INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA FISIOLOGA DE LA NUTRICIN

PRCTICA 1

ANLISIS APROXIMADO DE LOS ALIMENTOS (Humedad, Cenizas, Nitrgeno Total (protenas), Fibra Cruda, Extracto Etreo (grasas) y Carbohidratos)

1. OBJETIVOS a) El alumno aplicar las tcnicas de anlisis comnmente empleadas para la determinacin de los constituyentes principales de los alimentos. El alumno determinar el valor energtico y nutritivo de los alimentos analizados, basndose en el anlisis aproximado de los mismos. El alumno analizar la importancia que tiene el anlisis aproximado de alimentos y la composicin de los mismos en la nutricin y ciencia de los alimentos.

b) c)

2. INTRODUCCIN La ciencia de la qumica trata de la naturaleza de los constituyentes atmicos y moleculares del universo y de las relaciones e interacciones entre estos componentes. La qumica de los alimentos se dedica al estudio de los constituyentes atmicos y moleculares de los alimentos que consumimos. El anlisis aproximado es un anlisis de los principales constituyentes de los alimentos, estos se agrupan en carbohidratos y fibras, protenas, grasas y

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN aceites, minerales o cenizas y agua. El anlisis detallado es el anlisis de los elementos que forman las molculas presentes en los alimentos. La composicin de los alimentos se expresa generalmente en trminos del anlisis aproximado. Hay medios exactos y precisos para identificar y determinar los constituyentes en los alimentos. El anlisis aproximado es de este tipo de anlisis. Es muy til, ya que permite saber la composicin de los alimentos en trminos de la utilidad que significan para el cuerpo humano. La importancia de la nutricin en las decisiones relacionadas con la salud, ha trado como resultado un incremento en la demanda de conocimientos de los constituyentes nutritivos de los alimentos, es decir, los nutrimentos. Estos conocimientos son requeridos por cientficos que investigan en reas tales como nutricin, ciencia de los alimentos, qumica clnica y epidemiologa. Existen varias razones para cuantificar los nutrimentos en los alimentos, estas incluyen: investigaciones en gentica de plantas y animales, modificaciones en la tecnologa post-cosecha, investigaciones en ciencia de los alimentos, desarrollo de nuevos productos alimenticios y el anlisis de la composicin de nutrimentos.

3. INVESTIGACIN PRELIMINAR a) b) c) Cules son los fundamentos en los que se basan cada una de las tcnicas de anlisis de los componentes de los alimentos? Cul es el valor energtico y nutritivo de los alimentos que se analizarn en esta prctica? Cmo influye en las determinaciones la estructura y la composicin de los alimentos?

4. MATERIALES Y REACTIVOS 4.1. Determinacin de Humedad

Balanza analtica Estufa para desecacin Parrilla de calentamiento Termo balanza Desecador con placa Cpsulas de Porcelana 2 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Crisoles Esptula con cucharilla de acero inoxidable Pinzas para crisol Platos para termo balanza Probeta de vidrio de 100 ml Matraz baln fondo plano 250 ml con boca esmerilada 24/40 Trampa de Bidwell-Sterling Refrigerante boca 24/40 Tolueno, xileno o benceno Agente desecante 4.2. Determinacin de cenizas (residuos por calcinacin)

Balanza analtica Campana de extraccin Estufa para desecacin Mufla Desecador con placa Mecheros Anillo metlico Crisoles Esptula con cucharilla Pinzas para crisol Pipetas de 1 ml Soporte universal Tringulos de porcelana 4.3. Determinacin de Nitrgeno Total (protenas)

Mtodo de Kjeldhal Balanza analtica Bulbos de destilacin Kjeldhal Bureta de 50 ml Bao de hielo Matraces Erlenmeyer de 250 y 500 ml Bomba de reflujo Matraces Kjeldhal de 500 800 ml Calentador (elctrico o de gas) Pipetas serolgicas de varias capacidades Probetas de vidrio de 100 ml Refrigerantes de tubo recto cido Sulfrico 93-98%, exento de N Oxido de mercurio o mercurio metlico, exento de N Sulfato potsico (anhidro) Grnulos de zinc 3 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Solucin de sulfuro o triosulfato. Disolver 40g de sulfuro potsico comercial en un litro de agua o 40g de sulfuro sdico o 80g de triosulfato de sodio en 1L de agua. Solucin o lentejas de Hidrxido de Sodio. Disolver 450g de hidrxido de sodio slido en agua y aforar a 1L, densidad no menor a 1.36. Indicador de rojo de metilo. Disolver 1g de rojo de metilo en 200 ml de alcohol. Solucin patrn de cido clorhdrico o de cido sulfrico 0.5N 0.1N. Solucin patrn de hidrxido de sodio 0.5N 0.1N. Mtodo de micro Kjeldhal Bulbos de destilacin Kjeldhal Bao de hielo Bureta de 50 ml Balanza analtica Matraces Erlenmeyer de 125 ml Calentador (elctrico o de gas) Matraces Kjeldhal de 30 ml Pipetas serolgicas de varias capacidades Probetas de vidrio de 100 ml Refrigerantes de tubo recto cido brico al 4% (p/v) cido clorhdrico 0.1 N (estandarizado) cido sulfrico concentrado Oxido de mercurio Sulfato de potasio Solucin de hidrxido-tiosulfato de sodio. Disolver 60 g de hidrxido de sodio y 5 g de tiosulfato de sodio pentahidratado en agua y diluir a 100 ml. Solucin indicadora (1) (2) (1) Rojo de metilo-azul de metileno. Mezclar dos partes de una solucin alcoholica de rojo de metilo 0.2% con una parte de una solucin alcoholica de azul de metileno al 0.2%. (2) Rojo de metilo- verde de bromocresol. Mezcla una parte de una solucin alcohlica de rojo de metilo 0.2% con 5 partes de una solucin alcohlica de verde de bromocresol 0.2%. 4.4. Determinacin de Fibra Cruda

Cpsulas de incineracin. Aparato de digestin. Desecador Balanza analtica Filtro de succin Bomba de vaco Matraz Kitazato Dispositivos de filtracin 4 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Vasos Berzelius Estufa de desecacin Precalentador de lquidos Solucin de cido sulfrico 0.225 N, 1.25g de cido sulfrico en 100 ml. Solucin de hidrxido de sodio 0.313 N, 1.25g de hidrxido de sodio en 100 ml de agua, prcticamente exenta de carbonato de sodio. Asbesto preparado, extender sobre una cpsula de evaporacin una capa fina de asbesto de fibra media o larga, lavado al cido y calentar a 600C durante 16 hrs. en la mufla. Hervir durante 30 min. con cido sulfrico al 1.25%, filtrar, lavar intensamente con agua y hervir durante 30 min. con hidrxido de sodio al 1.25%, lavar una vez con cido al 1.25% y luego, intensamente con agua, desecar durante 2 hrs. a 600C. Hacer una determinacin en blanco, tratando 1g de asbesto preparado con cido y lcali como se indica en el desarrollo experimental. Alcohol, metanol, alcohol izo proplico o alcohol etlico al 95%. Antiespumante, Dow Corning Antifoam A diluido 1 + 4 con ter de petrleo o aceite mineral, o emulsin antifoam A diluida 1 + 4 con agua. Grnulos para regular la ebullicin. Determinacin de fibra cruda sin asbesto Unidad de reflujo banco de 6 o 12 Tanque de agua caliente-provisto de agentes de salida a travs de serpentinas en el tanque El aparato de filtracin de Holst 3 filtros Junnels. 75 milmetros de dimetro inferior estn fijados por tapones de caucho del No.9 para proveer vaci Filtros de cono Fisher 5 cientin con acero inoxidable Papel filtro Whatman No.5041 endurecido de 24 cm. de dimetro Crisol 600ch. Con vidrio desgastado 50ml. De porosidad gruesa Fibra cruda Estufa de vaci Mufla Placa de calentamiento con agitacin cido actico 70% (v/v). Se diluyen 700 ml de cido actico en agua destilada aforando a 1000 ml. cido ntrico concentrado cido triclorocetico en cristales 4.5. Determinacin de extracto etreo (grasa cruda)

Algodn Balanza analtica Cartuchos para la extraccin 5 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Equipo de extraccin Soxhlet Desecador Estufa de desecacin Matraz bola a peso constante Parrilla de calentamiento ter etlico anhidro: lavar el ter comercial dos o tres veces con agua, aadir varias lentejas de hidrxido de sodio o potasio y dejar en reposo durante toda la noche o durante el tiempo y dejar en reposo durante toda la noche o durante el tiempo necesario para que absorba la parte del agua. Decantar a un frasco seco, aadiendo una pieza pequea de sodio, esperar a que cese el desprendimiento de gas. Conservar sobre sodio, en un frasco protegido por un tubo de cloruro clcico. 4.6. Determinacin de Carbohidratos

Determinacin de Carbohidratos por el Mtodo del Fenol Sulfrico Bao Maria a 30oC Reactivo A. A 5.5 ml de fenol (90%) adicionarle 94.5 ml de agua (obtenindose una concentracin final de 5%) Determinacin de hexosas por el mtodo de la antrona D-galactosa D-manosa Agua destilada Bao Stopper tubes Reactivo A: disolver 200 mg de antrona en 100 ml de H2SO4 concentrado (0.2%). Prepararse el mismo da que ser usado a ms tardar en 4 horas.

5. DESARROLLO EXPERIMENTAL A una muestra representativa de cada alimento, practicarle los siguientes anlisis: Humedad, cenizas, nitrgeno total (protenas), fibra cruda, extracto etreo (grasas) y carbohidratos. 5.1. DETERMINACIN DE HUMEDAD

El contenido de humedad es de gran importancia por muchas razones cientficas, tcnicas y econmicas pero su determinacin precisa es muy difcil. El agua se encuentra en los alimentos esencialmente en dos formas; como agua enlazada y agua disponible o libre. El agua enlazada incluye molculas de agua unidas en forma qumica mientras que el agua libre es la que no esta 6 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN fsicamente unida a la matriz del alimento y se puede congelar y perder con facilidad por evaporacin o secado. Mtodos de secado: estos mtodos incluyen la determinacin de la prdida de peso debida a la evaporacin de agua en el punto de ebullicin o temperaturas cercanas a el. La perdida de peso tambin depende de otros factores, incluyendo tamao de partcula y el peso de la muestra, el tipo de recipiente en el que se seca y las variaciones de temperatura entre una y otra charola del horno. Algunos mtodos con estas caractersticas son: el mtodo de la estufa y el de la termo balanza. Mtodos de destilacin: estos mtodos incluyen la destilacin del alimento usando un disolvente no miscible con un punto de ebullicin mayor y gravedad especifica meno que la del agua, como tolueno, heptano y xileno. El agua destilada que de debajo del disolvente condensado en un recipiente graduado que mide el volumen de la fase acuosa. Mtodos qumicos: El mtodo originalmente desarrollado pro Karl Fisher par la determinacin de agua por titulacin que tiene una gran sensibilidad se describe en una norma britnica (BS2511; 1970). Este mtodo se basa en la reaccin no estequiomtrica de agua con yodo y dixido de azufre en una solucin de piridina metanol. Mtodos instrumentales: una gran variedad de mtodos instrumentales basados en principios fsicos o fisicoqumicos se han aplicado en la determinacin de humedad. Entre ellos el de la termo balanza, resonancia magntica nuclear, refractancia en el infrarrojo cercano y el de microondas. 5.1.1. Determinacin con la estufa de humedades a) Regular la estufa de humedades a una temperatura de 100C 2C. S el material de prueba es termolbil usar una temperatura menor. b) Introducir un crisol o una cpsula de porcelana vaca, limpia y previamente marcada. Evitar tomar el recipiente con las manos. c) Dejarlo de dos a tres horas. d) Pasarlo mediante pinzas para crisol a un desecador con placa, que est limpio y con desecante activo. e) Dejarlo de 10 a 15 min. para que se enfre y luego pesarlo en una balanza analtica.

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MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN f) Volver a introducirlo en la estufa y repetir las pesadas a intervalos de tiempo regulares de 30 a 60 min. hasta que ya no haya variacin en el peso. g) Una vez puesto el crisol a peso constante, pesar en l de 2 a 5 g de muestra. h) Llevarlo a la estufa y mantenerlo por 3 horas. i) Registrar el peso del crisol con muestra en la misma forma que se hizo con el crisol vaco hasta que se tenga un peso constante. 5.1.2. Determinacin con la estufa de humedades a) Verificar que el equipo est en condiciones de uso y que el platillo donde se coloca la muestra est limpio. b) Seleccionar la temperatura que se usar en la prueba. NOTA: En algunos equipos es necesario revisar la temperatura en el platillo correspondiente a cada valor del dial en el selector. c) Con el control de tiempo dar 5 minutos de calentamiento al platillo vaco. Despus dejar enfriar un minuto. d) Poner en ceros y adicionar rpidamente 10 gramos de muestra o una cantidad recomendable de acuerdo a la capacidad de la termo balanza. Registrar exactamente el peso. En caso de que el equipo d directamente la lectura en porcentaje esto no es necesario. e) Con el selector de tiempo dar 30 min. para la determinacin. Al final de este perodo registrar la lectura. f) Dar otros 15 min. de calentamiento y observar las variaciones que haya en las lecturas en los ltimos 5 min. S la variacin en la lectura se da cada minuto o ms tiempo, dar por terminada la prueba y tomar el ltimo valor como correcto. S existe mucha variacin todava, dar perodos sucesivos hasta que se obtenga lectura constante. 5.1.3. Determinacin con la trampa de Bidwell-Sterling a) Montar el matraz con unin 24/40 con el refrigerante y la trampa de Bidwell-Sterling. b) Adicionar de 10 a 50 gramos de muestra considerando la humedad esperada y la capacidad de la trampa. De esta ltima se debe respetar la escala. 8 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN c) Hacer circular el agua por el refrigerante. d) Adicionar 100 ml de Tolueno, xileno o benceno al matraz. e) Calentar hasta bullir y mantener un reflujo vigoroso y constante pero seguro. f) Mantener 30 min. y observar si ya no hay incremento del nivel de agua en la trampa o si el reflujo no est turbio. De ser as dar por terminada la prueba y en caso contrario mantener el reflujo hasta que ya no haya arrastre de humedad. g) Registrar los mililitros de agua depositados leyendo directamente en su escala. 5.2. DETERMINACIN DE CENIZAS (RESIDUOS POR CALCINACIN)

La ceniza de un producto es el residuo inorgnico que queda despus de quemar la materia orgnica, el valor de las cenizas se puede considerar como una medida general de calidad y a menudo es un criterio til en la identificacin de la autenticidad de un alimento. Existen varios mtodos para la determinacin de cenizas: Mtodo para cenizas solubles en agua: las cenizas se llevan a ebullicin con 25 ml de agua y el lquido se filtra a travs de un papel filtro libre de cenizas, despus el papel filtro se incinera en una cpsula se enfra y se pesa para determinar las cenizas insolubles en agua Mtodo para cenizas solubles en cido: las cenizas insolubles en agua se llevan a ebullicin con 25 ml de cido clorhdrico diluido durante cinco minutos, el lquido se filtra a travs de papel filtro de cenizas y se lava perfectamente con agua caliente. El papel filtro se incinera en un crisol se enfra y se pesa. Mtodo para cenizas sulfatadas: el procedimiento consiste en humedecer las cenizas con cido sulfrico concentrado e incinerar suavemente hasta lograr un peso constante. a) Introducir un crisol previamente marcado en la estufa de desecacin para ponerlo a peso constante. Seguir el mismo procedimiento indicado para la determinacin de humedad y registrar el peso. b) Pesar de 2 a 5 gramos de muestra, de humedad conocida o a la cual se le est determinando simultneamente la humedad, registrar exactamente el peso.

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MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN c) Colocar el crisol en un tringulo de porcelana montado en un anillo sujeto al soporte y calentar directamente con el mechero para calcinar la muestra. PRECAUCIN: esto se debe realizar en la campana y se debe evitar que la muestra se inflame para que no haya prdidas, la calcinacin de la muestra debe ser por contacto con las paredes del crisol. d) Cuando ya no haya desprendimiento de humo negro pasar el crisol a una mufla que est a 550C y mantenerlo por 3 hrs. e) Despus de este tiempo observar la apariencia de las cenizas. S estas son de color blanco o gris claro pasar el crisol a la estufa de humedades la cual debe estar a 100C. En el caso de que las cenizas estn muy oscuras dejar ms tiempo. PRECAUCIN: Se debe evitar tomar el crisol con las pinzas fras, igualmente colocarlo en superficies fras conductoras para que no haya cambios bruscos de temperatura y se fracture. f) Despus de media hora en la estufa de humedades pasar el crisol a un desecador. Dejar enfriar por 15 min. y pesar en la balanza analtica. NOTA: En caso de que las cenizas no se aclaren, enfriar el crisol y agregar algunas gotas de agua y continuar la calcinacin en la mufla. 5.3. DETERMINACIN DE NITRGENO TOTAL (PROTENAS)

El contenido total de protenas se determina a partir del contenido de nitrgeno orgnico presente en la muestra por medio del mtodo de Kjeldhal. El mtodo de Kjeldhal an sigue siendo la tcnica ms confiable para la determinacin de nitrgeno orgnico, en consecuencia se incluye en mtodos oficiales y reglamentarios y est aprobado por organizaciones internacionales; ms an, los resultados obtenidos por el mtodo de Kjeldhal se usan para calibrar mtodos fsicos y automticos Mtodo Kjeldhal este mtodo se basa en la combustin en hmedo de la muestra por calentamiento con cido sulfrico concentrado en presencia de catalizadores metlicos y de otro tipo para reducir el nitrgeno orgnico de la muestra hasta amoniaco el cual queda en solucin en forma de sulfato de amonio. Se emplean diversos catalizadores el mercurio, como xido mercrico es el ms eficaz, junto con el selenio, que casi tiene la misma eficacia; pero ambos tienen propiedades txicas y plantean problemas para desecharlos. 10 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Tambin se ha logrado reducir el tiempo de digestin mediante la adicin de sulfato de sodio o de potasio, los cuales elevan la temperatura de digestin. El digerido, una vez alcalinizado, se destila directamente o por arrastre de vapor para desprender el amoniaco, el cual es atrapado y luego se titula. En la actualidad, es ms comn destilar y recolectar el amoniaco en una solucin de cido brico al 4% y titularlo en forma directa con una solucin estndar de cido sulfrico. La muestra se disuelve en cido sulfrico concentrado y se calienta con la finalidad de que la materia carbonosa se libere en forma de CO 2, los minerales se sulfaten y el nitrgeno se transforme en sulfato de amonio. Como catalizador se utiliza CuSO 4, puede usarse sales de Hg, Zn, Se, pero estos dos ltimos son muy caros y el Hg es txico. El K 2SO4 sirve como elevador de la temperatura de ebullicin (no es catalizador), por cada 10o C de elevacin de la temperatura, la velocidad de la reaccin se duplica. El ataque finaliza cuando la solucin se torna de un color verde-esmeralda lmpido. En este proceso de digestin o taque de la muestra, se libera en la digestin la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la muestra en forma de CO2; la parte oxigenada de la protena tambin se libera, slo queda la parte nitrogenada de la protena. Al final del ataque, se tiene en la solucin H2SO4 sobrante, sales sulfatadas de los minerales disueltos y el sulfato de amonio. En el proceso de destilacin, se aade al baln de Kjeldhal 500 ml de agua con la finalidad de diluir al cido sulfrico remanente, a la vez que el sulfato de potasio, sulfato de cobre y sulfato de amonio disueltos precipiten, dejando libre en la parte superior el H 2SO4 sobrante es decir hay formacin de dos fases. Luego se aaden algunas granallas de zinc con la finalidad de evitar la ebullicin tumultuosa creando ncleos de vaporizacin. Inmediatamente despus de este paso se adiciona la soda custica por los bordes del baln para evitar una reaccin violenta con el cido sulfrico remanente y el (NH 4)2SO4. La adicin de la soda neutraliza la accin del cido sulfrico sobrante, favorece la liberacin del amonaco en forma de NH 4OH que ser recibido en el vaso Erlenmeyer que contiene la solucin de cido brico. Inicialmente al producirse el calentamiento desaparecen las dos fases, se forma una solucin de color celeste-oscuro, luego al ebullir se torna color marrn debido a la presencia de un complejo cprico, que desaparece a medida que se libera el amonaco. El amoniaco es captado por la solucin de H 3BO3, que forma un complejo estable, esto se observa debido al cambio de color que experimenta la solucin progresivamente, a medida que es captado por el cido brico; esto es visible gracias al indicador rojo de metilo, pudindose usar otro indicador segn el rango de viraje. 11 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Posteriormente, se determina por titulacin con HCl 0.1 N hasta cambio de color, en este caso, amarillo a rojo-grosella, el volumen gastado de cido y se procede con los clculos. Este mtodo de anlisis es aplicable a todo tipo de alimento en general, si el alimento ha sido enriquecido con urea, la expresin del resultado es engaosa. 5.3.1.Mtodo de Kjeldhal a) Pesar de 0.7 a 2.2 g de la muestra, de acuerdo con su contenido de nitrgeno. b) Depositar la pesada en un matraz de digestin de Kjeldahl, aadir 0.7g de xido de mercurio 0.65 de mercurio metlico, 15g de sulfato de potasio o sodio y 25 ml de cido sulfrico. Si la muestra pesa ms de 2.2 g, aumentar el volumen de cido sulfrico en 10 ml por gramo de muestra. c) Colocar el matraz inclinado y calentar cuidadosamente hasta que deje de formar espuma (s es necesario aadir una pequea cantidad de parafina para controlar la formacin de espuma). d) Hervir intensamente hasta que la solucin se aclare y continuar la ebullicin durante al menos otros 30 min., 2 hrs. para muestras que contengan materia orgnica. e) Una vez digerida la muestra, enfriar y aadir aproximadamente 200 ml de agua, a una temperatura inferior a 25C, y 25 ml de la solucin de sulfuro o trisulfato, para precipitar el mercurio. f) Aadir unos grnulos de zinc para evitar que salpique las paredes. g) Inclinar el matraz y aadir lentamente, sin agitacin, dejando que resbale a lo largo del cuello 25g de lentejas de hidrxido de sodio o una cantidad equivalente de una solucin acuosa para alcalinizar el contenido del matraz, s se desea se puede mezclar el hidrxido de sodio con la solucin de sulfuro o trisulfato antes de su adicin al matraz. h) De inmediato, conectar el matraz al equipo de destilacin, en cuya punta del refrigerante se coloca previamente un matraz erlenmeyer de 500 ml con 25 a 50 ml de la solucin patrn de cido clorhdrico o sulfrico, es necesario que la punta del refrigerante penetre en la solucin de cido contenido en el matraz. i) Encender el mechero o la fuente de calentamiento situada bajo el matraz de destilacin y hacer girar el matraz para mezclar bien su contenido. 12 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN j) Calentar hasta destilar todo el amoniaco, es preciso recoger no menos de 150 ml de destilado. k) Terminada la destilacin, bajar el matraz colector hasta que el extremo del refrigerante quede por encima del lquido colocado en el matraz y lavar la punta del refrigerante con agua destilada. l) Titular el exceso del cido normalizado del destilado con la solucin normalizada del lcali, con rojo de metilo como indicador. m) Calcular el porcentaje de nitrgeno que contiene la muestra. S se desea transformarlo en porcentaje de protena bruta, multiplicar el porcentaje de nitrgeno por 6.25, que es el factor convencionalmente usado para las protenas en general. A veces se utilizan otros factores: 5.7 para el trigo, 6.38 para la leche, 5.55 para la gelatina, 5.95 para el arroz, 5.77 para la soya, etc. 5.3.2.Mtodo micro Kjeldhal a) Pesar la cantidad de muestra que consuma en la titulacin de 3 a 10 ml de HCl 0.1N (10 a 100 mg de muestra seca), en papel libre de nitrgeno y transferir a un matraz de micro Kjeldhal. b) Adicionar 1.9 + 0.1 g de K2SO4, 40 + 10 mg HgO, y 2.0 + 0.1 ml de H2SO4 (densidad especfica 1.84). Si la muestra es mayor a 15 mg, adase 0.1 ml adicional de H2SO4 por cada 10 mg ms de muestra. c) Agregar perlas de ebullicin que pasen por un tamiz nmero 10. d) Si el tiempo de ebullicin es de 2 a 2.5 min., debe digerirse por una hora despus de que se halla destilado toda el agua y el cido se encuentre en franca ebullicin; si es tiempo de ebullicin es de 2.5 a 3 min., se digiere entonces 1.5 h o bien hasta que la muestra se aclare. e) Se enfra y se aade la mnima cantidad de agua destilada para disolver slidos remanentes. Se engrasa ligeramente con vaselina el cuello de matraz. f) Tanto la muestra digerida como las perlas de ebullicin se transfieren al receptor del aparato destilador y se enjuaga el matraz 5 a 6 veces con porciones de 1 a 2 ml de agua destilada. g) Se coloca debajo del condensador un matraz Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 5 ml de la solucin de H3BO3 4% y de 2 a 4 gotas del indicador, procurando que el extremo del condensador quede sumergido en la solucin. 13 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN h) A la muestra digerida se le adiciona de 8 a 10 ml de la solucin de NaOHNa2S2O3. i) Se colectan 15 ml de destilado y se diluye aproximadamente a 50 ml. j) Esta solucin se valora con el HCl 0.1N. Un color violeta indica el termino de la valoracin. k) Correr un blanco bajo las mismas condiciones. l) Clculos: %N= (ml HCl ml blanco) Normalidad del HCl * 0.14007 * 100 mg de muestra

% N proteico = %N * F Cuadro 1. Factores de conversin de nitrgeno a protena cruda Alimento Trigo (harina integral) Otras harinas Macarrones Salvado Arroz Cebada, avena y centeno Maz Soya Cacahuates, nuez de brasil Almendras Otras nueces Leche y derivados Gelatina y colgeno Todos los otros alimentos Factores recomendados por la FAO/OMS (1973). Factor 5.83 5.70 5.70 6.31 5.95 5.83 6.25 5.71 5.41 5.18 5.30 6.38 5.55 6.25

5.3.3.Determinacin de protena por el mtodo de Lowry Este es el clsico y uno de los mtodos de medicin de la concentracin de protenas ms sensibles (hasta 0.2 g). El color se desarrolla con el reactivo fenol Folin despus de un tratamiento alcalino de cobre. Es 10 o 20 veces ms 14 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN sensible que los que miden en la absorcin ultravioleta a 280 nm y es 10 veces ms sensible que la reaccin de Biuret. Solucin estndar: seroalbumina de bovino 10 g/l. Con una linealidad de 1 a 10 l. Mtodo. a) 75 l de muestra. b) 750 l del reactivo, mezclar. c) Dejar de 10 a 30 minutos en reposo. d) Agregar 75 l del reactivo de Folin fenol agitar. e) Dejar en reposo mnimo 20 minutos (pero no ms de 2 horas) a temperatura ambiente. f) Leer a 750 nm. Reactivos. 2 g de NaOH, 10 g de Na2CO3, 0.1 g de tartrato de Na y K en 500 ml de agua. 0.5 g de CuSO4 .5H2O en 100 ml de agua. Mezclar 10 ml de la solucin A + 0.2 ml de la solucin B antes de ser usada. Mezclar una parte de fenol Folin (2 N) con una parte de agua antes de ser usada. 5.3.4.Determinacin de protenas por el mtodo de Biuret Este es un mtodo de estimacin rpida de protenas, pero es cerca de diez veces menos exacto que el mtodo de Lowry. Solucin estndar de albmina serica bovina: prepararla a concentracin de 10 g/l (1%), obtener diluciones de 1 a 4 l. Mtodo. a) 500 l de muestra. b) 750 l de la solucin de Biuret. Agitar. 15 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN c) Colocar en un bao a 370 c por 30 minutos. d) Leer a 540 nm. Reactivo: la solucin de Biuret se obtiene comercialmente. 5.4. DETERMINACIN DE FIBRA CRUDA

En la actualidad, la fibra no digerible de la dieta o forraje se considera un factor tan importante para mantener la salud como el suministro adecuado de nutrientes absorbibles. La fibra total en la dieta, incluye hemicelulosas, sustancias pcticas, gomas, muclagos, celulosa y lignina, as como lpidos y protenas no digeridas e impurezas ingeridas. Se debe notar que algunos de stos son materiales solubles sin estructura fibrosa. La fibra cruda es el residuo orgnico insoluble y comestible que queda despus de tratar una muestra en las condiciones descritas a continuacin. Las condiciones ms comunes son tratamientos consecutivos con petrleo ligero ebullicin con cido sulfrico diluido, ebullicin con hidrxido de sodio diluido, con cido clorhdrico diluido, con alcohol y con ter. Este tratamiento emprico proporciona una fibra que consiste principalmente en celulosa y cierta proporcin de lignina y hemicelulosa contenidas en la muestra. La falta de una clara definicin qumica de la fibra en la dieta ha impedido el desarrollo de un mtodo sencillo de anlisis de aceptacin general. En efecto el contenido de fibra total diettica se considera como la cantidad presente en el producto alimenticio medida por la tcnica analtica que se use, en lugar de ser una cantidad absoluta. a) Extraer 2g de la muestra molida con ter etlico o ter de petrleo. S el contenido de grasa es inferior al 1% puede omitirse esta etapa. Se puede usar la muestra a la que se le haya determinado el extracto etreo. b) Transferir el residuo a un vaso de 600 ml, evitando la contaminacin de la fibra con el papel o cepillo. Aadir aproximadamente 1g de asbesto preparado, 200 ml de la solucin de cido sulfrico al 1.25% hirviendo y una gota de la solucin antiespumante, agregar solo cuando sea necesario, se pueden agregar grnulos para regularizar la ebullicin. c) Colocar el vaso sobre el aparato de destilacin con la placa de calentamiento ya ajustada, hervir durante 30 min. exactamente, girando peridicamente el vaso para evitar que los slidos se adhieran a las paredes del mismo. d) Transcurrido el tiempo, retirar el vaso y filtrar el contenido como en (a) (b). 16 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN 5.4.1.Utilizando el filtro de Oklahoma (a) a) Poner en funcionamiento el sistema de succin e introducir el cedazo en el vaso, manteniendo la superficie del cedazo inmediatamente por debajo de la del lquido hasta agotar ste. b) Cuando todo el lquido haya sido eliminado, sin interrumpir la succin, ni elevar el filtro, aadir de 50 a 75 ml de agua hirviendo. Tras eliminar toda el agua, repetir otras 3 veces la operacin, utilizando 50 ml de agua cada vez. Proceder con rapidez para evitar que la superficie se deseque. c) Retirar el filtro del vaso y drenar toda el agua de la lnea de succin, elevndola por encima del nivel de trap. d) Devolver la capa de asbesto y el residuo al vaso, interrumpiendo la succin y aplicando presin positiva. e) Aadir 200 ml de la solucin de hidrxido de sodio al 1.25% y hervir durante 30 min. exactamente. Retirar el vaso y filtrar como anteriormente. Sin interrumpir la succin, lavar con 25 ml de cido sulfrico al 1.25% hirviendo y con 3 porciones de 50 ml de agua hirviendo. f) Eliminar el exceso de agua, elevando el filtro. Bajar de nuevo el filtro, introducirlo en el vaso y lavar con 25 ml de alcohol. g) Expulsar el agua de la lnea de succin, interrumpir sta y expulsar la capa de asbesto, impulsando aire a presin a travs del cedazo filtro, recogindola en la cpsula de incineracin. Proseguir como se indica en el inciso 5. 5.4.2.Utilizando el embudo Bchner California (b) a) Filtrar el contenido a travs del embudo de Bchner, recubierto de asbesto si el material a analizar est finamente dividido. b) Enjuagar el vaso con 50 a 75 ml de agua hirviendo y pasar a travs del embudo de Bchner. Repetir el lavado con 3 porciones de 50 ml de agua y succionar para secar el residuo retenido en el filtro. c) Retirar la capa formada por el asbesto y el residuo, golpeando el fondo del embudo de Bchner contra el borde del vaso, mientras se tapa la salida del cuello con un dedo y recogerla en el vaso. d) Aadir 200 ml de la solucin de hidrxido de sodio al 1.25%, a temperatura de ebullicin y hervir durante 30 min., retirar el vaso y filtrar el contenido como anteriormente. 17 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN e) Lavar, primero con 25 ml de la solucin de cido sulfrico al 1.25%, luego 3 veces con sendas porciones de 50 ml de agua y una con 25 ml de alcohol. Sacar la capa formada por el asbesto y el residuo, transferirla a una cpsula de incineracin. Proceder como se indica en el inciso 5. f) Desecar durante 2 hrs. a 130C 2C, enfriar en un desecador y pesar. Incinerar 30 min. a 600C 15C, enfriar en el desecador y pesar nuevamente. g) Calcular el porcentaje de fibra cruda como se indica a continuacin:
%Fibra Cruda = (Peso perdido durante la incineracin Peso perdido por el asbesto de la determinacin) * 100 peso de la muestra

5.4.3.Determinacin de fibra cruda sin asbesto Un nuevo mtodo ha sido desarrollado para el anlisis de fibra cruda eliminando el uso de asbesto y con ello la posible inhalacin de fibras de asbesto las cuales son reconocidas como agentes causantes de cncer. Este mtodo tambin recorta significativamente el tiempo recorrido, haciendo posible el anlisis de un numero mayor de muestras por da. Los reactivos y tiempos del procedimiento son detallados como un mtodo oficial AOAC, usado sin modificaciones. En el mtodo oficial AOAC, los asbestos son usados como ayuda de filtros por lo tanto con el uso del aparato de filtracin Holst y crisoles de vidrio desgastados el uso del asbesto es eliminado. El procedimiento para el mtodo de Holst Gehrke y AOAC. Es el mismo hasta antes de poner las muestras en la unidad de reflujo. En el mtodo antiguo las muestras eran puestas en la unidad de reflujo en intervalo de 5 min. Y en esta velocidad posterior mente podra ser filtrada colocando papel y cono de filtracin en el embudo de filtracin y el embudo en el aparato de filtracin. Cercano al final del periodo del reflujo se enciende un aspirador que ajuste el nivel del vaci de medio a 1 pulgada de mercurio. Al final del periodo de reflujo muy lentamente a travs de un vaso de precipitado se pone un embudo de filtracin la mayor parte del liquido es decantado y manteniendo lo slidos en el gas. Lavar la muestra del vaso hacia el embudo con una mnima cantidad de agua caliente destilada incremente el vaci nicamente si es agua caliente destilada o hasta que este libre de cidos, filtrando despus de cada lavada. La muestra lavada se regresa a papel filtro dentro de un vaso precipitado con papel filtro con un agente bsico caliente y se pone a reflujo 30 min. Despus del periodo de reflujo con la solucin alcalina filtrar a travs de los crisoles usando los mismos pasos de filtracin que se describieron arriba. El flujo de agua caliente del crisol para entibiarlo o calentarlo es antes de filtrar la muestra. Lavar una vez con agente cido caliente y 1 o 2 veces con agua caliente destilada. Poner los crisoles a 100C en un horno toda la noche, ponerlo al desecador y pesar. Colocar las

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MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN cenizas toda la noche a 500 o 550C. En un horno toda la noche. La perdida del empez sobre las cenizas es calculado como el porcentaje de fibra cruda. 5.4.4.Fibra cruda El tratamiento de muestras desengrasadas con cidos ntrico, tricloroactico y actico, solubiliza completamente almidn, protena y lignina y la mayor parte de la hemicelulosa, pero no afecta la celulosa, al cual se puede cuantificar despus de este tratamiento, separando por filtracin. Colocar 3 g de muestra desengrasada en un matraz baln adicionando 2 g de cido triclorocetico, 5 ml de cido ntrico y 70 ml de cido actico al 70%. Este sistema se mantiene a reflujo con agitacin constante durante 30 minutos; enseguida filtrar a travs de un filtro con fondo de vidrio poroso (puesto previamente a peso constante), lavando el residuo con agua destilada caliente hasta eliminar por completo el olor a cido actico, el filtrado se seca en estufa de vaci a 105C durante 12 horas y pesar. La fibra real se calcula restndole a la fraccin retenida el filtro el contenido de cenizas insolubles, obtenido con su calcinacin. NOTA: La correccin para cenizas solo se realiza cuando el contenido de fibra cruda es mayor del 8%. Clculos: (Pr Pv) - (Pf Pc) % FC = --------------------------------------- X 100 M Donde: % FC = Porcentaje de fibra cruda Pr = Peso del filtro con residuo (g) Pv = Peso del filtro vacio Pf = Peso del crisol a peso constante con fibra (g) Pc = Peso del crisol a peso constante M = Peso de la muestra desengrasada (g) 5.5. DETERMINACIN DE EXTRACTO ETREO (GRASA CRUDA)

Los constituyentes grasos de los alimentos son diversas sustancias lpidas. El contenido de grasa (algunas veces llamado extracto etreo, grasa neutra o grasa cruda), el cual puede ser considerado como formado de constituyentes lpidos libres es aquel que puede ser extrado por los disolventes menos polares, como fracciones ligeras del petrleo y ter etlico, mientras que los lpidos enlazados requieren disolventes ms polares para su extraccin. El contenido de lpidos libres que bsicamente consiste en grasas neutras (triglicridos) y cidos grasos libres se determina sin mayor problema en los 19 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN alimentos por extraccin del material seco y molido con una fraccin de petrleo o con ter etlico en un aparato de extraccin continua. Los metodos de extraccin directa con disolventes son: Bolton o Baukey Walker Soxhelt La extraccin completa de grasa neutra se obstaculiza por la presencia de grandes cantidades sustancias solubles en agua, como carbohidratos, glicerina y cido lctico. Otros mtodos utilizados son: Extraccin en presencia de alcoholes: causa el desprendimiento de sustancias lipoideas unidas a protenas y carbohidratos como fosfolpidos y glucolpidos. Mtodo de extraccin por solubilizacin; los cidos grasos enlazados se pueden liberar si la muestra de alimento se disuelve por completo antes de la extraccin con disolventes polares. La disolucin del alimento se logra por hidrlisis cido o alcalina. Analizador de grasa Foss-Let: es un dispositivo para medir el contenido de grasa en semillas oleaginosas, productos lcteos (previa hidrlisis con cido), grasa en productos crnicos. a) Desecar una muestra de 2g, preferiblemente en una estufa de vaco a 70C, se puede usar para esta determinacin el residuo de la del contenido de humedad por el mtodo de la estufa. b) Transferir el material deshidratado a un cartucho de extraccin con una porosidad que permita un rpido flujo del ter. c) Extraer durante unas 4 hrs. en un extractor Soxhlet funcionando a una velocidad de condensacin de 5 6 gotas por segundo, o a lo largo de la noche a una velocidad de 2 a 3 gotas por segundo. d) Eliminar el ter del matraz evaporndolo con precaucin y desecar el residuo en una estufa de aire a 100C durante 30 min. enfriar y pesar. e) Calcular el porcentaje de grasa cruda en la muestra. 5.6. DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS.

a) En las tablas de composicin de alimentos, el contenido de carbohidratos est comnmente dado como carbohidratos totales por diferencia, es decir, se resta a 100 el contenido de agua, cenizas, protenas (nitrgeno total * factor) y extracto etreo. 20 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN b) Considerando lo anterior, calcular el contenido de carbohidratos totales para las muestras analizadas. c) Determinar el valor energtico de los alimentos analizados, utilizando los valores de energa metabolizable para cada uno de los componentes de los alimentos reportados en la bibliografa, es decir, 4 Kcal/g para los carbohidratos y las protenas y 9 Kcal/g para las grasas. 5.6.1.Determinacin de Carbohidratos por el Mtodo del Fenol Sulfrico Este es un mtodo para la estimacin cuantitativa de azucares simples, oligosacaridos, polisacridos y sus derivados con grupos reductores libres o potencialmente libres. Con la ventaja de que no se requiere una hidrlisis previa. Con la desventaja de que no es aplicable a los azucares aminados, alcoholes azucarados y no lo es susceptible sensible con pentosas. El mtodo es particularmente utilizado para la estimacin de azucares separados por cromatografa en papel. Curva estndar de dextrosa con concentracin de 10 g/l con una separacin de 1 a 5l. Mtodo. a) 200 l de muestra. b) 200 l de fenol reactivo a c) Rpido y con cuidado adicionar 1 ml de h2so4 mezclar con cuidado. d) Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos. e) Dejar en un bao Maria a 30oc por 20 minutos. f) Leer a 490 nm (el color es estable a temperatura ambiente durante 2 o 3 horas. Reactivo A: a 5.5 ml de fenol (90%) adicionarle 94.5 ml de agua (obtenindose una concentracin final de 5%). 5.6.2.Determinacin de hexosas por el mtodo de la antrona Uno de los mtodos para evaluar el contenido de hexosas en materiales biolgicos es mediante la reaccin con la antrona. El principio de la reaccin es la condensacin del antrol con reactivos como el cido sulfrico obtenindose derivados del furfural de los azucares presentes. Los amino azucares y los N21 PRACTICA 1

MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN acetil-amino azucares no reaccionan con este reactivo. Los cidos hexuronicos reaccionan solamente moderadamente con este reactivo. Solucin estndar. D-galactosa y D-manosa 100 g/ml. (100 mg de galactosa y 100 mg de manosa son disueltas en 200 ml de agua. La solucin de trabajo se hace diariamente haciendo una mezcla de 1:10 a partir de la solucin stock.) Metodologa. a) 500 l de muestra. b) Dejar en un bao con hielo 45 minutos. c) Adicionar goteando 1 ml del reactivo a. Agitar en el bao Stopper tubes. d) Dejar 8 minutos en bao de agua a 92oc. e) Detener la reaccin metiendo los tubos en el bao con hielo. f) Leer a 620 nm

6. INFORME DE RESULTADOS a) Presentar en forma de tabla, con unidades, los resultados de las determinaciones hechas a los alimentos analizados, incluyendo en esta tabla los valores establecidos para cada determinacin en las Normas Oficiales y en la bibliografa consultada. b) Presentar en forma de tabla, las determinaciones del valor energtico de los alimentos analizados, as como los valores que se presentan en la bibliografa. c) Discutir, de manera integral, los resultados obtenidos, tomando en cuenta los siguientes aspectos: Composicin general respecto a lo reportado en la bibliografa. Puntos crticos en cada una de las determinaciones. Fuentes de error en las determinaciones. Utilidad del anlisis aproximado de alimentos.

d) Elaborar sus conclusiones de la prctica en base a la discusin y anlisis de resultados y a los objetivos planteados.

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MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN 7. BIBLIOGRAFA a) Association of Oficial Anlytical Chemists. 1990. Official Methods os Analysis, 15a. Ed., Association of Oficial Anlytical Chemists, Inc., USA, 342. b) Dubois, M., K. A. Gilles, J.K. Hamilton, P. A. Rebers and F. Smith, Anal. Chem. 28, 350 (1956). c) Hart-Fisher. d) Herriott, R. M., Proc. Soc. Exp. Biol.. Med. 46, 642 (1941). e) Keleti, G., Lederer, W. Handbook of Micromethods for the Biological Sciences. f) Kirk, R, Sawyer, R. Egan, H. Composicin y Anlisis de Alimentos de Pearson 9a Ed. Ingles 2a Espaol CECSA, Mxico, D. F. g) Lees, R. S/a. Anlisis de los alimentos. mtodos analticos y de control de calidad. Acribia Zaragoza, Espaa. h) Lowry, O. H., N. J. Rosenbrough, A. L. Farr and R. J. Randall, J. Biol. Chem. 193, 265 (1951). i) Nowotny, A., Basic Exercises in Immunochemistry, p, 99m SpringerVerlag, New York, 1969. j) Pomeranz, Y and Melona, C. E. 1987 Food Analysis. Theory and Practice. 2nd Ed. Van Nostrand Reinhold Company New York, USA. 573 768. k) Williams S., Oficial Methods OF Analisis of the Association of Oficial Analytical Chemists, 14 th. Ed., A.O.A.C. Inc., Arlington, Virginia, 1984. l) Winton m) Van de Kamer, J.H. & L. Van Ginkel. 1952. Rapid determination of crude in cereals. Cereal Chemistry 29: 239-251.

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MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Cuadro 2. Indicadores cidos y bsicos Indicador Azul de timol Purpura de m-cresol 4-Dimetilaminoazobenceno Azul de bromofenol Rojo congo Anaranjado de metilo Verde de bromo cresol Indicador de mixto 5 Rojo de metilo Lacmoide Prpura de bromocresol Rojo de bromofenol Azul de bromotimol Rojo fenol Rojo neutro Rojo de cresol Prpura de m-cresol Azul de timol Fenolftalena timolftalena Amarillo de alizarina gg Azul epsilon Nivel de pH 1.2-2.8 1.2-2.8 2.9-4.0 3.0-4.6 3.0-5.2 3.1-4.4 3.8-5.4 4.4-5.8 4.4-6.2 5.0-8.0 5.2-6.8 5.2-6.8 6.0-7.6 6.4-8.2 6.8-8.0 7.0-8.8 7.4-9.0 8.0-9.6 8.2-9.8 9.3-10.5 10.0-12.1 12.0-13.0 Cambio de color Rojo-amarillo Rojo-amarillo Rojo-naranja amarillento Amarillo-rojo violceo Azul violceo-naranja amarillento Rojo-naranja amarillento Amarillo-azul Rojo violceo-verde Rojo violceo-naranja amarillento Rojo-azul Amarillo-prpura Naranja amarillento-prpura Amarillo-azul Amarillo-rojo Rojo azuloso-naranja amarillento Amarillo prpura Amarillo-prpura Amarillo-azul Incoloro-rojo violceo Incoloro-azul Amarillo claro-naranja rojizo Naranja-violceo

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MANUAL DE PRCTICAS DE FISIOLOGA DE LA NUTRICIN Preparacin de soluciones para anlisis por titulacin To cianato de amonio NH4SCN, 76.12 0.1 N = 0.1 M = 7.612 g por litro cido clorhdrico HCl, 36.46 0.1 N = 0.1 M = 3.646 g por litro. Yodo I, 126.90 0.1 N =0.1 M = 12.69 g de I + 18 g de KI por litro. Dicromato de potasio K2Cr2O7, 294.24 0.1 N = M/60 = 4.903 g por litro. Yodato de potasio KIO3, 214.02 Normalmente depende de la reaccin que se utilice, pero en general 0.1 N = M/60. Cuando la acidez de la reaccin es superior a 4 N, 0.1 N de yodato = M/40. Permanganato de potasio KMnO4, 158.0 6 N = 0.02 M = 3.11 g por litro. To cianato de potasio KSCN, 97.185 0.1 N = 0.1 M = 9.7185 g por litro. Nitrato de plata AgNO3, 169.9 0.1 N = 0.1 M = 16.99 g por litro. EDTA sdico C10N2Na2O8. H2O, 372.5 0.05 M = 18.61 g por litro. Hidrxido de sodio NaOH, 40.00 0.1 N = 0.1 M = 4.00 g por litro. To sulfato de sodio Na2S2O3.5H2O, 248.2 0.1 N = 0.1 M = 24.82 g por litro. cido sulfrico H2SO4, 98.08 0.1 N = 0.05 M = 4.904 g por litro.

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