PRACTICA N 6 RECUPERACIN DE VULOS DE OVARIOS DE VACUNOS

Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas, Programa Profesional de Ingeniera Biotecnolgica, Campus U.C.S.M. Arequipa, PER. I.- RESUMEN En esta prctica usaremos unos ovarios de vaca para obtener vulos , retiraremos estos y adems reconoceremos los vulos en sus diferentes fases mediante el microscopio y estereoscopio. Usaremos dos mtodos de extraccin (aspiracin y diseccin) . Evaluaremos los vulos si estn aptos para fertilizar o tambin se puede madurar in vitro. II.- ASTRACT In this lab we will use a cow ovaries for eggs, we will remove these and also recognize the eggs at different stages through the microscope and stereoscope. We use two methods of extraction (suction and dissection). Evaluate whether the eggs are capable of fertilizing or you can mature in vitro. III.- INTRODUCCION

La baja disponibilidad de material biolgico y la maduracin del ovocito tambin involucra transformaciones a nivel del citoplasma que prepara a la clula para soportar la fecundacin y el desarrollo embrionario temprano. La biotecnologa reproductiva para asegurar el tener descendencia con caractersticas determinadas justifican la produccin de Embriones in Vitro tambin el uso de ovocitos para una reproduccin asexual como en la clonacin lo cual hace necesaria la obtencin de ovocitos a travs de diferentes mtodos. Una de las formas ms sencilla y econmica de obtener ovocitos es a travs de la aspiracin folicular de ovarios, utilizando una aguja y jeringa, cuyo porcentaje de recuperacin de ovocitos, es relativamente ms alta en vacunos que los obtenidos en otras especies. El otro mtodo es obtener los ovocitos a travs de la diseccin de los ovarios.
(Basurto, 1997). La utilizacin del mtodo cientfico fortalece la formacin metodolgica del estudiante universitario para el planteamiento y solucin de problemas singulares, particulares y universales de la naturaleza y la sociedad, cada vez con mayor interdependencia y dinamismo. En este contexto, como respuesta a la demanda de incrementar la produccin pecuaria de las zonas tropicales, comnmente se ha recurrido a la introduccin de bovinos especializados en la produccin de leche, provenientes de zonas templadas (Hernndez et al., 1982). El resultado ha sido una alta mortalidad tanto en adultos como en terneros y una mala eficiencia reproductiva, con beneficios muy bajos para ser rentables (Wilkings et al., 1979; Morales et al., 1981; Morales et al., 1983); todo ello a consecuencia de la inadaptabilidad de estas razas a las difciles condiciones del medio, con una capacidad de pastoreo muy baja y una constante prdida de peso, por lo que los rendimientos son menores que los registrados en sus zonas de origen (Koppel et al., 1984). Por lo tanto, se ha descartado su crianza en forma

pura, y en lugar de esto, se est utilizando en mayor proporcin la inseminacin artificial con semen de razas lecheras para lograr un ganado mestizo adecuado al sistema de doble propsito. IV.- OBJETIVOS Identificar vulos (oocitos) que se recuperar del folculo del ovario Evaluar los vulos para diferenciar sus estados

V.- MARCO TEORICO Las hembras bovinas adultas pueden tener patrones de 2 3 ondas foliculares por ciclo estral. En ambos patrones, la emergencia de la primera onda folicular ocurre el da de la ovulacin (da 0). La emergencia de la segunda onda ocurre el da 9 10 para ciclos con dos ondas y el da 8 9 para ciclos de 3 ondas. La emergencia de la tercera onda ocurre en el da 15 16. El periodo gestacional, prepuberal y de anestro estacional estn caracterizados por pulsos de FSH regulares y peridicos y por la emergencia de ondas foliculares no ovulatorias. La maduracin del ovocito es un fenmeno complejo durante el cual el ovocito avanza del diploteno (profaseI) a metafase II (maduracin nuclear). La transicin del estado de diploteno a la metafase es denominado diacinesis. El ovocito reanuda la meiosis en respuesta al pico ovulatorio de LH o al retirar el ovocito del folculo. La maduracin del ovocito tambin involucra transformaciones a nivel del citoplasma que prepara a la clula para soportar la fecundacin y el desarrollo embrionario temprano (maduracin citoplasmtica). La maduracin nuclear por s sola, no garantiza el subsiguiente desarrollo embrionario. La replicacin exitosa en laboratorio de los procesos involucrados en la maduracin ovocitaria, nuclear y citoplasmtica, es clave para desarrollar programas de produccin in vitro de embriones. Comprender los mecanismos que repercuten sobre la capacidad de desarrollo de los ovocitos es un paso imprescindible para poder aprovechar el potencial de uso de donadoras prepberes en dichos programas, lo cual tendra un gran impacto en la aceleracin de la ganancia gentica. FOLICULOS Y OOCITOS Los ovarios de una hembra bovina al nacer tienen aproximadamente 200 mil oocitos primarios que tericamente al ser fertilizados pueden dar origen a un ser (Callesen y Greve, 1983). Sin embargo, slo un oocito es eliminado desde un folculo cada 21 das. Como se observa, los ovarios contienen 1.000 veces ms oocitos que los que maduran y ovulan durante la vida productiva de un animal.

MEDIOS DE CULTIVO Existe una gran variedad de medios de cultivo (TCM199), PBS, HAMF10, etc.) que pueden utilizarse para recolectar oocitos, el ms usado actualmente es el Dulbecco's fosfato buffer salino (PBS) (Gibco, Grand Island N.Y.). Este medio tiene la particularidad que su buffer es fosfato lo que lo hace ms estable a los cambios de pH. Adems, es un medio de fcil preparacin, sus componentes son encontrados sin mayores problemas en el comercio y son de relativo bajo costo. Comnmente se habla de 2 tipos de medios de cultivos. El medio de coleccin o de lavado (flushing) y el medio de mantencin (Cuadro 1). La diferencia fundamental entre ambos radica en la cantidad de protena agregada,el primero posee 12% de protena (suero fetal, albmina bovina, etc.), en cambio el medio de mantencin posee 1020% de protena y a veces se enriquece con glucosa (1 mg/ml) y piruvato de sodio (0,33 mM). COLECCION DE OOCITOS Todo el equipo (catter, jeringas, material de vidrio, etc.) que se usa en la coleccin y transferencia de embriones, se lava cuidadosamente con agua destilada y se esteriliza adecuadamente. En un principio los oocitos eran colectados haciendo un lavado del tero una vez que la donante era sacrificada. Posteriormente se us el Mtodo quirrgico a travs de la lnea media con el animal bajo anestesia general (Rowson y col 1969), el cual es impracticable en terreno ( no se discutir en este trabajo), y actualmente se utiliza el mtodo no quirrgico a travs de la vagina. Este ltimo puede realizarse por medio de un circuito cerrado de circulacin (por gravedad) o por aspiracin interrumpida (Rowe y col, 1976; Rowe y col, 1980b). Para la coleccin no quirrgica de oocitos se han inventado variedades de instrumentos (Drost y col 1976; Eldensen y col 1976; Greve y col 1977; Rowe y col 1976) pero los ms comnmente usados son los catteres Foley de 2 vas y el modelo Neustadt/Aish (Shneider y Hahn 1979). Las diferencias fundamentales entre ellos redica en el largo y en la consistencia. El modelo Neustadt/Aish es 27 cm. ms largo y es ms duro que el Foley. BSQUEDA, IDENTIFICACION Y CLASIFICACION DE LOS OOCITOS Cuando los lavados han sido colectados en probetas la parte superior del medio se extrae por medio de sifonaje dejando aproximadamente 100 a 200 ml en el fondo. Este medio restante se coloca posteriormente en placas petri y se observa bajo el estereoscopio, generalmente usando un aumento de 10x. En el caso de usar bulbos la extraccin del medio a observar se realiza a la inversa (Fig. 5). Los oocitos que se encuentran son retirados de la placa con una pipeta Pasteur o cnula plstica y colocados en un medio de cultivo fresco. Posteriormente se observan a mayor aumento (40x 70x) para ser identificados y clasificados. Existen diferentes tcnicas para clasificar los oocitos en viables y no viables, por ejemplo tinciones vitales (Kardymowicz, 1972), cultivos (Renard y col 1980), tcnicas que miden el metabolismo (Schilling y col 1979) etc., pero estas son difciles de realizar en condiciones de terreno. Actualmente la forma ms popular de clasificacin se basa en una apreciacin subjetiva, utilizando el microscopio estereoscpico. IDENTIFICACION Y CLASIFICACION MORFOLOGICA A TRAVS DEL ESTEREOSCOPIO.

IDENTIFICACION La identificacin se realiza tomando como base el estado de desarrollo de los oocitos (para mayores detalles ver Lindner y Wright 1983). En un lavado (da 59) se pueden encontrar oocitos de diferentes estados, por ejemplo (Fig. 6): Oocito no fertilizado Zona pelcida vaca Oocitos de 8 clulas: 1 x 8 Oocitos de 16 clulas: 1 x 16 Mrula Mrula compacta Blastocisto Blastocisto expandido Blastocisto eclosionado o por eclosionar.

Algunos ejemplos de oocitos bovinos de 7-8 das de edad. MATERIALES Y MTODOS

Recoleccin de ovarios en animales postmrtem, se colectaron muestras procedentes del mercado avelino.

Se preparo placas petri para la recoleccin de los folculos; con jeringas se extrajeron estos. Se usaron 2 mtodos : Mtodo de Aspiracin: Mtodo por diseccin: Se someten a este procedimiento folculos Cortar cuidadosamente el folculo superficiales visibles con jeringas de 5-10 cc y seleccionado y dejar el contenido en la agujas calibre 18 G. placa, observar.

IX.- CONCLUSIONES Tanto las tcnicas de aspiracin como las de corte seriado son efectivas para la recuperacin de ovocitos. .En los animales de ms de ocho aos de edad, disminuye la recuperacin por efecto de la edad. Algunos animales con defectos como quistes pueden carecer de ovocitos. X.- BIBLIOGRAFIA http://www.institutomarques.com/fiv_transferencia_embriones.html

http://tarwi.lamolina.edu.pe/~emellisho/Reproduccion_archivos/Practica%202eval-ovocitos.pdf http://www.unjbg.edu.pe/coin2/pdf/c&d_9_art_28.pdf http://nuevo.sefertilidad.com/recomendaciones/22.pdf

CUESTIONARIO 1. Indicar otras mtodos de recuperacin de ovocitos. Mtodo de Corte Seriado: Los ovarios se transportaron al Laboratorio en solucin salina suplementada con antibiticos. En el Laboratorio se hace remocin del tejido adyacente, del cuerpo lteo y de sangre con lavados de solucin salina. El mtodo de corte seriado consiste en colocar cada uno de los ovarios en placas petri que contienen la solucin, se corta la superficie y el interior de los ovarios a lo largo y a travs de ste con cuchi l las separadas por 2mm aproximadamente. 2. Que aspectos deberan de tomarse en cuenta ovocitos. para hacer la clasificacin de

completamente rodeados por 3 capas clulas del cumulus con citoplasma homogneo, eventualmente granulado ovocitos rodeados con < 3 capas de clulas del cumulus y citoplasma generalmente homogneo Ovocitos maduros

3. Indique la clasificacin, diferencias y las caractersticas caractersticas de los ovulos en cada una de sus etapas.

de lo folculos y las

Foliculognesis y Ovognesis Foliculognesis es el proceso de crecimiento que experimenta el folculo desde el momento que deja la poblacin de reserva, constituida por folculos primordiales, hasta su ovulacin o atresia. Los folculos son reclutados continuamente hasta que la reserva se termina. Los folculos se clasifican en: Folculos primordiales Folculos preantrales (folculos primarios y secundarios) Foliculos antrales y preovulatorios.

Folculos primarios

En el bovino son activados aproximadamente al da 140 de la gestacin Los ovocitos tienen un tamao de 30 um y esta rodeado de clulas de la granulosa cuboidales Los ovocitos de folculos primordiales y primarios no se observan diferencias de tamao. o Folculos secundarios

Aparecen al da 210 de gestacin en la bovino, cuando las clulas foliculares estn en plena divisin mittica. Los folculos secundarios contienen aproximadamente 2 capas de clulas y el ovocito mide entre 50 a 60 um de dimetro o Folculos terciarios

Los folculos terciarios o antrales son caracterizados por la presencia de cavidad conocida como antro. El antro es una cavidad llena de fluido folicular. El antro es detectado cuando el folculo tiene entre 0,12 y 0,28 mm de diametro. Los primeros folculos antrales aparecen alrededor de da 230 de gestacin en el bovino, estos presentan una extenso nmero de clulas que se unen por uniones gap para transferir nutrientes y seales de regulacin en el ovocito y la clula de la granulosa.

4. Insique y seale con imgenes los vulos que deben de estar listos para una fertilizacin de embriones In vitro. (1) completamente rodeados por 3 capas clulas del cumulus con citoplasma homogneo, eventualmente granulado (2) ovocitos rodeados con < 3 capas de clulas del cumulus y citoplasma generalmente homogneo, (3) ovocitos denudados y citoplasma con apariencia irregular con zonas oscuras y (4) ovocitos con cumulus expandido y/o citoplasma irregular. Los COCs se clasificaran como viables (calidad I y II) y no viables (calidad III y IV), para los procesos de maduracin y fecundacin in vitro