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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO CENTRO TECNOLGICO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA AMBIENTAL

Giselle Intra Pedroti

ENSAIOS DE BIODEGRADABILIDADE AERBIA DE HIDROCARBONETOS DERIVADOS DO PETRLEO EM SOLOS

Vitria 2007

Giselle Intra Pedroti

ENSAIOS DE BIODEGRADABILIDADE AERBIA DE HIDROCARBONETOS DERIVADOS DO PETRLEO EM SOLOS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps Graduao em Engenharia Ambiental do Centro Tecnolgico, Departamento de Hidrulica e Saneamento da Universidade Federal do Esprito Santo, como requisito parcial para a obteno do Grau de Mestre em Engenharia Ambiental. Orientador: Srvio Tlio Alves Cassini

Vitria 2007

Dados Internacionais de Catalogao-na-publicao (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Esprito Santo, ES, Brasil)

P372e

Pedroti, Giselle Intra, 1980Ensaios de biodegradabilidade aerbia de hidrocarbonetos derivados do petrleo em solos / Giselle Intra Pedroti. 2007. 119 f. : il. Orientador: Srvio Tlio Alves Cassini. Dissertao (mestrado) Universidade Federal do Esprito Santo, Centro Tecnolgico. 1. Biodegradao. 2. Biorremediao. 3. Hidrocarbonetos. 4. Bactrias. I. Cassini, Srvio Tlio Alves. II. Universidade Federal do Esprito Santo. Centro Tecnolgico. III. Ttulo. CDU: 628

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO CENTRO TECNOLGICO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA AMBIENTAL

Ensaios de biodegradabilidade aerbia de hidrocarbonetos derivados do petrleo em solos


GISELLE INTRA PEDROTI

Banca Examinadora:

____________________________ Prof. Dr. Srvio Tlio Alves Cassini Orientador DEA/CT/UFES

__________________________________ Profa. Dra. Edumar Ramos Cabral Coelho Examinadora Interna DEA/CT/UFES

_____________________________________ Prof. Dr. Eustquio Vincius Ribeiro de Castro Examinador Convidado DQUI/CCE/UFES

___________________________________ Prof. Dr. Marco Antnio Almeida de Souza Examinador Externo - UNB

Coordenador do PPGEA: Prof. Dr. Srvio Tlio Alves Cassini UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO Vitria, ES, 29 Junho de 2007.

Dedico este trabalho minha famlia pelo incentivo, confiana e por estar sempre ao meu lado.

Agradecimentos

A Deus, de onde tirei foras para seguir sempre em frente e ir a busca dos meus ideais. minha famlia que me proporcionou e continua proporcionando condies materiais e emocionais para que eu possa sempre ir mais alm. Em especial minha me, Maria Geni pelo apoio incondicional. As minhas tias Vera Intra e Nola Intra que nunca mediram esforos para me ajudar e a famlia Pimenta pelas palavras de carinho e solidariedade.

Aos colegas e professores do PPGEA Programa de Ps Graduao em Engenharia Ambiental que de forma direta ou indireta, participaram da minha jornada no mestrado, em especial a Hyane, Eduardo, Emlia, Hugo, Cludia, rika, Priscilla, Fernanda, Caio, Francisco e Eudrades. Ao LABSAN, por ter me auxiliado nos momentos que precisei. Ao LABPETRO, pela parceria e aos colegas e professores que facilitaram o desenvolvimento deste trabalho, em especial ao Prof. Eustquio, Prof. Edna, Prof. Reginaldo, Vernica, Mariana e Michel pela ateno e disponibilidade. Ao professor Wolfgang Riegert pelo total desprendimento, disponibilidade, ateno e pacincia em me ajudar sempre que precisei, sem medir esforos. Aos amigos que, mesmo de longe, se preocuparam ao longo deste trabalho e se mostraram companheiros e acreditaram no meu potencial. Ao CNPq pela bolsa. Ao meu orientador, Srvio Tlio Cassini pela orientao na pesquisa e por ter, desde o incio, acreditado em mim.

A todos que de alguma forma contriburam para o desenvolvimento deste trabalho.

"O amor e a verdade esto unidos entre si, como as faces de uma moeda. impossvel separ-los. So as foras mais abstratas e mais poderosas desse mundo." (Mahatma Gandhi)

RESUMO

A poluio ambiental causada por derramamentos e vazamentos de petrleo e seus derivados tm sido um grande motivo de preocupao com o Meio Ambiente. Com o objetivo de recuperar o Meio Ambiente da poluio sofrida por estes acidentes, este trabalho se props a isolar e caracterizar microrganismos com capacidade de biodegradao de hidrocarbonetos de petrleo em ambiente terrestre. A pesquisa obteve 19 isolados, os quais foram analisados atravs do sistema manual, baseado no mtodo respiromtrico de Bartha (modificado), descrito pela NBR 14.283 (1999) pela literatura por meio da condutivimetria, que determina a atividade microbiolgica pela gerao de gs carbnico e, indiretamente, a biodegradao de contaminantes do solo. A pesquisa foi realizada em trs ensaios. No primeiro ensaio foi avaliada a capacidade de biodegradao das 19 cepas isoladas, tendo areia e vermiculita como substrato. O segundo ensaio avaliou 4 cepas (1, 2, 13 e 14) com quatro hidrocarbonetos (A, B, C e D), formando assim 16 tratamentos em forma matricial, tendo areia e vermiculita como substrato, e objetivando avaliar a especificidade das cepas isoladas. O terceiro ensaio envolveu 2 cepas (1 e 14) com 4 hidrocarbonetos (A, B, C e D), em forma matricial, utilizando solos arenoso e argiloso objetivando avaliar as possveis diferenas de biodegradao nos solos. As cepas avaliadas apresentaram potencial de biodegradao dos hidrocarbonetos derivados de petrleo. A anlise de biodegradao foi realizada por meio da liberao de gs carbnico gerado pelas bactrias no sistema respiromtrico. Os dados foram ajustados de acordo com o clculo da taxa de biodegradao proposto pela cintica qumica. Foram observados valores de at 32% de biodegradao de hidrocarbonetos em um perodo de 15 dias, considerando o modelo de biodegradao nico proposto por Firme (2005). A taxa de biodegradao apresentou variaes de acordo com tipo de composto orgnico e a cepa isolada utilizados nos tratamentos de cada ensaio.

ABSTRACT

The environmental pollution caused by oil and derivatives leaking is a great worry about environment. With the target of recovering the environment from the pollution caused by those accidents, this work intends to isolate and characterize microorganisms with capacity of petroleum biodegradation in ground environment. The research achieve 19 isolated, which were analyzed through manual system, based in Bartha respirometric method (modified), described by NBR 14.283 (1999), by literature through condutivimetrics, which determines microbiologic activity by carbonic gas generation and, indirectly, biodegradation of ground contaminant. The research was done in three experiences: in first, biodegradation capacity of 19 isolated strains was verified, with sandy and vermicuta as substracts. The second experience tested four strains (1, 2, 13 and 14) with four hydrocarbons (A, B, C and D), forming 16 matricial treatments, with sand and vermicuta as substracts, with the purpose of verify isolated strains specificity. The third experience involved two strains (1 and 14) with four hydrocarbons (A, B, C and D), in matricial form, using sandy and clay ground, with the purpose of verify possible differences of ground biodegradation. The evaluted strains showed biodegradation potential of petroleum derivatives hydrocarbons. The biodegradation analysis was done by carbonic gas generated by bacterias in respirometric system. Data were adjusted according with biodegradation rate calculations proposed by chemical kinetics. Values until 32% hydrocarbons biodegradation in a 15 day period were observed, considering the only biodegradation model proposed by Firme (2005). The biodegradation rate presented variation according with each type of organic composites and isolated strain utilized in each experience treatment.

SUMRIO

1. INTRODUO ......................................................................................................16 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 19 2.1 Objetivo geral:..................................................................................................19 2.2 Objetivos especficos: ...................................................................................... 19 3. REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................. 20 3.1. Composio Qumica do Petrleo ..................................................................20 3.2. Processo de Separao do Petrleo .............................................................. 24 3.3. Classificao dos Hidrocarbonetos.................................................................26 3.4. Poluio e Contaminao Ambiental .............................................................. 28 3.5. Biodegradao................................................................................................ 33 3.6. Solo ................................................................................................................ 45 3.7. Biorremediao............................................................................................... 48 3.8. Respirometria Aerbia .................................................................................... 53 3.9. Modelos cinticos ........................................................................................... 54 4. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 59 4.1 Coleta e enriquecimento de amostras ............................................................. 60 4.1.1 Fase de enriquecimento............................................................................ 60

4.2 Isolamento e Caracterizao dos microorganismos ........................................61 4.2.1 Isolamento de bactrias ............................................................................ 61 4.2.2 Meios de Cultivo........................................................................................ 62 4.2.3 Inoculao e Incubao ............................................................................ 63 4.2.4 Caracterizao dos isolados .....................................................................64 4.3 Avaliao da Biodegradabilidade Aerbia ....................................................... 64 4.3.1 Preparo dos Sistemas de Avaliao ......................................................... 64 4.3.2 Avaliao da produo de CO2 .................................................................66 4.3.3 Condies experimentais .......................................................................... 68 4.3.4 Condies experimentais .......................................................................... 71 5. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 72 5.1 Avaliao das cepas isoladas Ensaio I ......................................................... 72 5.11 Caracterizao Morfolgica e Bioqumica .................................................. 72 5.1.2 Atividade de respirometria......................................................................... 75 5.2 Avaliao das cepas isoladas Ensaio II ........................................................ 82 5.3 Avaliao das cepas isoladas Ensaio III....................................................... 94 5.4 Comparao das taxas de biodegradao nos ensaios I, II e III ................... 102 6. CONCLUSES ...................................................................................................104 7. RECOMENDAES........................................................................................... 105 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................106 10

LISTA DE TABELA

Tabela 1 Classificao do Petrleo segundo o Grau API e o Teor de Enxofre ......22 Tabela 2 Produtos obtidos a partir do fracionamento do petrleo .......................... 25 Tabela 3 Caractersticas das fraes de petrleo e leos brutos avaliados........... 61 Tabela 4 Composio do Meio Mnimo (MM)......................................................... 62 Tabela 5 Soluo de Micronutrientes .....................................................................63 Tabela 6 Composio dos tratamentos do ensaio I da respirometria..................... 68 Tabela 7 Composio dos tratamentos da segunda etapa da respirometria ......... 69 Tabela 8 Composio dos tratamentos da terceira etapa da respirometria. .......... 70 Tabela 9 Caracterizao morfolgica das colnias isoladas dos solos de mangue e horta, utilizadas no experimento respiromtrico................................................. 72 Tabela 10 Caracterizao bioqumica das bactrias.............................................. 74 Tabela 11 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R2) para os tratamentos do Ensaio I .................................................................78 Tabela 12 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R2) para os tratamentos do ensaio I, destacando a fase rpida (k 1) e fase lenta (k2). .................................................................................................................... 81 Tabela 13 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R2) para os tratamentos do ensaio II ................................................................ 86

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Tabela 14 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste (R 2) para os tratamentos do ensaio II, destacando a fase rpida (k1) e fase lenta (k2). ....88 Tabela 15 Mdias de CO2 acumulado (mg) das cepas e dos hidrocarbonetos A, B, C e D do primeiro ao stimo dia de ensaio. ....................................................... 90 Tabela 17 Mdias de CO2 acumulado (mg) das cepas e dos hidrocarbonetos A, B, C e D do primeiro ao vigsimo nono dia de ensaio............................................ 92 Tabela 18 Valores mdios de biodegradabilidade de fraes de hidrocarbonetos, expostos em mg de CO2 cumulativo, durante 29 dias. ......................................94 Tabela 19 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R2) para os tratamentos ensaio III do experimento. .......................................... 97 Tabela 20 Valores das constantes de biodegradao (k1 e k2) e respectivos ajustes da reta (R2) para os tratamentos do ensaio III do experimento.......................... 99 Tabela 21 - Estatsticas descritivas das Cepas 1 e 14 , utilizando solos texturizados, sendo solo X (arenoso) e solo Y (argiloso) e dos hidrocarbonetos A, B, C e D (petrleo leve, frao 6, frao 29 e frao 31), considerando a anlise do primeiro ao dcimo dia..................................................................................... 100 Tabela 22 - Estatsticas descritivas das Cepas 1 e 14, utilizando solos texturizados, sendo solo X (arenoso) e solo Y (argiloso) e dos hidrocarbonetos A, B, C e D (petrleo leve, frao 6, frao 29 e frao 31), considerando a anlise do dcimo primeiro ao trigsimo primeiro dia. ...................................................... 100 Tabela 23 - Estatsticas descritivas das Cepas 1 e 14, utilizando solos texturizados, sendo solo X (arenoso) e solo Y (argiloso) e dos hidrocarbonetos A, B, C e D (petrleo leve, frao 6, frao 29 e frao 31), considerando a anlise do primeiro ao trigsimo primeiro dia. ...................................................................101 Tabela 24 Comparao das taxas de biodegradao (k) entre os tratamentos nos trs ensaios......................................................................................................102

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema de separao do petrleo a partir da destilao fracionada que aquece, separa e esfria os produtos. .................................................................25 Figura 2 Fluxograma de classificao dos hidrocarbonetos...................................26 Figura 3 Exemplos de hidrocarbonetos alifticos ................................................... 27 Figura 4 Exemplos de hidrocarbonetos aromticos ............................................... 27 Figura 5 Constituio do solo em seus trs tipos de fases: slida, lquida e gasosa. ........................................................................................................................... 46 Figura 6 Fluxograma de etapas do experimento de respirometria aerbia. ........... 59 Figura 7 Experimento respiromtrico aerbio composto de vermiculita e areia, meio mnimo, inculo bacteriano e hidrocarbonetos derivados do petrleo. .............. 65 Figura 8 Ensaios de biodegradabilidade atravs da respirometria de Bartha. .......66 Figura 9 Visualizao em placa da cepa 13. .......................................................... 73 Figura 10 Visualizao em placa da cepa 5........................................................... 73 Figura 11 Visualizao em placa da cepa 4........................................................... 73 Figura 12 Visualizao em placa da cepa 16. ........................................................ 73 Figura 13 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias. .............. 75 Figura 14 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias. .............. 76

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Figura 15 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias. .............. 76 Figura 16 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias. .............. 77 Figura 17 Taxa de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio I, por um perodo de 15 dias. ......................................................................................................... 79 Figura 18 Os resultados referentes acumulao de CO 2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto A ( leo bruto 1)............................................................................................................... 83 Figura 19 Os resultados referentes acumulao de CO2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto B (frao 6). ........................................................................................................................... 83 Figura 20 Os resultados referentes acumulao de CO 2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto C (frao 29)...................................................................................................................... 84 Figura 21 Os resultados referentes acumulao de CO 2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto D (frao 31)...................................................................................................................... 84 Figura 22 Taxa de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio II por um perodo de 29 dias. ......................................................................................................... 87 Figura 23 Ensaio de biodegradabilidade (I IV) dos hidrocarbonetos A, B, c e D (leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31, respectivamente), por respirometria aerbia, com as cepas 1 e 14, utilizando solo argiloso (Y) como substrato, por um perodo de 31 dias................................................................. 95 Figura 24 Ensaio de biodegradabilidade (I-IV) dos hidrocarbonetos A, B, C e D (leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31, respectivamente), por

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respirometria aerbia, com as cepas 1 e 14, utilizando

solo arenoso como

substrato, por um perodo de 31 dias................................................................. 96 Figura 25 Taxa de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio III, por um perodo de 31dias. .......................................................................................................... 98

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1. INTRODUO

Os crescentes derramamentos de leo, em terra ou em mar, tm sido motivo de desenvolvimento de pesquisas, objetivando solucionar os problemas que causam impacto ambiental ou a busca de alternativas possveis, menos agressivas, para a recuperao do Meio Ambiente, preocupao do homem contemporneo.

O petrleo, palavra formada do latim petra

oleum, leo que vem da pedra, uma

mistura de hidrocarbonetos resultantes de processos fsico-qumicos sofridos pela matria orgnica que se depositou juntamente com fragmentos de rochas durante a formao de rochas sedimentares, milhes de anos atrs. Devido a efeitos mecnicos, ocorre a migrao do petrleo no subsolo, acumulando-se em rochas porosas e permeveis denominadas rochas reservatrio.

Os hidrocarbonetos de petrleo incluindo os hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAH) tm sido categorizados como os principais poluentes pela Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos (EPA) e outras organizaes ambientais e de sade em todo mundo. Tambm aqui no Brasil, a partir dos anos oitenta, as pesquisas tm se voltado para os efeitos, no Meio Ambiente, da explorao de petrleo em nosso territrio, a utilizao de seus derivados e a necessidade de polticas ambientais conseqentes.

O petrleo, especificamente o brasileiro, tipicamente um leo pesado que, quando fracionado em refinaria, produz uma quantidade muito grande de nafta, gasolina, leo combustvel e, em quantidade menor, o leo diesel.

Apesar da separao da gua, leo, gs e slidos produzidos, ocorrer em estaes ou na prpria unidade de produo, necessrio o processamento e refino da mistura de hidrocarbonetos provenientes das rochas reservatrio, para a obteno dos componentes que sero utilizados nas mais diversas aplicaes. Esses hidrocarbonetos so compostos orgnicos formados por carbono e hidrognio e podem ser caracterizados em saturados, insaturados ou aromticos. Os 16

hidrocarbonetos saturados, tambm denominados de alcanos ou parafinas so aqueles cujos tomos de carbono so unidos somente por ligaes simples e ao maior nmero possvel de tomos de hidrognio, constituindo cadeias lineares, ramificadas ou cclicas, interligadas ou no. Os hidrocarbonetos insaturados, tambm denominados de olefinas, apresentam pelo menos uma dupla ou tripla ligao carbono-carbono, enquanto que os hidrocarbonetos aromticos, tambm chamados de arenos, apresentam pelo menos um anel de benzeno na sua estrutura.

A contaminao por petrleo e derivados tem causado bastante preocupao, seja pela freqncia dos eventos ou pelo elevado potencial dos mesmos. A contaminao de ecossistemas aquticos e terrestres por hidrocarbonetos pode ser atribuda s atividades das refinarias de petrleo e seus derivados ou vazamentos de tanques de combustveis subterrneos.

Quando o leo derramado na gua do mar, a princpio, somente os componentes solveis afetam os organismos que vivem sub-superfcie. Porm, quando ventos, ondas e correntes agem sobre a mancha de leo, misturando-a gua, outros componentes no solveis, passam tambm afetar os organismos ali presentes. Quanto mais solvel for o composto, mais txico ser ele.

Segundo Domingues (2005), um litro de leo capaz de esgotar o oxignio de 1 milho de litros de gua, formando, em poucos dias, uma fina camada sobre a superfcie de 1000 m2, o que bloqueia a passagem de gua e luz, impedindo a respirao e a fotossntese.

Devido a essa preocupao ambiental, desenvolveram-se pesquisas para avaliar a biodegradabilidade de hidrocarbonetos de petrleo no solo, pela ao de bactrias presentes no Meio Ambiente. O tratamento biolgico ou tcnicas de biorremediao so mtodos alternativos para tratamento do solo contaminado. Essas tcnicas so econmica e politicamente atrativas e tm mostrado resultados promissores no tratamento de solos

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contaminados com compostos orgnicos, particularmente com hidrocarbonetos de petrleo.

As bactrias heterotrficas so os organismos mais importantes na transformao de compostos orgnicos perigosos, e esquemas de tratamento de solos podem ser direcionados para o realce de suas atividades.

A biorremediao a reduo biolgica de substncias qumicas complexas catalisadas por microorganismos. A biorremediao de solos contaminados por hidrocarbonetos pode ser realizada atravs da simulao da microflora nativa, pela introduo de nutrientes e oxignio dentro do solo (bioestimulao) ou por meio de uma inoculao de uma populao microbiana mista ou pura, enriquecida dentro do solo (bioaumentao).

A cultura pura de um dado microrganismo uma cultura de clulas gentica e morfologicamente idnticas, j a cultura mista uma cultura de clulas diferentes. A imobilizao das clulas num meio slido torna possvel a visualizao do crescimento em massas celulares isoladas denominadas colnias. Nos ltimos anos, tem sido dada ateno obteno de consrcios microbianos, que comparativamente s culturas puras, tm se mostrado mais efetivos na degradao de compostos orgnicos. A biodegradao de hidrocarbonetos pode ser aerbia ou anaerbia. A aerbia no solo dominada por uma variedade de microorganismos, incluindo bactrias e fungos, os quais requerem oxignio durante a degradao qumica. A anaerbia no solo dominada por uma quantidade menor de microorganismos que no utilizam o oxignio para a degradao qumica.

Este trabalho tem

por objetivo

avaliar

uma alternativa

capaz de tratar

adequadamente as contaminaes em solos decorrentes de acidentes ambientais com hidrocarbonetos derivados do petrleo.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral:

Avaliar uma alternativa capaz de tratar adequadamente as contaminaes em solos decorrentes de acidentes ambientais com hidrocarbonetos derivados do petrleo.

2.2 Objetivos especficos:

1. Isolar e caracterizar microrganismos com atividade de biodegradao de hidrocarbonetos de petrleo e fraes.

2. Avaliar o potencial de biodegradabilidade aerbia de microorganismos isolados, caracterizados em diferentes tipos de solos.

3. Comparar os diferentes tipos de ambientes com o potencial de biodegradabilidade utilizando os microorganismos isolados.

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3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1. Composio Qumica do Petrleo

O petrleo uma mistura complexa de ocorrncia natural formada por diversos componentes orgnicos e inorgnicos, entre os compostos orgnicos encontram-se principalmente hidrocarbonetos parafnicos, naftnicos e aromticos. As

propriedades fsicas e termodinmicas e o comportamento de uma mistura desse tipo dependem principalmente de seus constituintes, das quantidades relativas desses constituintes e das condies termodinmicas nas quais ela se encontra.

O petrleo um lquido escuro acastanhado, de consistncia oleosa, de cheiro desagradvel e colorao que pode variar do preto ao castanho, originando-se da decomposio de animais e vegetais marinhos soterrados em desabamentos da crosta terrestre em pocas remotas. Alguns podem ser escuros, densos e viscosos, com pouco gs, enquanto outros podem apresentar tonalidades mais claras, baixa densidade e viscosidade, com quantidade expressiva de gs, em funo dos diferentes reservatrios em que os leos so obtidos.

A caracterizao adequada dos constituintes de petrleo uma informao indispensvel para a determinao do comportamento termodinmico e , portanto, de grande importncia para todas as operaes de produo de petrleo, desde a estimativa das reservas existentes at os projetos para sua produo nas fases primria e suplementar, seu transporte, refino e a distribuio de seus produtos.

Os leos crus contm muitas substncias txicas como benzeno, tolueno, xileno alm de outras substncias de baixo peso molecular (Kennish, 1996). As principais caractersticas de um tipo de petrleo so, conforme Martins (2005) a densidade do leo, o tipo de hidrocarboneto ou base predominante na mistura e o teor de enxofre. De acordo com o autor, em relao densidade, os diferentes tipos de

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petrleo so classificados segundo uma gradao que vai de leves (menos densos) a pesados (mais densos). De acordo com as normas do American Petroleum Institute, essa classificao conhecida tambm como grau API. Segundo essa classificao, quanto menor a densidade do petrleo, maior o grau API e conseqentemente maior o valor comercial do petrleo, tendo em vista que ser possvel produzir uma parcela maior de derivados nobres, de elevado valor comercial, como a gasolina, o diesel e o GLP, relativamente a outro tipo de leo, mais pesado (menor grau API).

O grau API maior quando se diz que o petrleo mais leve. Petrleos com grau API maior que 32 so considerados leves; entre 24 e 31 API, so mdios; abaixo de 23 API, so considerados pesados; e com grau API igual ou inferior a 10, so petrleos extrapesados. O leo leve (alto API) constitudo predominantemente de hidrocarbonetos alifticos mais facilmente degradados pela populao microbiana do que o leo mais pesado, que pode conter maior abundncia de hidrocarbonetos aromticos (Peters e Moldowan, 1993). Quanto ao teor de enxofre, o petrleo pode ser classificado como doce ou cido. So classificados como cidos os leos com percentual de enxofre superior a 0,5%; estes tm seu valor comercial reduzido devido a corrosividade e toxicidade do enxofre, que resultam em maiores custos no processo de refino. A Tabela 1 relaciona a classificao do petrleo de acordo com o teor de enxofre e do grau API.

De acordo com Mariano (2005), as caractersticas do petrleo tm grande influncia sobre a escolha das tcnicas que sero adotadas para a sua refinao, e de um modo geral so elas que iro determinar quais sero os produtos que melhor podero ser obtidos de um dado petrleo. Nem todos os derivados podem ser produzidos com qualidade e de forma economicamente vivel a partir de qualquer tipo de petrleo. Tambm no existe uma tcnica nica de refino que seja aplicvel a qualquer tipo de leo bruto.

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Tabela 1 Classificao do Petrleo segundo o Grau API e o Teor de Enxofre

Categoria
Leve com baixo teor de enxofre Pesado com mdio teor de enxofre Leve com elevado teor de enxofre Pesado com elevado teor de enxofre Muito pesado com elevado teor de enxofre Fonte: Tavares (2005)

% Enxofre
0-0,5 0,35-1,1 >1,1 >1,1 >0,7

Grau API
>32 >24 >32 24-33 0-23

Tcnicas instrumentais convencionais permitem a separao e identificao precisa dos componentes orgnicos em uma mistura de petrleo desde o metano at o pentano. Os hidrocarbonetos de massa molecular mais elevada no so facilmente separados e identificados, e geralmente definem-se estes constituintes como fraes de determinadas propriedades fsicas como temperatura de ebulio, massa molecular ou densidade. O fracionamento obtido por destilao convencional ou simulada, por exemplo, cromatografia gasosa. Novas tcnicas experimentais permitem caracterizar mais detalhadamente estas fraes em termos de constituintes parafnicos, naftnicos e aromticos (anlise PNA). Mesmo assim, permanece sempre uma frao residual que de difcil identificao por ser termicamente degradvel. Uma alternativa para identificar e caracterizar essa frao pesada atravs do comportamento de solubilidade dos constituintes em solventes orgnicos parafnicos e aromticos, o que classifica as fraes em saturados, aromticos, resinas e asfaltenos (SARA).

A presena dessa frao pesada, mesmo em quantidades pequenas, tem implicaes importantes sobre o comportamento de fases de fluidos de petrleo e gs natural nas condies encontradas durante as operaes de produo, transporte e refino. A natureza qumica, a quantidade e a interao dessa frao com os outros constituintes do fluido influenciam significativamente algumas propriedades e fenmenos importantes como, por exemplo, o ponto de orvalho de um gs natural, a precipitao de parafinas em petrleos sujeitos ambientes frios (linhas de transporte de petrleo em guas profundas) e a desestabilizao e deposio de asfaltenos no reservatrio, na coluna de produo e em linhas de

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transporte, devido a alteraes nas composies e condies termodinmicas de temperatura e presso durante a produo de petrleo. A presena de gua em sistemas de gs natural pode gerar outros problemas como a formao e deposio de hidratos. A formao de slidos durante a produo de petrleo traz prejuzos que variam do aumento dos gastos energticos devido ao aumento de viscosidade at a catastrfica interrupo da produo.

Entre os constituintes na frao pesada de petrleo que vem despertando interesse e ateno mundialmente esto os asfaltenos e a parafina. A comprovao de que petrleos brasileiros produzidos das jazidas de maiores reservas no pas contm quantidades apreciveis de asfaltenos juntamente com parafinas de alta massa molecular despertou o interesse para a realizao de pesquisas nesta rea. Foram realizados tanto trabalhos experimentais como tericos com bastante sucesso, revelando a complexidade de comportamentos destas fraes e dos fenmenos envolvidos e sugerindo a necessidade de estudos mais detalhados para desvendar os passos e mecanismos que levam deposio de asfaltenos e parafinas.

O petrleo consiste basicamente em compostos de apenas dois elementos que, no entanto, formam grande variedade de complexas estruturas moleculares.

Independentemente das variaes fsicas ou qumicas, quase todos os petrleo variam de 82 a 87 % de carbono em peso e 12 a 15% de hidrognio. Os asfaltos mais viscosos geralmente variam de 80 a 85% de carbono e de 8 a 15% de hidrognio. De acordo com a origem do petrleo, a composio qumica e as propriedades fsicas do leo cru podem variar demasiadamente, e devido a esses fatores (composio complexa e variabilidade na composio) que se encontram dificuldades para o tratamento de reas contaminadas por tal substncia.

Em geral, todas as formas do petrleo so compostas quase que completamente por tomos de carbono e de hidrognio, com menores propores de nitrognio e

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oxignio (Solomons, 1996). Existem mais de 600 compostos de hidrocarbonetos identificados no petrleo (Fetter, 1993).

3.2. Processo de Separao do Petrleo

Os hidrocarbonetos de petrleo so separados por destilao fracionada, pois o leo bruto extrado no contm muitas propriedades para uso. Na destilao, separam-se os vrios compostos em grupos chamados fraes do petrleo, conforme mostrado na figura 1. Se a amostra original consiste em vrios lquidos volteis, os lquidos componentes aparecem no destilado sucessivamente em uma srie de fraes, ou amostra do destilado, que fervem em intervalos de temperatura especficos. O componente mais voltil destila primeiro e o componente menos voltil obtido como frao final. Todas as fraes do petrleo obtidas na destilao so utilizadas, como o caso da gasolina, que contm oito tomos de carbono. Os leos lubrificantes - leos bsicos - so obtidos de fraes mais pesadas, devido sua estrutura molecular, pois so hidrocarbonetos de cadeia de16 carbonos. Como pode-se verificar pela tabela 2, a porcentagem de gasolina obtida atravs da destilao fracionada relativamente pequena, no atendendo s necessidades do consumo mundial e a quantidade de leo obtida muito grande (maior que a demanda). Com isso, sobrava muito leo e faltava gasolina, de maneira que foi possvel desenvolver um mtodo que permitisse a quebra de 1 molcula de leo (compostos com 15 a 18 carbonos) em 2 molculas menores (5 a 12 tomos de carbono) por meio do aquecimento desse leo uma temperatura de aproximadamente 500C utilizando um catalisador apropriado. Esse processo chamado de pirlise ou craqueamento cataltico.

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Figura 1 Esquema de separao do petrleo a partir da destilao fracionada que aquece, separa e esfria os produtos.

Tabela 2 Produtos obtidos a partir do fracionamento do petrleo Frao Gs de cozinha (GLP) Solvente para colas e tintas Gasolina Querosene leo Diesel e combustvel leo lubrificante e parafina Asfalto Outros (%) 7.5 11.2 16.2 5.0 50.4 1.2 1.8 6.7 Temp. destilao(C) abaixo de 20 60 - 100 80 - 205 175 - 275 acima de 250 acima de 350 slidos no volteis N de carbonos 1a4 5a7 5 a 12 12 a 16 15 a 18 acima de 17 estr. policclicas

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As indstrias utilizam colunas de fracionamento gigantescas para separar misturas complexas como leo cru. Utiliza-se as fraes volteis como gs natural (ferve abaixo de 0 C), gasolina (ferve entre 180 e 325 C). As fraes menos volteis so usadas como diesel combustvel (acima de 275 C). O resduo que permanece depois da destilao asfalto, que usado em rodovias.

3.3. Classificao dos Hidrocarbonetos Os hidrocarbonetos so constitudos por tomos de carbono e hidrognio arranjados em vrios tipos de configuraes estruturais, basicamente divididos em dois grupos, os alifticos e os aromticos.

Na classificao estrutural dos alifticos existem quatro classes denominadas alcanos, alcenos, alcinos e cicloalcanos. Os aromticos so divididos em monoaromticos e poliaromticos (Potter e Simmons,1998).

Os alcanos formam cadeias com ligaes simples, os alcenos possuem ligaes duplas e os alcinos possuem pelo menos uma ligao tripla. Os hidrocarbonetos aromticos so formados por anis benznicos. As principais classes esto apresentadas na figura 2.

Hidrocarbonetos

Alifticos

Aromticos

Alcanos Alcenos

Alcinos Ciclanos

Monoaromticos Poliaromticos

Figura 2 Fluxograma de classificao dos hidrocarbonetos. Fonte:Potter e Simmons,1998

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CH3 | CH3 CH C CH2 CH3 | | CH3 CH3


2,3,3 trimetil pentano

CH3 C CH2 CH CH3 || | CH2 CH2 | CH3


2,4 dimetil hexeno - 1

Figura 3 Exemplos de hidrocarbonetos alifticos

Figura 4 Exemplos de hidrocarbonetos aromticos

Os hidrocarbonetos aromticos, tambm chamados de BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzenos e xilenos) no formam concentraes abundantes na maioria dos leos brutos. Eles so produzidos durante o processo de destilao e so associados aos produtos de petrleo refinados, como a gasolina, o querosene e o leo diesel (Robbins et al., 1993).

Os hidrocarbonetos que possuem dois ou mais anis so denominados hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAH), estes hidrocarbonetos so

considerados os mais txicos componentes do petrleo e esto associados a efeitos

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carcinognicos. Muitos dos PAH de baixo peso molecular so solveis em gua, aumentando o risco de contaminao. Os PAHs so os poluentes que mais preocupam tratando-se de poluio ambiental. Esta preocupao origina-se do fato que os PAHs, so conhecidos como potentes cancergenos. O benzo(a)pireno, o mais extensivamente PAH estudado, tm sido demonstrado que produz metablitos cancergenos quando agem nas enzimas do corpo. Outra preocupao crescente a contaminao do solo por PAH, que segue para guas subterrneas, cuja contaminao associada a uma grande gama de locais contaminados por substncias perigosas (Haimann, 1995). Os

hidrocarbonetos policclicos aromticos, ainda so produzidos hoje por processos industriais da refinao de petrleo, produo de coque e estao de tratamento de esgotos na indstria petrolfera. (Cutright e Lee, 1994).

O conjunto de hidrocarbonetos presentes em uma amostra de petrleo ou de seus derivados conhecido como TPH (Total Petroleum Hydrocarbons). Os TPH so definidos como a soma dos compostos aliftico e aromticos (Weisman, 1998). Os grupos BTX e PAH so os compostos de maior mobilidade e toxicidade no Meio Ambiente (Schneider, 2005).

3.4. Poluio e Contaminao Ambiental

A Poluio pode ser definida como a introduo no Meio Ambiente de qualquer matria ou energia que venha a alterar as propriedades fsicas ou qumicas ou biolgicas desse meio, afetando, ou podendo afetar, por isso, a "sade" das espcies animais ou vegetais que dependem ou tenham contato com ele, ou que nele venham a provocar modificaes fsico-qumicas nas espcies minerais presentes. A contaminao quando a poluio resulta em prejuzos sade humana.

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Entre as principais fontes de contaminao do solo e das guas subterrneas podem-se citar os vazamentos em dutos e tanques de armazenamentos subterrneos de combustvel, atividades de minerao e uso de defensivos agrcolas (Alaburda e Nishihara, 1998). Os postos de gasolina compem uma parte significativa do total dos

empreendimentos implantados nos centros urbanos representando potencialmente uma fonte de impacto ambiental caracterizada por vazamentos de derivados de petrleo no solo, os quais conduzem impactos ambientais, contaminando guas subterrneas e o solo. As normas ABNT estabelecem padres para os equipamentos e dispositivos de proteo contra vazamentos e derramamentos a serem instalados nos postos, em funo de sua classe 1, 2 ou 3 (NBR 13.786/97). Esta classe determinada a partir de fatores de agravamento tais como: proximidade de escolas, hospitais, tneis, ou seja, de acordo com o tipo de vizinhana no entorno do posto, a uma distncia de 100 metros a partir de seu permetro. O termo poluio do solo usualmente se refere presena de substncias txicas de classes qumicas tais como VOC (Volatile Organic Compounds), hidrocarbonetos alifticos e aromticos como BTX (Benzeno, Tolueno e Xileno), leos pesados, sub produtos do craqueamento dos derivados petroqumicos, elementos

radionucleotideos, metais pesados, solventes e compostos clorados, PAH (Hidrocarbonetos Poliaromticos), fenis, pesticidas halogenados, aminas

nitrogenadas, steres, lcoois e produtos intermedirios. Todos eles alteram negativamente a qualidade do solo e podem, por conseguinte, afetar a vegetao que dele depende, a quantidade da gua subterrnea, ou ainda representar um risco para a sade das pessoas que com ele entrem em contato direto ou indiretamente (Rodriguez, 2006). Quando ocorre um derramamento de gasolina, uma das principais preocupaes a contaminao de aqferos que so usados como fonte de abastecimento de gua para consumo humano. Por ser muito pouco solvel em gua, a gasolina derramada, contendo mais de uma centena de componentes, inicialmente estar presente no 29

subsolo como lquido de fase no aquosa (NAPL). Em contato com a gua, os compostos BTEX se dissolvero parcialmente, sendo os primeiros contaminantes a atingir o lenol fretico (Silva, 2002). Alguns estudos tm demonstrado que a presena de etanol no ambiente subterrneo afeta a intemperizao dos hidrocarbonetos monoaromticos (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos BTEX) e dos hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAH). Os principais efeitos observados pela presena do etanol em reas contaminadas por hidrocarbonetos de petrleo so: (a) o aumento das

concentraes dos hidrocarbonetos na gua subterrnea, decorrente do incremento da solubilidade aquosa dos compostos, provocado pelo efeito co-solvncia; (b) o aumento da distncia percorrida pelos contaminantes devido ao fluxo da gua subterrnea, decorrente do aumento da massa destes contaminantes e reduo da soro na frao orgnica dos hidrocarbonetos dissolvidos; (c) consumo preferencial do etanol pelos microorganismos que resulta na diminuio da atividade microbiolgica devido toxicidade, alterao do meio, consumo de nutrientes e de receptores de eltrons presentes no solo, principalmente o oxignio dissolvido; (d) intensificao da biodegradao dos hidrocarbonetos dissolvidos no meio aps o esgotamento da massa de etanol, provocado pela grande quantidade de biomassa gerada para a degradao do etanol.

A composio de combustveis presentes no solo e na gua subterrnea de reas impactadas pode variar ao longo do tempo. Isto ocorre porque os hidrocarbonetos do petrleo esto sujeitos atuao de um conjunto de processos naturais que, combinados, influem na persistncia, mobilidade e reduo da massa dos contaminantes. Este conjunto de processos inclui a dissoluo, a biodegradao e a volatilizao, e recebe a denominao de intemperismo ou atenuao natural.

A comunidade microbiana presente nos solos ativa e metabolizante e sua atividade est associada aos inmeros compostos nele existentes. Portanto, numerosos nichos ecolgicos so formados a partir da atividade dos microrganismos nos solos. O solo pode ser visto como um vasto local de reciclagem que continuamente recebe e modifica compostos de carbono na tendncia de oxid-los a 30

CO2

gua.

No obstante as qualidades do solo como atenuador de poluio, exercendo o papel de filtro e imobilizador de grande parte das impurezas nele depositadas, esse pode degradar-se. A capacidade do solo limitada, podendo ocorrer alterao da sua qualidade devido ao efeito cumulativo da deposio de poluentes. Assim, no possvel desvincular-se o tratamento de um resduo em solo dos cuidados a serem tomados para no causar rpida contaminao da rea.

O Meio Ambiente possui uma capacidade natural de se regenerar, restabelecendo seu equilbrio inicial propcio vida. Sabe-se que estes processos regeneradores naturais ocorrem com velocidades finitas e muito variveis, em funo do tipo de fator que tenha causado o desequilbrio. Tambm sabido que, ultrapassados certos limites, a capacidade regenerativa do ambiente pode ser superada, dando lugar ao aparecimento de mudanas que so irreversveis (Gomes, 1995).

A poluio ambiental geralmente conseqncia da atividade humana, sendo causada pela introduo de substncias (ou de condies), que normalmente no esto no ambiente ou que nele existem em pequenas quantidades. Poluente o detrito introduzido em um ecossistema no adaptado a ele, ou que no suporta as quantidades de poluentes que nele so introduzidos (FEEMA, 1992).

No Brasil, ainda no existe uma legislao especfica para as questes que envolvam reas contaminadas (AC). No entanto, a legislao ambiental existente oferece uma certa base, referindo-se indiretamente a diferentes aspectos do problema de reas contaminadas, como, por exemplo, os itens que abordam a preservao ou a recuperao da qualidade ambiental, os instrumentos legais como as polticas nacional ou estadual de meio ambiente e diretrizes e normas para o controle de poluio. H tambm leis especficas que estabelecem instrumentos legais especiais com certa relevncia para o problema de reas contaminadas, como, por exemplo, o parcelamento do solo urbano. De acordo com a estrutura federativa, encontram-se legislaes ambientais no mbito federal, estadual e

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municipal que podem, tendo em vista a falta de legislao especfica, ser utilizadas nas aes dos rgos ambientais nas questes que envolvem esse tema. Como, por exemplo, a Lei n0 6.938/81 que dispe sobre a Poltica Nacional do Meio Ambiente e a Lei 9.605/98 que dispe sobre as sanes penais e administrativas derivadas da lei de crimes ambientais, condutas atividades lesivas ao Meio Ambiente (Lei dos Crimes Ambientais).

O petrleo e seus derivados esto entre os principais compostos orgnicos que, nos ltimos decnios, tm sofrido aumento na sua produo e industrializao, aumentando, tambm a quantidade dos mesmos como poluente ambiental, pois, quando em contato com a gua, o petrleo se espalha sobre a superfcie formando uma fina pelcula que impede a troca de gases entre o ar e a gua e a chegada de luz ao fitoplncton, afetando, assim, as cadeias alimentares. Nas plantas, veda a entrada dos estmatos, impedindo a respirao e a fotossntese. Nos peixes e caranguejos a pelcula de petrleo recobre as guelras e os rgos respiratrios, impedindo a respirao. No solo, bloqueia a absoro de nutrientes pelas razes das plantas. Como os homens e os animais no possuem enzimas capazes de promover a decomposio de petrleo, a sua ingesto impede a absoro dos alimentos pelas mucosas do aparelho digestivo, alm de conter substncias txicas ao organismo. (Fellenberg, 1980).

Ao longo do tempo, o petrleo foi se impondo como fonte de energia e hoje, com o advento da petroqumica, o petrleo, alm de produzir combustvel, passou a ser imprescindvel s facilidades e comodidades da vida moderna assumindo uma importncia cada vez maior na vida das pessoas. Do lenol de fibra sinttica aos combustveis, do plstico da escova de dentes ao chiclete, ele se faz presente no dia a dia em diversos momentos, sendo o componente bsico de mais de seis mil produtos (Abadie, 1984).

A busca pela produtividade entra muitas vezes em conflito com as necessidades de preservar o Meio Ambiente. Um dos grandes problemas da indstria de petrleo a quantidade de substncias qumicas que so lanadas nos solos, guas

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subterrneas, sedimentos, guas superficiais e ar. A indstria do petrleo, em suas diversas atividades explorao, produo, refino, transporte e comercializao apresenta um risco ambiental inerente, que precisa ser constantemente gerenciado, visando prevenir os seus impactos ao meio ambiente (Seabra, 2001).

O controle efetivo da gerao, do armazenamento, do tratamento, da reciclagem e reutilizao, do transporte, da recuperao do depsito dos resduos perigosos so de extrema importncia para a sade humana, assim, como para a proteo ambiental. Uma das primeiras prioridades do manejo de resduos perigosos a sua minimizao, como parte de um enfoque mais amplo de mudanas dos processos industriais e dos padres de consumo, por meio de estratgias de preveno poluio e de tecnologias limpas (CNUMAD, 2001).

3.5. Biodegradao

A biodegradao se d atravs do aproveitamento dos contaminantes pelos microorganismos como fonte de carbono que os permitem produzir novas clulas e, tambm, suprir-se de eltrons que possibilitem a obteno de energia. A energia obtida mediante a catlise de reaes qumicas que, dentre outras formas, podem ser por oxidao ou reduo. O que ocorre a quebra das ligaes qumicas e a transferncia de eltrons do contaminante. Para microorganismos degradarem completamente o petrleo, centenas de diferentes compostos tm que ser metabolizados.

A biodegradao pode ser dividida em trs categorias: (a) mineralizao, onde os compostos qumicos orgnicos so transformados a compostos qumicos

inorgnicos como dixido de carbono, gua e amnia; (b) biotransformao, onde os compostos orgnicos qumicos so transformados em estruturas menores e (c) cometabolismo, onde outro composto metabolizado primeiramente ou

simultaneamente a um composto especfico (Dalton, 1982). A escolha de um mtodo de tratamento vai depender das caractersticas fsicas, fsico-qumicas e qumicas do 33

resduo e da disponibilidade de instalaes para processar esses materiais (Rocca et al., 1993).

Biodegradao a transformao de compostos orgnicos pela atividade metablica dos organismos, especialmente microrganismos. Por ser o petrleo composto principalmente de hidrocarbonetos, a sua degradao completa resulta na produo de CO2 e gua, fenmeno denominado de mineralizao. O termo biodegradao tem sido utilizado para a descrio de todos os tipos, incluindo aquelas que originam produtos menos txicos que o composto original, pela sua inativao, assim como aquelas responsveis pela completa mineralizao at CO2, H2O e outros (Musumeci, 1992). Segundo Grishenkov et al. (2000), a biodegradao de hidrocarbonetos pode ocorrer sob condies aerbicas e anaerbicas, entretanto, sob condies anaerbicas, a taxa e a extenso de biodegradao de hidrocarbonetos decresce e a variedade de substncias degradadas tipicamente mais estreita.

Cerca de 60% a 90% so hidrocarbonetos alifticos, passveis de biodegradao. Nessa classe, o fitano e o pristano so mais resistentes degradao e podem ser usados como marcadores qumicos em monitoramento. Entre os aromticos, devese monitorar benzeno, tolueno e xileno (BTEX), mais txicos aos seres vivos; hopano pode ser usado como marcador qumico, em monitoramento. Nos seres vivos, o petrleo pode ser incorporado s gorduras, causar distrbios metablicos ou interromper a quimiorrecepo.

A biorremediao de uma rea degradada pode ser realizada por processo in situ ou ex situ. No primeiro, a remediao biolgica aplicada diretamente no local poludo, ao contrrio dos processos ex situ, em que o meio impactado removido e tratado em local apropriado.

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Bactrias, leveduras e fungos filamentosos que degradam substratos insolveis em gua como os hidrocarbonetos slidos e lquidos, gorduras, leos e graxas, usualmente produzem biosurfactantes, molculas com pores hidrofbicas e hidroflicas que atuam como detergentes e auxiliam na disponibilidade destes compostos clula microbiana atravs das emulses formadas (Gerson, 1993).

Os microorganismos so os principais agentes responsveis pela reciclagem do carbono na natureza, incluindo bactrias, leveduras e fungos. As bactrias capazes de degradar estes hidrocarbonetos podem, s vezes, produzir biossurfactantes, os quais melhoram a solubilidade de poluentes hidrofbicos e assim a sua biodegradabilidade. Em muitos ecossistemas j existe uma adequada comunidade microbiana hidrocarbonoclstica nativa capaz de uma extensiva biodegradao de leo, provando que condies ambientais so favorveis para a atividade metablica de degradao de leo (Atlas, 1977).

As bactrias e os fungos so dois grupos de microorganismos dominantes na biodegradao. As bactrias tm a vantagem de reterem facilmente o substrato e proverem um rpido crescimento. Em condies favorveis, as bactrias dominam mesmo na presena de fungos, embora degradem apenas pequenas molculas orgnicas que so facilmente incorporadas nas suas clulas. Pseudomonas e Nocardia so normalmente bactrias presentes nestas situaes.

Os microrganismos necessitam de condies ambientais de crescimento. Por sua vez, a velocidade e a extenso com que os componentes do petrleo so degradados dependem da existncia de, pelo menos, quatro fatores principais (Rodrigues, 1984, Baird, 2002): I- Umidade, para facilitar as reaes; II- Oxignio, para rpida oxidao dos hidrocarbonetos e outros compostos do petrleo, j que sob condies anaerbicas, a biodegradao mais lenta e normalmente efetuada por bactrias sulfato-redutoras; III- Contato leo-gua, devido relativa insolubilidade do leo na gua, tal contato controla a velocidade de oxidao e da degradao;

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IV- Presena de nutrientes (fosfatos, sulfatos, nitratos, etc) para o desenvolvimento microbiano.

A biodegradao do etanol e de hidrocarbonetos uma reao de oxidao-reduo realizada durante o processo respiratrio microbiano, na qual estes so oxidados, ou seja, doam eltrons a um receptor. Desta forma, microorganismos presentes no solo podem consumir os hidrocarbonetos de petrleo, se estes forem utilizados como fonte de doadores de eltrons para o metabolismo microbiano para obteno de energia, produo e manuteno celular, como demonstra a equao 1.

Hidrocarboneto (doador de eltrons) + O2 (receptor de eltrons) + microorganismos + nutrientes CO2 + H2O + microorganismos + metablitos

(1)

As bactrias se caracterizam por seu crescimento rpido, sua versatilidade metablica, plasticidade gentica e capacidade de adaptao rpida as variaes ambientais. Como todos os seres vivos, as clulas bacterianas necessitam basicamente de energia, carbono e nutrientes (nitrognio, fsforo, enxofre, potssio, clcio, magnsio, etc).

No processo de biorremediao, necessrio que o pH seja compatvel com os microrganismos. Bactrias desenvolvem-se com um pH timo entre 5 e 9, enquanto que os fungos que degradam compostos complexos tem o pH timo de 5 ou menos (Skaladany e Metting,1992).

Muitas espcies de fungos desenvolvem-se em grandes intervalos de pH, desde o extremo de 9 at 3 a 4. Mas pelo fato das bactrias e actinomicetos dominarem em solo de pH prximo ao neutro, os fungos geralmente dominam as reas com baixo

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pH (Alexander, 1980). A presena da gua fundamental para a comunidade microbiana. Entretanto, a disponibilidade de oxignio o maior limitante para microrganismos aerbios. A falta de oxignio causada principalmente pelo excesso de gua no solo (Skaladany e Metting,1992).

Os

organismos

mais so

comumente bactrias

isolados

em do

reas

contaminadas

por

hidrocarbonetos Achromobacter,

heterotrficas Vibrio,

gnero

Pseudomonas, Brevibacterium,

Micrococcus,

Acinetobacter,

Corynebacterium, Flavobacterium (Kobayashi e Rittmann, 1982), Mycobacterium (Gholson, Guire, e Friede, 1972; Soli, 1973). A Pseudomonas, que uma bactria gram negativa, pertence a um gnero de bactrias bastante heterogneo, capaz de utilizar diferentes compostos como a nica fonte de carbono e energia para o seu crescimento.

So conhecidos 25 gneros de bactrias e 27 de fungos, que fazem a degradao dos hidrocarbonetos no ambiente marinho (Floodgate, 1984), enquanto que nos solos so registrados 22 gneros de bactrias e 31 de fungos (Bossert e Bartha, 1984; Rosato, 1997). Os fungos parecem ser mais importantes na biodegradao de hidrocarbonetos presentes em solos (Jones e Eddington, 1968; Rosato, 1997). Em geral, as bactrias e leveduras apresentam capacidade decrescente de degradao de acordo com o aumento da cadeia carbnica ao passo que os fungos no exibem degradao preferencial de tamanho (Walker et al., 1975).

A tomada de nutrientes e posterior metabolismo so influenciados por fatores fsicos e qumicos do meio ambiente. Os principais fatores so: temperatura, pH, presena de oxignio e luz. Cada tipo de bactria apresenta uma temperatura tima de crescimento, em torno desta temperatura observa-se um intervalo dentro do qual o desenvolvimento tambm ocorre, sem, no entanto, atingir o seu mximo. Ultrapassado o limite superior, rapidamente ocorre desnaturao do material celular e, conseqentemente, a morte da clula. As temperaturas inferiores tima levam a uma desacelerao

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das reaes metablicas, com diminuio da velocidade de multiplicao celular, que em caso extremo, fica impedida.

Os valores de pH em torno da neutralidade so os mais adequados para absoro de alimentos para a grande maioria das bactrias. Existem, no entanto, grupos adaptados a viver em ambientes cidos e alcalinos.

Algumas caractersticas dos fungos filamentosos, como a bioatividade e o crescimento morfolgico, os tornam melhores degradadores potenciais do que as bactrias. Alm disso, os fungos so capazes de crescer sob condies ambientais de estresse: meios com baixos valores de pH, pobres em nutrientes e com baixa disponibilidade de gua, favorecendo o seu desenvolvimento diante de outros microorganismos (Mollea et al., 2005).

Os fungos geralmente crescem mais devagar e as suas dimenses superiores levam a uma relao baixa entre a superfcie e o volume de reteno de substrato. No entanto, os fungos so capazes de degradar uma grande variedade de contaminantes e alguns de elevada complexidade, excretando enzimas que quebram as ligaes entre os polmeros e resistem a condies bastante adversas. importante notar que os fungos produzem grandes filamentos que podem bloquear o fluxo de ar e impedir a biodegradao pelas bactrias.

As bactrias apresentam-se em maior proporo no solo, se comparado s leveduras, atuando com efeito inibitrio sobre as mesmas, competindo pelos nutrientes presentes.

A utilizao de microrganismos em saneamento bsico e ambiental prtica comum desde os primrdios do desenvolvimento dos processos biolgicos de tratamentos de guas residurias e resduos slidos. Foi a capacidade microbiana de catabolizar diferentes compostos orgnicos, naturais ou sintticos, e inorgnicos, extraindo destes compostos fontes nutricionais e, energticas, que possibilitou o emprego

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desses agentes biolgicos como soluo aos problemas gerados pelos rejeitos lanados no meio ambiente.

Ururahy (1998) estudaram a viabilidade tcnica do tratamento biolgico de borra oleosa em escala de bancada. A partir de estmulo de microrganismos nativos presentes no resduo oleoso, concluram que os mesmos foram capazes de crescer em meio contendo borra de leo como nica fonte de carbono e energia. A identificao Pseudomonas desses microrganismos Pseudomonas revelou a presena das bactrias picketti,

cepacia,

aureofaciens,

Pseudomonas

Flavobacterium indologenes, Xanthomonas maltophilia e Ochrobactrum anthropi , das leveduras Candida tropicalis e Rhodotorula mucilaginosa, alm de duas espcies de fungos filamentosos. Os hidrocarbonetos possuem diferentes valores de densidade. A principal razo de se conhecer a densidade de uma substncia determinar se esta flutuar sobre a gua (densidade < 1,0 mg/l) ou se mesclar com a gua (densidade > 1,0 mg/l) (Ferreira et al., 1998).

Os hidrocarbonetos so classificados como contaminantes de fase lquida no aquosa (NAPL) e podem ser divididos em duas subfases: a) fase lquida no aquosa densa (DNAPL dense non-aqueous phase liquids) e b) fase lquida no aquosa leve (LNAPL- light non-aqueous phase liquids) (Hasan, 1996).

Os compostos solveis dos NAPLs so dissolvidos pela gua de infiltrao que os transportam pelas zonas saturadas at as zonas insaturadas (Hasan, 1996). Para a biodegradao dos hidrocarbonetos essencial uma reao redox, em que o hidrocarboneto oxidado (doador de eltron) e um aceptor de eltron reduzido. Existem diferentes compostos que podem agir como aceptores de eltron, entre eles o oxignio (O2), o nitrato (NO3-), os xidos de Fe (III), o sulfato (SO 4=), entre outros. Bactrias aerbicas usam oxignio molecular como aceptor de eltron e bactrias anaerbicas usam outros compostos, tais como nitrato (NO 3-2), xidos de Fe (III), sulfato (SO4=) como aceptor de eltron. O oxignio o aceptor preferencial, pois os

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microorganismos ganham mais energia nas reaes aerbicas. Dentre os aceptores de eltron das reaes anaerbicas, o nitrato um dos ons mais encontrados em guas naturais, ocorrendo geralmente em baixos teores nas guas superficiais, mas podendo atingir altas concentraes em guas subterrneas (Borden et al., 1995). A ingesto de nitrato, atravs das guas de abastecimento, est associada induo metemoglobinemia, especialmente em crianas, e formao potencial de nitrosaminas e nitrosamidas carcinognicas, dois efeitos adversos sade. O desenvolvimento da metemoglobinemia com base no nitrato presente nas guas potveis depende de sua converso bacteriana a nitrito durante a digesto que ocorre no trato gastrointestinal. As crianas, principalmente as menores de trs meses de idade, so bastante suscetveis ao desenvolvimento dessa doena por causa das condies mais alcalinas do seu sistema gastroinstestinal, fato tambm observado em pessoas adultas que apresentam gastroenterites, anemia, pores do estmago cirurgicamente removidas e mulheres grvidas (Alaburda e Nishihara, 1998). Portanto, existem dois motivos para que seja determinada a concentrao de nitrato em gua de consumo humano contaminada por BTEX, primeiro, como fator benfico, por ser um aceptor de eltron no processo de biodegradao dos BTEX, e o segundo, que malfico, por ser um parmetro de avaliao da contaminao de guas por compostos nitrogenados que, no caso do nitrato, prejudicial sade humana acima de 10 mg.L-1 segundo estabelecido pelo Ministrio da Sade na Portaria 518/2004 (MS, 2004). Cassarini et al. (1988) relatam, que o tratamento de resduos oleosos de petrleo est sujeito a vrios mecanismos que promovem a degradao. Muitas das substncias do petrleo so volteis e instveis sob condies normais. O leo est sujeito evaporao, fotoevaporao, adsoro, percolao e biodegradao. Citam ainda que aproximadamente 50% do carbono presente no teor de leos e graxas de um lodo oleoso convertido para biomassa e hmus no solo.

O potencial de biodegradao de hidrocarbonetos, utilizando microrganismos isolados de solos poludos por compostos txicos, vem sendo descrita como prtica de grande eficincia, baixo custo e crescente utilizao. Dentre outras linhagens

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selecionadas, uma cultura do gnero Acinetobacter apresentou-se como efetiva na assimilao de hidrocarbonetos aromticos e resinas em leos (Chaneau et al., 1999).

Alcanos de cadeia ramificada, alcenos e cicloalcanos so atacados por uma limitada faixa de organismos. Compostos aromticos so parcialmente oxidados por muitos, mas so assimilados por poucos organismos. Aromticos polinucleares so menos txicos que aromticos simples e so metabolizados por poucos organismos a baixas taxas de degradao. Cicloalcanos so bem txicos e a degradao inicial geralmente acompanhada de cometabolismo. As classes mais resistentes so os poliaromticos, substncias alicclicas (como os tripentacclicos, hopanos) e os alifticos de cadeia muito longa (Atlas, 1981).

A seqncia de degradao de hidrocarbonetos no solo determinada por uma sucesso de microorganismos. Microorganismos degradadores de alcanos, com rpidas taxas de crescimento competem com os decompositores de lento crescimento de hidrocarbonetos mais recalcitrantes pelos recursos nutricionais at a exausto dos primeiros. Estes organismos sero substitudos por micrbios com lenta taxa de crescimento, mas grande flexibilidade metablica para degradar os hidrocarbonetos mais recalcitrantes. A relativa biodegradabilidade dos

hidrocarbonetos tem sido reportada (em ordem de decrscimo de degradabilidade): alcanos lineares (C10 a C19), gases (C2 a C4), alcanos (C5 a C9), alcanos ramificados com at 12 carbonos, alcenos (C3 a C11), alcenos ramificados, aromticos e cicloalcanos. A tendncia encontrar menos microorganismos com o aumento da dificuldade de degradao (Heely et al., 1992).

A biodegradao de hidrocarbonetos de petrleo se inicia com a oxidao do substrato por oxidases, em condies aerbias. Os alcanos so transformados em cidos carboxlicos, os quais so tambm metabolizados pelos microorganismos. Os compostos aromticos so geralmente hidroxilados, formando diis, os quais so degradados a catecis.

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Muitos hidrocarbonetos como n-alcanos so facilmente degradados por um grande nmero de microorganismos os quais os usam como fonte de carbono e energia. Por outro lado, hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAHS) e os cicloalcanos so principalmente degradados por co-oxidao no meio ambiente (Bouchez et al., 1995).

O petrleo cru no ambiente nunca completamente degradado, sempre persistindo resduos mais complexos, geralmente contendo compostos asflticos, os quais so mais inertes, possuem baixa disponibilidade e toxicidade e no apresentam grandes riscos ecolgicos aparentes (Atlas, 1995). Devido s caractersticas de determinados contaminantes, inclusive sua concentrao, por vezes a degradao no acontece por completo, gerando os produtos recalcitrantes, que podem apresentar um nvel de toxidade bastante perigoso ou mais alto que o prprio contaminante original. Em geral, quanto maior o nmero de tomos de carbono do composto presente no petrleo, maior ser a sua persistncia no ambiente, mais lenta ser a sua evaporao e a sua solubilidade e menor ser a sua susceptibilidade biodegradao (Marques et al., 2002).

Quando um substrato adicionado ao solo, este prontamente utilizado pelos organismos colonizadores pioneiros, favorecendo sua competio, e isso leva a uma seletividade dos mais aptos, dependendo da velocidade de crescimento, rapidez de assimilao de nutrientes e tolerncia aos fatores biticos e abiticos (Cardoso, 1992). Posteriormente, poder ocorrer alterao na comunidade microbiana, considerando que h uma modificao no substrato, ou seja, alguns microrganismos vo sendo eliminados, dando lugar a outros mais aptos a degradarem os novos substratos. A degradao microbiolgica possui uma seqncia preferencial de compostos a serem degradados. Os hidrocarbonetos alifticos (alcanos e alcenos) so mais rapidamente e facilmente degradados, seguidos pelos hidrocarbonetos aromticos e finalmente cicloalcanos. Quando h multiplicidade de compostos em um determinado ambiente, os microorganismos do preferncia queles que so de digesto fcil ou fornecem mais energia.

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Nem sempre os contaminantes encontram-se dispostos de uma forma facilmente assimilvel pelos micrbios que os devem degradar. Em razo desse fator, os contaminantes a serem degradados podem no ser degradados ou serem de forma extremamente lenta em razo de uma baixa concentrao (Martins et al., 2003).

A populao microbiana da camada reativa de solo resultado da seleo e aclimatao de microorganismos capazes de degradar os resduos adicionados e seus subprodutos de ressntese e intermedirios resultantes da degradao (populao ativa), e de microorganismos que convivem neste ecossistema sem necessariamente estarem envolvidos diretamente na degradao (populao associada). Conforme as condies do solo (aerao, pH, temperatura, salinidade, atividade aquosa, nutrientes, presena de compostos txicos, etc.), pode haver variaes na relao populao ativa e populao associada e, tambm na biomassa microbiana de camada reativa do solo (Almeida e Carvalho, 1995).

Segundo Bcego (1988), a degradao do leo bem mais lenta no sedimento do que na gua, inclusive os compostos mais leves persistem mais tempo no sedimento.

Muitos estudos tm empregado culturas mistas de bactrias ou bactrias-fungos para maximizar a degradao. As vantagens do emprego de culturas mistas ao invs do uso de culturas puras na biorremediao de solos contaminados tm sido amplamente demonstradas. Isso pode ser atribudo aos efeitos das interaes de sinergismo entre os membros das associaes.

Muitos compostos considerados no biodegradveis em culturas puras passam a ser biodegradveis em cultura mista; isto porque, o cometablito uma vez transformado por uma determinada espcie, pode resultar em uma substncia til para outra espcie, podendo ser assimilado em uma via metablica comum (Ururahy, 1998).

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A completa degradao de um composto orgnico para CO2 (mineralizao) e outros minerais constituintes o resultado da atividade microbiana, tanto individual como em um consrcio.

Os n-alcanos so considerados os mais facilmente degradveis e j foi comprovada a biodegradao de at C44 (Hainnes e Alexander, 1974). A biodegradao dos nalcanos procede normalmente por um ataque monoterminal: h formao de um lcool primrio, seguido de um aldedo e um cido carboxlico (Mackenna e Kallio, 1964; Van Eyk e Bartels,1968). O cido carboxlico degradado via -oxidao com a formao de cidos graxos com dois carbonos a menos e a formao de acetilcoenzima A, com liberao eventual de CO2. Alguns cidos graxos txicos, podem se acumular durante o processo de biodegradao (Atlas e Bartha, 1973).

Os alcanos ramificados fazem -oxidao, como via de degradao mais comum, com formao de cidos dicarboxlicos (Fall et al., 1979). Os grupos metil aumentam a resistncia dos hidrocarbonetos ao ataque microbiano. O ciclo alcano particularmente resistente biodegradao (Chosson et al.,1991), porm h estudos mostrando que os hidrocarbonetos cclicos, at seis anis condensados, podem ser degradados (Walker et al., 1975).

Os compostos aromticos de at trs anis so degradados mais facilmente. Tipicamente, a degradao bacteriana envolve a ao de uma dioxigenase que gera a formao de um diol, com subseqente clivagem e formao de um dicido. Os compostos aromticos mais leves esto sujeitos a evaporao e a degradao microbiana no estado dissolvido. O ataque enzimtico pode ser no substituinte alquil ou diretamente no anel (Gibson, 1971; Rosato,1997). H linhagens de

microorganismos capazes de degradar compostos com cinco ou mais anis aromticos. Geralmente a oxidao dos hidrocarbonetos aromticos se processa produzindo principalmente fenis.

A biodegradao de hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs) por uma cultura mista microbiana, foi descrita por Yuan et al. (2000). As culturas foram selecionadas

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de locais conhecidos por contnuos descartes de efluentes petroqumicos no sul de Taiwan e cultivadas em meio mineral mnimo, contendo como nica fonte de carbono, o fenantreno. Segundo Corseuil e Maris (1997), a biodegradao dos compostos BTEX pode ser representada por uma reao qumica onde os hidrocarbonetos, em presena de um aceptor de eltrons, nutrientes e microorganismos so transformados em gua, dixido de carbono, e mais microorganismos. Os aceptores de eltrons, compostos que recebem eltrons e so, portanto, reduzidos, so principalmente o oxignio, nitrato, ferro frrico e sulfato.

Os hidrocarbonetos mais leves, com 4 a 12 carbonos so os primeiros a volatilizarem, pois quanto maior o nmero de carbonos, menos voltil o hidrocarboneto. O aumento da cadeia de carbonos normalmente est associado a menor mobilidade do composto no solo e a maior facilidade em ficar adsorvido a matria orgnica. Os hidrocarbonetos com 10 a 20 carbonos, mais densos, so menos volteis, menos solveis em gua e apresentam menor mobilidade no ambiente do que os mais leves (Finotti et al., 2001).

Alcanos C10 a C26 so mais facilmente degradados. Entre os aromticos, os de baixa massa molecular como o benzeno, tolueno e xileno, que esto entre os componentes txicos do petrleo so facilmente degradados pelos microorganismos marinhos. Molculas com estruturas mais complexas, contendo ramificaes e anis aromticos so degradados por um nmero menor de microorganismos e com uma taxa de degradao menor, se comparadas com molculas de estrutura mais simples.

3.6. Solo

Os solos se caracterizam por serem ambiente de vida, apresentando uma microbiota ativa, inclusive atuante em processos de disperso e decomposio de poluentes.

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O solo um corpo natural, com uma composio extremamente diversa, em que interagem com uma enormidade de fatores, como o clima, material de origem e sua utilizao pelo homem, entre outros (Kabatas-Pendias et al., 1986).

Suas interaes entre as propriedades qumicas, fsicas e biolgicas extremamente complexas e, inclusive, as condies locais com as interaes antropognicas, criam especificidades que precisam ser consideradas para anlise de processos de contaminao, pois cada stio um ambiente especfico, com caractersticas nicas.

O solo constitudo por trs fases: slida, lquida e gasosa. A fase slida constituda pelo material parental (rocha) local ou transportado e material orgnico, originrio da decomposio vegetal e animal. A fase lquida do solo (elementos orgnicos e inorgnicos em soluo) e fase gasosa, de composio varivel, de acordo com os gases produzidos pelas razes das plantas e dos animais, conforme pode-se visualizar na figura 5.

Figura 5 Constituio do solo em seus trs tipos de fases: slida, lquida e gasosa. Fonte: Jos Salsa (2004).

As propriedades fsicas, qumicas e biolgicas do solo so determinadas pelo processo geolgico de sua formao, origem dos minerais, e sua evoluo de acordo com o clima e o relevo do local, alm dos organismos vivos que o habitam.

A frao do solo chamada matria orgnica constituda por um sistema complexo de substncias, cuja formao depende da adio contnua de restos de plantas e

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animais, e materiais excretados pelos mesmos, independente de seu estado de decomposio, transformao, alteraes qumicas e enzimticas e ressntese (Alexander, 1967)

O solo possui, naturalmente, diversos microrganismos com atividades metablicas variadas capazes de degradar leo cru. Entretanto, a tcnica de biorremediao em solos contaminados com leo cru sofre limitao devido ao baixo nvel de disponibilidade dos hidrocarbonetos (baixa solubilidade em gua, alta fixao sobre a matriz do solo e pouca transferncia dos poluentes absorvidos da fase slida para a fase aquosa). Dessa forma, a utilizao de um biossurfactante pode minimizar estes problemas e aumentar os ndices de biodegradao de leo cru (Volkering et al., 1995).

Conjuntamente com a matria orgnica do solo, a biota (macro e micro) tem fundamental importncia nas reaes que ocorrem nos solos e principalmente sobre a interao com os compostos orgnicos como os hidrocarbonetos. A energia para o crescimento microbiano provm da decomposio enzimtica dos compostos orgnicos e da decomposio dos compostos inorgnicos e metais (Alexander, 1977).

Os solos de mangue so formados pela deposio de partculas de origem terrgena e marinha, orgnicas e inorgnicas, que esto em suspenso na gua, e que se movimentam em funo das correntes de fluxo e refluxo das mars. Por meio da ao mecnica, as partculas grossas se depositam primeiro, seguidas das partculas de argila e silte, as quais se agregam e sedimentam aps floculao (Vannucci, 1999; Stralher, e Stralher, 2000 ; Woodhouse et al., 1974). Apesar da origem e transporte dos sedimentos serem similares, os solos de mangue podem apresentar caractersticas diferentes devido variao na intensidade de gerao e do transporte dos mesmos.

Os manguezais so considerados verdadeiros celeiros biolgicos, abrigando espcies tpicas desses sistemas ou aquelas que passam, pelo menos, uma parte

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do ciclo de vida, podendo ainda ser tratados como recurso renovvel finito, quando se considera a sua produo natural ou como um recurso no renovvel, quando substitudos por aterros, lixes, empreendimentos imobilirios ou distritos industriais (Maciel, 1991).

Esses sistemas desempenham funes como manuteno e preservao da linha de costa, reteno de sedimentos, filtro biolgico e berrio, sendo ainda exportadores de carbono orgnico e de nutrientes para as guas costeiras. O ecossistema de manguezal considerado rea de preservao permanente (Lei Federal n 4.771, 15/09/65) e reserva biolgica, em toda a sua extenso (Res. CONAMA, n 004, 18/09/85).

O petrleo e seus derivados podem persistir por mais de 20 anos nos manguezais, antes que a vegetao se recupere totalmente (Michel, 2002). Esta alta persistncia explicada pela lenta biodegradao dos hidrocarbonetos de petrleo, devido limitao de oxigenao do meio e lenta ciclagem de nutrientes, essenciais para a atividade microbiana aerbia (Sherrer e Mille, 1989).

3.7. Biorremediao

A biorremediao o processo de tratamento que utiliza a ocorrncia natural de microrganismos para degradar substncias toxicamente perigosas, transformandoas em substncias menos ou no txicas, possibilitando a despoluio de reas contaminadas.

O objetivo principal da biorremediao criar condies favorveis para o crescimento e atividade bacterianas.

A biorremediao baseia-se em trs aspectos principais: a existncia de microorganismos com capacidade catablica para degradar o contaminante; a

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disponibilidade do contaminante ao ataque microbiano ou enzimtico e condies ambientais adequadas para o crescimento e atividade do agente biorremediador.

A rea ser considerada contaminada se, entre outras situaes, as concentraes de elementos ou substncias de interesse ambiental estiverem acima de um dado limite denominado valor de interveno, indicando a existncia de um risco potencial de efeito deletrio sobre a sade humana, havendo a necessidade de uma ao imediata na rea, a qual inclui uma investigao detalhada e a minimizao das vias de exposio como a restrio do acesso de pessoas a rea e suspenso do consumo da gua subterrnea.

A eficincia da biorremediao depende da biota (microorganismos com enzimas capazes de degradar o contaminante), das propriedades do contaminante (o contaminante tem que estar biodisponvel), das condies fsico-qumicas da gua tais como pH adequado e temperatura adequada, da biodisponibilidade dos nutrientes necessrios aos microorganismos, da presena de receptores de eltrons, da ausncia de substncias txicas aos microorganismos e de um grau de biodegradao maior do que o grau de migrao da gua subterrnea (Nriagu, 1989; Alexander, 1994; Corseuil e Alvarez, 1996). O monitoramento destes parmetros permite avaliar e compreender a cintica microbiana mostrando a persistncia dos compostos qumicos no ambiente, como as respectivas concentraes em que estes podem estar sendo transportados a possveis stios de exposio ao homem e outras espcies (Alexander,1994). Sendo assim, estudos sobre fatores que influenciam os mecanismos de ao microbiana na degradao de compostos orgnicos de interesse so de extrema importncia j que podem otimizar as tecnologias de biorremediao, auxiliando nos processos de descontaminao de solos e guas subterrneas.

A escolha de uma tcnica para remediar em uma rea contaminada depender de um grande nmero de variveis, incluindo tipo de poluentes do solo, os tipos de solo, as condies de circulao das guas subterrneas, e a natureza do risco sade

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humana e aos ecossistemas decorrentes da presena desses poluentes (Rodriguez, 2006).

A tcnica da biorremediao pode ser classificada como in situ e ex situ. No tratamento in situ a tcnica envolve tratamento no prprio local contaminado e no tratamento ex situ o material contaminado removido para outro lugar e tratado.

A tcnica de biorremediao aplicada por meio da bioaumentao e da bioestimulao. A bioaumentao ocorre pela adio de microrganismos especficos em regies impactadas, adaptados em laboratrio s condies ambientais. Ao usar essa tcnica, faz-se a avaliao dos microrganismos presentes no ambiente, identificando-se os degradadores de leo. Em seguida, atravs de bioreatores estimula-se em laboratrio, o crescimento microbiano das espcies de interesse e, posteriormente, injeta-se o pool de microrganismos no local contaminado com o objetivo de aumentar a populao microbiana, responsvel pela degradao do leo.

A bioestimulao a acelerao da reproduo microbiana e de suas atividades metablicas, pela adio de oxignio, gua e nutrientes ao meio ambiente contaminado. Tanto a adio de gua como a oxigenao do ambiente contaminado favorece a atuao da biodegradao.

O sucesso total por tratamentos de biorremediao depende de inmeros fatores, tais como: caracterstica do resduo, presena de condies microbiolgicas timas, a seleo correta da tecnologia de biorremediao, o uso de mtodos analticos apropriados para determinar o tipo e a extenso da contaminao (Huesemann, 1994).

Geralmente, os microorganismos utilizados para o tratamento biolgico so organismos que existem na natureza. Estas populaes microbianas podem ser dominadas por uma nica espcie em particular, ou podem interagir com um grande nmero de espcies para atuar em um poluente particular.

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A biodegradao tem enormes vantagens. Em

primeiro

lugar, como os

microorganismos esto presentes em todos os ambientes, muitas vezes, o processo pode ser realizado no prprio local, impossvel incinerar-se um solo de milhes de hectares contaminados, mas a biodegradao est em curso em todos os hectares.

Em segundo lugar, um processo que permite grande desenvolvimento: 1) Pela seleo de mutantes capazes de degradao mais eficiente; 2) Pela engenharia gentica, que permite a transferncia de genes, responsveis pelas enzimas de degradao a microrganismos j ambientados no local; 3) Pela versatilidade nas estaes de tratamento. Finalmente seus custos so muito mais baixos que aqueles processos de incinerao e, por isso, a biodegradao se torna o nico mtodo vivel (Langenbach, 1994).

Microrganismos que degradam hidrocarbonetos esto amplamente distribudos no solo e em ambientes aquticos. Populaes desses microrganismos normalmente constituem menos que 1% da comunidade microbiana total, mas quando hidrocarbonetos esto presentes, essas populaes aumentam em 10% da comunidade (Atlas, 1995).

Os hidrocarbonetos de petrleo, por serem poluentes hidrofbicos, tendem a ficar sorvidos na matriz do solo, diminuindo assim a sua disponibilidade aos microorganismos e, consequentemente limitando a sua biodegradao.

A adio de biossurfactante na tcnica de biorremediao tem efeitos positivos em relao dessoro dos COHs (compostos orgnicos hidrofbicos) sorvidos no solo e ao aumento da solubilidade dos mesmos.

Os biossurfactantes diminuem a tenso superficial e possuem alta capacidade emulsificante e consistem em subprodutos metablicos de bactrias, fungos e leveduras (Nitschke e Pastore, 2002).

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Os microrganismos so capazes de consumir os hidrocarbonetos de petrleo e os biossurfactantes, utilizando-os como fonte de carbono e de energia. Sendo assim, a gerao de CO2 nos ensaios de biodegradao seria tanto do biossurfactante quanto dos hidrocarbonetos presente no solo contaminado.

Diferentes microorganismos utilizam diferentes processos metablicos para obter energia. Heterotrficos aerbicos empregam a respirao para oxidar compostos orgnicos como fonte de carbono e energia. Os heterotrficos so os mais importantes para degradao de contaminantes orgnicos e podem obter energia da fermentao, respirao aerbica e anaerbica (Alexander, 1977).

Os microrganismos presentes no solo, embora ocupem pequena porcentagem em seu volume total, desempenham uma funo fundamental sobre a matria orgnica e sobre a sua mineralizao. Portanto, o consumo de oxignio ou a produo de gs carbnico so tcnicas geralmente teis para se avaliar o grau de mineralizao de um composto orgnico disposto no solo.

Segundo Atlas (1995), durante a biorremediao de um derramamento de leo em guas marinhas, a taxa de biodegradao aumentou de 3 a 5 vezes aps a aplicao de fertilizantes. Margesin e Schinner (2001) compararam a biorremediao de solo poludo por leo diesel com concentrao inicial de 2612 mg/kg de solo atravs da atenuao natural e bioestimulao por fertilizantes e verificaram reduo de aproximadamente 70% no solo bioestimulado enquanto que no solo no tratado a reduo foi de 50%.

Ururahy (1998) estudaram a biodegradao de resduos oleosos de petrleo em meio lquido e verificaram que a eficincia da biodegradao no meio contendo 5% (v/v) de resduo foi maior do que a eficincia da biodegradao no meio contendo 10% (v/v) do mesmo. O fato que em altas quantidades, as populaes microbianas podem sofrer inibio pelo efeito txico do resduo.

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Considerando que os microorganismos tm a capacidade de biodegradao de petrleo e seus derivados, tais microrganismos podero ser utilizados em programas de biorremediao de reas impactadas por poluentes derivados de petrleo, com intuito de otimizar esse processo.

A taxa de decomposio de compostos orgnicos depende da prpria composio qumica e dos fatores do solo como a textura, infiltrao e permeabilidade, capacidade de reteno da gua, densidade, contedo de matria orgnica, capacidade de troca de ctions, contedo de macronutrientes, salinidade e micronutrientes (Atlas, 1981).

3.8. Respirometria Aerbia

A respirometria uma metodologia bastante adequada quantificao da atividade biolgica aerbia, a qual determina a velocidade de respirao de uma biomassa ativa.

A NBR 14.283 especifica o mtodo respiromtrico de Bartha para determinao do ndice de biodegradao da matria orgnica contida em resduos a serem tratados em solos. Por meio desse mtodo possvel avaliar a tratabilidade de resduos em solos e inferir as condies de manejo de sistema de tratamento de resduos em solo.

O mtodo respiromtrico de Bartha, adaptado de uma norma holandesa, um mtodo simples e economicamente vivel para determinar a atividade microbiolgica pela gerao de gs carbnico e, indiretamente, a biodegradao de contaminantes orgnicos no solo.

O oxignio pode ser fornecido sem fluxo de ar, com reteno passiva de CO 2, e com fluxo de ar, continuo ou intermitente, pelo sistema chamado de aerao forada. O primeiro processo de simples utilizao, principalmente quando se tem um grande

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nmero de tratamentos envolvidos, porm pode se tornar limitado em ensaios prolongados (Caldeira, 1997).

O CO2 liberado na respirometria capturado pelo NaOH e determinado por condutivimetria. O mtodo da condutivimetria usa a relao direta entre as produes de CO2 e as mudanas de condutividade da soluo bsica receptora para anlise de biodegradabilidade. Junto com os ons de uma soluo aquosa de hidrxido de sdio (NaOH), o CO2 gerado produz carbonato de sdio (Na2CO3). O carbonato menos dissocivel que a base, e mostra uma menor condutividade. A relao linear entre a quantidade de CO2 liberada e as mudanas na condutividade pode ser usada para determinar a formao de CO2 com bastante preciso. Os mtodos utilizados para a determinao da eficincia de biodegradao baseiam-se na medio de CO2 gerado no processo de biodegradao e construo de uma curva da massa acumulada desse CO2 em funo do tempo, que devero apresentar fases distintas, tais como: incio da curva com baixssima inclinao, que dever corresponder fase de adaptao dos microrganismos, seguida de um elevado crescimento exponencial, uma vez que nesta fase estar ocorrendo elevada atividade microbiana e, por fim, a formao de um patamar, onde a eficincia da biodegradao drasticamente reduzida (Borges, 2006).

3.9. Modelos cinticos

O conhecimento da cintica da biodegradao essencial para a avaliao da persistncia dos poluentes orgnicos e a avaliao a exposio de humanos, animais e plantas. A degradao de substncias qumicas, a quantidade que desaparece com o tempo e a forma do desaparecimento da curva funo do composto em questo, sua concentrao, os organismos responsveis e a variedade de fatores ambientais.

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Uma determinao importante no estudo da cintica de uma reao qumica a da ordem da reao, que pode ser de ordem zero, primeira ordem e segunda ordem.

A forma integrada da lei de velocidade mostra que a reao de zero ordem d uma linha reta em uma figura se os valores medidos das concentraes do reagente forem colocados na figura em funo do tempo. A inclinao da reta ser a constante da velocidade de zero ordem aparente. Esta constante de velocidade de zero ordem deve ter a mesma unidade que a velocidade da reao, a qual em mol m-3 s-1 . A equao 2 demonstra a equao de ordem zero.

C C 0 k .t
Onde, C = quantidade total acumulada de CO2 liberada no tempo t de incubao;

(2)

C0 = indica a quantidade de CO2 produzida num tempo infinito, ou em termos prticos, a quantidade total de CO2 produzida quando a liberao desse gs deixa de ter acrscimos mensurveis aps um perodo de incubao; k = constante de velocidade de primeira ordem de reao de degradao. t= tempo

O modelo de primeira ordem baseia-se no princpio de que a velocidade de decomposio de determinado substrato, em determinado instante, diretamente proporcional quantidade de substrato presente neste mesmo momento (Lathan, 1974). Como a quantidade do substrato mxima no incio e diminui com o tempo, a velocidade de decomposio decrescente.

Utilizou-se a cintica para avaliar as taxas de degradao dos hidrocarbonetos testados na respirometria. O conhecimento dos parmetros cinticos de extrema importncia para a modelao do processo bioqumico, pois permite avaliar as velocidades de utilizao de substrato e de crescimento de biomassa, nas condies estabelecidas (Zaiat et al., 1997).

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Levando em considerao a importncia da cintica na biodegradao dos compostos qumicos utilizou-se um modelo cintico de primeira ordem (Equao 3), de acordo com Jenkinson e Rayner (1977) para avaliar a taxa de biodegradao dos hidrocarbonetos expressa por k.

C C 0 1 e kt
Onde,

(3)

C = quantidade total acumulada de CO2 liberada no tempo t de incubao; C0 = indica a quantidade de CO2 produzida num tempo infinito, ou em termos prticos, a quantidade total de CO2 produzida quando a liberao desse gs deixa de ter acrscimos mensurveis aps um perodo de incubao; k = constante de velocidade de primeira ordem de reao de degradao. t= tempo da reao

A matria orgnica um sistema complexo, formado via de regra por uma gama de compostos orgnicos diferentes, constituindo diferentes compartimentos, aos quais se pode atribuir velocidades de degradao diferenciadas. Nesse sentido, pode-se adotar um modelo estendido de cintica de primeira ordem considerando-se mais de uma fase, como mostrado na equao 4.

C C1 1 e k 1t C 2 1 e k 2t
Onde,

(4)

C = quantidade total acumulada de CO2 liberada no tempo t de incubao; C1 = indica a quantidade de CO2 produzida num tempo infinito, ou em termos prticos, a quantidade total de CO2 produzida quando a liberao desse gs deixa de ter acrscimos mensurveis aps um perodo de incubao, na fase rpida;

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C2 = indica a quantidade de CO2 produzida num tempo infinito, ou em termos prticos, a quantidade total de CO2 produzida quando a liberao desse gs deixa de ter acrscimos mensurveis aps um perodo de incubao, na fase lenta; t= tempo da reao k1 = constante de velocidade de primeira ordem de reao de degradao, na fase rpida. k2 = constante de velocidade de primeira ordem de reao de degradao, na fase lenta.

Na avaliao do comportamento da matria orgnica no solo conveniente de ajustar um modelo de cintica, pois atravs de parmetros numricos, como constante de velocidade, o processo pode ser relacionado com diferentes variveis (Reis e Rodella, 2002).

Walker et al., (1976) pesquisaram as taxas de biodegradao de componentes do petrleo e concluram que a degradao microbiana dos componentes do leo cru um processo dinmico caracterizado pela biodegradao das vrias fraes e diferentes taxas.

Por se tratar de equaes exponenciais, observa-se que quando maior a magnitude de k melhor o desempenho do processo. Os valores de k so caractersticos para cada tipo de substrato e existem vrios fatores que podem influenciar na taxa de degradao do substrato, principalmente, quando o substrato utilizado slido. A constante de biodegradao fornece uma idia da velocidade com que o substrato bioestabilizado no interior do reator. Assim, quando maior o valor da constante maior a taxa de bioestabilizao do material.

Para a cintica de segunda ordem, as leis da velocidade de segunda ordem envolvem dois reagentes, e para ambos a concentrao depende do tempo. Devido ao fato de haver vrias pequenas diferentes formas possveis de leis da velocidade de segunda ordem, mais conveniente trat-las separadamente. A formula da cintica de segunda ordem demonstrada segundo a equao 5.

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C C0

1 1 k .C0 .t

(5)

Onde,

C = quantidade total acumulada de CO2 liberada no tempo t de incubao; C0 = indica a quantidade de CO2 produzida num tempo infinito, ou em termos prticos, a quantidade total de CO2 produzida quando a liberao desse gs deixa de ter acrscimos mensurveis aps um perodo de incubao; k = constante de velocidade de primeira ordem de reao de degradao. t= tempo da reao

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4. MATERIAL E MTODOS

O presente estudo baseou-se em isolar e caracterizar os microrganismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos de petrleo. Para isso, utilizaram-se solos de horta e mangue, que so solos ricos em matria orgnica, para a obteno das cepas e posterior ensaio da biodegradabilidade. A figura 6 apresenta o fluxograma das etapas do experimento.

Amostras

Enriquecimento com adio de leos brutos e fraes de petrleo

Incubao a temperatura ambiente Isolamento dos microrganismos

Caracterizao dos microrganismos

Avaliao do potencial de biodegradabilidade aerbia (Ensaios I, II e III)

Figura 6 Fluxograma de etapas do experimento de respirometria aerbia.

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4.1 Coleta e enriquecimento de amostras

4.1.1 Fase de enriquecimento

Foram coletados os seguintes solos como fonte de inculo na fase de enriquecimento das amostras:

Solo de mangue Solo de horta

As amostras foram coletadas de acordo com os procedimentos segundo a NBR 14.283 e encaminhadas ao Laboratrio de Saneamento da Universidade Federal do Esprito Santo UFES. O solo de mangue foi coletado do Campus da UFES de Goiabeiras e o solo orgnico de uma residncia domstica, sem adio de agrotxicos.

Para a fase de enriquecimento, as amostras coletadas foram dispostas em dois recipientes, sendo o primeiro com 50 g de solo de mangue e o segundo com 50 g de solo de horta. Foram adicionados 50 g de areia e 5% de hidrocarboneto em cada recipiente.

As amostras de hidrocarbonetos utilizados foram cedidas pelo Laboratrio de Pesquisa de Desenvolvimento de Metodologias para Anlises de Petrleos LABPETRO UFES, sendo provenientes de quatro tipos de reservatrios diferentes I, II, III e IV. As principais caractersticas dos hidrocarbonetos estudados esto descritos na tabela 3.

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Tabela 3 Caractersticas das fraes de petrleo e leos brutos avaliados leos brutos e fraes de petrleo FD 6 FD 17 FD 26 FD 30 FD 23 FD 13 FD 29 FD 31 leo bruto (1) leo bruto (2) FD = Frao destilada. Fonte: Labpetro UFES Temperatura 0 ( C) 377 134 226 360 277 475 323 360 Densidade Relativa 3 (g/cm ) 0,9004 0,7468 0,8264 0,8948 0,8494 0,9524 0,8858 0,9086 0,9039 0,8906

API 25,0 56,9 38,9 26,0 34,3 16,5 27,6 23,6 40 28

Origem Reservatrio I Reservatrio I Reservatrio I Reservatrio I Reservatrio I Reservatrio II Reservatrio II Reservatrio II Reservatrio III Reservatrio IV

As misturas foram dispostas em recipientes plsticos de 600 mL sem tampa, umedecidos com gua deionizada e protegidos da luz, incubados por 60 dias, a temperatura ambiente para o crescimento de microrganismos com capacidade de biodegradao.

4.2 Isolamento e Caracterizao dos microorganismos

4.2.1 Isolamento de bactrias

Os microorganismos isolados de ambientes naturais pertencem a uma populao mista. Ao determinar as caractersticas de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as clulas na populao so idnticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma clula parental.

Para a fase de isolamento, adicionou-se 1 g da mistura enriquecida a 10 mL de Cloreto de Sdio a 0,75% (NaCl). A partir disso, uma alquota da soluo foi inoculada em placa de Petri contendo Meio Mnimo e hidrocarbonetos. Utilizou-se a tcnica de esgotamento por meio de estrias superficiais, onde a amostra semeada na superfcie do meio solidificado com uma ala de semeadura para esgotar a

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populao, assim em algumas regies do meio, clulas individuais estaro presentes. Aps a semeadura, as placas inoculadas foram mantidas em temperatura ambiente at o visvel crescimento das colnias bacterianas.

Para o isolamento de culturas puras, uma colnia individual foi transferida da placa de Petri para outra placa, com a mesma composio da primeira. Este procedimento foi repetido por trs vezes at a total purificao das amostras.

4.2.2 Meios de Cultivo Para o preparo do meio de cultura slido (Meio Mnimo), utilizaram-se as substncias descritas nas tabelas 4 e 5, de acordo com Pelczar (1996) e Chernicharo (1997). A mistura foi convenientemente homogeneizada e esterilizada em autoclave e conservada em geladeira at ser usada.

Para o preparo das placas de Petri utilizou-se 5% (p/v) de hidrocarboneto derivado do petrleo para 20 mL de Meio Mnimo em cada placa de Petri, as quais foram devidamente identificadas e conservadas em geladeira. A seguir foram preparadas as placas de Petri por meio da adio de hidrocarbonetos.

Tabela 4 Composio do Meio Mnimo (MM)

Substncia
Cloreto de sdio anidro ( NaCl) Sulfato de amnio anidro ((NH4)2SO4) Fosfato de sdio monobsico anidro ( Na2HPO4) Fosfato de potssio monobsico ( KH2PO4) Sulfato de magnsio (MgSO4. 7 H2O) Soluo micronutriente gua deionizada Para o meio slido adicionou-se 15g/l de Agar. Fonte: Pelczar(1996)

Quantidade
1g/l 5g/l 6,2 g/l 0,9 g/l 0,3 g/l 1ml/l 1000 ml

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Tabela 5 Soluo de Micronutrientes

Substncia
KH2PO4 K2HPO4 NH4Cl Na2S. 7H2O 2 FeCl3. 6H2O ZnCl2 CuCl2. 2H2O MnCl2. 2H2O (NH4)6.Mo7O24 .4H2O AlCl3 CoCl3. 6H2O HCl (concentrado) Fonte: Chernicharo (1997)

Concentrao
1500 mg/l (Tampo) 1500 mg/l 500 mg/l (Macronutriente) 50 mg/l 2000 mg/l (Micronutriente) 50 mg/l 30 mg/l 500 mg/l (Macronutriente) 50 mg/l 50 mg/l 2000 mg/l (Micronutriente) 1 ml /l

4.2.3 Inoculao e Incubao

Para o preparo do inculo, as cepas foram transferidas para erlenmeyers de 250 mL, contendo 20 mL de Meio Mnimo lquido e 5% de hidrocarboneto. As amostras foram mantidas sob agitao a uma temperatura constante de 30 C durante cinco dias. Aps o perodo de crescimento foram realizadas leituras por meio de valores de absorbncia, utilizando espectrofotmetro, a 420 nm, para o ajuste da biomassa microbiana. As cepas utilizadas no experimento respiromtrico foram selecionadas de acordo com o padro de densidade ptica (D.O.) das amostras.

Foram diludas pequenas fraes das amostras enriquecidas em tubos de ensaio contendo 5 mL de soluo salina (0,75 %). A suspenso foi semeada em placas de Petri contendo 20 mL do meio de cultura e 5% (p/v) de hidrocarboneto. Aps serem inoculadas, as placas foram embaladas em papel alumnio, identificadas e incubadas a uma temperatura ambiente at o visvel crescimento bacteriano, por um perodo de 10 a 15 dias, evidenciado pela formao de colnias em crescimento na superfcie do meio.

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Aps esta etapa, as cepas foram armazenadas em geladeira a 4C, dentro de tubos inclinados especficos para conservao e retardamento do crescimento bacteriano at a sua utilizao nos experimentos de biodegradabilidade.

4.2.4 Caracterizao dos isolados

Aps a obteno de culturas puras, foi realizada uma caracterizao preliminar das cepas isoladas, utilizando os critrios de Silva (1999), principalmente quanto morfologia de colnia, colorao de gram e testes bioqumicos (indol, catalase e coagulase).

4.3 Avaliao da Biodegradabilidade Aerbia

4.3.1 Preparo dos Sistemas de Avaliao Para a avaliao da biodegradabilidade dos compostos orgnicos propostos, utilizaram-se potes de vidro com tampa de rosca, hermeticamente fechados, com capacidade de 1700ml cada. A vermiculita e a areia foram lavadas e autoclavadas antes de serem utilizadas. Utilizou-se um potinho de polietileno de 50 mL para armazenar a soluo de NaOH. O sistema formado por tratamentos, controles e brancos, todos em duplicata, conforme mostra as figuras 6 e 7.

Composio dos tratamentos: 100 g de solo (50% de vermiculita e 50% de areia - v/v); Meio Mnimo lquido (fonte de micro e macronutrientes, de acordo com 60% da capacidade de campo); 1 mL do inculo bacteriano (previamente ajustado por densidade ptica D.O.);

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5% de hidrocarboneto (fonte de carbono); 20 mL de NaOH a 0,5 M

Composio dos controles: 100 g de solo (50% de vermiculita e 50% de areia - v/v); Meio Mnimo lquido (fonte de micro e macronutrientes, de acordo com 60% da capacidade de campo); 5% de hidrocarboneto (fonte de carbono); 20 mL de NaOH a 0,5 M

Composio dos brancos: 20 mL de NaOH a 0,5 M

Figura 7 Experimento respiromtrico aerbio composto de vermiculita e areia, meio mnimo, inculo bacteriano e hidrocarbonetos derivados do petrleo.

65

Figura 8 Ensaios de biodegradabilidade atravs da respirometria de Bartha.

4.3.2 Avaliao da produo de CO2

Para os ensaios de biodegradabilidade aerbia, utilizou-se a metodologia de respirometria aerbia de amostras com e sem inoculao de bactrias isoladas, avaliando-se a formao de CO2, adaptado do mtodo respiromtrico de Bartha (1999) descrito pela NBR 14.283 Resduos em solos Determinao da Biodegradao pelo Mtodo respiromtrico. Nesta metodologia foi realizada utilizando-se um sistema fechado de frascos estticos com anlise da condutividade eltrica da soluo de coleta do CO2 produzido para as diversas combinaes de substratos (amostras ambientais) e hidrocarbonetos sob avaliao.

No ensaio de biodegradabilidade observou-se o decaimento da condutividade medida que se processa o experimento, ou seja, quanto maior a produo de CO 2, menor ser a condutividade. Isso ocorre porque o CO2 produzido pelas bactrias, ao realizarem o processo de degradao de um composto, entra em contato com a soluo aquosa de NaOH (soluo alcalina) do frasco coletor do respirmetro e forma, inicialmente, H2CO3 (cido carbnico) que em seguida d origem a duas sries de sais, os bicarbonatos, NaHCO3 e carbonatos, Na2CO3 (Lee, 2000),

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conforme as equaes 6a e 6b. A condutividade foi determinada atravs do mtodo descrito por Rodella e Saboya (1999).

As principais reaes de avaliao no sistema de respirometria aerbia so:

CO2 + H2O H2CO3 H2CO3 + 2NaOH Na2CO3 + 2H2O

(6a) (6b)

A calibrao do sistema foi efetuada preparando-se solues padro de NaOH e Na2CO3 obtendo-se concentraes equivalentes em carga de nions. Cada soluo pode ser relacionada a uma hipottica quantidade de CO 2 que, se efetivamente absorvida, resulta nas mesmas concentraes de CO3-2. Para cada soluo foi obtida uma curva padro especfica para condutividade. As leituras da condutividade eltrica foram efetuadas em condutivmetro da marca Jenco, modelo 1671, com correo de temperatura de leitura a 25 C. Os resultados foram obtidos por meio da equao 7, sendo expostos em forma de mg de CO2 cumulativamente no perodo do experimento.

mg de CO2 = M x V x 22 . [ (C1 Cx) / (C1 C2)]

(7)

Onde, M= molaridade da soluo de NaOH utilizada (expressa em mol l-1) V= volume utilizado (ml) da soluo padro de NaOH no frasco de captura C1= concentrao padro de NaOH Cx = valor da condutividade eltrica por amostra C2 = concentrao da soluo de Na2CO3

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4.3.3 Condies experimentais

Foram isoladas 19 cepas a partir dos 10 hidrocarbonetos derivados do petrleo. O experimento consistiu na avaliao da biodegradabilidade aerbia que foram divididos em 3 ensaios (Ensaio I, II e III). O ensaio I consistiu na avaliao das cepas isoladas a partir de leos e fraes como fator de seleo, conforme a tabela 6. Assim, foram obtidas 19 cepas com os respectivos hidrocarbonetos. Os ensaios foram realizados por meio da avaliao da respirometria aerbia utilizando frascos estticos e avaliao da condutividade de acordo com a metodologia proposta.

A cada frasco foi adicionado um tipo de hidrocarboneto juntamente com a respectiva cepa isolada anteriormente, originando assim 19 tratamentos com duas repeties mais controle, com um total de 40 unidades experimentais. Os controles consistiram de substrato, hidrocarboneto e Meio Mnimo, sem inoculao.

Tabela 6 Composio dos tratamentos do ensaio I da respirometria.

Tratamentos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 FD: Frao destilada

Composio
Cepa 1 + leo bruto 1 Cepa 2 + FD 6 Cepa 3 + FD 29 Cepa 4 + FD 31 Cepa 5 + FD 30 Cepa 6 + FD 23 Cepa 7 + FD 13 Cepa 8 + FD 17 Cepa 9 + FD 26 Cepa 10 + leo bruto 2 Cepa 11 + leo bruto 1 Cepa 12 + FD 6 Cepa 13 + FD 29 Cepa 14 + FD 31 Cepa 15 + FD 30 Cepa 16 + FD 23 Cepa 17 + FD 13 Cepa 18 + FD 17 Cepa 19 + FD 26

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O ensaio II consistiu em avaliar quatro tipos de cepas (1, 2, 13 e 14), com quatro hidrocarbonetos (A, B, C e D, respectivamente leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31). As cepas utilizadas neste ensaio foram escolhidas de acordo com a produo de CO2 acumulado do ensaio I. A partir da, as quatro cepas foram adicionadas, individualmente aos quatro hidrocarbonetos, formando assim 16 tratamentos diferentes: 1A, 1B, 1C e 1D; 2A, 2B, 2C e 2D; 13A, 13B, 13C e 13D; 14A, 14B, 14C e 14D, conforme tabela 7. O experimento foi realizado em duplicata, contendo assim, um total de 40 unidades experimentais. As leituras do ensaio II foram realizadas atravs do condutivmetro durante 29 dias para obteno da curva de biodegradao. Nos primeiros 9 dias as leituras foram realizadas diariamente, aps este perodo as leituras passaram a ser feitas a cada dois dias at o final de 29 dias. A composio dos tratamentos do ensaio II est descrito na tabela 7.

Tabela 7 Composio dos tratamentos da segunda etapa da respirometria Tratamentos 1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 2D 13A 13B 13C 13D 14A 14B 14C 4D Composio Cepa 1 + leo bruto 1 Cepa 1 + frao 6 Cepa 1 + frao 29 Cepa 1 + frao 31 Cepa 2 + leo bruto 1 Cepa 2 + frao 6 Cepa 2 + frao 29 Cepa 2 + frao 31 Cepa 13 + leo bruto 1 Cepa 13 + frao 6 Cepa 13 + frao 29 Cepa 13 + frao 31 Cepa14 + leo bruto 1 Cepa 14 + frao 6 Cepa 14 + frao 29 Cepa 14 + frao 31

O ensaio III consistiu em avaliar duas cepas (1 e 14) com quatro hidrocarbonetos (A, B, C e D, respectivamente leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31) em dois tipos de solos diferentes (X e Y, sendo arenoso e argiloso, respectivamente). Este

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ensaio contou com um solo arenoso, tendo como composio 70% de areia e 30% de argila e o solo argiloso contendo 30% de areia e 70% de argila.

Neste ensaio obtiveram-se ento 16 tratamentos: 1AX, 1BX, 1CX e 1DX; 14AX, 14BX, 14CX e 14DX (arenosos) e 1AY, 1BY, 1CY e 1DY; 14AY, 14BY, 14CY e 14DY (argilosos), conforme tabela 8. O experimento foi realizado em duplicata. As leituras do ensaio III foram realizadas atravs do condutivmetro durante 31 dias para obteno da curva de biodegradao. Nos primeiros 5 dias as leituras foram realizadas diariamente, aps este perodo as leituras passaram a ser feitas a cada dois dias at o dia 13 e depois a cada 3 dias at o final de 31 dias. A composio dos tratamentos do ensaio III est descrita na tabela 8.

Tabela 8 Composio dos tratamentos da terceira etapa da respirometria. Tratamentos 1AX 1BX 1CX 1DX 14AX 14BX 14CX 14DX 1AY 1BY 1CY 1DY 14AY 14BY 14CY 14DY X= solos arenosos Y =solos argilosos Composio Cepa 1 + leo bruto 1 Cepa 1 + frao 6 Cepa 1 + frao 29 Cepa 1 + frao 31 Cepa 14 + leo bruto 1 Cepa 14 + frao 6 Cepa14 + frao 29 Cepa 14+ frao 31 Cepa 1 + leo bruto 1 Cepa1 + frao 6 Cepa 1 + frao 29 Cepa 1 + frao 31 Cepa 14 + leo bruto 1 Cepa 14 + frao 6 Cepa 14 + frao 29 Cepa 14 + frao 31

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4.3.4 Condies experimentais

A metodologia empregada para a avaliao das taxas de biodegradao dos hidrocarbonetos foi realizada de acordo com a cintica de primeira ordem descrita por Firme (2005). A escolha dessa ordem de reao foi realizada atravs da avaliao dos dados e empregando a metodologia do best fitting.

O experimento respiromtrico foi desenvolvido em trs ensaios e o programa computacional utilizado nos estudos estatsticos deste do trabalho foi realizado atravs de um pacote estatstico. O desenho experimental de cada ensaio foi inteiramente casualizado, utilizando cepas e hidrocarbonetos como tratamentos, com duas repeties em cada ensaio.

Foi aplicada a anlise de varincia (ANOVA) calculando a estatstica F, a um nvel de significncia de 5%, nos resultados obtidos durante o estudo da

biodegradabilidade dos hidrocarbonetos atravs do teste respiromtrico.

71

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Avaliao das cepas isoladas Ensaio I

5.11 Caracterizao Morfolgica e Bioqumica Na avaliao das 19 cepas isoladas dos solos de mangue e horta, foram realizadas tcnicas de caracterizao morfolgica de acordo com Neder (1992), conforme ilustrado nas tabelas 9 e 10 e nas figuras de 9 a 12 .

Tabela 9 Caracterizao morfolgica das colnias isoladas dos solos de mangue e horta, utilizadas no experimento respiromtrico.

Cepas Tamanho Forma Elevao Bordos Estrutura 1 pequena circular convexa lisos lisa 2 pequena circular convexa lisos lisa 3 pequena circular convexa lisos lisa 4 pequena circular convexa lisos lisa 5 mdia irregular achatada lobados granulosa 6 mdia circular convexa lisos lisa 7 pequena circular convexa lisos lisa 8 pequena irregular convexa lisos lisa 9 grande circular convexa lisos lisa 10 mdia irregular achatada ondulados granulosa 11 pequena circular convexa lisos lisa 12 mdia irregular achatada ondulados lisa 13 pequena circular convexa lisos lisa 14 pequena circular convexa lisos lisa 15 mdia irregular achatada lisos lisa 16 mdia circular convexa lisos lisa 17 pequena circular convexa lisos lisa 18 mdia irregular convexa lisos lisa 19 mdia circular convexa lisos lisa

Brilho
translcida translcidos translcida translcida opaca translcida translcida translcida translcida opaca translcida translcida translcida translcida translcida translcida translcida translcida translcida

Cor
incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor incolor

Aspecto
viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa membranosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa

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Figura 9 Visualizao em placa da cepa 13.

Figura 10 Visualizao em placa da cepa 5.

Figura 11 Visualizao em placa da cepa 4

Figura 12 Visualizao em placa da cepa 16.

Na caracterizao morfolgica das colnias realizada nas 19 cepas isoladas, observou-se que o tamanho varia de pequena a mdia, somente a cepa 9 apresentou tamanho grande. A forma das cepas irregular ou circular. Quanto elevao, a maioria convexa, mas algumas so achatadas. A maioria das cepas apresentam bordos lisos, com exceo das cepas 10 e 12 que so onduladas e a 5 que lobada. A estrutura lisa na maioria das cepas, somente as cepas 5 e 10 apresentam estrutura granulosa. Quanto ao brilho somente as cepas 5 e 10 so opacas, as demais so translcidas. Todas as cepas so incolores e quanto ao aspecto, somente a 10 membranosa, as demais cepas so viscosas.

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Tabela 10 Caracterizao bioqumica das bactrias Teste da Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + Teste da Coagulase + + + + + + + + + + +

Cepas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Teste de Gram + -

Forma cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos cocos bacilo cocos

Teste de Indol + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Os testes bioqumicos foram realizados de acordo com Silva (1999). No teste de gram, as bactrias que fixam o composto iodo-pararrosanilina so denominadas gram-positivas, e as bactrias que no fixam o composto e deixam-se descorar pela soluo descorante recebem o nome de gram-negativas.

Para a caracterizao morfolgica das bactrias, observou-se que a maioria das cepas so gram-negativas e somente a cepa 9 positiva. Quanto forma, observouse que somente a cepa 18 tem a forma de bacilo, enquanto as demais so cocos.

Para os testes bioqumicos realizados, todas as cepas tiveram teste de indol positivo. Para o teste de catalase, somente a cepa 14 foi negativa, as demais cepas so positivas. Para o teste de coagulase as cepas 1, 2, 7, 8, 9, 16, 17 e 18 so negativas, as demais cepas so positivas para o teste.

74

De acordo com os testes morfolgicos e bioqumicos realizados, observa-se que h uma baixa biodiversidade das cepas isoladas, tendo em vista que os testes utilizados so insuficientes para a identificao dos isolados.

5.1.2 Atividade de respirometria

Para a avaliao das cepas isoladas e caracterizadas previamente (tabela 6) foi utilizado o sistema de respirometria, segundo Bartha (1999), utilizando vermiculita e areia. Os resultados esto ilustrados nas figuras 13, 14, 15 e 16.

Figura 13 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias.

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Figura 14 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias.

Figura 15 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias.

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Figura 16 Produo acumulada de CO2 de leos brutos e fraes de petrleo, tendo como substrato areia e vermiculita, por um perodo de 15 dias.

A partir da anlise das figuras 13, 14, 15 e 16 observa-se o comportamento das 19 cepas isoladas dos leos brutos e das fraes de hidrocarbonetos derivados de petrleo, por um perodo de 15 dias. Os isolados apresentam uma fase de adaptao nos primeiros dias do experimento (fase lag), seguida de um aumento exponencial (fase log) que ocorre a partir do quinto dia.

Com base nos resultados obtidos, pode-se observar que, durante o perodo avaliado de 15 dias, as cepas mostraram diferentes potenciais de biodegradao, avaliadas em termos de produo de CO2. As maiores produes de CO2 foram observadas para as cepas 2, 5, 15, 12, 16, 1, 10 e 11, variando de 80,71 a 112,21mg de CO2, aps 15 dias. Estas cepas correspondem aos isolados de solo de horta e mangue, apresentando distintas propriedades conforme a tabela de caracterizao (tabelas 9 e 10).

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De acordo com Teles (2006), os ensaios de biodegradabilidade de lodo de esgoto, apresentaram uma variao na produo de CO2 de 170 a 680 mg de CO2, em 47 dias de incubao, em funo das dosagens utilizadas.

De acordo com Firme (2005), os valores acumulados de CO2 produzidos pelos microorganismos na degradao da torta de filtro, chega a aproximadamente 1221,8 mg de CO2, em 72 dias de ensaio utilizando 40 Mg ha-1 de torta de filtro. Ao utilizar a mesma dosagem de torta de filtro e acrescentar 62,5 mg Kg-1 de nquel, a quantidade de CO2 diminui, resultando tambm em diminuio da biodegradao. Utilizou-se a cintica de primeira ordem para avaliar os dados obtidos na respirometria. Os valores da constante de biodegradao (k) dos tratamentos do Ensaio I e seus respectivos ajustes de reta (R2) esto ilustrados na tabela 11 em ordem decrescente de biodegradabilidade dos compostos.

Tabela 11 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R ) para os tratamentos do Ensaio I
-1 2

Tratamentos 18 3 5 12 10 6 13 19 7 14 4 16 9 8 17 11 2 15 1

k (dia ) 0,3275 0,2731 0,2317 0,2250 0,2141 0,2119 0,2078 0,1991 0,1956 0,1878 0,1795 0,1672 0,1653 0,1554 0,1542 0,1512 0,1398 0,1391 0,1301

0,8875 0,8881 0,7983 0,6124 0,7978 0,9021 0,8950 0,8621 0,7619 0,8325 0,8846 0,6218 0,9106 0,9380 0,9132 0,4802 0,5533 0,6087 0,4508

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De acordo com os valores da taxa de biodegradao (k) observados, verifica-se que os hidrocarbonetos apresentaram uma grande variedade de respostas. A anlise da taxa de biodegradao no ensaio I foi realizada levando-se em considerao do primeiro ao ltimo dia de experimento, em uma nica fase. O tratamento 18 foi o que apresentou a maior taxa de velocidade de biodegradao, com k= 0,3275. J o tratamento 1 apresentou a menor taxa de velocidade de biodegradao, com k=0,1301. Desta forma, pode-se afirmar, baseando-se na figura 17, que o tratamento 18 tem potencial de biodegradao de 32% da concentrao inicial do hidrocarboneto presente neste tratamento enquanto que o tratamento 1 tem capacidade de biodegradao de 13% da concentrao inicial do hidrocarboneto presente neste tratamento.

Figura 17 Taxa de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio I, por um perodo de 15 dias.

O tratamento 18, em solo contendo areia e vermiculita como substrato, apresentou uma taxa de biodegradao de 32%, em 15 dias. De acordo com a literatura, Andrade (2006), obteve o valor mdio das taxas de degradao de biosslidos aplicados ao solo, aps 70 dias de incubao de 21,63%. Isso pode ser explicado

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pela presena predominante de compostos orgnicos recalcitrantes, isto , de difcil degradao biolgica no solo.

Cansfield et al., (1978), trabalharam com resduos de hidrocarbonetos provenientes de tanques de armazenamento de leo cru incorporados ao solo. O contedo de leo no solo aps a contaminao era de 1,45 %. Foram analisadas as fraes saturadas, monoaromticas, diaromticas, poliaromticas e compostos polares e material de alto peso molecular, tais como asfaltenos. No final do experimento, a degradao dessas fraes era respectivamente: 54,6 %, 50,0 %, 57,1 %, 44,4 % e 11,1 %, mostrando que a degradao de fraes mais pesadas se processam de forma mais lenta.

Segundo Firme (2005), os compostos orgnicos possuem diferentes velocidades de degradao em funo da sua constituio varivel. Por este motivo, o clculo da taxa de biodegradao (k) tambm foi realizado em duas etapas, neste experimento, sendo a primeira k1, representando a fase rpida da biodegradabilidade dos compostos orgnicos e a segunda, k2, representando a fase lenta da biodegradao. A tabela 12 apresenta os valores da velocidade de degradao (k) dos tratamentos, e seus respectivos ajustes de reta (R2), do ensaio I do experimento em duas fases, que so a fase rpida (k1) e a fase lenta (k2), levando e considerao que a degradao dos hidrocarbonetos realizada pelas cepas com diferentes velocidades, dependendo de cada composto orgnico. A fase rpida foi calculada at o 5 dia de experimento e a outra fase considerou os demais dias at o final do experimento da primeira etapa.

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Tabela 12 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R ) para os tratamentos do ensaio I, destacando a fase rpida (k1) e fase lenta (k2). Tratamentos 12 18 11 16 5 1 7 3 2 15 14 13 19 10 4 9 17 k1 (dia ) 0,8544 0,7127 0,6849 0,6664 0,6475 0,6001 0,5791 0,5508 0,5493 0,5208 0,5091 0,4521 0,4436 0,4386 0,3758 0,3210 0,2612
-1

R (1) 0,7622 0,9532 0,6783 0,8589 0,9118 0,6116 0,8823 0,9490 0,6318 0,6992 0,8698 0,8047 0,9827 0,7741 0,9457 0,9758 0,9005

k2(dia ) 0,0835 0,2025 0,0368 0,0583 0,1171 0,0400 0,0914 0,1664 0,0608 0,0633 0,1264 0,1731 0,0972 0,1020 0,1043 0,1094 0,1025

-1

R (2) 0,9299 0,9538 0,9461 0,9739 0,9641 0,9245 0,9069 0,8909 0,9687 0,9555 0,9667 0,9653 0,8752 0,6160 0,9791 0,9118 0,8980

interessante ressaltar que essas duas fases, por vezes identificadas como 1 e 2 no so simultneas. Contudo, como uma delas muito mais rpida que a outra, uma etapa mais lenta que a outra domina a maior parte da degradao da matria orgnica do material orgnico em estudo. (Firme, 2005). A partir da anlise do modelo duplo de cintica de biodegradao (fases rpida e lenta) pode-se observar que os tratamentos apresentam comportamentos diferentes na degradao dos hidrocarbonetos,conforme demonstrado na tabela 12.

O tratamento 12 apresenta a melhor taxa de velocidade de biodegradao, com k1=0,8544 e k2=0,08535, quando analisado em duas fases, isso se deve ao diferente comportamento que os compostos orgnicos apresentam.

81

O tratamento 18, em fase nica, apresenta uma taxa de biodegradao de 32%, mas quando comparado com o modelo de fase dupla, 71% da biodegradao alcanada na fase rpida (k1) e apenas 2% biodegradada na fase lenta (k2). Segundo Firme (2005), os valores das taxas de biodegradao da fase rpida (k 1) da torta de filtro variam de 0,1649 a 0,7829. A taxa de degradao (k) depende das dosagens de matria orgnica e se a mesma est ou no na presena do metal (nquel).

De acordo com Tauk (1990), no solo ocorre uma rpida decomposio inicial da matria lbil e, posteriormente, num processo mais lento, a decomposio de materiais resistentes. Esta fase lenta pode ocorrer devido ao mecanismo de adsoro, estabilizao dos metablitos e queda da taxa de biomassa no solo.

Os valores da cintica da biodegradao (k) e o tempo (t) s so inversamente proporcionais se o valor de k for calculado em uma nica fase ou se for considerado o valor da taxa de biodegradao na fase lenta (k2).

5.2 Avaliao das cepas isoladas Ensaio II

No ensaio II, foi avaliada a especificidade de 4 cepas isoladas (1,2,13 e 14) com 4 hidrocarbonetos (A, B, C e D que so, respectivamente, leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31). As cepas e os hidrocarbonetos foram selecionados a partir de uma anlise quantitativa de CO2 no ensaio I. Nesta etapa utilizou-se como substrato areia e vermiculita, sendo 50% de cada (v/v). As leituras foram realizadas por meio do condutivmetro por um perodo de 29 dias. Os tratamentos esto descritos na tabela 7.

Os grficos da figura 18, 19, 21 e 21 apresentam os valores de CO2, em mg, emanados dos isolados no experimento respiromtrico do ensaio II.

82

Figura 18 Os resultados referentes acumulao de CO2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto A ( leo bruto 1).

Figura 19 Os resultados referentes acumulao de CO2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto B (frao 6).

83

Figura 20 Os resultados referentes acumulao de CO2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto C (frao 29).

Figura 21 Os resultados referentes acumulao de CO2 nos diferentes tratamentos, envolvendo as cepas 1, 2, 3 e 4 com o hidrocarboneto D (frao 31).

De acordo com os grficos 18, 19, 20 e 21, utilizando a produo do CO2 como indicador do processo de biodegradabilidade que ocorreu no sistema 84

solo/hidrocarboneto nos respirmetros de Bartha, verificou-se que a adio do hidrocarboneto no solo proporcionou aumento na produo de CO 2. Segundo Morais (2005), a adio do inculo mais o fertilizante proporcionaram acrscimo de 1,8% e 5,3% respectivamente, na evoluo de CO2, comparado com o controle solo/resduo no tratamento do resduo oleoso atravs do sistema de biopilhas.

A partir dos grficos representados pelas figuras 18, 19, 20 e 21, pode-se observar que os hidrocarbonetos A e B (leo bruto 1 e frao 6) foram mais facilmente biodegradados em relao a C e D (frao 29 e 31), de acordo com a produo de CO2. O hidrocarboneto A classificado como leve, de acordo com o grau API (American Petroleum Institute), assim, mais facilmente biodegradado em relao aos hidrocarbonetos B, C e D que so classificados como mdios.

Entre os valores apresentados graficamente pelas figuras 18, 19, 20 e 21, a cepa 1 foi a nica que no apresentou fase de aclimatao como as demais cepas (2, 13 e 14) para a biodegradao dos hidrocarbonetos, mostrando uma alta especificidade em relao s demais cepas estudadas. Observa-se que as cepas tiveram um perodo de cerca de cinco dias de adaptao para posteriormente entrarem na fase log.

A cepa 1, isolada do hidrocarboneto A, apresentou o maior ndice de biodegradabilidade com os 4 tipos de hidrocarbonetos em relao as cepas 2, 13 e 14. Observa-se que a cepa 1 produziu 250,41 mg de CO 2 quando associada ao hidrocarboneto A (leo bruto1) e a menor produo, 109,45 mg de CO2, quando associada ao hidrocarboneto C (frao 29). Isso demonstra que o hidrocarboneto A mais facilmente biodegradado pela cepa em relao ao hidrocarboneto C.

85

A biodegradao dos hidrocarbonetos segue a seguinte ordem: cepa 1 (A>B>D>C); cepa 2 (A>B>D>C); cepa 13 (A>B>C>D) e cepa 14 (A>B>C>D). As cepas 1 e 2 tm uma maior capacidade de biodegradao do hidrocarboneto D (frao 29) em relao as cepas 13 e 14. O hidrocarboneto A proveniente de um leo leve, j os demais hidrocarbonetos (B, C e D) so fraes provenientes de dois leos pesados do mesmo reservatrio.

Utilizou-se a cintica de primeira ordem para avaliar os dados obtidos na respirometria. Os valores da constante de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio II e seus respectivos ajustes de reta (R2) esto ilustrados na tabela 13 e os valores de k1 e k2 e seus respectivos ajustes so demonstrados na tabela 14 em ordem decrescente de biodegradabilidade dos compostos.

Tabela 13 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R ) para os tratamentos do ensaio II Tratamentos 14A 13A 2A 14C 13B 13D 1D 13C 1C 14B 2D 14D 2B 2C 1A 1B K (dia
1

0,1313 0,1276 0,1146 0,0992 0,0971 0,0962 0,0960 0,0951 0,0912 0,0896 0,0848 0,0835 0,0833 0,0785 0,0636 0,0515

0,6748 0,6451 0,6563 0,8436 0,6156 0,8382 0,8910 0,8447 0,8606 0,5646 0,7602 0,7446 0,6104 0,7576 0,5396 0,7124

A cintica da biodegradao nos permite afirmar atravs dos dados demonstrados na tabela 13 que o tratamento 14A foi o que apresentou a maior taxa de

86

degradao, com k=0,1313 e o tratamento 1B com a menor taxa de degradao, com k=0,0515.

De acordo com a figura 19, pode-se afirmar que o tratamento 14A apresentou um potencial de biodegradao de 13% da concentrao inicial do hidrocarboneto presente neste tratamento, da mesma forma que o tratamento 1B foi somente 5% biodegradado em 29 dias de experimento.

Figura 22 Taxa de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio II por um perodo de 29 dias.

Considerando a velocidade da taxa de degradao (k) dos tratamentos obteve-se a seguinte ordem: cepa 1 (D>C>A>B), cepa 2 (A>D>B>C), cepa 13 (A>B>D>C) e cepa 14 (A>C>B>D). Quanto menor o perodo de avaliao, apenas uma frao mais facilmente decomponvel ser degradada e no sero atingidos grupos mais recalcitrantes, o que levar o maior valor da constante de velocidade.

Nocentini et al.(2000) contaminaram solos com diferentes petroderivados, entre eles o querosene, e relataram que o microcosmo presente no solo degrada quase que totalmente o querosene em 100 dias de experimento.

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Tabela 14 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste (R ) para os tratamentos do ensaio II, destacando a fase rpida (k 1) e fase lenta (k2).
-1 2 -1 2

Tratamentos 13A 14B 2A 14A 13B 2B 14D 1A 13D 2D 2C 14C 13C 1C 1D 1B

k1 (dia ) 0,5745 0,5240 0,5208 0,5163 0,4945 0,4423 0,3283 0,3273 0,3191 0,3139 0,3106 0,3053 0,3034 0,2853 0,2757 0,2053

R (1) 0,9961 0,9158 0,9961 0,9464 0,9919 0,8799 0,8888 0,5435 0,9164 0,8511 0,8997 0,8646 0,9212 0,9513 0,9348 0,6412

k2(dia ) 0,0291 0,0243 0,0302 0,0337 0,0227 0,0289 0,0396 0,0347 0,0608 0,0427 0,0404 0,0638 0,0590 0,0584 0,0678 0,0329

R ( 2) 0,8638 0,9260 0,9283 0,8224 0,9244 0,9722 0,9735 0,9770 0,9716 0,9502 0,9780 0,9356 0,9782 0,9932 0,9909 0,9947

O clculo da taxa de biodegradao (k) do ensaio II foi realizado em duas fases, segundo o modelo de cintica duplo descrito por Firme (2005), considerando a biodegradao em duas fases (rpida e lenta). A fase rpida (k1) de biodegradabilidade dos compostos orgnicos foi calculada at o stimo dia de experimento e a fase lenta (k2) foi calculada a partir do oitavo dia at o final do experimento do ensaio II.

Observa-se na tabela 14 que o tratamento 13A o que apresenta a maior taxa de degradao, com k1= 0,5745 e k2= 0,0291, em relao aos demais tratamentos, sendo assim, pode-se afirmar que o tratamento 13A apresentou 57% de degradao do hidrocarboneto presente, em 7 dias (fase rpida) e 2% at o dia 29 (fase lenta). A primeira fase se caracteriza por ser curta e muito biodegradvel, j que so degradados os compostos mais biodegradveis, restando para a outra fase os recalcitrantes.

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O tratamento 14A, em fase nica, apresenta uma taxa de biodegradao de 13%, mas quando comparado com o modelo de fase dupla, 51% da biodegradao alcanada na fase rpida (k1) e apenas 3% biodegradada na fase lenta (k2). Os valores da cintica da biodegradao (k) e o tempo (t) s so inversamente proporcionais se o valor de k for calculado em uma nica fase ou se for considerado o valor da taxa de biodegradao na fase lenta (k2). Ghaemghami et al. (1998) trabalharam com solos contaminados com solventes e notaram que as taxas de mineralizao so mais elevadas nas primeiras semanas de incubao, sugerindo a existncia de uma comunidade adaptada

biodegradao e tambm a existncia de compostos mais facilmente degradados. Segundo Moraes (2005), nos primeiros 45 dias de sua anlise, foram produzidos mais de 50% do total de CO2 acumulado em todos os respirmetros. Nesse perodo, provavelmente, os microrganismos consumiram mais rapidamente aqueles compostos que so facilmente biodegradveis, restando, portanto, os que so mais resistentes degradao (recalcitrantes), que foram consumidos posteriormente de forma mais lenta.

Os dados estatsticos do ensaio II foram realizados em duas etapas, sendo que a primeira etapa (fase rpida) foi realizada do primeiro ao stimo dia. A segunda etapa (fase lenta) foi realizada do oitavo ao vigsimo nono dia de experimento. Realizou-se tambm a anlise dos dados em uma nica etapa, do primeiro ao vigsimo nono dia de experimento. Os resultados esto dispostos em mg de CO 2 e esto apresentados nas tabelas de 15 a 17.

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Tabela 15 Mdias de CO2 acumulado (mg) das cepas e dos hidrocarbonetos A, B, C e D do primeiro ao stimo dia de ensaio.

Cepas 1 2 13 14 x
x = mdia

A
81,54 31,05 16,23 23,18 38,00

Hidrocarbonetos B C D
65,20 44,59 35,05 41,35 46,55 14,52 17,28 16,23 15,89 15,98 15,83 16,08 15,50 14,72 15,53

x
44,27 27,25 20,75 23,78

Atravs da tabela 15, que demonstra a fase rpida, observa-se que a cepa 1 relacionada aos hidrocarbonetos A, B, C e D apresenta, em mdia, a maior produo de CO2 (44,27 mg) em relao as demais cepas estudadas, portanto a cepa com maior potencial de biodegradao. J a cepa 13 quando relacionada aos hidrocarbonetos A, B, C e D apresenta, em mdia, a menor produo de CO 2 (20,75 mg).

Os tratamentos compostos pelo hidrocarboneto B apresentaram, em mdia, a maior produo de CO2 (46,55 mg) emanado nesta etapa do experimento, sendo, portanto, considerado o composto orgnico mais facilmente biodegradvel em relao aos demais hidrocarbonetos.

Observa-se que a cepa 1 associada ao hidrocarboneto A apresenta uma produo de 81,54 mg de CO2, ao passo que quando utiliza-se o mesmo hidrocarboneto com a cepa 13 a produo de 16,23 mg de CO2. J a cepa 2 quando associada ao hidrocarboneto B apresenta uma produo de 65,20 mg de CO2, enquanto a cepa 13 associada ao mesmo hidrocarboneto apresenta uma produo de 35,05 mg de CO2. A cepa 2 associada ao hidrocarboneto C apresenta 17,28 mg de CO2, enquanto que a cepa 1 associada ao hidrocarboneto C apresenta uma produo de 14, 52 mg de CO2. A cepa 2 quando associada ao hidrocarboneto D produz 16,08 mg de CO 2 enquanto que a cepa 14 associada ao mesmo hidrocarboneto produz apenas 14,72 mg de CO2. Dessa forma, afirma-se que a avaliao da biodegradabilidade ocorre de

90

acordo com o tipo de cepa que utilizada nos experimentos e a composio dos compostos orgnicos.

Levando em considerao os tratamentos da fase rpida, a maior produo de CO2 (81,54 mg), foi observada pela cepa 1 quando associada ao hidrocarboneto A e a menor produo de CO2 (14,52 mg), foi observada pela cepa 1 quando associada ao hidrocarboneto C. dessa forma, afirma-se que o biodegradvel em relao aos demais hidrocarbonetos. hidrocarboneto A mais

Tabela 16 Mdias de CO2 acumulado (mg) das cepas e dos hidrocarbonetos A, B, C e D, do oitavo ao vigsimo nono dia de ensaio.

Cepas 1 2 13 14 x

A
183,03 172,45 178,94 189,38 180,95

Hidrocarbonetos B C
137,60 146,55 146,66 141,01 142,96 59,91 57,41 70,94 74,08 65,59

D
69,90 60,53 67,37 53,86 62,92

x
112,61 109,24 115,98 114,58

x = mdia

A tabela 16 mostra os dados da fase lenta do experimento, do oitavo ao vigsimo nono dia. Observa-se que, a cepa 13 relacionada aos hidrocarbonetos A, B, C e D apresenta, em mdia, a maior produo de CO2 (115,98 mg), em relao s demais cepas estudadas, portanto a cepa com maior potencial de biodegradao nesta etapa do oitavo ao vigsimo nono dia de experimento. J a cepa 2 quando relacionada aos hidrocarbonetos A, B, C e D apresenta, em mdia, a menor produo de CO2 (109, 24 mg). Os tratamentos compostos pelo hidrocarboneto A apresentaram, em mdia, a maior produo de CO2 (180,95 mg) emanado nesta etapa do experimento, sendo, portanto, considerado o composto orgnico mais facilmente biodegradvel em relao aos demais hidrocarbonetos.

91

A cepa 14 relacionada ao hidrocarboneto A apresentou, em mdia, maior potencial de biodegradabilidade (189,38 mg), em contrapartida, a cepa 2 quando relacionada ao hidrocarboneto A apresentou, em mdia, uma produo de CO2 (172,45 mg). J a cepa 13 quando associada ao hidrocarboneto B apresenta uma produo de 146,66 mg de CO2, enquanto a cepa 1 associada ao mesmo hidrocarboneto apresenta uma produo de 137,60 mg de CO2. A cepa 14 associada ao hidrocarboneto C apresenta 74,08 mg de CO2, enquanto que a cepa 2 associada ao hidrocarboneto C apresenta uma produo de 57,41 mg de CO2. A cepa 1 quando associada ao hidrocarboneto D produz 69,90 mg de CO2 enquanto que a cepa 14 associada ao mesmo hidrocarboneto produz 53,86 mg de CO2. Dessa forma, afirmase que a avaliao da biodegradabilidade ocorre de acordo com o tipo de cepa que utilizada nos experimentos e da composio do composto orgnico.

Levando em considerao os tratamentos da fase lenta, a maior produo de CO2 (189,38 mg), foi observada pela cepa 1 quando associada ao hidrocarboneto A e a menor produo de CO2 (53,86 mg), foi observada pela cepa 14 quando associada ao hidrocarboneto D. Dessa forma, afirma-se que o biodegradvel em relao aos demais hidrocarbonetos. hidrocarboneto A mais

Tabela 17 Mdias de CO2 acumulado (mg) das cepas e dos hidrocarbonetos A, B, C e D do primeiro ao vigsimo nono dia de ensaio.

Cepas 1 2 13 14 x

A
145,64 120,36 122,92 128,15 129,27

Hidrocarbonetos B C
110,93 108,98 105,54 104,29 107,44 43,19 42,62 50,78 52,64 47,31

D
49,98 44,15 48,26 39,44 45,46

x
87,43 79,03 81,88 81,13

A partir da tabela 17, observa-se que a cepa 1 relacionada aos hidrocarbonetos A, B, C e D apresenta, em mdia, a maior produo de CO 2 (87,43 mg) em relao as demais cepas estudadas, portanto a cepa com maior potencial de biodegradao.

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J a cepa 14 quando relacionada aos hidrocarbonetos A, B, C e D apresenta, em mdia, a menor produo de CO2 (81,13 mg). Os tratamentos compostos pelo hidrocarboneto A apresentaram, em mdia, a maior produo de CO2 (129,27 mg), sendo, portanto, considerado o composto orgnico mais facilmente biodegradvel em relao aos demais hidrocarbonetos.

Observa-se que a cepa 1 associada ao hidrocarboneto A apresenta uma produo de 145,64 mg de CO2, ao passo que quando utiliza-se o mesmo hidrocarboneto com a cepa 2 a produo de 120,36 mg de CO2. J a cepa 1 associada ao hidrocarboneto B produz 110,93 mg de CO2 enquanto que a cepa 14 relacionada ao mesmo hidrocarboneto produz 104,29 mg de CO 2. A cepa 14 associada ao hidrocarboneto C produz 52,64 mg de CO2 e a cepa 2 com o mesmo hidrocarboneto produz 42,62 mg de CO2. J a cepa 1 quando associada ao hidrocarboneto D produz 49,98 mg de CO2 enquanto que a cepa 14 associada ao hidrocarboneto D produz 39,44 mg de CO2. Esse fato confirma que a avaliao da biodegradabilidade ocorre de acordo com o tipo de cepa que utilizada nos experimentos e a composio do composto orgnico.

Levando em considerao os tratamentos desta segunda etapa (fase lenta), a maior produo de CO2 (145,64 mg), foi observada pela cepa 1 quando associada ao hidrocarboneto A e a menor produo de CO 2 (39,44 mg), em mdia, foi observada pela cepa 14 quando associada ao hidrocarboneto D.

Foram realizados testes descritivos para as cepas de acordo com as categorias de hidrocarbonetos. Para verificar a existncia de diferena de mdias entre categorias dos hidrocarbonetos (A, B, C e D) para cada cepa, foi utilizada a tcnica de anlise de varincia, ANOVA, considerando um nvel de significncia de 5%.

Atravs do resultado do teste conclui-se que existe diferena significativa (valor p < 0,05) entre as categorias dos hidrocarbonetos com todas as cepas.

93

Para detectar as diferenas entre as categorias, foi realizado um teste de comparao mltipla onde foi realizado o teste de Tukey, considerando um nvel de significncia de 5%, conforme mostra a tabela 18.

Tabela 18 Valores mdios de biodegradabilidade de fraes de hidrocarbonetos, expostos em mg de CO2 cumulativo, durante 29 dias.

Hidrocarbonetos Cepas 1 2 13 14 A
81,54A 31,05A 16,23A 23,18A

B
65,20A 44,59A 35,05A 41,35A

C
14,52B 17,28B 16,23B 15,89B

D
15,83B 16,08B 15,50B 14,72B

De acordo com o teste de mdia, descrito na tabela 18, observa-se que os hidrocarbonetos A e B so iguais entre si e os hidrocarbonetos C e D tambm so iguais entre si, embora o primeiro grupo (A e B) so diferentes do segundo grupo (C e D).

5.3 Avaliao das cepas isoladas Ensaio III

O ensaio III foi realizado com 2 cepas ( 1 e 14) e 4 hidrocarbonetos (A, B, C e D, respectivamente, leo bruto 1,frao 6, frao 29 e frao 31), e com dois tipos de solos diferentes (arenoso e argiloso). O solo arenoso possui 70% de areia e 30% de argila e o solo argiloso possui 70% de argila e 30% de areia. As terminaes X identificam os solos arenosos e as terminaes Y identificam os solos argilosos. Os

94

grficos relacionados ao ensaio II do experimento esto apresentados nas figuras 20 e 21, e os tratamentos esto descritos na tabela 8.

Figura 23 Ensaio de biodegradabilidade (I IV) dos hidrocarbonetos A, B, c e D (leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31, respectivamente), por respirometria aerbia, com as cepas 1 e 14, utilizando solo argiloso (Y) como substrato, por um perodo de 31 dias.

95

Figura 24 Ensaio de biodegradabilidade (I-IV) dos hidrocarbonetos A, B, C e D (leo bruto 1, frao 6, frao 29 e frao 31, respectivamente), por respirometria aerbia, com as cepas 1 e 14, utilizando solo arenoso como substrato, por um perodo de 31 dias.

Observa-se que, os tratamentos em solos arenosos apresentam maior capacidade de biodegradao dos hidrocarbonetos em relao aos tratamentos em solos argilosos.

Isso se deve quantidade de oxignio que maior nos solos arenosos, facilitando a biodegradabilidade. As cepas que esto relacionadas aos hidrocarbonetos A e B, tanto para os tratamentos em solo arenoso quanto para o argiloso, so mais biodegradveis em relao s cepas que esto relacionadas aos hidrocarbonetos C e D.

Os grficos das figuras 23 e 24 representam os ensaios de biodegradabilidade em solos argilosos e arenosos, respectivamente. Os tratamentos, em solos arenosos, 1AX, 1BX e 1CX apresentaram uma produo maior de CO 2 em relao aos 96

tratamentos 1AY, 1BY e 1CY, em solos argilosos. Em contrapartida, os tratamentos 14AY, 14CY, 1DY e 14DY, em solos argilosos, apresentaram uma produo maior de CO2 em relao aos tratamentos 14AX, 14CX, 1DX e 14DX, em solos arenosos. A tabela 19 apresenta os valores da constante de biodegradao (k) e o respectivo ajuste de reta (R2) dos tratamentos 1AX, 1BX, 1CX, 1DX, 14AY, 14BY, 14CY, 14DY, 1AY, 1BY, 1CY, 1DY, 14AY, 14BY, 14CY e 14DY em ordem crescente de biodegradabilidade.

Utilizou-se a cintica de primeira ordem para avaliar os dados obtidos na respirometria. Os valores da constante de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio III e seus respectivos ajustes de reta (R2) esto ilustrados na tabela 19 e os valores de k1 e k2 e seus respectivos ajustes so demonstrados na tabela 20 em ordem decrescente de biodegradabilidade dos compostos.

Tabela 19 Valores da constante de biodegradao (k) e respectivo ajuste da reta (R ) para os tratamentos ensaio III do experimento. Tratamentos 14DY 14BX 14CX 14AY 14DX 14AX 1AY 14CY 14BY 1CX 1DX 1CY 1BY 1DY 1AX 1BX k (dia ) 0,1101 0,1091 0,1079 0,1064 0,1047 0,1009 0,1009 0,1005 0,1003 0,0997 0,0947 0,0882 0,0871 0,0838 0,0785 0,0783
-1

0,8089 0,6786 0,7649 0,7235 0,7537 0,5989 0,7503 0,8193 0,8137 0,7144 0,8227 0,8354 0,7040 0,8270 0,5428 0,6169

97

Observa-se que o tratamento 14DY foi o que apresentou a maior taxa de degradao, com k=0,1101 e o tratamento 1BX com a menor taxa de degradao, com k=0,0783.

De acordo com a figura 25, pode-se afirmar que o tratamento 14DY apresentou um potencial de biodegradao de 11% da concentrao inicial do hidrocarboneto presente neste tratamento, da mesma forma que o tratamento 1BX foi somente 7% biodegradado em 31 dias de experimento.

Figura 25 Taxa de biodegradao (k) dos tratamentos do ensaio III, por um perodo de 31dias.

Os tratamentos que foram testados em solos arenosos apresentaram, em mdia, uma velocidade de degradao maior que a dos tratamentos testados em solos argilosos. O clculo da taxa de biodegradao (k) do ensaio III tambm foi realizado em duas etapas, segundo Firme (2005). A fase rpida (k 1), considerando os dados do primeiro ao nono dia de experimento e a fase lenta (k2), considerando do dcimo ao trigsimo primeiro dia de experimento, conforme tabela 20.

98

Richard e Vogel (1999) analisaram a cintica de degradao de leo diesel por duas linhagens de Pseudomonas fluorescens e constataram que 10,4% e 12,3% dos hidrocarbonetos foram degradados pelas bactrias ao final de 50 dias de experimento.

Tabela 20 Valores das constantes de biodegradao (k 1 e k2) e respectivos ajustes da reta (R ) para os tratamentos do ensaio III do experimento. Tratamentos 14AX 14BX 1BY 1AX 14AY 1CX 1BX 14DX 14CX 1AY 14DY 14CY 14BY 1CY 1DX 1DY k1 (d ) 0,5549 0,4886 0,4528 0,4419 0,4306 0,4036 0,3854 0,3771 0,3768 0,3714 0,3411 0,3064 0,3053 0,2691 0,2906 0,2577
-1

R (1) 0,8814 0,9630 0,9026 0,7255 0,9732 0,9870 0,7543 0,8682 0,9153 0,8847 0,9589 0,9587 0,9742 0,9847 0,8855 0,9750

k2(d ) 0,0316 0,0333 0,0393 0,0243 0,0384 0,0325 0,0288 0,0454 0,0459 0,0436 0,0515 0,0494 0,0469 0,0462 0,0506 0,0428

-1

R (2) 0,9525 0,9219 0,9339 0,9457 0,9256 0,9550 0,9367 0,8892 0,8756 0,8709 0,9282 0,9273 0,9342 0,9497 0,9352 0,9330

No ensaio III, os valores da cintica da biodegradao (k) e o tempo (t) s so inversamente proporcionais se o valor de k for calculado em uma nica fase ou se for considerado o valor da taxa de biodegradao na fase lenta (k2).

Os dados estatsticos do ensaio III foram realizados em duas etapas, sendo que a primeira etapa (fase rpida) foi realizada do primeiro ao nono dia. A segunda etapa (fase lenta) foi realizada do dcimo ao trigsimo primeiro dia de experimento. Realizou-se tambm a anlise dos dados em uma nica etapa, do primeiro ao trigsimo primeiro dia de experimento. Os resultados esto dispostos em mg de CO 2 e esto apresentados nas tabelas de 21a 23.

99

Tabela 21 - Estatsticas descritivas das Cepas 1 e 14 , utilizando solos texturizados, sendo solo X (arenoso) e solo Y (argiloso) e dos hidrocarbonetos A, B, C e D (petrleo leve, frao 6, frao 29 e frao 31), considerando a anlise do primeiro ao dcimo dia.

Cepas 1Y 14Y x
Y = solo argiloso

A
24,01 26,76 25,39

Hidrocarbonetos B C
25,56 15,81 20,69 13,38 13,22 13,30

D
15,37 12,85 14,11

x
19,58 17,16

Cepas 1X 14X x
X= solo arenoso

A
51,10 34,74 42,92

Hidrocarbonetos C
17,03 12,04 14,54

D
12,26 11,11 11,69

x
29,26 19,87

36,64 21,60 29,12

Observa-se, a partir da tabela 21, que os tratamentos em solos arenosos apresentam um potencial de biodegradao maior aos tratamentos em solos argilosos, isso se deve ao fato da aerao ser maior em solos arenosos, facilitando, assim, a biodegradao. A cepa 1, mostra mais facilidade na degradao do hidrocarboneto B (25,56 mg), em solo argiloso, e na degradao do hidrocarboneto A (51,10 mg) em solo arenoso. A cepa 14X apresentou maior produo de CO2 (34,74 mg) quando associada ao hidrocarboneto A, em solo arenoso. O hidrocarboneto D o que apresenta, em mdia, o menor potencial de degradao microbiana, em relao aos demais hidrocarbonetos.

Tabela 22 - Estatsticas descritivas das Cepas 1 e 14, utilizando solos texturizados, sendo solo X (arenoso) e solo Y (argiloso) e dos hidrocarbonetos A, B, C e D (petrleo leve, frao 6, frao 29 e frao 31), considerando a anlise do dcimo primeiro ao trigsimo primeiro dia.

Cepas 1Y 14Y x
Y= solo argiloso

A
123,05 132,45 127,75

Hidrocarbonetos C
61,21 71,25 66,23

D
63,99 78,54 71,27

x
86,52 91,52

97,82 83,84 90,83

100

Cepas 1X 14X x
X= solo arenoso

A
151,40 131,60 141,50

Hidrocarbonetos B C
110,42 102,02 106,22 74,76 69,01 71,89

D
60,13 59,87 60,00

x
99,18 90,63

Nesta etapa (fase lenta), ocorre a maior parte de degradao dos hidrocarbonetos. As maiores produes de CO2 foram observadas nos tratamentos realizados em solos arenosos, devido aerao. A cepa 1Y, em solo argiloso, produz 123,05 mg de CO2 quando associada ao hidrocarboneto A, j a cepa 1X, em solo arenoso, produz 123,05 mg de CO2. A cepa 14Y, em solo argiloso, associada ao hidrocarboneto produz 132,45mg de CO2, enquanto que a cepa 14X, em solo arenoso, produz 131,50 mg de CO2.

Tabela 23 - Estatsticas descritivas das Cepas 1 e 14, utilizando solos texturizados, sendo solo X (arenoso) e solo Y (argiloso) e dos hidrocarbonetos A, B, C e D (petrleo leve, frao 6, frao 29 e frao 31), considerando a anlise do primeiro ao trigsimo primeiro dia.

Cepas 1Y 14Y x
Y= solo argiloso

A
69,72 75,54 72,63

Hidrocarbonetos B C
58,91 47,21 53,06 35,70 40,00 37,85

D
37,81 43,17 40,49

x
50,54 51,48

Cepas 1X 14X x
X=solo arenoso

A
97,39 79,44 88,42

Hidrocarbonetos B C
69,62 58,71 64,17 43,67 38,34 41,01

D
34,35 33,62 33,99

x
61,26 52,53

A partir da anlise da tabela 23 observamos que, nesta etapa nica (do primeiro ao trigsimo primeiro dia), as maiores produes de CO2 so dos tratamentos realizados em solos arenosos. A cepa 1Y produziu 69,72 mg de CO2 quando associada ao hidrocarboneto A. J a cepa 1X produziu 97,39 mg de CO 2, associada

101

ao hidrocarboneto A. A cepa 14Y produziu 75,54 mg de CO 2 quando associada ao hidrocarboneto A, j a cepa 14X, produziu 79,44 mg de CO 2 quando associada ao hidrocarboneto A.

5.4 Comparao das taxas de biodegradao nos ensaios I, II e III

Tabela 24 Comparao das taxas de biodegradao (k) entre os tratamentos nos trs ensaios

Tratamentos

Ensaio I

Ensaio II

Ensaio III arenoso argiloso

1 2 13 14

0,1301 0,1998 0,2078 0,1878

0,0636 0,0833 0,0951 0,0835

0,0785

0,1009

0,1047

0,1101

O tratamento apresentou um potencial de biodegradao de 13% no ensaio I, com 15 dias de experimento, 6% no ensaio II, com 29 dias de experimento e 7% no ensaio III (solos arenoso) e 10% (solo argiloso), em 31 dias de experimento. O tratamento 14 apresentou um potencial de biodegradao de 18% no ensaio I, 8% no ensaio II e 10% (solo argiloso) e 11% (solo arenoso) no ensaio III. O tratamento 14 apresentou um comportamento de biodegradao similar ao primeiro, diferenciando na biodegradao dos solos, sendo mais biodegradvel no solo argiloso.

O tratamento 2 apresentou um potencial de 19% de biodegradao no ensaio I e 8% no ensaio II. O tratamento 13 apresentou um potencial de biodegradao de 20% no ensaio I e 9% no ensaio II.

102

No ensaio I e II, o tratamento 13 foi o que apresentou o maior potencial de biodegradao e no ensaio III, o tratamento 14 foi o que apresentou o maior potencial de biodegradao, tanto para solo arenoso quanto para o argiloso.

103

6. CONCLUSES

As cepas isoladas neste trabalho apresentam potencial de biodegradabilidade de hidrocarbonetos derivados do petrleo. Assim, as mesmas podem ser utilizadas como uma alternativa eficaz no tratamento de reas contaminadas por

hidrocarbonetos de petrleo.

Foram isoladas um total de 19 cepas, a partir de solos de horta e mangue, que apresentam capacidade de biodegradao de hidrocarbonetos derivados do petrleo.

Observou-se, a partir dos controles, que a adio do inculo bacteriano nos tratamentos fundamental para a biodegradao dos compostos orgnicos, influenciando diretamente nos resultados dos ensaios de biodegradabilidade.

Os testes morfolgicos e bioqumicos realizados nas cepas isoladas neste experimento so insuficientes para a classificao das bactrias.

O hidrocarboneto A (petrleo leve) apresentou ser mais biodegradvel em relao aos hidrocarbonetos B (frao 6), C (frao 29) e D (frao 31).

Estatisticamente, no existe diferena significante entre os hidrocarbonetos A e B e os hidrocarbonetos C e D, nos estudos realizados neste experimento.

De acordo com a cintica empregada neste estudo, a fase rpida (k1) dos experimentos representam a maior parte da degradao dos hidrocarbonetos derivados do petrleo.

104

7. RECOMENDAES

Analisar os compostos orgnicos estudados atravs de cromatografia com a finalidade de identific-los. Caracterizar o solo utilizado como fonte de inculo sob os aspectos fsicos, qumicos e biolgicos.

105

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