Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fs.Nat. (Esp) Vol. 102, N.

1, pp 201-213, 2008 IX Programa de Promocin de la Cultura Cientfica y Tecnolgica

EL CDIGO GENTICO CUMPLE 40 AOS

LUIS FRANCO VERA * * Real Academia de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales. Universidad de Valencia. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. 46100 Burjassot, Valencia. luis.franco@uv.es

INTRODUCCIN
En 1799, durante la campaa de Napolen en Egipto, las tropas francesas descubrieron una estela de poco ms de 1 m de alta, con inscripciones en dos sistemas egipcios de escritura, caracteres jeroglficos y demtico y en griego clsico. Debido al lugar en que se encontr, la estela, que se conserva actualmente en el British Museum, se conoce hoy da con el nombre de piedra de Rosetta. La comparacin del texto un decreto de Ptolomeo V en los diferentes idiomas fue determinante para que los especialistas, entre los que destac el egiptlogo francs Jean-Franois Champollion, consiguieran descifrar los caracteres jeroglficos en 1822. Si el desciframiento de la piedra de Rosetta fue decisivo para la Egiptologa, en la Biologa Molecular se dio un acontecimiento de similar importancia. Haba que descifrar el cdigo gentico, algo necesario para conocer como las clulas son capaces de traducir un lenguaje de cidos nucleicos a otro de protenas. En las lneas que siguen se intenta poner de manifiesto cmo el desciframiento del cdigo gentico result ser tan apasionante como el de los caracteres jeroglficos, con la diferencia de que en vez de durar 23 aos, el trabajo se termin en poco ms de 5. La competencia entre los diversos laboratorios implicados en la ingente tarea fue, posiblemente, uno de los factores que permitieron culminar la investigacin en un tiempo rcord, ya que todos trabajaron contra reloj en su afn de alcanzar la solucin asegurando la prioridad de sus descubrimientos.

EL PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En 1866, Gregor Mendel emple por primera vez el trmino gen. Aunque haba de pasar mucho tiempo hasta que se perfilara su concepto se puede decir que an no se ha terminado de perfilar y se conociera que el DNA es el componente de los genes, las investigaciones del fraile agustino echaron los cimientos de la Gentica moderna. Casi un siglo ms tarde, en 1958, Francis Crick, que 5 aos antes haba propuesto con James Watson la estructura de doble hlice para el DNA, postul el dogma central, segn el cual, el flujo de informacin gentica desde el DNA hasta las protenas las destinatarias de esa informacin pasa por el RNA (1). Aunque la publicacin formal del dogma central tuvo lugar en 1958, la idea de que el RNA serva de intermediario estaba en la mente de Crick y en la de otros investigadores desde unos aos antes, como veremos enseguida. En lneas generales, los procesos implicados en ese flujo se han revisado en otro lugar (2) y all se han comentado las razones por las que se denomina transcripcin al paso de la informacin desde el DNA hasta el RNA y traduccin al trnsito de esa informacin desde el RNA hasta las protenas. Baste ahora con recordar que, aunque hay varios tipos de RNA, slo uno, el RNA mensajero, abreviado como mRNA, desempea ese papel de intermediario informativo entre el DNA y las protenas. En 1955 Paul Zamecnik haba descubierto que la traduccin, o biosntesis de protenas, tiene lugar en los ribosomas (3), unos pequeos orgnulos presentes en todas las clulas. Los ribosomas de las clulas pro-

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cariticas tienen un coeficiente de sedimentacin1 de 70S y estn formados por dos subunidades de 50 y 30S. Los ribosomas eucariticos son algo mayores, de 80S, y tambin poseen dos subunidades, en este caso de 60 y 40S. En todos los casos, las subunidades ribosomales estn constituidas por protenas y RNA. Este RNA ribosomal, del que existen varias molculas de diverso tamao, se abrevia como rRNA. Aunque en un principio se pens que el rRNA desempeaba el papel de mensajero, Jacob y Monod, en 1961, postularon la existencia del mRNA como molcula independiente (4) y ese mismo ao se demostr su presencia tanto en procariotas como en eucariotas. Dejando aparte los problemas mecansticos, tan complejos que siguen siendo objeto de una activa investigacin, la transcripcin es conceptualmente fcil. Es bien sabido que la informacin contenida en una molcula de DNA depende de su secuencia, del orden en que se encuentran encadenados los nucletidos que lo componen, de la misma manera que el sentido de una frase escrita depende del orden en que se hayan colocado las letras que la forman. Los nucletidos que constituyen el DNA difieren en sus bases, que pueden ser 4: adenina, guanina, timina y citosina, que en lo sucesivo designaremos de ordinario slo con sus iniciales, A, G, T y C. El RNA es tambin un polmero lineal formado por 4 nucletidos, pero en este caso T est reemplazada por el uracilo, U, una base de rasgos estructurales muy similares. Teniendo en cuenta estos datos y la conocida propiedad de las bases de aparearse especficamente, G con C y A con T (o U), es fcil comprender que si una cadena de DNA tiene, por ejemplo, la secuencia ...ATTGGCTACGATTACGGTA... cuando se transcriba su hebra complementaria, el mRNA resultante se leer: ...AUUGGCUACGAUUACGGUA... Pero las cadenas polipeptdicas que forman las protenas estn constituidas por 20 aminocidos, por lo que la traduccin presenta un problema conceptual ms serio: cmo pasar de un alfabeto de 4 nucletidos a otro de 20 aminocidos? Otro problema aadido, y no pequeo, es la falta de complementariedad entre bases y aminocidos. Si bien existe un apareamiento especfico entre las bases que forman los nucletidos, examinando las estructuras de

bases y de aminocidos, no se ve ninguna relacin estructural entre ambos grupos de compuestos. Pero vayamos por partes. En primer lugar, cuntos nucletidos del RNA mensajero son necesarios para determinar la colocacin de un aminocido? Es evidente que, habiendo slo 4 nucletidos, la respuesta no puede ser uno. Si as fuera, slo se podran determinar 4 aminocidos. Y si fueran 2? Entonces, la combinatoria nos dice que cabran 42 = 16 posibilidades: AA, AG, AU, AC, etc. Siguen siendo insuficientes para los 20 aminocidos. Si fueran 3, es decir, si cada triplete de nucletidos (o de bases, que es la parte variable de un nucletido a otro) determinara la colocacin de un aminocido, las posibilidades seran 43 = 64. Ahora sobran posibilidades, pero esto no constituye un problema si hay algunos tripletes que no corresponden a ningn aminocido o si cada aminocido viene determinado por ms de un triplete. Es esencial comprender que en el flujo direccional de informacin, que va del mRNA a las protenas, lo problemtico sera que una combinacin de bases pudiera corresponder a ms de un aminocido. Esa ambigedad dara al traste con la fidelidad con que debe producirse la traduccin, ya que la maquinaria traduccional se encontrara con indeterminaciones que no se podran resolver fcilmente. Por el contrario si, como veremos que sucede, los tripletes UUA y CUG corresponden al aminocido leucina, no hay problemas. Tanto cuando aparezca uno como otro en el mRNA, la maquinaria de traduccin colocar leucina en el lugar correspondiente de la cadena polipeptdica y, como nunca hay un flujo de informacin desde protenas hacia RNA, las clulas no se encontrarn con situaciones ambiguas. El primer investigador que lleg a la conclusin de que cada unidad de codificacin, que pronto comenz a designarse codn, estaba constituida por un triplete de nucletidos fue el fsico ruso Georgii Gamov (5). Lo hizo por un simple razonamiento matemtico, como se ha expuesto ms arriba, ya que la formacin de Gamov no era biolgica ni qumica. Pero ello no fue obstculo para que, tras el descubrimiento de la doble hlice, se interesara profundamente por los problemas planteados por la transmisin del mensaje

El coeficiente de sedimentacin es un parmetro relacionado con la velocidad a la que sedimenta una partcula en un campo centrfugo. Se mide en unidades Svedberg (S), denominadas as en honor de Theodor Svedberg, pionero de la ultracentrifugacin aplicada a la bioqumica.

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gentico. Comprendi que la solucin llegara a travs de un esfuerzo multidisciplinar y en 1954, con un innegable toque de buen humor, fund el RNA Tie Club, llamado as porque sus 24 miembros 20 por el nmero de los aminocidos y 4 por el de los nucletidos llevaban una corbata con una hlice bordada, que dise el propio Gamov. La finalidad del club era resolver el enigma de la estructura del RNA y comprender cmo construye las protenas. Francis Crick era, por derecho propio, uno de los miembros del club; le corresponda el apelativo de Tyr, por el aminocido tirosina. Centremos ahora la atencin en el segundo de los problemas enunciados anteriormente, es decir, en el modo por el que puede cada aminocido reconocer su triplete especfico. Las actividades del RNA Tie Club fueron decisivas al respecto. Francis Crick propuso en 1955 la hiptesis del adaptador segn la cual alguna estructura, hasta ahora desconocida, transporta los aminocidos y los coloca en el orden correspondiente a la secuencia sobre una hebra de cido nucleico. La hiptesis no lleg a publicarse en una autntica revista cientfica, aunque como dira Crick ms tarde, fue su artculo no publicado ms influyente. Pero dejemos que explique l mismo la hiptesis:
La idea fundamental era que resulta muy difcil considerar cmo el DNA o el RNA en cualquier posible estructura pueden constituir un molde inmediato para las cadenas laterales de los veinte aminocidos. Lo que se esperara de cualquier estructura posible es una distribucin especfica de grupos atmicos que puedan formar enlaces de hidrgeno. Por lo tanto, propuse una teora segn la cual existiran veinte adaptadores (uno para cada aminocido), junto con veinte enzimas especiales. Cada enzima sera capaz de unir un aminocido concreto a su propio adaptador especfico. Estos complejos se trasladaran por difusin al molde de RNA. Una molcula de adaptador podra encajar slo en aquellos lugares del molde de cido nucleico en los que pudiera formar los enlaces de hidrgeno necesarios para manenerlo en su lugar. Al hacer eso, el adaptador habra llevado a su aminocido precisamente al lugar correcto en que haca falta (6)

No hubo que esperar mucho para confirmar la hiptesis del adaptador. En 1958 el grupo de Zamecnik, el descubridor del papel del ribosoma en la sntesis de protenas, describi la existencia de unas molculas pequeas de RNA que desempeaban el papel sugerido por Crick (7). Habida cuenta de su papel, esa nueva especie de RNA pas a denominarse RNA de transferencia, tRNA. Cada aminocido reconoce y se une a un tRNA especfico, gracias a la accin de la correspondiente aminoacil-tRNA sintetasa. Y la presencia en el tRNA de un triplete complementario al codn, que llamaremos a partir de ahora el anticodn, permite que encajen los diversos aminoacil-tRNAs sobre el mRNA en un orden correcto. Todo este conjunto de interacciones tiene lugar sobre el ribosoma, que se encarga de separar de sus tRNAs los aminocidos, ya ordenados, y de encadenarlos entre s mediante la formacin de los enlaces peptdicos2.

HACIA EL DESCIFRAMIENTO DEL CDIGO

En este momento puede proponerse ya el tema central de este artculo. La existencia de 64 posibles tripletes de nucletidos plantea inmediatamente la cuestin: qu aminocido codifica cada uno de los 64 codones? Descubrir este cdigo, el cdigo gentico como se comenz a llamar desde el principio, atrajo la atencin de varios laboratorios en los inicios de la dcada de 1960, cuando ya se estaba en posesin de los conocimientos que se han recogido ms arriba. Pero los antecedentes de la historia hay que buscarlos en 1955. En ese ao, en el laboratorio de Severo Ochoa se realiz un descubrimiento de crucial importancia. Consiguieron caracterizar la polinucletido fosforilasa, enzima que cataliza la reaccin reversible:
nXDP U (XMP )n + nPi

[I],

en la que XMP es uno cualquiera de los 4 nucletidos que componen el RNA. Hay que caer en la cuenta de que el producto, que en el esquema se ha representado

El lector interesado puede encontrar los detalles de este proceso, que caen fuera del alcance de este captulo, en cualquier texto actual de Bioqumica o Biologa Molecular.

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sigue el presente artculo, el inters del descubrimiento radica en que hizo que Ochoa se interesara por el desciframiento del cdigo gentico. Gracias a los trabajos de los grupos de Zamecnik y de Nirenberg, se conocan los requisitos necesarios para llevar a cabo la biosntesis de protenas en sistemas acelulares, es decir, in vitro. Esencialmente, son necesarios, adems de los ribosomas y del mRNA, un extracto que contenga todas las enzimas, tRNAs y factores precisos, una fuente de energa que proporcione la necesaria para la formacin del enlace peptdico y, por descontado, los aminocidos que se polimerizarn al formar la cadena polipeptdica. La fig. 1 esquematiza un experimento de traduccin in vitro y en l se aprecia cmo el sedimento final, que contiene los polipptidos sintetizados, ser radiactivo siempre que el aminocido marcado isotpicamente se haya incorporado. El grupo de Ochoa comenz a utilizar la reaccin catalizada por la polinucletido fosforilasa para sintetizar polinucletidos artificiales, con la idea de utilizarlos en una reaccin como la esquematizada en la fig. 1 en sustitucin del mRNA. Pero cuando estaban comenzando ese trabajo, en el V Congreso Internacional de Bioqumica celebrado en Mosc se enteraron de que otro grupo, el de Marshall Nirenberg se les haba adelantado. As lo narra Carlos Basilio, un colaborador de Ochoa, testigo del histrico momento:
Cuando acabbamos de iniciar nuestro trabajo, Marshall Nirenberg comunic en el Congreso Internacional de Bioqumica de Mosc que el cido poliuridlico promova la sntesis de polifenilalanina. Algunos cientficos asistentes al Congreso contaron que los oyentes quedaron electrizados por la noticia. Cuando volvi de Mosc un miembro de nuestro Departamento y nos comunic la novedad, quedamos literalmente petrificados (10).

Figura 1. Esquema de un experimento de traduccin in vitro. Tras la incubacin de una mezcla de todos los componentes indicados, se aade cido tricloroactico, que precipita las protenas y cidos nucleicos. Evidentemente, si el aminocido marcado isotpicamente se ha incorporado a una cadena polipeptdica naciente, aparecer radiactividad en el sedimento.

como (XMP)n, es un polmero de ribonucletidos, es decir un RNA. Lo que haban hecho Ochoa y sus colaboradores era sintetizar in vitro, por primera vez, un RNA, un cido nucleico (8). Puede comprenderse la emocin del Profesor Severo Ochoa cuando realiz este descubrimiento. Muchos aos ms tarde, en 1989, lo recordaba en una conferencia pronunciada en Valencia, que comenz con las palabras:
Quisiera hoy discurrir sobre la satisfaccin que puede producir el dedicar la vida a la investigacin cientfica. Pocas veces he sentido emocin ms intensa que cuando cre haber hecho descubrimientos de alguna trascendencia (9).

La polinucletido fosforilasa no tiene in vivo la funcin de catalizar la sntesis de RNA. A la vista del dogma central, la transcripcin traslada al RNA la informacin contenida en el DNA. Es necesaria la presencia de un DNA que acte como molde para que la transcripcin tenga lugar y la polinucletido fosforilasa ni requiere DNA, ni une los nucletidos en un orden determinado, sino que lo hace al azar. De hecho, in vivo la enzima funciona segn el esquema [I], pero de derecha a izquierda, es decir, destruyendo el RNA. El que la enzima no se encargara in vivo de sintetizar el RNA no quit valor al hecho de haber conseguido sintetizar un RNA, al contrario, la investigacin supuso el premio Nobel para Ochoa. Pero, para el fin que per-

El experimento de Nirenberg, que se public poco ms tarde (11), haba seguido el protocolo esquematizado en la fig. 1. Y para preparar un polinucletido que hiciera las veces de mensajero haban empleado la reaccin de la polinucletido fosforilasa, partiendo exclusivamente de UDP. Evidentemente, en estas condiciones slo se poda obtener un homopolmero, el cido poliuridlico, poli(U). Usando ste como mensajero, nicamente se consegua que apareciera radiactividad en el sedimento cuando el aminocido radiactivo era la fenilalanina. Y entonces, en el sedi-

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mento apareca un homopolipptido, la polifenilalanina, poli(Phe). El experimento fue especialmente relevante por varias razones. La primera de ellas, era que se demostraba sin lugar a dudas el papel del mRNA en la sntesis de protenas: en el poli(U) slo existen los codones UUU y, por tanto, slo puede esperarse la sntesis de un polipptido repetitivo. Pero en segundo lugar, el experimento signific el inicio del desciframiento del cdigo gentico: el codn UUU codifica la fenilalanina. Es fcil imaginar la decepcin de los miembros del laboratorio de Ochoa; otro grupo se haba adelantado a su investigacin utilizando sus mismas armas. Pero lejos de desanimarse, la reaccin de Ochoa y sus colaboradores fue lanzarse a una frentica carrera para conseguir descifrar el significado de los 63 codones restantes. Por supuesto el equipo de Nirenberg no abandon el trabajo y en los dos aos siguientes el grupo de Ochoa public 14 artculos sobre el cdigo gentico y el de Nirenberg 12. Con homopolinucletidos se consigui demostrar que el codn AAA corresponde a la lisina y el CCC a la prolina. Los resultados con poli(G) no fueron concluyentes y entonces comenz el trabajo con polinucletidos mixtos. El equipo de Ochoa consigui una ligera ventaja sobre el de Nirenberg, al ser el primero en comprobar que los polinucletidos que contenan dos bases diferentes eran capaces de dirigir la sntesis de polipptidos que incluan diferentes aminocidos. Por ejemplo, el producto formado por la reaccin de la polinucletido fosforilasa usando como sustratos UDP y CDP a una relacin molar 5:1 promova la incorporacin mayoritaria de fenilalanina, pero tambin se incorporaban serina y leucina y, en menor proporcin, prolina (12). Aos despus, Ochoa mantena vivo el recuerdo del momento en que obtuvieron los primeros resultados de su experimento:
Cuando, en nuestro primer experimento, Lengyel, Speyer y yo observamos ansiosamente el contador de radiactividad y vimos que los polinucletidos que contenan dos bases diferentes promovan la incorporacin de diversos aminocidos, nuestro entusiasmo no tuvo lmites. (...) Siempre recordar aquel momento como uno de los ms emocionantes de mi vida (9).

Figura 2. Resultados experimentales de la incorporacin de serina y leucina dirigida por polinucleotidos formados por U y C en funcin de la fraccin molar de este ltimo nucletido. Las curvas representan la probabilidad de encontrar tripletes de composicin U2C o UC2.

Como la polinucletido fosforilasa produce polinucletidos de secuencia al azar, el producto obtenido por polimerizacin de U y C, puede contener codones

de composicin U3, U2C, UC2 o C3. A su vez, los codones U2C pueden tener la secuencia UUC, UCU o CUU, mientras que los UC2 pueden ser UCC, CUC o CCU. Con la salvedad de los codones UUU y CCC, que ya estaban asignados por los experimentos con homopolinucletidos, quedaba la ingente tarea de comprobar cul o cules de los otros 6 codones correspondan a los aminocidos incorporados. Para abordar esta cuestin, tanto el grupo de Ochoa como el de Nirenberg utilizaron una estrategia similar: analizar la proporcin de los aminocidos incorporados en funcin de la proporcin de U y C en la mezcla de polimerizacin. Los resultados experimentales para serina y leucina se recogen en la figura 2. Hay que tener en cuenta que, estadsticamente, la frecuencia con la que aparecern en el producto de reaccin los codones que contengan ms U disminuir a medida que disminuya la relacin U:C. Por ejemplo, se puede calcular esta frecuencia para los codones de composicin UC2 y U2C, con los resultados que se recogen en las curvas de la figura 2. A primera vista puede parecer sorprendente que los puntos experimentales no se ajusten a ninguna de la curvas, pero hay que tener en cuenta que, como el nmero de tripletes posibles es superior al de aminocidos, el cdigo gentico puede estar degenerado, es decir, a cada aminocido pueden corresponder varios tripletes, una posibilidad que se ha apuntado antes y que hizo notar por primera vez

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En el transcurso de estos experimentos se obtuvo, adems, la comprobacin experimental de algo que se vena dando por supuesto, pero que no estaba an demostrado de modo fehaciente: que los codones eran realmente tripletes (13). Pero el rompecabezas que implicaba el desciframiento total del cdigo gentico era demasiado complejo para que se pudiera resolver slo con esa aproximacin y hubo que esperar a que aparecieran nuevas tcnicas.

LA SOLUCIN
El apartado anterior terminaba anunciando la necesidad de una metodologa nueva para despejar las numerosas incertidumbres que se presentaban en el desciframiento del cdigo gentico. En este momento hizo su aparicin en escena Gobind Khorana, que describi un procedimiento para la sntesis de polinucletidos de secuencia alternante. El mtodo daba un pequeo rodeo: se sintetizaba primero un DNA artificial de secuencia alternante y, mediante transcripcin in vitro se lograba despus el polirribonucletido alternante (14). As, el polirribonucletido que se designa como poli(UC) tiene la secuencia ...UCUCUCUCUCUC... y, evidentemente, contiene una sucesin de dos tripletes: UCU y CUC. El producto obtenido en un sistema de traduccin in vitro como el de la fig. 1, es un polipptido de secuencia alternante, que puede ser Leu-Ser-Leu-Ser... o bien Ser-Leu-Ser-Leu..., ya que la traduccin puede empezar por cualquier punto3. La conclusin de este experimento es que UCU y CUC corresponden a leucina o serina. An no se puede asignar cada triplete a uno de esos dos aminocidos, pero por exclusin se obtiene otra conclusin. Si antes se haba concluido que un triplete de composicin U2C perteneca a la fenilalanina, ahora se puede descartar que sea UCU. De la misma manera se puede descartar que CUC corresponda a prolina. El mtodo de Khorana permite tambin la sntesis de polinucletidos con repeticin de tres bases. Con todas esas aproximaciones experimentales, se dio un paso de gigante en la dilucidacin del cdigo gentico, pero an faltaban otras aportaciones decisivas. La primera de ellas vino otra vez de la mano del

Figura 3. Se muestran los mismos resultados experimentales de la figura 2, pero se ha aadido la suma de las probabilidades de encontrar tripletes de composicin U2C o UC2. Los resultados muestran que a los aminocidos serina y leucina les corresponden al menos dos de los tripletes UUC, UCU, CUU, UCC, CUC o CCU.

Gamov (5). Por eso, en la figura 3 se aade la suma de las dos curvas, es decir la frecuencia de UC2 + U2C en funcin de la proporcin de C. Puede verse que todos los puntos experimentales se ajustan ahora razonablemente bien a la curva resultante, lo que indica que a los aminocidos serina y leucina les corresponden mas de uno de los tripletes UUC, UCU, CUU, UCC, CUC o CCU. Pero, en buena lgica, teniendo en cuenta la degeneracin del cdigo, alguno o algunos de estos codones podra tambin corresponder a fenilalanina (adems del ya conocido UUU) o a prolina (adems del CCC). Para aclarar esta cuestin, se analiz, por un procedimiento similar, la frecuencia de aparicin de estos dos ltimos aminocidos, con los resultados de la figura 4. Analizando estos resultados con los criterios mencionados antes, se puede concluir que para la fenilalanina, adems del codn UUU, existe uno U2C y para la prolina, adems del CCC existe otro UC2. De esta forma se fueron dando pasos entre 1962 y 1964. Por supuesto, los grupos de Ochoa y de Nirenberg analizaron todas las posibles combinaciones de nucletidos en la mezcla de polimerizacin, con lo que obtuvieron resultados con poliUA, poli UG, etc.
3

Es evidente que, in vivo, la traduccin no puede empezar por cualquier lugar del mRNA. Pero los sistemas acelulares que se emplean in vitro, aunque son vlidos para estudios relacionados con el cdigo gentico, no garantizan un inicio correcto de la traduccin.

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levadura especfico de alanina, abreviadamente, tRNAAla. Evidentemente, la secuencia del anticodn permite, por complementariedad, deducir la del codn. Con este mtodo indirecto se llegaron a descifrar tres codones. En las lneas precedentes se han resumido las apasionantes investigaciones que, comenzadas con el experimento fundacional de Nirenberg con la asignacin del codn UUU a la fenilalanina en 1961, permitieron en poco ms de 5 aos llegar a asignar con certeza 59 de los 63 tripletes restantes. A dos de ellos, UAA y UAG, se les adjudic el papel de terminadores de la cadena polipeptdica, basndose en datos genticos (para una revisin contempornea a la investigacin, ver la ref. 18). Como se ha apuntado, los logros fueron fundamentalmente de los laboratorios de Nirenberg, Ochoa, Khorana y Holley, aunque participaron otros muchos. La figura 5 recoge las aportaciones de los diferentes grupos al desciframiento del cdigo. Como resultado de estas brillantes contribuciones a la Biologa Molecular, Nirenberg, Khorana y Holley recibieron en 1968 el premio Nobel de Fisiologa o Medicina por su interpretacin del cdigo gentico y su funcin en la sntesis de protenas. Ochoa, como se ha comentado, lo haba recibido en 1959 por la sntesis enzimtica de polirribonucletidos.

Figura 4. Resultados experimentales de la incorporacin de fenilalanina y prolina dirigida por polinucletidos formados por U y C en funcin de la fraccin molar de este ltimo nucletido. Las curvas representan la probabilidad de encontrar tripletes formados homogneamente por U o por C, as como la suma de estas probabilidades y las de encontrar, respectivamente, tripletes de composicin U2C o UC2. Los resultados muestran que a la fenilalanina, adems del codn UUU le corresponde otro de la serie UUC, UCU, CUU, UCC, CUC o CCU y la prolina, adems de CCC, posee algn codn de esa serie.

grupo de Nirenberg. En 1964 comprobaron que los ribosomas son capaces de unir un tRNA especfico en presencia de un trinucletido cuya secuencia sea la del codn correspondiente. La unin puede medirse fcilmente, porque los ribosomas se retienen en filtros de nitrocelulosa (15). As pues, se incuba una mezcla de ribosomas, un aminoacil-tRNA marcado isotpicamente y un trinucletido, se filtra la mezcla y luego se mide la radiactividad retenida en el filtro. Si no aparece radiactividad en el filtro, es porque no se ha retenido el aminoacil-tRNA, o lo que es lo mismo, porque el trinucletido no es el codn correspondiente al aminocido cargado en el tRNA. Por el contrario, si el filtro aparece radiactivo, la conclusin es que el trinucletido empleado es un codn perteneciente al aminocido. El primer codn que se asign de este modo fue GUU, como correspondiente a valina (16). A esta asignacin siguieron otras llevadas a cabo por el mismo mtodo. La segunda aportacin fue la de Holley. Este investigador haba perfeccionado los mtodos de secuenciacin de RNA y consigui llevar a cabo la primera determinacin de la estructura primaria de un tRNA de

Figura 5. Nmero de codones asignados por los diversos grupos de trabajo. En amarillo se representa el total de codones asignados en cada laboratorio, mientras que las barras rojas indican los descubiertos exclusivamente por el grupo indicado.

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Figura 6. El cdigo gentico. La tabla es de triple entrada: en la primera columna se indica la primera base del codn (extremo 5'); la segunda base se lee en las columnas centrales (coloreadas en amarillo) y la tercera (extremo 3') aparece en la ltima columna.

Quedaban, pues, 4 tripletes dudosos, UGA, AGG, AGC y CUG. Para el primero se dudaba si era tambin un codn de terminacin o si perteneca a la cistena. Poco despus se demostr que la primera opcin era la vlida. Los otros tres se asignaron provisionalmente a arginina, serina y leucina, respectivamente. El tiempo demostr que esas asignaciones provisionales eran vlidas. De esta manera, se lleg a construir la tabla que resume el cdigo gentico (Fig. 6) y que resulta tan familiar a cualquier estudiante de Biologa. En 1966 todava quedaban algunos flecos sueltos en el estudio del cdigo gentico. Como se ha comentado antes (vase la nota 3), es evidente que la traduccin del mRNA no puede empezar por cualquier lugar si ha de producir una protena especfica. Tngase en cuenta que, al estar constituido el cdigo gentico por tripletes, el desplazamiento de uno o dos nucletidos en la pauta de traduccin significara cons4

truir un polipptido de estructura primaria totalmente diferente4. En 1966 se obtuvieron los primeros datos experimentales sobre la iniciacin de la traduccin en procariotas y en los siguientes aos el problema qued centrado. El triplete AUG sirve no slo para codificar la metionina, sino tambin como seal de iniciacin. De hecho, las cadenas polipeptdicas nacientes, tanto en procariotas como en eucariotas, comienzan con el aminocido metionina5. En procariotas existen dos tRNAs especficos de metionina, el tRNAfMet y el tRNAmMet. El primero se emplea para la iniciacin de la traduccin y la metionina que transporta se encuentra N-formilada. As pues, las cadenas polipeptdicas nacientes, estrictamente hablando, en procariotas comienzan por N-formil-metionina (fMet). Para que se inicie la traduccin, se ha de formar un complejo de preiniciacin entre fMet-tRNAfMet, la subunidad 30 S del ribosoma y el mRNA. Se requiere para ello la participacin de dos protenas no presentes en el

En este sentido, se llama cambio de fase a ese desplazamiento de la pauta de lectura que ocurre en la naturaleza, por ejemplo, cuando se produce una delecin o insercin de uno o dos nucletidos. 5 El que la traduccin comience por metionina no significa estrictamente que todas las cadenas polipeptdicas maduras posean este aminocido como residuo N-terminal. La mayora de las protenas se sintetizan en forma de precursores y, muy frecuentemente, en la maduracin se pierden aminocidos del extremo N-terminal, incluida la metionina con la que comienza la traduccin.

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ribosoma, los denominados factores de iniciacin IF-1 e IF-3, as como de un tercer factor de iniciacin, IF-2, que liga GTP. Cerca del codn de iniciacin, AUG, se encuentra en todos los mRNAs una secuencia de bases, conocida como secuencia Shine-Dalgarno en honor de sus descubridores, que interacciona con la subunidad pequea del ribosoma y ayuda a que el fMet-tRNAfMet se site con su anticodn interaccionando con el codn AUG. En este momento, se ensambla la subunidad 50S del ribosoma para formar el complejo de iniciacin, con el aporte energtico procedente de la hidrlisis del GTP, efectuada por el propio IF-2, que tiene actividad de GTPasa. El segundo tRNA especfico de metionina, tRNAmMet, se ocupa de posicionar al aminocido en los lugares determinados por los codones AUG internos durante la fase de elongacin de la cadena polipeptdica. La subunidad mayor del ribosoma tiene tres localizaciones, denominadas E, P y A. El complejo de iniciacin tiene situado el fMet-tRNAfMet sobre el sitio P. A continuacin, un nuevo aminoacil-tRNA, aqul cuyo anticodn sea complementario del codn siguiente al de iniciacin, se coloca sobre la localizacin A. Entonces, la peptidil transferasa, una actividad enzimtica que reside en una de las molculas de rRNA de la subunidad 50S concretamente en el rRNA 23S6 cataliza la formacin del enlace peptdico entre el grupo amino libre del aminocido recin ensamblado y el carboxilo de la formil-metionina, que estaba unido al extremo 3' de su tRNA. Tras la formacin del enlace peptdico, tiene lugar la fase de translocacin, en la que el peptidil-tRNA resultante se sita sobre la localizacin P, el tRNAfMet vaco pasa a la localizacin E antes de abandonar el ribosoma y el sitio A queda libre y enfrentado al siguiente codn, listo para recibir al siguiente aminoacil-tRNA. Para esta fase de elongacin, se requiere nuevamente GTP como suministrador de energa (tanto para el ensamblamiento del aminoacil-tRNA sobre el sitio A, como para el cambio de conformacin del ribosoma requerido para la translocacin), as como de otros tres factores proteicos de elongacin, EF-Tu, EF-Ts y EF-G.
6

La elongacin de la cadena polipeptdica contina hasta que en el mRNA se encuentra un codn de terminacin. Cuando ste se enfrenta a la localizacin A, sta permanece libre, ya que no existe ningn tRNA que pueda complementar los codones de terminacin. Esto sirve de seal para que la peptidil transferasa se limite a catalizar la hidrlisis del enlace ster que une el polipptido formado al ltimo tRNA, con lo que la cadena se libera, el ribosoma se desensambla y el mRNA se libera. Tambin para esta fase de terminacin se requiere energa aportada por el GTP y la presencia de factores de terminacin o de liberacin (RF1, RF2 y RF3). En eucariotas los procesos de iniciacin, elongacin y terminacin son muy similares a los que se acaban de apuntar. Tambin existen dos tRNAs para la metionina, pero en este caso, la metionina iniciadora no est formilada. Otra diferencia se encuentra en los factores de iniciacin, elongacin y liberacin. El examen de la Fig. 6 permite concluir que, como era de esperar, no hay ambigedades en el cdigo gentico. De hecho, el que el triplete AUG signifique metionina tanto para la iniciacin de la cadena como para las posiciones internas del aminocido no constituye ambigedad alguna, pues la existencia de dos tRNAMet, como se acaba de mencionar, salva las posibles dificultades. Lo que s existe es degeneracin, una degeneracin que se da en grado variable. As, mientras que para algunos aminocidos, como el triptfano, slo existe un triplete, para otros, como la leucina, existen 6. El nmero de tripletes no est relacionado con la abundancia de cada aminocido en las protenas. Por ejemplo, por trmino medio, la lisina es mucho ms abundante que la histidina en las protenas y, sin embargo, ambos poseen el mismo nmero de codones. Adems de las cuestiones relativas a la iniciacin, elongacin y terminacin de la traduccin, que se han mencionado ms arriba7, en 1966 quedaba an otro fleco suelto en el estudio del cdigo gentico. Cuando

Se trata, pues, de una ribozima, como se denominan las enzimas que, en vez de ser de naturaleza proteica, estn constituidas por RNA. Las ribozimas son muy raras en los organismos actuales, aunque parece que tuvieron un protagonismo importante en los primeros tiempos de la vida en nuestro planeta. 7 Por caer fuera del alcance de este artculo, estas cuestiones se han tratado aqu de una forma sucinta. El lector interesado puede encontrar ms detalles en cualquier texto actual de Bioqumica y Biologa Molecular.

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esquemtico la hiptesis del balanceo. Ms recientemente se han formulado algunas precisiones a la hiptesis elaborada por Crick (21). La historia del desciframiento del cdigo gentico comenz, pues, en 1961 con el trascendental descubrimiento de que el triplete UUU codifica a la fenilalanina y prcticamente culmin cinco aos ms tarde con el establecimiento de la hiptesis del balanceo. Es cierto que algunos detalles particulares tardaron un par de aos en aclararse totalmente, pero en esencia, el ingente trabajo de descifrar los 64 codones se realiz en tan slo 5 aos, constituyendo una de las pginas ms brillantes de la investigacin biolgica.

Figura 7. Hiptesis del balanceo. La figura recoge de un modo esquemtico la hiptesis formulada por Crick. Se representa la interaccin codn-anticodn, indicando las diversas posibilidades de apareamiento que existen para la tercera base del codn (izquierda) o para la primera del anticodn (derecha).

se comenz a fraccionar la mezcla de los tRNAs, se observ que, como era de esperar por la degeneracin del cdigo, se podan encontrar varios tRNAs para un mismo aminocido, pero el nmero total de especies distintas de tRNA no llega a ser 61, el nmero de codones que codifican aminocidos8. Eso quiere decir que un anticodn puede interaccionar con ms de un codn. Este sorprendente hallazgo, junto con el no menos sorprendente de que al secuenciar el tRNAAla se encontr como anticodn una secuencia, IGC, que contena una base anmala, la inosina (17). Un ao ms tarde, al secuenciar el tRNASer de levadura, se encontr el anticodn IGA (19). Teniendo en cuenta que, como en todos los casos de apareamiento de bases en cidos nucleicos, el apareamiento codn-anticodn implica que cada cadena tiene una orientacin distinta, la base rara inosina debe aparear con la tercera base del codn, precisamente la variable entre los 4 codones de la alanina y entre 4 de los 6 de la serina (Fig. 6). A partir de estos datos, y tras un profundo examen del cdigo gentico, Crick elabor la hiptesis del balanceo, segn la cual el apareamiento de las dos primeras bases del codn con las correspondientes del anticodn es estricto, pero el de la tercera base presenta una mayor flexibilidad (20). Crick lleg incluso a proponer unas reglas para el apareamiento de esa tercera base del codn que las investigaciones posteriores demostraron ser ciertas. La figura 7 muestra de modo
8 Aunque 9

CUL ES LA SITUACIN 40 AOS DESPUS?

Han transcurrido 40 aos desde que se termin el desciframiento del cdigo gentico. Qu nuevas perspectivas ha introducido la investigacin en este periodo? La primera concierne a la universalidad del cdigo gentico. El problema, una vez ms, fue ya planteado por Crick en su discurso al recibir el premio Nobel en 1962. En esa memorable ocasin, deca:
Hay una cuestin general adicional acerca del cdigo gentico que nos podemos formular en este momento. El cdigo, es universal, es decir, el mismo en todos los organismos? Los datos preliminares sugieren que muy bien podra ser (22).

Efectivamente, en lneas generales se puede decir que el cdigo gentico es universal. Pero algunas excepciones a esa regla general se han ido acumulando en los aos posteriores. La primera se observ en 1979, cuando se descifr el cdigo gentico mitocondrial9. En las mitocondrias de vertebrados, AGA y AGG son codones de terminacin, en vez de codificar arginina, mientras que UGA codifica triptfano en vez de ser un codn de terminacin. Adems, AUA codifica a la metionina. El cdigo gentico mitocondrial de levadura presenta alguna semejanza con el de mitocondrias de vertebrados, pero tiene tambin otras variantes

el nmero de especies de tRNA vara de unos organismos a otros, por trmino medio se puede estimar en 40. Las mitocondrias son unos orgnulos subcelulares presentes en clulas eucariticas, que poseen su propio DNA y contienen las maquinarias necesarias para realizar la transcipcin y la traduccin. Gozan, por tanto, de una cierta autonoma gentica.

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con respecto al cdigo estndar recogido en la figura 6. Tambin se han observado algunas pequeas variaciones en bacterias, en las que es frecuente encontrar GUG y UUG como codones de iniciacin10. Un caso aparte lo constituyen la selenocistena y la pirrolisina. Se trata de aminocidos naturales recientemente descubiertos. Aunque su presencia se encuentra limitada a algunos casos concretos, su incorporacin a las protenas exige codones propios. En arquebacterias metanognicas la pirrolisina est codificada por UAG, que acta de ordinario como un codn de parada (Fig. 6), mientras que la selenocistena est codificada por UGA, otro codn normal de parada, tanto en procariotas como en eucariotas. Pero el mecanismo de codificacin es en este caso muy particular. La maquinaria de biosntesis de protenas inserta selenocistena al encontrar el codn UGA slo cuando se encuentra presente en el mRNA una secuencia auxiliar, denominada elemento SECIS (de selenocysteine insertion sequence), que se caracteriza por poseer estructuras primaria y secundaria caractersticas (23). Los elementos SECIS se pueden localizar en diversas posiciones relativas al codn UGA dependiendo de si el organismo es procaritico o eucaritico. La degeneracin del cdigo conlleva, como se ha indicado, que para muchos aminocidos exista ms de un codn. En estos casos se plantea una cuestin interesante: se usan indistintamente todos los codones posibles o hay alguna preferencia entre ellos? La ingente acumulacin de datos de secuencia de genomas que se ha producido en los ltimos aos permite asegurar que no hay una utilizacin indistinta de los diversos codones y que cada organismo tiene unas determinadas preferencias, que estn relacionadas con los niveles de cada uno de los tRNAs (24). El conocimiento de la utilizacin de los diversos codones es no slo de inters acadmico, sino que se trata, por ejemplo, de un factor a tener en cuenta al disear estrategias experimentales para la produccin de protenas recombinantes (25). En resumen, aunque se han observado algunas excepciones al cdigo gentico descrito en la dcada de 1960, sorprende que en la inmensa mayora de los casos, todos los organismos, tanto procariotas como

eucariotas, utilicen el mismo sistema de codificacin. La conservacin de los mecanismos moleculares entre organismos muy distantes en la escala evolutiva es as, tambin en este caso, una caracterstica constante de los seres vivos.

CONCLUSIONES
Como se ha comentado antes, todo estudiante de Biologa e, incluso, toda persona culta ha visto alguna vez una representacin del cdigo gentico similar a la recogida en la figura 6. Pero al observarla, se corre el riesgo de pasar por alto el inmenso trabajo que cost el desciframiento del cdigo y contemplar la figura como si hubiera llovido del cielo sin esfuerzo alguno por parte de los investigadores. Esta breve revisin tena por objeto principal hacer patente ese trabajo a cuya culminacin concurrieron muchos factores. De una parte, la innegable vala cientfica de los protagonistas de la aventura que, con las forzosas omisiones, han quedado reseados en las pginas precedentes. Pero no menos importancia tuvo el clima de competitividad que surgi entre los diferentes laboratorios implicados. Esa competitividad y el propio afn de superacin han catalizado numerosos avances de la ciencia, de la misma manera que favorecen la obtencin de buenas marcas en una competicin deportiva. Estamos acostumbrados a ver cmo son muchos los atletas que empiezan una competicin, cmo los ms van cayendo eliminados en las rondas de clasificacin, cmo en la final van quedando algunos descolgados y cmo, al terminar, slo uno se ha alzado con la victoria. Y tambin estamos habituados a contemplar cmo numerosos grupos de investigacin se embarcan en un determinado tema, cmo algunos slo consiguen resultados triviales o poco significativos, cmo otros muchos, an con buenos resultados, no llegan a dar un salto cualitativo en el avance cientfico. Pero la analoga puede ir ms all de considerar la investigacin como una excitante aventura o del simple afrontarla con nimo deportivo. Tambin las clebres palabras del barn de Coubertin valen para quienes se aplican al deporte de la investigacin. Hay

10 Estas y otras variantes del cdigo gentico estndar se pueden encontrar navegando en la pgina web del National Center for Biotechnology

Information (National Institutes of Health, U.S.A.) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/) para buscar el apartado Genetic codes.

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que tener en cuenta que, ciertamente, cientficos que hayan protagonizado grandes revoluciones ha habido pocos, pero que los buenos cientficos, los que realizan su trabajo con honestidad, preparacin, dedicacin y competencia, son muy numerosos. Y que, posiblemente, sin su esfuerzo y sin sus resultados, muchas veces pequeos, no se habran podido dar los descubrimientos definitivos. Pretender que slo los grandes genios sean capaces de hacer ciencia equivale a firmar la partida de defuncin del desarrollo cientfico, cuyos grandes avances suelen ir precedidos por numerosos hallazgos ms modestos que, adems, contribuyen a crear una atmsfera adecuada para la aparicin de los genios. Pero, sigamos ms all con la analoga deportiva. Poner el acento en la participacin ms que en la victoria es compatible con el lema olmpico: citius, altius, fortior. Dicho de otro modo, hacer nfasis en la importancia de la participacin no significa que haya que erradicar la competencia. Antes al contrario, sin una sana competitividad seguramente no sera posible llegar ms arriba o hacerlo ms rpidamente. Y en la investigacin cientfica, el deseo de profundizar en el conocimiento, y an el de quemar etapas en ese empeo, ha de presidir el afn del investigador. Si se admiten las premisas anteriores, se pueden establecer varias conclusiones, pero dos parecen las fundamentales. En primer lugar, que no vencer en esa competencia no significa conformarse con la mediocridad. El investigador debe tender a que su trabajo sea siempre de excelencia. Por otro lado, es evidente que la competencia que favorece el desarrollo y avance de la investigacin debe ser respetuosa con las normas ticas: no puede significar, de ninguna manera, un deseo de triunfar a costa de no se sabe qu concesiones. Es esta ltima la actitud que, por mantener la analoga que se viene empleando, bien podramos llamar deportividad, que se resume en el empleo exclusivo de medios lcitos, en el saber ganar y tambin, por qu no?, en el saber perder. Excelencia y deportividad son, pues, dos de los pilares en que se debera apoyar toda investigacin.

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