La fermentacin puede llevarse a cabo por bacterias, levaduras y hongos. (48) Tambin se puede definir como un proceso metablico en el cual ocurren cambios qumicos en un sustrato orgnico por la actividad de enzimas secretadas por los microorganismos u otras clulas. Tales cambios dependen del tipo de organismo relacionado, la clase del sustrato y otros factores como el pH, temperatura, suministro de oxgeno, etc. (48)

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Con respecto al suministro de oxgeno se han llegado a distinguir dos tipos de fermentacin: Oxidativa: que equivale a la respiracin por la cual la desintegracin del sustrato se acompaa de oxgeno, que acta como aceptor de hidrgeno. Como ejemplo tenemos la fermentacin ctrica y glucnica. (40) Anaerobia: en la cual el oxgeno atmosfrico no forma parte del proceso sino que otras sustancias como el cido pirvico y los aldehdos funcionan como aceptores de hidrgeno. La produccin de alcohol por fermentacin as como la de cido lctico son ejemplos de este tipo de proceso. (40) En realidad la asimilacin oxidativa y la fosforilacin oxidativa son slo diferentes manifestaciones de un mismo fenmeno: la respiracin. (40) Independientemente del tipo de mecanismo de fermentacin debe de entenderse como el proceso por el cual un microorganismo es capaz de transformar un compuesto complejo (sustrato) en otro ms simple, y si este producto tiene una aplicacin til para el hombre, el estudio de este fenmeno caer dentro del campo de la Microbiologa Industrial. (40) 1.1.1 CIENCIAS DE APOYO Microbiologa general. Biotecnologa. Tecnologa de alimentos. Bioqumica. Matemticas. Agronoma. Qumica. Fisicoqumica. Medicina. Economa. Taxonoma. Petroqumica. Ecologa, entre otras. 1.1.2 PERSPECTIVAS Y APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Muchas sustancias muy valiosas econmicamente, son productos del metabolismo microbiano. Un ejemplo importante son los antibiticos. En 1975, las cifras del U.S. Tariff Comisin, sobre produccin y venta de qumicos medicinales, demostraron que en EE.UU. se elaboraron 8.5 millones de kilogramos de antibiticos a granel, es importante mencionar que la cantidad no incluye los farmacuticos destinados a pacientes (pldoras, cpsulas, tabletas y otros tipos de presentaciones) y solo en la produccin de penicilina fu de tres millones de kilogramos y dos millones de tetraciclnas. (40) Los antibiticos son nicamente uno de los productos de los microorganismos que tienen gran importancia industrial. Las buenas marchas de las industrias de las bebidas del vino dependen de la UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 8

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL capacidad de las levaduras para producir alcohol, vitaminas, aminocidos y otras sustancias qumicas que son fabricadas comercialmente mediante procesos microbiolgicos. (40) La industria petrolera usa microorganismos como indicadores durante la explotacin en busca de yacimientos adems de otras aplicaciones del microorganismo en la industria. (40) Enzimas microbianas y su aplicacin Las enzimas microbianas y su aplicacin en el campo de la nutricin, como medios digestivos; su uso en la industria de los alimentos para mejorar la calidad de los productos; su aplicacin como agentes quimioteraputicos en formas de enzimas puras cristalinas, que pueden hacerse disponibles; as como grandes aplicaciones para la conversin de productos por medio de la tecnologa de las enzimas inmovilizadas. (25) Produccin de protenas de un solo tipo de clula La produccin de protenas como suplemento y sustitutos alimenticios mediante el desarrollo masivo de microorganismos se desarrolla en muchos pases. Es muy probable que est prctica se extienda mucho ms y que se aprovechen nuevos microorganismos de la clula como fuentes de protenas. (25) Nuevos agentes farmacolgicos y quimioteraputicos El aislamiento de los nuevos microorganismos del ambiente marino y de otros hbitats naturales tiene orgen en los descubrimientos de nuevos compuestos biolgicos con aplicaciones teraputicas como es el caso de la ciclosporina A, que son un grupo de oligopptidos producidos por el hongo Tolypocladium inflamatum que tienen propiedades antifngicas, antiinflamatorias e inmunosupresoras. (25) El efecto inmunosupresor se debe a la inhibicin de la activacin de la respuesta de las clulas T. La ciclosporina es un pptido cclico de once miembros que se utiliza debido a las propiedades inmunosupresoras para impedir las reacciones de rechazo durante el transplante de rganos. (25) Las ciclosporinas se producen en una fermentacin sumergida de 15 das a partir de un medio que contienen (25): Glucosa Agua Sales minerales 4% 1% 95%

Desarrollo de la Bioingeniera La tecnologa de los cultivos mixtos se aplica a procesos de ciertos microorganismos para funciones adecuadas desde el nacimiento, pero que todava tenemos que aprender mucho acerca de la transformacin secuencial de los sustratos sobre los que actan esas poblaciones ptimas. (40)

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Tecnologa de enzimas inmovilizadas Los usos industriales de las enzimas se han incrementado mucho por el desarrollo de tecnologa de las enzimas inmovilizadas. (35) En esta tcnica la enzima se fija (inmoviliza) en una matriz insoluble; el sustrato se deja pasar sobre la capa de enzima inmvil, y durante ese tiempo el sustrato es atacado por la enzima. Esta tcnica presenta perspectivas interesantes como (35): 1. La enzima se recupera y reutiliza; as su tiempo de vida til aumenta. 2. La enzima no contamina el producto. Estas son solo algunas posibilidades en un futuro no lejano. Sin embargo es relativamente seguro predecir que todava la potencia de los microorganismos como fbricas qumicas no haya concluido. (35) Insecticidas microbianos La produccin de insecticidas de origen microbiolgico es de considerable inters, el nfasis aqu no es la produccin de productos qumicos activos contra insecticidas, sino en la utilizacin de microorganismos que son por si mismos patgenos para los insectos. En tales aplicaciones, los microorganismos vivos deben ser dispersados en el ambiente. (40) Antes de que puedan ser utilizadas como insecticidas preparaciones vivas, deben satisfacerse cuatro requerimientos especficos (40): Debe ser posible la produccin a gran escala. Debe ser mantenida la vialidad. Los organismos no deben ser txicos o patgenos para otros animales y plantas. Los organismos deben ser menos caros que los agentes qumicos.

Pueden ser utilizados como insecticidas: bacterias, virus, hongos o protozoos. Se producen comercialmente en fermentacin a gran escala, o sobre insectos hospedadores. Se conocen cerca de 400 hongos que atacan insectos, son relativamente inespecficos en cuanto a su rango de huspedes pero tambin son menos efectivos que otros agentes. (40) Tabla 1. Los hongos que actualmente son estudiados se resumen a continuacin (40): HONGO PATOGENO Aschersonia spp Conidobolus obscurus Entomophtura grylii Erynia neoaphidis Hirsutilla thompsonii Verricillium lecanii TCNICA DE PRODUCCIN Sumergido Sumergido In vivo In vivo / sumergido Semislido sumergido PAIS/ESTADO Rusia, Holanda Francia, Reino Unido, EUA EUA Reino Unido EUA Reino Unido

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Muchos de estos hongos pueden ser cultivados en placas abiertas con medio semislido, como granos de arroz. (40) Se han descrito ms de 650 tipos de virus de insectos. Estos virus ofrecen la mejor posibilidad para uso prctico como insecticidas y varios virus ya han sido comercializados, pero una de las desventajas para los virus es que la produccin a gran escala debe ser cultivada en insectos vivos, haciendo difcil el salto de escala. (40) Tres bacterias (Bacillus popilliae, B. moritae y B. thuringiensis) son producidas comercialmente. La primera de ellas puede ser cultivada solamente sobre insectos pero las dos ltimas pueden crecerse en cultivos sumergidos. Aproximadamente 40 insectos diferentes que causan enfermedades en la agricultura o en los bosques son tratadas con B. thuringiensis. Adems tambin es posible el control de ciertos insectos que son portadores de enfermedades humanas (la malaria por especies de Anopheles). El ingrediente activo de B. thuringiensis es una toxina polipeptdica que se produce durante el proceso de esporulacin. (40) En consecuencia el proceso de cultivo se dise para obtener un alto porcentaje de esporulacin y de acumulacin de la toxina. (40) Esta toxina es bastante selectiva en su accin y se administra mediante incorporacin en un alimento adecuado para el insecto, mata rpidamente a las larvas. Entre 10 a 15 minutos despus de la ingestin de la toxina, los animales dejan de alimentares y mueren en 3 a 5 das. (40) Biochips Una aplicacin bastante diferente de la biotecnologa implica la combinacin de la electrnica, la bioqumica y la gentica en el desarrollo del concepto de bioordenador. Los microprocesadores del futuro pueden constituir en "chips" en los que el material funcional son monocapas de protena. Los estudios con polilisina han tenido algn xito. Estos chips tienen por encima de 100.000 veces ms cambios que los microprocesadores convencionales. Las protenas adecuadas pueden ser producidas econmicamente a partir de microorganismos o mediante el uso de tcnicas de ingeniera elctrica. (40) Biofiltros Los biofiltros han sido utilizados para la eliminacin de olores de corrientes de aire que se originan del tratamiento de las plantas de residuos, establos de animales, molinos de papel y plantas productoras de tabaco, chocolate y caf. (40) Los gases fuertemente olorosos que se desprenden, se purifican y humedecen mediante el paso a travs de lechos que contienen bolas de plstico; los microorganismos que crecen sobre las bolas son responsables de la eliminacin de la mayor parte del olor. Durante el tiempo que el gas pasa a travs del lecho, los olores son absorbidos y metabolizados a biomasa y CO2. (40) Los biofiltros tambin pueden ser utilizados en el futuro para purificar el aire de las instalaciones de fermentacin a gran escala. (40) 11

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Sustancias saborizantes Los microorganismos producen sustancias con inherentes propiedades saborizantes que tiene gran importancia en la fabricacin de alimentos y bebidas. Intensos estudios sobre el uso de los microorganismos en la produccin de alimentos y en la gentica y bioqumica de la produccin del aroma muestran que entre varias bebidas alcohlicas han sido identificadas 400 sustancias diferentes; de stas, 118 eran steres, 80 cidos alifticos y aromticos, 41 compuestos carbonilo y 38 alcoholes alifticos y aromticos. Adems se pueden producir por fermentacin un conjunto de agentes saborizantes especficos; son producidos en procesos separados de fermentacin y luego ser utilizados como suplementos para aumentar el sabor de los alimentos preparados. (40) Aplicaciones de la biotecnologa fngica Muchos de los usos en los que se pueden utilizar hongos se pueden considerar tradicionales (por ejemplo, la fabricacin de cerveza y vino) tales tecnologas han existido desde la antigedad, sin embargo, la biotecnologa fngica moderna est teniendo un marcado impacto en los llamados procesos tradicionales. Nuestra capacidad de utilizar hongos en biotecnologa se ha extendido de modo espectacular en los ltimos aos; esto ha resultado de la aplicacin de los nuevos conocimientos sobre gentica molecular de hongos. (40) Se considerarn a continuacin algunos de los avances recientes de la biotecnologa fngica, que probablemente tendrn impacto en nuestras vidas futuras. (40) Los anlogos sintticos de la Fumagilina han sido recientemente evaluados para el tratamiento de cnceres; la Fumagilina, es un metabolito antibacteriano producido por Aspergillus fumigatus, los anlogos sintticos de este compuesto pueden inhibir un conjunto de tumores, sin causar efectos secundarios. (40) Una de las mejoras mdicas proporcionadas por el uso de productos fngicos es la Mevinolina; este compuesto se utiliza para disminuir los niveles de colesterol en sangre; originalmente fue producido en caldos de fermentacin de Aspergillus terreus, pero recientemente ha sido sintetizado. (40) El Reino Unido se ha conducido a la produccin de una levadura modificada genticamente que puede producir la hemoglobina, aunque no constituye un substituto de la sangre, pueden ser usadas como un apoyo en los casos de accidentes. (40) Es posible que las levaduras tambin alteren nuestros hbitos alimenticios en el futuro. El Kfir, una bebida fermentada espumosa poco corriente que es originaria de los Balcanes, ser hacia lo que tienda el yogur en el futuro. El kfir se produce aadiendo una mezcla especial de bacterias y levaduras a la leche; algunas de las bacterias son iguales a las que se utilizan en la fermentacin normal del yogurt, mientras que otras especies producen una goma viscosa que une a los microorganismos formando una gelatina grumosa, esto permite separar los grumos de kfir de la leche despus de la fermentacin. (3) El Koumiss, una bebida de leche espumosa puede ser fermentada para producir bebidas de diferentes grados de alcohol. El primer da del proceso es dulce, mientras que despus de tres das UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 12

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL de fermentacin se vuelve fuerte. El producto final se aade a los cereales. La fermentacin puede continuarse hasta conseguir una bebida alcohlica fuerte. (3) Sin duda seremos testigos de ms aplicaciones no esperadas e inusuales de los hongos en el futuro, lo que nos permitir, resolver los problemas que existen y los que an no se conocen con los cuales tendr que enfrentarse la humanidad en el futuro. (40) Qu est pasando en la industria de fermentacin en Mxico? En Mxico se producen productos fermentados desde la poca prehispnica ejemplo de ello es el pulque. Sin embargo, no fue sino hasta hace poco ms de 100 aos cuando se comenz a trabajar a niveles industriales con otro producto fermentado: la cerveza. (40) En 1944 se comenz la produccin industrial de penicilina por fermentacin. Actualmente se han desarrollado ms de 5000 compuestos con actividad antimicrobiana. (40) En 1973, genes ajenos a E. coli le fueron incorporados y se demostr que era posible expresar informacin gentica sinttica y/o diferente del organismo receptor, naciendo as la Ingeniera Gentica y los productos recombinantes. (40) Algunas de las recomendaciones y conclusiones de las industrias que se mantienen operando con xito, en las actuales condiciones de globalizacin mundial y crisis econmica interna son (40): Desarrollar estudios para conocer en detalle el mercado de sus productos. Producir compuestos de alta demanda y/o alto valor agregado. Establecer programas de modernizacin de infraestructura. Llevar a cabo programas de ahorro de energa. Implementacin de programas de aseguramiento de calidad BPM e ISO-9000.

1.1.3.1CARACTERSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS DE INTERS INDUSTRIAL Aquellos microorganismos que en el medio de seleccin; d resultado positivo del metabolito que se busca, halo claro cidos orgnicos y aminocidos, etc., se deben separar de los dems microorganismos presentes transfiriendo cada cepa, por aislamiento por estra cruzada a una placa con medio de cultivo adecuado al tipo de microorganismo. (25) Es importante remarcar que deben ser aisladas todas las cepas que hayan dado positivo el resultado de seleccin primaria, sin importar si el tamao del halo fue pequeo; ello no representa por fuerza que es un mal productor, ya que la seleccin de los mejores productores se realiza en medio lquido, que son condiciones ms cercanas a las que se habrn de tener para la produccin. Lo anterior es debido a que no siempre se comporta un microorganismo de la misma manera al cultivarse en medio slido que en medio lquido. Una vez aisladas las cepas a estudiar, se les identifica con algn nombre en clave que permitir su estudio sistematizado. (25) Atributos requeridos en los cultivos microbianos usados en la industria de fermentaciones. (25) 1. La cepa debe ser genticamente estable.

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 2. Las cepas seleccionadas deben producir clulas vivas vegetativas, esporas u otras unidades reproductivas. 3. Deben tener un crecimiento rpido y vigoroso, una vez que se han inoculado los tanques semilla. 4. La cepa debe provenir de un cultivo puro y mantenerse como tal. 5. La cepa debe producir el compuesto requerido en un periodo corto de tiempo. 6. Si sta produce sustancias txicas deben existir en cantidades insignificantes en relacin al producto. 7. La cepa debe ser resistente a alteraciones posibles en las condiciones ambientales, debido a contaminaciones microbianas. 8. Debe ser estable an en periodos largos de mantenimientos. 9. La produccin del compuesto estequiomtricamente predecible. deseado debe ser siempre en una cantidad

10. El microorganismo debe de ser de fcil manipulacin, de tal forma que se le pueda someter a programas de mutacin, al mismo tiempo que debe tener la capacidad de corregir algunos cambios genticos propiciados por la presencia de agentes mutagnicos. 1.1.3.2 FUENTES DE AISLAMIENTO Las principales fuentes de obtencin de microorganismos de inters industrial (25) 1. Colecciones internacionales de cultivos. 2. Fuentes naturales de aislamiento. 3. Programa de mejoramiento de cepas. Fuentes naturales de aislamiento (secundarias) (25) 1. Suelos (bosques, jardines, etc.) 2. Terrenos aledaos a pozos petroleros y refineras. 3. Aguas negras. 4. Residuos vegetales en descomposicin. 5. Races y tubrculos de vegetacin. 6. Aguas dulces (lagos y ros). 7. Frutos en descomposicin. 8. Tejidos animales. 9. Residuos de los procesos de fermentacin. 10. Residuos de las plantas elaboradoras de jugos. 11. Residuos de la industria alimenticia. 12. Residuos municipales con contenido orgnico. 13. Aguas salobres. UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 14

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 14. Residuos de ganado. 15. Residuos lignocelulsicos. 16. Residuos de procesamiento de productos pesqueros. Para determinar de qu fuente natural se intentar el aislamiento de los microorganismos deseados, partimos del metabolito a detectar ya que en ocasiones dicho metabolito es utilizado por el microorganismo para la degradacin de algn sustrato que nos indica la fuente de aislamiento. Este es el caso especfico de enzimas tales como amilasas que son aisladas de fuentes que contengan almidn (pan o frutas en descomposicin) y las clulas que se aslan de fuentes que contengan celulosa (madera podrida). (25) Otro elemento de seleccin de la fuente de aislamiento es el tipo de microorganismo que normalmente produce el metabolito deseado, ya que normalmente hay diferentes tipos de microorganismo que crecen a diferentes ambientes naturales. Por ejemplo, los hongos y actinomicetos, productores de metabolitos como los cidos orgnicos o los antibiticos, suelen crecer en ambientes de pHs mas bien bajos tales como basura de algunos desperdicios orgnicos, o aguas contaminadas. (25) Por ltimo una fuente de aislamiento que contiene gran diversidad de microorganismos productores de muchos metabolitos distintos, es el suelo de regiones en que hay una gran variedad de vida, tales como: bosques, selvas y montes. (25) Desarrollo experimental Tcnica de diluciones decimales Se pesa 1 g de suelo finamente tamizado o de frutos en descomposicin macerados y se procede a hacer diluciones decimales con agua destilada. Para tener una serie hasta la dilucin 10-8, se puede tener como criterio terico de aislamiento, los siguientes ndices (25): 10-2 y 10-3 para aislar hongos. 10-4 y 10-5 para aislar levaduras. 10-6 y 10-8 para aislar bacterias.

De la dilucin apropiada se puede sembrar por vaciado (1 ml) o por espatulado (0.1 ml) en una caja de Petri conteniendo medio adecuado para el aislamiento. (25) Tcnica de imprenta Se usa la muestra de suelo tamizado con la muestra de fruta macerada. Para sembrar se usa una esponja cilndrica de 7.5 mm. de dimetro por 3 o 4 cm. de longitud. Esta esponja se humedece ligeramente por uno de sus extremos y con este extremo se toca suavemente el suelo o la fruta macerada. Inmediatamente se presiona la imprenta sobre la superficie de agar del medio seleccionado, previamente vaciado en cajas de Petri y enfriados. Se debe tocar el agar repetidamente de una serie de por 10 menos tres placas, sin volver a tocar la fuente de aislamiento.
(25)

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Cultivos de enriquecimiento Se preparan una serie de cuatro matraces de 250 ml con 50 ml de medio mineral de aislamiento correspondiente adicionado del sustrato sobre el cual se desea que el microorganismo crezca. Por ejemplo, paja de trigo, bagazo de caa, residuos quitinosos, metanol, petrleo, etc. (25) Unos de los matraces se inocula con 1 g de suelo tamizado con 5 ml de la fruta macerada. El matraz se incuba a 28, 37 u 80 C. Cada 12 o 24 hrs. debern hacerse observaciones al microscopio de la poblacin de microorganismos creciendo en el matraz. Visualmente deber evaluarse el consumo de la fuente de carbono En caso de ser necesario se debe ajustar el pH del medio al valor inicial, con adicin de hidrxido de amonio o cido clorhdrico. Despus de 48 a 72 hrs. se transfiere una alcuota de ste matraz a un segundo matraz con medio de cultivo de la misma composicin incubndolo en las mismas condiciones que el primero y haciendo iguales observaciones. De sta forma se hace la 3era. y 4ta. transferencia. Cuando el matraz de la 4ta. transferencia cumpla de 36 a 48 hrs. se harn diluciones decimales (hasta 10-8), y se usarn stas diluciones para sembrar en medio con agar en placas. Las cajas sembradas se incubarn a la misma temperatura a la que se hizo el enriquecimiento y se continuar con los pasos indicados para purificacin y conservacin de las cepas. (25) Al final de cada uno de stos procedimientos se siembran seis cajas de Petri como mnimo. Las cajas se incuban despus de 28 o 37 C. y se hacen observaciones, y cada 12 o 24 hrs. hasta detectar crecimiento y produccin para proseguir con el aislamiento; de aquellas placas con colonias seleccionadas se toma una asada de la, o las colonias y se siembra por estra cruzada en placas que contengan la misma composicin de medio o cualquier otro medio para realizar las cepas. Debern hacerse observaciones de la morfologa colonial y microscpica con objeto de establecer la pureza de la cepa. El siguiente paso ser sembrar las cepas aisladas en medio de conservacin en tubos con medio de agar inclinado, guardando stas cepas a 4C., una vez que se observa crecimiento en los tubos con agar inclinado. (25) Problemas especficos de aislamiento Aislamiento de clulas simples (cultivos monocelulares) con ayuda de un micromanipulador. Quiz sea la micromanipulacin el mtodo ms simple y directo de preparar cultivos de levadura a partir de una sola clula. Los micromanipuladores, de los cuales se conocen varios modelos, estn destinados en esencia al control manual y con alto nivel de precisin del movimiento de un instrumento adecuado, usualmente una delgada aguja de vidrio, que al mismo tiempo se observa al microscopio. En unin con una platina metlica que controla el movimiento del portaobjetos del microscopio, se puede realizar cualquier movimiento deseado de la aguja en relacin con el desplazamiento; es decir, la extremidad de la aguja puede atravesar el porta en cualquier direccin y tambin se puede separar de la superficie del mismo. La operacin se realiza en la superficie inferior del cubreobjetos. Sobre un cubreobjetos estril, y con la ayuda de una pequea asa de platino se coloca un nmero, por ejemplo, 8 gotitas de mosto estril junto con una gota de cultivo de levadura crecido en mosto. El cubreobjetos se monta entonces con vaselina en el lado superior de la cmara de Bottcher estril de vidrio o metal, la cual ha sido fijada con cera a un portaobjetos ordinario de vidrio. Estas operaciones suelen realizarse en el interior de una cmara abitica. La funcin de las mangas laterales de la cmara de Bottcher consiste en admitir las agujas del UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 16

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL micromanipulador el que se emplea en una o dos de las mismas para realizar el trabajo es ms bien cuestin de gusto personal. La cmara debe contener as mismo una gota de agua para prevenir la evaporacin de las gotitas del mosto. El portaobjetos se coloca ahora bajo el microscopio, y la aguja o agujas, se introducen con cuidado, a travs de las mangas laterales, como se muestra en el diagrama (Fig.18). Mediante una serie de maniobras que son mucho ms fciles de realizar que descubrir, la aguja se emplea (25): 1. Para arrastrar unas cuantas clulas fuera del margen de la gota de cultivo levadura. 2. Para separar las mismas en clulas simples. 3. Para transportar cada una de estas clulas simples a una gota de mosto estril. Estas operaciones resultan posibles, porque cada clula se halla rodeada por una diminuta gota de lquido que se adhiere a la superficie del cubreobjetos por atraccin capilar, igualmente por atraccin capilar el extremo de la aguja de vidrio se puede utilizar para arrastrar la gota con su nica clula a cualquier punto deseado del cubreobjetos. Habindose depositado una sola clula en cada una de las gotas de mosto estril, las agujas se apartan de la cmara, las mangas laterales se taponan con algodn estril y la cmara se incuba durante 24 a 48 hrs. a la temperatura conveniente. La inspeccin microscpica mostrar despus si los cultivos han crecido a satisfaccin, y cualquiera de ellos se podr separar absorbindole en el extremo de una pequea tira de papel de filtro estril, que entonces se inocula en seguida en mosto estril, obtenindose as el cultivo monocelular deseado. (25) Fig. 18 Tcnica de aislamiento de clulas

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Objetivos del desarrollo de cepas industriales a) Optimizacin de las propiedades deseadas (25) Altos rendimientos del producto. Estabilidad gentica. Independencia de inductores. Mejor aprovechamiento de los componentes del medio. Ms fcil recuperacin del producto.

b) Remocin o supresin de las propiedades no deseables (25) Productos txicos. Antibiticos. Actividades enzimticas indeseables. Color, olor y textura del producto final.

Los cultivos de microorganismos presentes en fuentes heterogneas de aislamiento, como son las fuentes naturales, es en algunas ocasiones difcil separar al microorganismo de otras poblaciones presentes en el cultivo, pero conociendo las necesidades nutricionales que se buscan as como de otras caractersticas, se puede llegar al aislamiento de ste. (25) 1.1.3.3 SELECCIN DE MICROORGANISMOS Esta es una etapa del trabajo de aislamiento de microorganismos, referida nicamente al aislamiento a partir de fuentes naturales, sin embargo, cabe aclarar que actualmente una buena parte de los trabajos de desarrollo de procesos fermentativos, parten de la bsqueda de cepas de colecciones microbianas que ya los han aislado y caracterizado. (25) 1.1.3.3.1 SELECCIN PRIMARIA La seleccin primaria de microorganismos se refiere al aislamiento de diferentes tipos de microorganismos a partir de fuentes naturales, y la seleccin de aquellos que producen el metabolito deseado. Para esta etapa, se seleccionan todos los microorganismos que producen dicho metabolito, sin importar en que concentracin se obtenga el trabajo de seleccin se realiza comnmente en medio slido, distinguindose los microorganismos de nuestro inters mediante alguna caracterstica del metabolito a detectar al reaccionar con algn componente del medio de cultivo. Este trabajo se dificulta particularmente cuando los metabolitos a detectar son intracelulares, en cuyo caso se comienza por aislar el tipo de microorganismo que generalmente produce dicho metabolito (gnero y especie) y a partir de cada cepa aislada identificar aquellas que producen el metabolito despus de romper las clulas. (25) Los principales pasos a seguir en la seleccin primaria de los microorganismos son (25): 1. Seleccionar el metabolito que se desea detectar. 2. Seleccionar las fuentes de aislamiento. UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 18

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 3. 4. 5. 6. Tomar muestras representativas de la fuente seleccionada. Aislar los microorganismos en medios de cultivo convenientes. Seleccionar aquellos microorganismos que producen el metabolito deseado. Mantener los microorganismos viables.

1.1.3.3.2 SELECCIN SECUNDARIA La seleccin secundaria consiste en determinar cuales de los microorganismos en la etapa anterior producen buenas cantidades de metabolito deseado de tal manera que se consideren microorganismos potenciales para caracterizar y realizar un trabajo de mejoramiento gentico. Esta etapa de seleccin se debe realizar en medio lquido y para ello se debe contar con mtodos de cuantificacin del producto adecuados. De la misma manera se debe estudiar el consumo del sustrato y la produccin de biomasa para estimar las mejores cepas a seleccionar. Sin embargo, al ser este trabajo an parte de la seleccin, no es necesario contar con demasiados datos cinticos, ni se requiere un gran nivel de exactitud en las determinaciones. (25) Los principales pasos a seguir en la seleccin secundaria son (25): 1. Diseo y formulacin del medio lquido para la seleccin. 2. Preparacin del medio e inoculacin del mismo. 3. Produccin del metabolito. 4. Deteccin de niveles de produccin. 5. Seleccin de cepas. 1.1.4 MTODOS DE CONSERVACIN Cualitativos Las cepas pueden ser almacenadas a corto plazo (semanas o meses) con medios relativamente fciles y de bajo costo. (25) Resiembra peridica . Aceite mineral. Agua destilada. Tierra estril. Slica gel. Papel filtro. Perlas de porcelana.

a corto plazo

Cuantitativos Las cepas son almacenadas por tiempos prolongados, requieren de sustancias crioprotectoras (aseguran la supervivencia de los cultivos) y tienen alto costo de mantenimiento. (25) Liofilizacin. Criopreservacin. Congelacin. Nitrgeno lquido.

a largo plazo

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 1.1.4.1 RESIEMBRA PERIDICA El mtodo tradicional para la preservacin de cultivos microbianos es a travs de la transferencia peridica de los cultivos (resiembra) hacia un medio de cultivo ya sea lquido o slido. (25) El intervalo entre cada transferencia vara con el microorganismo. Algunas bacterias pueden ser transferidas peridicamente durante solo algunas semanas o meses. La mayora de los hongos pueden crecer en agar papa o en agar malta. El periodo entre la resiembra vara dependiendo del hongo, para algunos es de 2 a 4 semanas o de 2 a 4 meses; en cuanto a otros pueden sobrevivir 12 meses sin transferirse. (25) Condiciones que deben establecerse cuando se usa este mtodo(25) 1. Medio adecuado para mantener el cultivo. 2. Temperatura ideal. 3. Frecuencia entre transferencias. Los medios diferenciales selectivos son los preferidos, porque disminuyen el metabolismo de los microorganismos y por lo tanto prolongan el periodo entre las transferencias. Algunas bacterias requieren un medio complejo para su crecimiento o tambin necesitan de estos compuestos para preservar determinadas caractersticas fisiolgicas. (25) El intervalo entre cada transferencia es (25): Minimizar su nmero de resiembra para evitar mutaciones. Conservar en duplicado los tubos como una precaucin contra prdidas. Examinar la pureza del cultivo en cada transferencia. Escoger colonias con las mismas caractersticas para la resiembra.

Ventajas (25): Bajo costo. No requiere equipo especializado. Su manejo es sencillo.

Desventajas (25): El equipo empleado, el cual repercute en los costos para mantener la cepa en una coleccin microbiana. Prdida de las caractersticas morfolgicas o fisiolgicas. Seleccin de clulas atpicas (mutantes). Riesgo de contaminacin. Supervisin especializada. No es recomendada para mantener cepas de microorganismos por periodos largos de tiempo. 20

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 1.1.4.2 SUELO ESTRIL La tierra es un reservorio natural para muchos microorganismos y pueden ser recuperados despus de almacenamiento prolongado. La tierra estril ha sido usada para inducir esporulacin de bacilos aerobios y anaerobios. (8) El mtodo consiste en adicionar a 5 gr de suelo estril una suspensin de 1 ml de clulas mantenindose en refrigeracin a una temperatura de 4 a 5 C. El proceso no es considerado de aplicacin general, siendo recomendado para la manutencin de bacterias esporuladas: hongos y algas. (8) Ventajas (8): Estabilidad en el cultivo. Inculos sucesivos de un mismo tubo. Bajo costo de material y mano de obra. Buena sobrevivencia a causa de su bajo promedio metablico.

Desventajas (8): Su cuantificacin es difcil.

1.1.4.3 LIOFILIZACIN Este es uno de los mtodos ms eficaces en la preservacin a largo plazo de los cultivos de microorganismos. (8) La liofilizacin implica el desplazamiento del agua en una suspensin de microorganismos congelados, por sublimacin bajo presin reducida. Esto es, que el agua se evapora sin pasar por fase lquida. (8) Son requeridos agentes crioprotectores para resultados ptimos cuando se liofilizan los microorganismos para conservacin durante largo tiempo. Los agentes crioprotectores ms comnmente usados son el polvo de leche desnatada o la sacarosa. (8) La liofilizacin es particularmente til cuando los cultivos conservados no necesitan ser trasladados a superficies de agua antes de ser transportados; adems no se necesitan de refrigerar los cultivos liofilizados. (8) Procedimiento (8): Hacer una mezcla homognea del agente crioprotector y la suspensin del microorganismo. Trasladar 0.2 ml de la mezcla anterior a cada cultivo, se agita suavemente, y se deja que la suspensin de clulas se congele rpidamente en el bao. Mantener la temperatura del bao a -40C durante 90 a 120 minutos. Despus de 2 horas se eleva la temperatura del bao a temperatura ambiente. UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 21

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Durante las primeras 4 horas, se examina peridicamente al vaco y se debe bajar gradualmente hasta que se acerque a la sequedad. El almacenamiento de los cultivos liofilizados son conservados por temperatura debajo de 5C. se cree que las temperaturas bajas de almacenamiento son superiores para estabilidad del cultivo durante periodos largos (-20C a -70C).

Ventajas (8): Viabilidad y longevidad elevada. Estabilidad de las caractersticas. Control total contra infecciones por microorganismos. No requiere almacenamiento especial, solamente protegerlo de la luz.

Desventajas (8): Muchas especies no sobreviven. La viabilidad post-liofilizacin es en ocasiones insatisfactoria. Costo de mano de obra elevado. Se requiere de personal especializado. Daos genticos.

1.1.4.4 PERLAS DE PORCELANA Este procedimiento fue ideado por J.Leiderberg y es utilizado para la mayora de las especies de bacterias. El procedimiento es el siguiente (8): Se colocan de 3 a 4 gr de slice con un indicador en niveles de 25 ml con tapa de metal. Se colocan 10 mm de fibra de vidrio. Se esterilizan con calor seco a 160C durante 1 a 2 horas. Se hace crecer el microorganismo en 1 ml de medio de cultivo adecuado, cuando el crecimiento es bastante claro, se colocan las perlas de porcelana y se agitan. Cuidadosamente se elimina todo el exceso del medio de cultivo. Se regresan las perlas hmedas dentro de los viales, y se cierra fuertemente. Se revisan los viales y se seleccionan aquellos que presentan grnulos de gel de slice an azules y se descartan los rosas.

1.1.4.5 OTROS ACEITE MINERAL Muchos microorganismos pueden ser conservados por meses o aos en un medio relativamente fcil y simple que es el de inmersin en aceite mineral. La contaminacin de cultivos cuando este mtodo es utilizado ocurre cuando el aceite es esterilizado de manera incorrecta. Para un adecuado crecimiento, se debe colocar aspticamente el aceite mineral estril sobre la superficie del cultivo a una altura aproximada de 1 a 2 cm, esto impide la deshidratacin, reduce la actividad metablica, as como la velocidad de crecimiento del microorganismo, debido a la reduccin de oxgeno. Se guardan los cultivos cubiertos con aceite mineral en una posicin vertical, en un refrigerador a 4C. UNIDAD 1 MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 22

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Se realizan pruebas de variabilidad peridicamente para determinar si el cultivo esta deteriorado. Este procedimiento es usado frecuentemente por los maestros para llevar los cultivos para el uso en clase. (8) Ventajas (8): Bajo costo. No requiere equipo especializado. Sobrevivencia de especies sensibles a los dems mtodos.

Desventajas (8): Riesgo de contaminacin. Accidentes de trabajo. Perdida de cultivo. Espacios grandes para el almacenamiento.

AGUA DESTILADA Muchos microorganismos mueren rpidamente cuando son suspendidos en agua destilada. Sin embargo los cultivos de Pseudomonas solacearum en agua destilada sobreviven durante ms de 10 aos a temperatura ambiente. Por este mtodo no se detectan cambios genticos. (8) El mtodo consiste en cultivar el microorganismo en una caja de Petri conteniendo un medio de agar apropiado. Luego del crecimiento el agar es cortado con una lmina estril en bloques de aproximadamente 4 a 6 cm, despus es transferido con asepsia a tubos o frascos que contengan de 10 a 15 ml de agua estril. Se debe tener cuidado de no sobrecargar el agua con los bloques de agar; puesto que puede reducir la disponibilidad de nutrientes y por consiguiente disminuye el metabolismo celular. (8) Ventajas (8): Sobrevivencia de especies sensibles a los dems mtodos. No requiere equipo especializado. Bajo costo.

Desventajas (8): Dificultad de retirar la muestra (cubos de agar). Riesgo de contaminacin.

SILICA GEL Perkins fue el primero que uso el gel de slice para conservar hongos y para muchos otros microorganismos. El procedimiento es simple y no requiere un equipo especial. El procedimiento es el siguiente (8):

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 1. Se llena a la mitad cada tubo de rosca con el gel de slice. 2. Se esterilizan en seco a 180C durante 90 minutos y se conservan en recipientes hermticamente sellados. 3. Se preparan tubos con una suspensin de agua en plano inc1inado, usando de 1 a 2 ml de leche desnatada al 10 %. 4. Se aade 0.5 ml de suspensin a cada tubo del gel de slice para reducir al mximo el color, y se sumerge el tubo en un bao de hielo. 5. Se agitan para aflojar los granos de gel de slice. Se enfran a 25C y se almacenan en recipientes cerrados con desecantes, a temperatura ambiente por una semana. 6. Se revisa el crecimiento despus de 2 a 3 das de la incubacin y se protegen con parafina. Ventajas (8):

Es de bajo costo. No requiere de un equipo especial. Su estabilidad es elevada. De un mismo tubo se pueden hacer inculos sucesivos.

PAPEL FILTRO ESTRIL Es un mtodo relativamente simple y barato para la preservacin de bacterias. Los gneros de enterobacterias y una gran variedad de otras bacterias, son preservadas por muchos aos a travs de este mtodo. (8) El procedimiento de este mtodo es como sigue (8): Se moja el papel filtro estril en una suspensin de clulas y se seca al vaco para mantener la viabilidad. Se colocan las tiras de papel en tubos, entre dos cmaras de material plstico o en papel aluminio. Se guardan en refrigeracin para prolongar el tiempo de vida. Ventajas (8): Fcil manipulacin. Poco espacio de almacenamiento, ideal para envos por correo. Bajo costo.

Desventajas (8): El tiempo de desecacin es prolongado. Es difcil hacer una cuantificacin de la sobrevivencia de los microorganismos.

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Fig. 19 Tubos empleados en la criopreservacin

CRIOPRESERVADORES El congelamiento es el mtodo ms simple y ms comnmente usado para la conservacin de los microorganismos. Para el congelamiento ordinario no se requiere ningn equipo especial. Sin embargo, para obtener resultados satisfactorios, deben ser aadidos al cultivo conservador. Tambin las temperaturas de almacenamiento deben conservarse mas bajas que -20C. Debe tenerse cuidado en asegurarse que los cultivos sean congelados apropiadamente y que sean ptimas las temperaturas de almacenamiento (Fig. 19). (8) Ventajas (8): Los medios de cultivo son mantenidos en condiciones estables en periodos muy largos. Los cultivos pueden ser completamente sellados, libres de cualquier contaminacin.

Desventajas (8): Alta dependencia de servicios externos. Necesidad de infraestructura adecuada. Es relativamente caro.

Parmetros en la conservacin de microorganismos. (8) Tipo de microorganismo. El tamao y la complejidad son importantes para determinar la capacidad del organismo para sobrevivir. Edad del cultivo. Puede tener un efecto profundo en la fase de sobrevivencia, una clula en la fase estacionaria es ms resistente.

Concentracin de clulas. El aumento de la concentracin de clulas generalmente resulta en 1 % mayor el nmero de clulas que sobreviven a la liofilizacin, ha sido observado que un promedio de aumento de sobrevivencia es obtenido con un incremento de concentracin inicial de clulas bacterianas, la mayora de las clulas son protegidas de sustancias liberadas de la lisis de algunas clulas. (8) NITROGENO LQUIDO(8) Se utiliza nitrgeno lquido para obtener temperaturas ultrabajas. Esto ha sido satisfactorio para un gran nmero de clulas vivas como hongos, algas, protozoarios, clulas de mamferos y bacterias.

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Desventajas

(8)

Es relativamente caro. Requiere vigilancia constante.

Procedimiento (8): El microorganismo se hace crecer en 10 ml de medio de cultivo adecuado y se deja crecer a temperatura ptima de crecimiento. Se mezclan cantidades iguales de una suspensin del microorganismo y el agente crioprotector (glicerol al 10 %). Usando una pipeta de 2 a 5ml se distribuye 1 ml, de suspensin de clulas de la mezcla anterior, se colocan en viales de plstico estril. Los viales son congelados en el cuello del termo de nitrgeno lquido a una velocidad aproximada de 1 C/min durante tres horas, transcurrido este tiempo la temperatura es de -70C. Los viales se pasan a las canastillas y son sumergidos en nitrgeno lquido a -196 C. Despus del perodo de almacenamiento, los viales son sacados del nitrgeno lquido y colocados en bao Mara a 35 C/5min. Las cuentas viables se hacen inmediatamente despus de la recuperacin.

Nota: Para dar la concentracin de glicerol al 10 %, se aade un volumen de glicerol estril al 20 % a un volumen igual de caldo de cultivo. (8)

Conservacin de cepas

Los grupos taxonmicos de microorganismos, varan su respuesta en cuanto a los diferentes mtodos de conservacin. (8)

Objetivo de la conservacin de cepas (8) Mantener los cultivos de los microorganismos en condiciones adecuadas de habilidad y estabilidad. Mantenerlo vivo sin modificaciones morfolgicas, fisiolgicas o genticas.

Fig. 20

Refrigeradores donde se guardan las cepas.

Fig. 21 Cmaras de incubacin.

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Criterios de conservacin Habilidad de reproduccin Los medios cuantitativos, tales como unidades formadoras de colonias o unidades que forman placas, proveen mucha informacin acerca de la calidad de la tcnica de conservacin. Si estos ensayos son hechos antes y despus del almacenamiento, proporciona un medio objetivo para seleccionar el mtodo ptimo. La lesin es definida como dao subletal o reparable, la mutacin es un cambio permanente, algunas clulas lesionadas ya no pueden desarrollarse en medios mnimos, pero pueden formar colonias en medios completos, tal como es el agar de soya tripticasa, en otros casos las clulas requieren nicamente suplementacin con aspartato o pruvato para desarrollarse.
(8)

Propiedades funcionales La viabilidad, an si esta basada en nmero de organismos sobrevivientes, no es un criterio enteramente satisfactorio para evaluar la efectividad de la conservacin de cultivos. (8) Los ensayos de viabilidad proporcionan medios sensibles y cuantitativos de control de calidad que pueden ser usados para predecir cuando el cultivo debera ser reprocesado. (8)

Criterios para crear un medio

Mxima productividad. Mxima concentracin de producto o biomasa. Mxima velocidad de formacin del producto. Productividad mnima de productos indeseables. Econmico, calidad consistente.

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