UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DECANATO

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES 1. Titulo del Proyecto: Concentracin de Polihidroxialcanoato de cepas nativas de Azospirillum spp. aisladas de races de Zea mays L. y Citrus limon L. 2. Personal Investigador: Autores Est. Chafloque Cruz Carlos Alberto Br. Quesqun Chancafe Cristian Enrique Patrocinadora Dra. Carmen Rosa Carreo Farfn 3. Carrera profesional/especialidad Ciencias Biolgicas/Microbiologa-Parasitologa 4. Tipo de investigacin 4.1. De acuerdo al fin que se persigue Bsica-Aplicada 4.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin Experimental 5. Rgimen de investigacin Libre

6. Localidad e institucin donde desarrollar el proyecto Lambayeque, Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. 7. Duracin del Proyecto 7 meses 8. Fechas probables de inicio y terminacin 8.1. 8.2. Inicio Terminacin : abril 2010 : octubre 2010

9. Cronograma de trabajo

ACTIVIDADES FASE DE PLANEAMIENTO

Revisin bibliogrfica Elaboracin del proyecto Presentacin del Proyecto Aprobacin del Proyecto Implementacin del Proyecto

2010 ABR MAY JUN JUL AGO SET OCT

X X X X X

FASE DE INVESTIGACION
Recoleccin de muestra Procesamiento de muestra Registro de datos Anlisis estadstico de datos

X X

X X X X X X X

FASE DE COMUNICACION
Anlisis de interpretacin Elaboracin del informe Presentacin y sustentacin

X X X

10. Recursos disponibles 10.1. Personal

Se contar con el personal encargado del laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. 10.2. Equipos e instrumentos

Autoclave marca FANEN. Autoclave Vertical mod. 415 Estufa marca PRECISION SCIENTIFICO P.S. 30-110C Horno marca THELCO. Tem. Range to 200C Microscopio ptico marca ZEISS Balanza analtica marca EXCELL BH-150 Cocina elctrica marca CHARITO de una hornilla pHmetro BIOCHEMICALS INSTRUMENTS S.R.L. Porttil con

compensacin automtica de temperatura. Rango 0,0 a 14,0 pH, margen de error +/- 0,1. Cmara digital SANSUNG-7 Megapixeles. Memoria USB SONY 2 Gb.

10.3.

Material y reactivos

10.3.1. Material 20 matraces de 250 mL 30 pipetas de 10 mL; 1 mL y 0,5 mL 100 tubos de dilucin 100 placas de Petri 02 cajas de laminas portaobjetos 01 espatula Asas bacteriolgicas 10 frascos de vidrio de 300 mL 10 frascos de vidrio de 150 mL 150 viales 10.3.2. Reactivos Reactivos para tincin Gram Hipoclorito de sodio 2 % Solucin salina fisiolgica estril Perxido de hidrogeno

10.4.

Local Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

11. Presupuesto 11.1. Bienes 11.1.1. Materiales de escritorios 04 juegos de etiquetas 03 lpices marcador 03 millares de papel bond A4 75 g 06 lapiceros 06 lpices 02 correctores de tinta 05 rollos de pabilo 03 cuadernos 03 cintas embalaje 11.1.2. Material de laboratorio 100 tubos de ensayo 16 x 150 mm 100 tubos de ensayo 13 x 150 mm 30 tubos para centrifuga 100 placas de petri 15 x 100 mm 02 cajas de laminas portaobjetos 10 frascos de boca ancha de 500 mL 02 asas bacteriolgicas 02 mecheros de alcohol 06 pipetas graduadas de 1 mL y 10 mL 04 paquetes de algodn de 500 g 100 bolsas de polietileno para 500 g Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) Agar tripticasa soya (TSA) Agar Solucin salina fisiolgica Colorante Sudan Negro II S/. 2000,00 S/. 2 600,00 S/. 200,00

11.1.3. Material de impresin 02 cartuchos de tinta para impresora HP Photosmart C4280 11.2. Servicios 11.2.1. Pasajes y subvenciones Movilidad a Lambayeque, 4 das por semana Movilidad a Chiclayo-Olmos y viceversa Impresiones: tipeos en computadora, copias fotostticas Encuadernacin

S/. 400,00

S/. 1600,00 S/. 1100,00

11.2.2. Publicaciones Publicacin de 6 ejemplares 11.2.3. Otros Procesado revelado de pelculas: fotografas y diapositivas

S/. 300,00

S/. 200, 00

_____________________________________________________________________ TOTAL S/. 4 200,00

12. Financiacin El presente trabajo de investigacin ser autofinanciado.

II. PLAN DE INVESTIGACIN 1. Realidad Problemtica La principal propiedad de los bioplsticos o polmeros biolgicos constituidos por Polihidroxialcanoatos (PHAs) es la de ser biodegradable, por lo tanto no contaminante del medio ambiente, adems de ser termoplsticos, por lo cual constituyen materiales tiles en reas como medicina, agricultura o como envases flexibles, tambin es susceptible de ser empleado como pelcula para la proteccin de cultivos en sus primeros estadios. Por todas estas propiedades es necesario sintetizar biopolmeros con distintas propiedades fsico qumicas debido a sus diferentes aplicaciones (Quagliano, 2000)

En la industria alimentaria, los polmeros han trado grandes beneficios en el envasado de alimentos. Un gran problema que se deriva es la acumulacin de estos materiales en el medio ambiente y la reduccin de espacio para confinarlos. Una alternativa a estos problemas es la utilizacin de plsticos biodegradables, que pueden ser polmeros sintticos, naturales o artificiales, pero todos con un potencial de biodegradabilidad para ayudar a solucionar la problemtica ambiental y energtica actual (Ramiro, 2004)

Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son sintetizados por muchas especies de distintos gneros bacterianos, debido al estrs alimentario por la induccin de periodos de ayuno y abundancia, mostrando como respuesta la acumulacin de grnulos de PHA intracelular como estrategia de reserva de energa o fuente de alimento (Arcos y Vargas, 2006). Entre los microorganismos productores de PHAs tenemos a la bacteria Azospirillum spp, lo cual la podemos encontrar en diferentes tipos de plantas (trigo, maz, sorgo, arroz, cebada, avena y cultivos perennes como caf, ctricos).

En nuestro medio contamos con diversidad de especies de plantas tanto anuales como perennes y de las cuales podemos aislar Azospirillum spp. que es el productor del elemento ms pequeo de la familia de los PHAs, el Poli Hidroxibutirato (PHB) (alrededor de 1,5 g.L-1), dicha produccin est influida negativamente por altos niveles de aireacin (Martnez et al, 2004). Las cuales serian una gran fuente para poder ser utilizadas en la produccin de estos bioplsticos.

1.1.

Identificacin del problema Contaminacin degradables. ambiental por acumulacin de plsticos no

1.2.

Delimitacin del problema Concentracin de Polihidroxialcanoato de cepas nativas de

Azospirillum spp. aisladas de races de Zea mays L. y Citrus limon L. 2. PROBLEMA Cules son las concentraciones de Polihidroxialcanoato de cepas nativas de Azospirillum spp. aisladas de races de Zea mays L. y Citrus limon L.?

3. Justificacin e Importancia Bacterias del genero Azospirillum son bacterias de gran inters

agroindustrial ya que promueve el crecimiento de cultivos econmicamente importantes debido a la interaccin de simbiosis que establece con la raz. Una de las caractersticas del metabolismo de esta bacteria es de tener la capacidad de producir polmeros de reserva que se forman debido a condiciones desfavorables y que adems le ayudar a competir con otros microorganismos.

Adems estas bacterias poseen caractersticas fisiolgicas eficientes tales como la formacin de quistes, formacin de flculos, produccin de melanina y proteccin interna contra esporas fungales que le ayudan a vivir en condiciones desfavorables. El PHB elaborado por Azospirillum no solo tiene propiedades como la del petrleo sino que tambin son biodegradables, que finalmente por la degradacin de otros microorganismos se transforman en abono lo cual reducirn la contaminacin ambiental.

El maz y el limn son cultivos importantes en la Regin Lambayeque y que tienen diferentes tiempos de desarrollo, ya que una es anual y otra perenne respectivamente, de acuerdo a esta caracterstica de tiempo es que Azospirillum genere ms o menos PHAs en base al tipo de planta, adems de otras caractersticas fisiolgicas de la planta, tales como Oxigeno, tipo de suelo o de acuerdo a la estacin del tiempo. De obtener resultados favorables se seleccionaran las cepas con mayor produccin de PHAs.

4. Objetivos 4.1. Aislar e identificar cepas nativas de Azospirillum spp. de races de Zea mays L. maz y Citrus limon L. limn. 4.2. Apreciar la produccin de PHAs en cepas nativas de Azospirillum spp. utilizando la tincin con sudan II. 4.3. Determinar la concentracin de PHAs en cepas nativas de Azospirillum spp. aisladas de races de Zea mays L. maz y Citrus limon L. limn. 4.4. Comparar concentraciones de produccin de PHAs entre las cepas nativas de Azospirillum spp. de Zea mays L. maz y Citrus limon L. limn.

5. Antecedentes 5.1. El Gnero Azospirillum Beijerinck, en 1925, estudi la primera bacteria del gnero Azospirillum identificada como Spirillum lipoferum, en suelos arenoso pobres en nitrgeno en Holanda. Estudios taxonmicos de S. lipoferum permitieron su reclasificacin en un gnero nuevo, Azospirillum (Holguin et al., 1999)

El gnero Azosporillum forma parte de las bacterias Gram negativas, subclase alfa de las proteobacterias, de la familia Rhodospirillaceae y actualmente son reconocidas siete especies (Eckert et al., 2001). Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo estas las ms ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A. amazonense, A halopraeferans, Airakense, A. doebereinerae, A. largomobile siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile (Bashan et al., 2004).

Azosporillum puede unirse a partculas del suelo, superficie de races, as como a superficies inertes y al poliestireno hidrofbico (Casyellanos., et al., 2000). La capacidad de movimiento es una propiedad que le permite trasladarse del sitio de inoculacin a la raz, lo cual es esencial para que la colonizacin ocurra. Adems posee mecanismos especficos para interactuar con el interior de las races y colonizar la capa mucigel o clulas corticales de una raz daada (Alexandre et al., 2000)

Adems de ser bacteria de rizsfera o cultivos econmicamente importantes, las bacterias del gnero Azospirillum son habitantes naturales de plantas y en ocasiones pueden promover su crecientito (Holguin et al., 1999).

Se han aislados en numerosos cultivos tropicales, subtropicales y templadas en todo el mundo (Eckert et al., 2001), con una prevalencia variable (Bashan 1999)

Tanto en A. lipoferum como en A. brasilense se ha demostrado una fuerte actividad quimiotctica hacia diversos azcares, cidos orgnicos y

aminocidos, as como hacia compuestos aromticos y exudados radicales (Barak, 1982). La respuesta quimiotcticas a diferentes fuentes de carbono es variable dependiendo de las especies de Azospirillum e incluso en cepas especficas. Tambin es una respuesta hacia el oxgeno (aerotaxia) fue

observada en A. brasilense. Zonas de baja concentracin fueron las preferidas por las clulas bacterianas para su crecimiento y multiplicacin, siendo repelidas por altas concentraciones de oxgeno y condiciones anaerbicas (Reiner et al., 1986). La aerotaxia parece ser especialmente importante bajo condiciones de fijacin de nitrgeno, permitindole a la clula de Azospirillum alcanzar concentraciones de oxgeno suficientemente bajas para que exprese la actividad de la nitrogenasa. Se sugiere que tanto las especies quimio y aerotcticas son caractersticas que contribuyen al proceso de colonizacin en la races de las plantas, ya que en consumo de oxgeno durante el cremento celular activo de las races enriquece el ambiente con sustratos orgnicos y genera gradientes de oxgeno al consumirse esta durante la respiracin (Steenhoudt y Vanderleyden, 2000).

Azosporillum tiende a colonizar las zonas de elongacin de la raz y pelos radiculares (Murty y Ladha, en Bashan 1996). En cereales, la colonizacin ocurre principalmente en las superficies radiculares, a excepcin del arroz que la colonizacin se da en los pelos radiculares. Es una bacteria microaeroflica, que tiene un metabolismo oxidativo, y donde la deteccin de energa es un comportamiento dominante, por lo que la bacteria tratar de llegar a ambientes donde los nutrimientos como concentracin de oxgeno le permitan mantener niveles de energa optima y fijacin de nitrgeno (Alexander et al., 2000). Azospirillum ssp. Presenta pleomorfismo, por lo que cambia sus actividades metablicas en respuesta a las variaciones en el ambiente. Estas bacterias en condiciones microaeroflicas son mviles (Pereg et al., 2000), por dos tipos de flagelos: un flagelo polar sintetizado en medio slido y semislido; y numerosos flagelos laterales, adems del polar sintetizados en medios slidos y semilquidos. Bajo condiciones aerobias, particularmente en cultivos viejos,

pasan de la forma vibroide a una forma redonda encapsulada (quiste) no mvil (Katzy et al., 2001).

El medio de cultivo usado por excelencia para el enriquecimiento de las ce Azospirllum ha sido el NFb semigelificado "libre" de nitrgeno y con malato como fuente de carbono; aunque el medio NFb con algunas modificaciones en su composicin y pH permiten el aislamiento predominante de la mayora de las especies de Azospirllum (Dbereiner, et al., 1992). Los tubos donde se

observa crecimiento bacteriano en forma de sombrilla, la cual se transforma en una pelcula blanca y densa abajo de la superficie del medio de cultivo y viraje del indicador azul de bromotimol son considerados tentativamente como positivos para e! aislamiento en cultivo puro de la bacteria. El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio siendo muy comnmente usado un medio adicionado del colorante rojo Congo (Rodrguez-Cceres, 1982).

5.2. Polihidroxiacanoatos Los polihidroxialcanoatos son polmeros lineales de (R)-3- hidroxicidos en los que el grupo carboxilo de un monmero forma un enlace tipo ster con el grupo hidroxilo del monmero siguiente. Se depositan intracelularmente en forma, de cuerpos de inclusin, pueden llegar a constituir ms del 90% del peso seco celular (Martnez et al., 2004; Pettinari et al., 2004) y se descomponen biolgicamente por accin de microorganismos retomando al suelo como productos simples: CO2 y H2O (Figueroa., et al., 2008), El primer PHA descubierto fue el poli (3-D- hidroxibutirato): PHB, un homopolmero que fue detectado en la especie Bacillus megaterium en el ao 1925 (Lemoigne, 1926). El PHB ha suscitado considerable atencin en los ltimos aos como alternativa biodegradable a las aplicaciones de

termoplsticos sintticos. Este polister de origen bacteriano es obtenido bajo condiciones de estrs nutricional en el medio de cultivo (Povolo., et al., 2001).

El PHB se acumula en el citoplasma dentro de los grnulos y representan para los microorganismos una reserva de carbono y poder reductor. En el aislamiento y caracterizacin de una cepa de Azospirillum brasilense productora del elemento ms pequeo de la familia, el PHB (alrededor de 1,5 g.L-1), se determin que la produccin est influida negativamente por altos niveles de

aireacin. Se demostr el efecto de antagnico agitacin-aireacin y tambin se encontr que bajos niveles de nitrgeno y fosforo (Martnez, et al., 2004). Asimismo, se realiz el estudio de la maximizacin de la produccin de PHB de Azospirilum brasilense-Sp7 desde el punto de vista nutricional, usando un medio de cultivo definido y con condiciones previamente optimizadas en el laboratorio, logrndose aumentar de 0,1 a 16% la acumulacin de PHB en biorreactor; con lote alimentado discontinuo (Cholula, 2005). 6. Materiales y mtodos 6.1. Material 6.1.1. Material biolgico Muestras de races de Zea mays maz cultivados en campos agrcolas de Mochum, provincia de Chiclayo, regin de Lambayeque. Muestras de races de Citrus limn Cepas nativas de Azospirillum spp. limn cultivados en campos

agrcolas de Olmos, provincia de Chiclayo, regin Lambayeque.

6.1.2. Material de laboratorio Placas de Petri. Matraces. Frascos de boca ancha. Laminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos Tubos de vidrio (13x100mm) y (15x150 mm). Pipetas de 1 mL y de 10 mL. Tips para micropipetas Micropipetas. Asas bacteriolgicas. Agitador de vidrio. Bolsas de algodn de 500 g. Alcohol. Gradillas

6.1.3. Medios de cultivo Agar tripticasa soja (TSA) Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) slido

 Medio tomate - medio de produccin

6.1.4. Reactivos y Colorantes Colorantes para tincin de Gram Azul de bromotimol Solucin salina fisiolgica estril Hipoclorito de sodio (NaClO) al 2% Colorante Sudan Negro II Tween 80

6.1.5. Otros Esptulas. Bolsas plsticas. Tamizador

6.2. Mtodos 6.2.1. Poblacin y muestra de estudio La poblacin estar constituida por bacterias del gnero Azospirillum presentes en las races de Citrus limon "limn" de campos agrcolas del distrito Olmos, provincia de Chiclayo, regin Lambayeque y en las races de Zea mays maz cultivados en campos agrcolas de Mochum, provincia de Chiclayo, regin de Lambayeque y la muestra estar constituida por las cepas de Azospirillum aisladas de 96 muestras de races (48 de maz y 48 de limn); nmero que fue calculado tomando en cuenta una prevalencia del 20 % (Alvitres, 2000).

Donde: n= Tamao de la muestra z= 1,96 (=0,05), valor estndar p= 0,20, presencia de Azospirillum spp. En la rizsfera de limn y maz q= Ausencia, 1-p: 0,80 T= Error permitido: 0,08

6.2.2. Aislamiento e Identificacin de Azosporillum spp. a. Zona de muestreo Para aislar cepas nativas de Azospirillum spp. se tomarn muestras de races de cultivos de limn y de maz establecidos en campos agrcolas del distrito de Olmos y Mochum. b. Obtencin de muestras de rizsfera Las muestras de aproximadamente 20 g de races, sern obtenidas de plantas de limn y de maz que se encuentren al final del ciclo vegetativo poco antes de la cosecha. Cada una de las muestras ser depositada en bolsas plsticas de 500 g debidamente etiquetadas e inmediatamente sern transportadas para su procesamiento en el laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo,

Lambayeque. c. Aislamiento de cultivos puros de Azospirillum fijador de Nitrgeno Cada una de las muestras de raz se depositar en bandejas de plstico donde se separarn manualmente las races y se lavarn con agua potable para eliminar el suelo remanente. A continuacin las races se cortarn en fragmentos de un tamao aproximado de 1 a 2 cm de longitud, se desinfectarn superficialmente con hipoclorito de sodio (NaCIO) al 2% por 5 minutos, y luego se enjuagarn tres veces con agua destilada

Posteriormente se realizar el enriquecimiento de cada una de las muestras para favorecer el crecimiento de Azospirillum spp. para lo cual las races de depositarn en tubos con 10 mL de medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) semislido, a razn de un fragmento por tubo. La incubacin se realizara en aerobiosis 28C por 1 semana y se seleccionarn los tubos donde se observe el viraje del color del medio de verde a azul y la presencia de una pelcula gruesa blanquecina ubicada entre 0,5 a 1,5 cm bajo la superficie. A continuacin se tomar una alcuota de la pelcula y se sembrar en placas con medio NFb slido complementado con 20 mgL-1 de extracto de levadura y se incubarn a 28 C hasta por 5 das. A partir del tercer da se seleccionarn las colonias blanquecinas y pequeas con viraje del medio del verde al color azul y se sembrarn en medio NFb semislido en aerobiosis a 28 C por 1 semana hasta observar el viraje del color del medio de verde al azul y la presencia de una pelcula gruesa blanquecina entre 0,5 a 1,5 mm bajo la superficie. En caso positivo se tomar una alcuota para sembrarla por agotamiento y estra en placas con medio NFb-rojo de Congo en aerobiosis a 28 C durante 5 das. Se seleccionaran las colonias de tamao mediano y teido de color rojo oscuro o escarlata, abundante crecimiento, consistencia seca, superficie rugosa, y a continuacin se sembrarn en medio NFb semislido y se incubaran a 28 C por 1 semana, seleccionndose las que presenten el crecimiento caracterstico de pelcula bajo la superficie. Finalmente los aislamientos, sern cultivados en placas con TSA y se incubarn a 35 C por 48 horas. d. Identificacin y mantenimiento de cepas de Azospirillum spp. La identificacin a nivel de gnero de las bacterias nativas fijadoras de nitrgeno se realizara en funcin de las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas segn el Manual de Bergey de Bacteriologa Determinativa (Holt et al., 1994).

6.2.3. Deteccin de polihidroxibutirato en cepas nativas de Azospirillum spp. La capacidad de las bacterias del gnero Azospirillum para producir PHB se determinar cualitativamente mediante la inoculacin de las cepas asiladas en tubos conteniendo 5 mL de medio de produccin (Anexo 2).

Se incubarn a 37 C. Posteriormente del contenido de cada uno de los cultivos se realizar extensiones y se colorearan con Sudn Negro B (Anexo 4). La positividad a la produccin de PHA estar dada por la presencia de grnulos negros o grisceos en el interior de clulas vegetativas rosadas. 6.2.4. Determinacin de la concentracin de PHB en cepas nativas de Azospirillum spp. Cada una de las bacterias productoras de PHB se cultivar en medio tomate (Marn y Lpez, 1998) por un tiempo determinado segn la experiencia hasta alcanzar una concentracin de 107 cel/mL. Se utilizar elermeyers de 250 mL en cada variante con 47,5 mL de medio tomate y 2,5 mL de inoculo hasta llegar a un volumen de 50 mL, y se incubarn a 37 C por un tiempo determinado segn la experiencia.

Para cuantificar el peso de la biomasa se centrifugar cada uno de los cultivos y el sedimento se pesar en una balanza digital. Despus el sedimento o biomasa obtenida se lavar con agua destilada y posteriormente con hipoclorito de Sodio al 5% para debilitar la membrana celular y as facilitar el proceso de extraccin. La bioseparacin del PHB se efectuar mediante una lisis de la biomasa con cloroformo durante 30 minutos. El PHA es soluble al cloroformo por lo que la muestra se centrifugar y luego se evaporar el cloroformo para despus pesar el PHA slido obtenido.

El rendimiento (Y p/x) es la relacin entre el PHA y la biomasa formados y ser calculado dividiendo la concentracin de PHA obtenido entre los gramos de biomasa formada.

Se seleccionar la cepa que presente el mayor valor en el rendimiento de PHB.

6.2.5. Comparacin de concentracin de PHB en cepas nativas de Azospirillum spp. de las races de Citrus limon limn y Zea mays maz Despus de obtener los valores de rendimiento se proceder a comparar la concentracin de PHB producida por las cepas de Azospirillum spp. aisladas de las races de Citrus limon limn y Zea mays maz.

6.3. Anlisis de Datos Los datos obtenidos en la produccin de PHA de las cepas nativas de Azospirillum spp. se sometern en un anlisis de varianza (ANAVA) para determinar las diferencias estadsticas entre las cepas y se emplear la prueba discriminatoria de Tukey (= 0,05) para determinar el nivel de significancia entre ellos.
2ml de solucin a evaluar en los tubos de tapa rosca.

Adicionar 0.2 ml. de cada microorganismo.

Dividir las cajas de Petri con agar selectivo en cuatro cuadrantes.

Cada cuadrante corresponder los tiempos evaluados y el control positivo.

Realizar pases de cada tubo a los diferentes agares selectivos por duplicado a los 5,10 y 15 min.

Inocular con asa 4 estras en cada cuadrante, incluyendo en el control positivo.

Incubar a 35C por dos das para bacterias. Incubar a 28C por 5 das para levaduras y hongos.

Realizar lectura, cada estra con crecimiento tendr un valor de 25%, para un total de 100%. Para hacer valida la estra deber presentar un crecimiento mayor o igual al 50% de su longitud total.

7. Referencias bibliogrficas Arcos, M., A. Vargas. 2006. Degradacin de aguas residuales y produccin de Polihidroxialcanoatos mediante un biorreactor discontinuo. XV Congreso Nacional de Ingeniera Sanitaria Y ciencias Ambientales. Mexico D.F: Carballo, M. et al.,(2003) Evaluacin de la produccin de polihidroxialcanoatos por cepas bacterianas marinas en Revista Biologa. Vol.17, No. 1. Cholula, L (2005). Estudio de la produccin de poli-hidroxlbutirato (PHB) en Azospirillum brasilense Sp7. Disponible en: http: //teamna.bnct pn. mr. 23456733/1143/,33S_2COS_IOGEN_MAESTR\A_choluia_corderoJaura_patn da.pdf Figueroa, W. et al., (2008). Evaluacin de mezclas basadas en el polmero biodegradable polihidroxibutirato y polietileno funcionalizado con acrilamida y dietilmaleato en Revista Iberoamericana de Polmeros. Volumen 9(3). Martines (7004) Produccin de polihidroxialcanboatos en bacterias diazotrofas. Influencia de la aeracin de poli-B-hidroxibutirato en Azospirillum brasilensi cepa 7. Vol. 18 nmero 1.2004. Povolo. et al., (2001). Determinacin de los mdulos tensil y de

almacenamiento de compuestos de PHB. Disponible en: http://www.materialessam.org.ar/sit,io/bhlioteca/posadas/fTabaios/1313.pdf Quagliano, J. et al. 2000. Produccin microbiolgica de plsticos

biodegradables: estudios enzimticos y fermentativos. Ramiro, C. et al. 2004. Estudio de la biodegradabilidad en fermentacin aerobia por Aspergillus niger de pelculas biopolimericas flexibles a base de sorgo con potencial uso en bioenvases. Monterrey, N. L., C. P. 64849/328-4187 Segura, D., R. Noguez y G. Espn. (2007) Contaminacin ambiental y bacterias productoras de plsticos biodegradables. Disponible en:

http://www.ibt.unam.rnx/computo/pdfs/libro_25_aniv/capitulo_31.pdf (Accesado el 20 de Setiembre del 2009). S Matas, M. (2009) Obtencin de bioplsticos a partir de fcula de papa (de tercera categora). Disponible en: http://www.scribd.com/doc/17428147/PLANDE-TESIS-OBTENCION-DE-BIOPLASTICOS-A-PARTIR-DE-FECULA-DEPAPA S Llerena, V. (2009) Bioplsticos, limpia solucin. Disponible en:

http://biogeomundo.blogsppt.com/2009/09/bioplasticos-limpia-solucion.html

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M.

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http://www.cib.csic.es/es/detalle_lnea_investigacion.php?idlinea_investigacion =115 S Bashan, Y., Holguin, G., Ferrera, R. (1996) Interacciones entre plantas y microorganismos benficos. Azospirillum. Volumen 14, Nmero 2. Disponible en: http://www.bashanfoundation.org/gmaweb/pdfs/beneficali.pdf Quagliano, J. et al. 2000. Produccin microbiolgica de plsticos

biodegradables: estudios enzimticos y fermentativos.

ANEXO 1 MEDIOS DE CULTIVO Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol NFb (Dobereiner et al., 1976; citado por Motsara et al., 1995 Composicin cido mlico KOH K2HPO4 FeSO4-7H2O MnSO4-7H2O MgSO4-7H2O NaCI CaCI2 Na2MoO4 Azul de bromotimol (0,5 % m/v en etanol) Biotina Agua desionizada gL-1 5 4 0,5 trazas 0,01 0,01 0,02 0,01 0,002 2 mL 0,1 mg 1000 mL

Ajustar el pH a 6,8 -.7,0 (color verde) con NaOH. Para medio semislido aadir 2 g del agar. Para medio slido aadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar Medio NFb-rojo de congo (Bashan, 1993) Composicin cido mlico KOH K2HPO4 FeSO4-7H2O MnSO4-7H2O MgSO4-7H2O NaCI CaCI2 Na2MoO4 Biotina Agua desionizada Rojo de congo (solucin acuosa 1:400) gL-1 5 4 0,5 trazas 0,01 0,01 0,02 0,01 0,002 0,1 mg 1000mL 15 ml/L de medio

El rojo de congo se autoclava por separado y se aade justo antes de ser servido.

ANEXO 2 MEDIO DE PRODUCCIN

Medio tomate (Martin y Lopez, 1988)(en g.L) KOH K2HPO4 NH4Cl MgSO4 5.50 5.25 2.88 0.20

Extracto de levadura 0.50 Tomate Tween 80 Agar 333 mL. (dilucin 1:4)* 1mL (Slo para medio Lquido) 15

pH= 6,8 (ajustado con KOH). Esterilazo a 121 C durante 15 minutos *Extracto de tomate con un 3,55% de slidos solubles

ANEXO 3 DETECCIN DE PHB CON SUDN NEGRO La deteccin de PHB se realizar mediante tincin lipoflica con Sudn Negro II, se dispersar en 1 mL de acetato de etilo y se centrifugar a 60 x g x 1 min. Se aadirn 9 mL de etilglicerol al sobrenadante. Con esta solucin se cubrirn extensiones previas a los cultivos en lminas portaobjetos, calentando suavemente sin ebullir durante 5 min. Despus, las extensiones se decolorarn con xilol, se secar y contratiir con safranina. Cuando se observe con lente de inmersin los grnulos de PHB se colorearan de gris-negro y la clula vegetativa de rosado.

Msc. Carmen Rosa Carreo Farfn Firma Asesora

Chafloque Cruz Carlos Alberto Firma Autor

Quesqun Chancafe Cristian Firma Autor

26-04-2010 Fecha de presentacin

*Cuenta leucocitaria Introduccin: La leucopoysis es un proceso que se lleva a cabo con gran actividad, ya que si el nmero de granulocitos circulantes de ninguna manera es comparable al de los eritrocitos, en cambio se estima que la sobrevida de los neutrfilos no excede de 5 das, de las cuales solo pasan 10 hrs. en la sangre circulante. Fundamento: La sangre se diluye 1:2 con una solucin hipotnica de cido actico que destruye a los eritrocitos. El azul de metileno permite reconocer fcilmente el lquido y observar mejor los glbulos blancos, a los que tie ligeramente Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para corregir los resultados

Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100mm Pipeta de Thoma para glbulos blancos Cmara de Neubauer Microscopio Boquillas Gasa Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

EDTA (sal disdica) al 10 % Liquido de Turk:

cido actico glacial 3.0 ml Agua destilada c.b.p. 100 ml Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno Procedimiento 1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5 2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera 3.- Aforar con solucin de Turk hasta la marca de II 4.- Agitar la pipeta durante 3 min. 5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la cmara de Neubauer 6.-Dejar reposar la cmara durante 3 min. 7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos presentes en los cuatro cuadros grandes de los extremos 8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente frmula Clulas contadas x 20 (dilucin) x 10 (correccin de altura) / 4 (nm. De cuadro de 1mm contados) Este factor vara si se cambia la dilucin y o el nmero de cuadros contados *En caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) deber hacer la cuenta diferencial leucocitaria Valores de referencia: Leucocitos:

-Adultos: 5000 - 10 000 / mm3 - Recin nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3 -Nios: 8000 - 15 000 Objetivos Esto con el fin de determinar si el paciente presenta una deficiencia de glbulos blancos causa de una enfermedad as como tambin para prevenir cualquier anomala que se presente en la muestra del paciente. F u n d a m e n t o s MtodoTcnica La prctica se llevo a cabo con el mtodo de la cmara de Neubauer; cuya realizacin consiste en los pasos que se enumeran y explican a detalle en el inciso nmero 4 Desarrollodelaprctica Para La realizacin de la prctica de conteo de leucocitos se deben llevar a cabo los pasos que se describen en la siguiente lista: Lo primero que se debe de hacer as como en la mayora de las prcticas de laboratorio es revisar que todo el material este preparado, es decir que la boquilla este en buenas condiciones, que la pipeta no tenga agua, que la cmara de Neubauer est limpia y seca y que los portaobjetos no estn sucios; se podra decir que este es el paso mas importantes en cualquier prctica, ya que si cualquier objeto que tenga o presente impurezas puede alterar la composicin de la muestra, esto provocara unos resultados imprecisos en cualquier anlisis, en este caso en el conteo de leucocitos. Se toma el tubo de ensayo a presin con la muestra y se destapa cuidadosamente para que no se derrame. Se coloca la boquilla en la pipeta revisando que esta no tenga una rotura o que se salga el aire entre la pipeta y la boquilla. Se inclina el tubo de ensayo alrededor de unos 70 para que la sangre se escurra hasta el borde o casi el borde del tubo de ensayo, se mete ligeramente la pipeta en el tubo sin tapar la graduacin de la misma y se llena hasta 5 ml. Se sujeta la pipeta de tal manera que no se derrame sangre y se introduce en el tubo de ensayo con el lquido de Turk, se llena la pipeta hasta 11ml.
6.1 RECUENTO LEUCOCITARIO Principio La sangre anticoagulada se deposita en un lquido que permite evidenciar los leucocitos, mantenindolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados. El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se ex- presa por mm3 (milmetro cbico). 6.1.1 Equipos - Microscopio. - Hemocitmetro (Cmara de Neubauer). Consta de los siguientes elementos:

Una lmina portaobjeto gruesa, en el centro se hallan dos superficies cuadriculadas iguales separadas del resto de la lmina por surcos y dos barras transversales algo ms elevadas.

Una laminilla cubreobjetos pticamente plana, que, al colocarse sobre las barras elevadas de la lmina forma una cmara entre el cubreobjetos y la superficie cuadriculada. La altura entre el cubreobjetos y la lmina portaobjetos es de 0,1 mm. Cada cuadrcula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandes. Cada uno de los cuales mide 1 mm 2 de superficie, que se subdivide a su vez en 16 cuadrados medianos. El cuadrado grande central se divide en 25 cuadrados pequeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos. Cada cuadrado pequeo mide 0,2 mm de lado (0,04 mm 2 de superficie), y cada cuadradito mide 0,05 mm de lado (0,0025 mm 2 de superficie 6.1.2 Materiales y reactivos requeridos 6.1.2.1Pipeta de glbulos blancos (De Thoma) o pipeta automtica (de 0 a 100 L).
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Presenta cerca del extremo superior una marca de 11, inmediatamente contina una dilatacin (bulbo) que contiene una perla que funciona como mezcladora, luego sigue el extremo ms largo de la pipeta (tallo) que est dividida en 10 partes, con 2 marcas: 1 (parte final del bulbo) y 0,5 (a la mitad del tallo). Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombilla para aspirar. 6.1.2.2Diluyente de glbulos blancos: Solucin de Turk al 1%. 6.1.2.3Contador manual (Slo si fuera necesario). 6.1.2.4 Papel filtro. 6.1.3 Procedimiento 6.1.3.1Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo, se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente. 6.1.3.2Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucin de Turk y absorber hasta la marca de 11 (no debe haber burbujas). 6.1.3.3Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en un rotador automtico por 2 3 minutos. 6.1.3.4Monte la laminilla de vidrio en la cmara para recuento que debe estar limpia y seca. 6.1.3.5Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequea de esta solucin en la cmara. 6.1.3.6Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las clulas se sedimenten. 6.1.3.7Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares. Cuando se usa la pipeta automtica, se toma 20 L (0,02 mL) de sangre total con anticoagulante o sangre capilar con
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anticoagulante y se diluye en un tubo que contenga 380 L de solucin de Turk (aqu tenemos una dilucin 1:20).
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M AN UAL D E P ROCEDIMIENT OS DE L ABOR AT ORIO

EN

T C N I C A S B SIC AS D E H EMATOLOGA

31
IN ST I T UT O NA C I O N AL
MPR-CNSP-019
DE

SAL UD

La lectura se realiza en los campos 1, 3, 7 y 9 como est indicado en la figura. Adems de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la lnea horizontal superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos, adheridos a la lnea horizontal inferior y vertical interior. 6.1.4 Resultados N de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 campos altura x dilucin x rea Reemplazando = leucocitos contados en 4 campos 1/10 x 1/20 x 4 = leucocitos contados en 4 campos 4/200 = X/1= N leucocitos contados x 50 4/200
Fig. 13

6.1.5 Valores de referencia 5000 - 10 000 leucocitos / mm3 6.1.6 Correccin de valores para restar eritrocitos nucleados Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el lquido de dilucin, por lo tanto pueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con los leucocitos, de tal manera que se debe emplear la siguiente frmula: Clculo: La concentracin del nmero de normoblastos (por litro) es: Nmero de normoblatos contados x concentracin o nmero de leucocitos 100 + N de normoblastos contados Ejemplo: Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracin del nmero de leucocitos es 16 x 109/l, la concentracin del nmero de normoblastos ser: 50 x 16 = 5,3 x 109/l 100 + 50 y la concentracin de leucocitos corregida ser: 16 - 5,3 = 10,7 x 109/l En unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitos se expresan por milmetro cbico. En tales unidades el clculo correspon- diente al ejemplo que se ha dado sera: 50 x 16 000 = 5300 / mm3 100 + 50 Recuento corregido de glbulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 / mm3
Fuente:Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud.

Fundamento: La sangre se diluye 1:2 con una solucin hipotnica de cido actico que destruye a los eritrocitos. El azul de metileno permite reconocer fcilmente el lquido y observar mejor los glbulos blancos, a los que tie ligeramente Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para corregir los resultados Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100mm Pipeta de Thoma para glbulos blancos Cmara de Neubauer Microscopio Boquillas

Gasa Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

EDTA (sal disdica) al 10 % Liquido de Turk:

cido actico glacial 3.0 ml Agua destilada c.b.p. 100 ml Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno
Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas. Hacemos lo mismo que para los hematies pero empleando la pipeta de blancos, de modo que la solucin que obtenemos es de 1/20. Se utiliza el lquidos de Turck. El lquido de Turck es hipotnico de modo que se destruyen los hematies y as no entorpecen en el recuento. El lquido de Turck consta de cido actico glaciar 2ml, violeta de genciana disolucin de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deber filtrarse a menudo para evitar levaduras y hongos. Clculos En un principio es un poco difcil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hematies hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son ms refringentes (ms brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hematies. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmtica y de la membrana nuclear (a veces ms) como lneas finas y brillantes. Esto se observa fcilmente moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrs