Tcnicas de Cultivo In Vitro Aplicadas na Mamoneira

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ISSN 0103-0205 Setembro, 2008 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Centro Nacional de Pesquisa de Algodo

Documentos 194
Tcnicas de Cultivo In Vitro Aplicadas na Mamoneira

Julita Maria Frota Chagas Carvalho Silvany de Sousa Arajo

Campina Grande, PB. 2008

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Exemplares desta publicao podem ser solicitados : Embrapa Algodo Rua Osvaldo Cruz, 1143 Centenrio Caixa Postal 174 CEP 58.428-095 - Campina Grande, PB Telefone: (83) 3182-4300 Fax: (83) 3182-4367 sac@cnpa.embrapa.br http://www.cnpa.embrapa.br Comit de Publicaes Presidente: Carlos Alberto Domingues da Silva Secretrio: Valter Freire de Castro Membros: Fbio Aquino de Albuquerque Giovani Greigh de Brito Joo Luiz da Silva Filho Mira Milani Maria da Conceio Santana Carvalho Nair Helena Castro Arriel Valdinei Sofiatti Wirton Macedo Coutinho Supervisor Editorial: Valter Freire de Castro Reviso de Texto: Maria Jos da Silva e Luz Tratamento das Ilustraes: Geraldo Fernandes de Sousa Filho Capa: Flvio Trres de Moura/Srgio Cobel da Silva Editorao Eletrnica: Geraldo Fernandes de Sousa Filho 1 Edio 1 impresso (2008) 1.000 exemplares Todos os direitos reservados A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610)
EMBRAPA ALGODO (Campina Grande, PB) Tcnicas de Cultivo In Vitro Aplicadas na Mamoneira, por Julita Maria Frota Chagas Carvalho e Silvany de Sousa Arajos. Campina Grande, 2008. 23p. (Embrapa Algodo. Documentos, 194) 1. Planta. 2. Tecido vegetal. 3. Propagao In Vitro. I. Carvalho, J.M.F.C. II. Arajo, S. de S. III. Ttulo. IV. Srie. CDD: 571.62

Embrapa 2008

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Autores
Julita Maria Frota Chagas Carvalho
Ph.D. Eng. Agrn. da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenrio, CEP 58.428-095, Campina Grande, PB. E-mail: julita@cnpa.embrapa.br

Silvany de Sousa Arajo

Estudante da Universidade Estadual da Paraba, Estagiria da Embrapa Algodo E-mail: ny_arajo@hotmail.com

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Apresentao

O cultivo de tecidos de importncia fundamental na acelerao dos programas de melhoramento gentico vegetais da Embrapa algodo. A aplicao das tcnicas de cultura de tecidos na mamoneira torna-se indispensvel, tendo em vista a importncia da cultura da mamona para o Nordeste brasileiro e diversas pesquisas vm sendo desenvolvidas, visando aprimorar os conhecimentos das tcnicas de cultivo de tecido in vitro aplicadas a mamoneira, que constituir sem dvida, uma importante ferramenta para o melhoramento vegetal, visto que possibilita a obteno de clones com caracteres agronmicos desejveis.

Napoleo Esberard de Macdo Beltro Chefe Geral da Embrapa Algodo

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Sumrio

Tcnicas de Cultivo In Vitro Aplicadas na Mamoneira .............................. 1. Introduo .................................................................................... 2. Aplicaes do Cultivo de Tecidos .................................................... 2.1. Cultivo In Vitro de anteras ........................................................ 2.2. Crioconservao de sementes ................................................... 2.3. Propagao In Vitro da mamoneira ............................................ 2.4. Cultivo de embries zigticos ou embries imaturos ..................... 3. Fatores que podem influenciar no cultivo In Vitro ............................... 3.1. Seleo do explante ................................................................ 3.2. Desinfeco do explante .......................................................... 3.3. Contaminao dos explantes .................................................... 3.4. Meios de cultivos ................................................................... 3.5. Uso de Fitorreguladores ........................................................... 4. Concluses ................................................................................... 5. Referncias Bibliogrficas ................................................................

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Julita Maria Frota Chagas Carvalho Silvany de Sousa Arajo

1. Introduo
O cultivo de tecidos pode ser definido como um conjunto de tcnicas que permitem a cultura de rgos, tecidos, clulas e protoplastos em condies asspticas, empregando meios nutritivos artificiais. Essas tcnicas podem ser aplicadas para a obteno de plantas livres de patgenos, propagao massiva de plantas, conservao de germoplasma, melhora por mutagnese in vitro e engenharia gentica (PIZA; PINHO, 2002). As tcnicas de cultura de tecidos tm sido empregadas de diferentes formas no desenvolvimento de cultivares superiores de plantas, podendo oferecer novas alternativas aos programas de melhoramento em suas diferentes fases e, muitas vezes, oferecem solues nicas (FERREIRA, et al., 1998). A mamoneira (Ricinus communis L.), planta de alto valor econmico, tem nas sementes, como produtos finais processados, o leo e a torta. O primeiro, utilizado na medicina, na fabricao de filtros hospitalares de hemodilise, de prtese ssea de resina, de silicones especiais e como matria-prima para produo de tintas especiais, sabo, vernizes, nylon e cosmticos, entre cerca de, aproximadamente, 650 produtos, que apresentam a vantagem de serem biodegradveis e de biomassa renovvel. A torta bastante usada como fertilizante, podendo ser utilizada para rao de bovinos, desde que passe por um processo de desintoxicao (GONALVES et al., 2005). Segundo Chierice e Claro Neto (2001), a partir do leo da mamona pode-se

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obter tambm o diesel vegetal, que substitui o leo diesel derivado do petrleo utilizado como combustvel. Para o Brasil, o leo da mamona pode ser considerado uma matria-prima estratgica, pois, alm de seu potencial qumico e energtico, os lubrificantes e fluidos aeronuticos j so todos sintetizados a partir de suas molculas. Tendo em vista a importncia da cultura da mamona para o Nordeste brasileiro, diversas pesquisas vm sendo desenvolvidas, visando aprimorar os conhecimentos das tcnicas de cultivo de tecido in vitro aplicadas a mamoneira, que constituir sem dvida uma importante ferramenta para o melhoramento vegetal, visto que possibilita a obteno de clones com caracteres agronmicos desejveis.

2. Aplicaes do Cultivo de Tecidos

Diversas tcnicas do cultivo de tecidos in vitro vm sendo aplicadas cultura da mamoneira, sendo estas, de grande importncia para o melhoramento da espcie e o desenvolvimento de novas cultivares.

2.1. Cultivo In Vitro de anteras

Entre as tcnicas de cultivo in vitro, a cultura de anteras apresenta-se como uma ferramenta de grande utilidade em programas de melhoramento, principalmente por reduzir o tempo necessrio para a obteno de linhagens homozigticas, substituindo as inmeras geraes de autofecundao necessrias no processo convencional e permitindo o estudo de mutaes recessivas, visto que indivduos haplides e duplo-haplides, por se constiturem de apenas um complemento cromossmico, no apresentam problemas de dominncia e recessividade (BAJAJ, 1984; FERNANDES, 1987). Segundo Peters et al. (1998), as plantas haplides podem ser obtidas de duas maneiras: por andrognese direta ou por andrognese indireta. Na andrognese direta, o micrsporo comporta-se como um zigoto e passa por vrios estdios de embriognese, semelhante ao que ocorre in vivo. Os embries, principalmente no estdio globular, so liberados, os cotildones desenvolvem-se e as plantas emergem das anteras de 4 a 8 semanas. Na andrognese indireta, os micrsporos, em vez de passarem pela embriognese, dividem-se algumas vezes,

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formando calos, os quais emergem atravs da parede da antera. Normalmente a regenerao de plantas via calo se d com maior freqncia. A maior dificuldade do uso da cultura de antera nas espcies, consiste na adequao do meio de cultura apropriado Para que ocorra a diviso celular, o processo de ativao e desativao dos genes, no momento e local apropriado necessrio ajustes na concentrao e tipo de reguladores de crescimento, uso de vitaminas e carvo ativado (INGRAM et al., 2000; SALOMOM, 2003; TEIXEIRA; TORRES, 1998). Souza et al. (2002) constatou a eficincia do 2,4D na induo de calos in vitro, a partir de anteras de mamona. Vargas (2006) tambm observou que os gros de plen de mamona apresentaram alto percentual de viabilidade polnica na antese. O maior percentual de gros de polens viveis obtido das cultivares IAC-80 e Cafelista; no entanto, mesmo apresentando diferenas significativas das cultivares AL-Guarany 2002 e AL-Preta, so igualmente consideradas com bom potencial de viabilidade. Sendo, portanto, possvel a utilizao de todas as cultivares analisadas na induo de fertilizao em programas de melhoramento.

2.2. Crioconservao de sementes

A crioconservao em nitrognio lquido um mtodo potencialmente estudado para reduzir a taxa de deteriorao, aumentando assim o tempo de armazenamento das sementes, assegurando a preservao das fontes genticas da planta, alm de reduzir os custos e evitar a perda da viabilidade (STANWOOD; BASS, 1981; STANWOOD, 1995). Medeiros e Cavallar (1992) definem crioconservao em nitrognio lquido como sendo a preservao de materiais biolgicos a baixas temperaturas (entre -160 e -196C), nas quais todos os processos metablicos so essencialmente paralisados e mantidos em estado latente, proporcionando a preservao dos materiais a longo prazo. Os outros mtodos de conservao somente adiam a deteriorao por um perodo de tempo determinado e especfico, de acordo com o material e a espcie em questo. Outras vantagens da crioconservao esto relacionadas com: 1) o pequeno espao a ser ocupado por um banco de germoplasma mantido em nitrognio lquido; 2) a simplicidade da manuteno, bastando manter-se o nvel de

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nitrognio lquido nos botijes, reabastecendo-o a cada 40-60 dias e 3) o baixo custo do armazenamento, uma vez que no exige sistema de refrigerao nem de eletricidade (ALMEIDA et al., 2002). Lopes et al. (2006), obtiveram a crioconservao de eixos embrionrios de mamona com teor de gua limite entre 4 a 7% b.u.(baixa umidade). Almeida et al. (2002) verificou que os melhores resultados de qualidade fisiolgica das variedades de mamona Nordestina e Pernambucana foram obtidos aos 30 dias de crioconservao, tanto no vapor (-176 oC) como na imerso (-196 oC) em nitrognio lquido. Alm disso, as sementes das variedades de R. communis estudadas, podem ser crioarmazenadas com a umidade de colheita em torno de 6% b.u.

2.3. Propagao In Vitro da mamoneira

A propagao vegetativa utilizando tcnicas de cultura de tecido pode ser um valioso instrumento na propagao clonal rpida de mudas em larga escala. Este mtodo vem sendo extensamente utilizado para a propagao clonal e eliminao de vrus em grande nmero de espcies, alm da introduo de novas variedades, previso de novos gentipos, formao de bancos de germoplasma, previso de estoque de plantas sadias e atendimento outras reas da pesquisa (HARTMANN; KESTER, 1983). A aplicao da micropropagao destaca-se pela hibridizao e desenvolvimento de novas cultivares, na recuperao de substncias farmacuticas, na multiplicao segura de cultivares desejveis, na propagao rpida com alto coeficiente de multiplicao, e como auxiliar na salvaguarda do patrimnio gentico de plantas ameaadas pela explorao humana (SIMES, 1988). Para o sucesso de mtodos de micropropagao in vitro necessria: a seleo dos explantes adequados, estabelecendo-se condies de desinfeco e cultura; o estabelecimento de condies fsicas e fisiolgicas de desenvolvimento dos explantes e o enraizamento das partes areas formadas aps subcultivos sucessivos formando a planta completa (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990). Carvalho et al. (2005), utilizaram o meio MS (Murashige Skoog) para a regenerao do explante eixo embrionrio de sementes de mamona e observou

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que possvel propagar sementes de mamona a partir do explante eixo embrionrio, concluram tambm que aclimatao das plntulas regeneradas vivel. Aires (2007), constatou que o complexo vitamnico contendo sais do meio MS acrescidos de vitaminas do meio B5 (GAMBORG et al., 1968), adicionado de sacarose apresentou um efeito diferencial e promissor no superbrotamento in vitro em explantes de gema apical do gentipo de mamona BRS Nordestina. Arajo et al. (2008), conseguiram o superbrotamento da cultivar BRS Paraguau, utilizando o meio MS bsico, suplementado com a combinao dos reguladores TDZ + GA3, com 45% de glicose

2.4. Cultivo de embries zigticos ou embries imaturos

Segundo Carvalho e Vidal (2003), o cultivo de embries zigticos ou embries imaturos usado para o co-cultivo de hbridos entre diferentes espcies, tornando possvel, a certas cultivares, a transferncia de genes desejveis. A tcnica de cultura de embries tem se expandido e ensejado importantes contribuies em estudos bsicos da fisiologia do desenvolvimento do embrio, em programas de melhoramento gentico, para recuperao de hbridos de interesse de cruzamentos incompatveis, bem como para a quebra de dormncia de sementes, observada em algumas espcies (FERREIRA et al., 1990). Deccetti (2000) afirma que, atravs do cultivo in vitro de sementes ou embries, condies ambientais fundamentais, como disponibilidade de gua, temperatura adequada, luminosidade e composio atmosfrica so apropriadas para que o processo de germinao ocorra; alm disso, a presena de reguladores de crescimento e de fontes exgenas de carboidratos, no meio de cultura, possibilita contornar fatores que inibem a germinao de diversas sementes, como a presena de inibidores qumicos, imaturidade de embries e pobre acmulo de reservas nutritivas, aumentando, assim, a percentagem de germinao ou fazendo com que o processo seja mais efetivo, rpido e uniforme. Carvalho et al. (2006a), conseguiram regenerar 88 acessos do banco ativo de germoplasma de mamona da Embrapa Algodo, por meio do cultivo in vitro de embries zigticos de sementes de mamona (Figura 1) Carvalho et al. (2005) tambm regeneraram eixos embrionrios que apresentavam at dois por cento de germinao no campo (Figura 2).

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Fig. 1. Regenerao in vitro de embries zigticos de sementes de mamona

Fig. 2. Cultivo in vitro de embries imaturos a partir de sementes secas de mamona.

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3. Fatores que podem influenciar no cultivo In Vitro

Diversos fatores podem influenciar o xito da cultura de tecidos in vitro, entre os quais destacam-se:

3.1. Seleo do explante:

O sucesso no estabelecimento da cultura de clulas, rgos ou tecidos in vitro depende, em geral, da seleo do explante (CARVALHO, 2001). Cada espcie ou variedade se comporta de maneira diferente em funo da idade da planta e suas condies prvias no campo, a poca da coleta, o tipo de explante, a posio que este ocupa na planta e uma larga lista de aspectos prprios do material vegetal, que dificilmente podem ser controlados em sua totalidade. Alm disso, o material cultivado in vitro tem que estar livre de microrganismos que possam interferir no processo (PIEREK, 1988).

3.2. Desinfeco do explante

O processo de desinfeco comea com os pr-tratamentos aplicados planta matriz, principalmente para combater microorganismos, uma etapa essencial, na qual podem ser utilizadas diversas substncias com ao germicida. Entre os mais utilizados esto o etanol, o hipoclorito de sdio e o de clcio, cloreto de mercrio, cido clordrico, perxido de hidrognio, entre outros. Alm desses, os habituais detergentes de cozinha, bem como o Tween 20, podem ser misturados soluo desinfestante para facilitar o contato dos agentes esterilizantes com o tecido, reduzindo a tenso superficial (WILLADINO; CMARA, 2007).

3.3. Contaminao dos explantes

Um dos maiores problemas que influenciam na cultura de tecidos diz respeito contaminao bacteriana e fngica; alm dessas contaminaes superficiais, so freqentes em explantes derivados de plantas cultivadas no campo contaminaes presentes no interior dos tecidos, conhecidas como contaminaes endgenas, (CARVALHO et al., 2006b). A assepsia do material vegetal de fundamental importncia na micropropagao e, sendo efetuada com sucesso, evitar contaminao no meio de cultura por

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fungos e bactrias, que ocasionam perdas do material vegetativo e do meio de cultura (RODRIGUES et al., 2003). Segundo Scalize (2003), necessrio enorme cautela em relao assepsia, desde o corte do material a campo at o manuseio na cmara de fluxo laminar.

3.4. Meios de cultivos

Alm de servir como suporte para o explante, o meio de cultivo tambm deve suprir tecidos e rgos cultivados in vitro com nutrientes necessrios ao crescimento. Basicamente, o meio de cultivo fornece macro e micronutrientes e carboidrato (normalmente sacarose) para substituir o carbono que, em geral, a planta fixa da atmosfera pela fotossntese. Para acelerar o crescimento, comum incluir componentes orgnicos como vitaminas, aminocidos e reguladores de crescimento (CARVALHO, 2001). H inmeras formulaes dos meios de cultura, no existindo um meio padro, embora o mais amplamente difundido seja o meio idealizado por Murashige e Skoog, conhecido mundialmente como meio MS. A consistncia do meio de cultura pode ser ajustada pela adio de agentes gelificantes. Os cultivos em meio lquido devem ser mantidos sob agitao para assegurar a aerao dos explantes; outra possibilidade inocular o explante sobre um suporte de algodo ou sobre pontes de papel, evitando que fiquem submersos (WILLADINO; CMARA, 2007).

3.5. Uso de Fitorreguladores

Os fitorreguladores so de fundamental importncia para a multiplicao in vitro de vrias espcies. Sua adio em meios nutritivos tem como objetivo principal suprir possveis deficincias dos teores endgenos de hormnios nos explantes que se encontram isolados das regies produtoras na planta matriz; alm de estimular respostas como alongamento ou multiplicao da parte area (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Os fitohormnios so classificados em cinco grupos: auxinas, citocininas, giberelinas, etileno e inibidores. Os reguladores de crescimento mais utilizados so auxinas, citocininas e giberelinas. A escolha do fitorregulador a ser utilizado na cultura in vitro depender: do tipo de morfognese desejada; do seu nvel

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endgeno no explante no momento da exciso; da capacidade do tecido sintetizar o regulador durante o perodo do cultivo e da possvel interao entre os fitohormnios endgenos e aqueles adicionados ao meio (SANTOS, 2003).

4. Concluses
A aplicao das tcnicas de cultura de tecidos in vitro na mamoneira torna-se indispensvel, sendo utilizadas em uma ou outra etapa do melhoramento, oferecendo assim, novas alternativas aos programas de melhoramento em suas diferentes fases e, muitas vezes, oferecem solues nicas. Alguns fatores podem influenciar no cultivo in vitro da mamoneira, como o tipo de explante utilizado, as tcnicas de desinfestao dos explantes, a ocorrncia de contaminao destes, os meios de cultivos utilizados e os fitorreguladores adicionados a estes meios.

5. Referncias Bibliogrficas
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