Você está na página 1de 77

Quando o combustvel oxidado na cmara de combusto, libera-se calor, aumentando a energia cintica de suas molculas.

. Assim que os gases quentes s

Existe um ramo na cincia que estuda a velocidade das reaes qumicas e os fatores que a influenciam, a chamada Cintica Qumica. Pode se definir reaes qumicas como sendo um conjunto de fenmenos nos quais duas ou mais substncias reagem entre si, dando origem a diferentes compostos. Equao qumica a representao grfica de uma reao qumica, onde os reagentes aparecem no primeiro membro, e os produtos no segundo. A+B Reagentes C+D Produtos

O conhecimento e o estudo das reaes, alm de ser muito importante em termos industriais, tambm esto relacionados ao nosso dia a dia. A velocidade de uma reao a rapidez com que os reagentes so consumidos ou rapidez com que os produtos so formados. A combusto de uma vela e a formao de ferrugem so exemplos de reaes lentas. Na dinamite, a decomposio da nitroglicerina uma reao rpida. As velocidades das reaes qumicas so determinadas atravs de leis empricas, chamadas leis da velocidade, deduzidas a partir do efeito da concentrao dos reagentes e produtos na velocidade da reao. As reaes qumicas ocorrem com velocidades diferentes e estas podem ser alteradas, porque alm da concentrao de reagentes e produtos, as velocidades das reaes dependem tambm de outros

fatores

como:

Concentrao de reagentes: quanto maior a concentrao dos reagentes maior ser a velocidade da reao. Para que acontea uma reao entre duas ou mais substncias necessrio que as molculas se choquem, de modo que haja quebra das ligaes com consequente formao de outras novas. O nmero de colises ir depender das concentraes de A e B. Veja a figura:

Molculas se colidem com maior frequncia se aumentarmos o nmero de molculas reagentes.

fcil perceber que devido a uma maior concentrao haver aumento das colises entre as molculas. Superfcie de contato: um aumento da superfcie de contato aumenta a velocidade da reao. Um exemplo quando dissolvemos um comprimido de sonrisal triturado e ele se dissolve mais rapidamente do que se estivesse inteiro, isto acontece porque aumentamos a superfcie de contato que reage com a gua. Presso: quando se aumenta a presso de um sistema gasoso, aumenta-se a velocidade da reao.

Um aumento na presso de P1 para P 2 reduziu o volume de V1 para V1/2, acelerando a reao devido aproximao das molculas.

A figura acima exemplifica, pois com a diminuio do volume no segundo recipiente, haver um aumento da presso intensificando as colises das molculas e em consequncia ocorrer um aumento na velocidade da reao. Temperatura: quando se aumenta a temperatura de um sistema, ocorre tambm um aumento na velocidade da reao. Aumentar a temperatura significa aumentar a energia cintica das molculas. No nosso dia a dia podemos observar esse fator quando estamos cozinhando e aumentamos a chama do fogo para que o alimento atinja o grau de cozimento mais rpido. Catalisadores: os catalisadores so substncias que aceleram o mecanismo sem sofrerem alterao permanente, isto , durante a reao eles no so consumidos. Os catalisadores permitem que a reao tome um caminho alternativo, que exige menor energia de ativao, fazendo com que a reao se processe mais rapidamente. importante lembrar que um catalisador acelera a reao, mas no aumenta o rendimento, ou seja, ele produz a mesma quantidade de produto, mas num perodo de menor tempo.

Next 1. 1 2. 2 3. 3 4. 4 5. 5 6. 6 7. 7 8. 8 9. 9 10. 10 11. 11 12. 12 Cintica Qumica 1. Cintica Qumica 2. 3. 1. Definio 2. Velocidade de uma reao 3. Condies para ocorrer uma reao 4. Lei cintica de uma reao 5. Mecanismo das reaes 6. Lei cintica para reaes no elementares e para reaes elementares 7. Tipos de reaes qumicas Definio: ramo da cincia que se preocupa em estudar a rapidez das reaes qumicas e os fatores que a influenciam.

1. Definio: ramo da cincia que se preocupa em estudar a rapidez das reaes qumicas e os fatores que a influenciam. 2. Velocidade de uma reao: 3. V = | variao da quantidade de uma substncia | 4. intervalo de tempo 5. A velocidade de produo ou consumo de um substncia, est diretamente relacionada com os coeficientes da reao, devidamente balanceada. 1. Reao: aA + bB cC + dD 2. Velocidade: VA a = VB b = VC c = VD d. Natureza dos reagentes ou a afinidade qumica 1. Natureza dos reagentes ou a afinidade qumica

2. cido + Base sempre reagem; logo, entre eles h afinidade 3. Ex : gs oxignio (O2) tem "afinidade" com o monxido de carbono (CO) e na reao que ocorre entre eles forma-se o gs dixido de carbono (CO2); no entanto, o O2 no reage com o CO2. 4. Contato entre os reagentes; 5. Energia de ativao: - calor 6. - luz 7. -eletricidade 8. -presena de catalisadores A velocidade de uma reao proporcional a concentrao dos reagentes. 1. A velocidade de uma reao proporcional a concentrao dos reagentes. 2. As reaes foram divididas em dois grandes grupos: 1. Relaes Elementares: possvel escrever a expresso da lei de velocidade para um reao desde que conheamos seu mecanismo.

2. Relaes No-Elementares: Numa reao no-elementar a velocidade da reao global igual a velocidade da etapa mais lenta do mecanismo. Exotrmica 1. Exotrmica 2. Endotrmica 1. Estado fsico da matria; 2. Superfcie de contato (para reagentes slidos); 3. Temperatura; 4. Concentrao dos reagentes; 5. Catalisador. 6. Equilbrio Qumico 1. Equilbrio Qumico 2. 3. 1. Conceito 2. Tipos de equilbrio qumico 3. Constante de equilbrio 4. Tipos de constante 5. Grau de equilbrio 6. Espontaneidade de uma reao 7. Principio de Le Chatelier 8. Deslocamento de equilbrio 9. Fatores que deslocam equilbrio Ocorre quando as concentraes dos reagentes e produtos se mantm constantes, pois as reaes direta e inversa esto se processando com velocidades iguais; 1. Ocorre quando as concentraes dos reagentes e produtos se mantm constantes, pois as reaes direta e inversa esto se processando com velocidades iguais; 2. dinmico; 3. S pode ser atingido em sistemas fechados. 4. v1 5. aA + bB v2 cC + dD V1 = K1 [A]a [B]b

6. V2 = K2 [C]c [D]d Homogneo: todos os participantes esto em uma mesma fase. 1. Homogneo: todos os participantes esto em uma mesma fase. 2. Ex: N2(g) + 3H2(g) 2NH3(g) 3. Heterogneo: os participantes da reao esto em mais de uma fase. 4. Ex: NH3 (g) + HCl (g) NH4Cl (s) Proporo entre os reagente e os produtos, quando o equilbrio qumico atingido; 1. Proporo entre os reagente e os produtos, quando o equilbrio qumico atingido; 2. Cada reao de equilbrio possui a sua constante, na qual possui o mesmo valor para uma mesma temperatura. 3. [C]c . [D]d 4. Kc = -------------5. [A]a . [B]b 6. 7. Pode ser de dois tipos: 8. Em termos de concentrao (Kc) 9. Em termos de presso parcial (Kp) Exemplo de Kc e Kp 1. Exemplo de Kc e Kp 2. Reao 3. SiO2(l)+ 3C(s) SiC(s)+2CO(g) 4.

5. Kc= [CO] Kp= p CO 6. Relao entre Kc e Kp 7. Kp=Kc.(R.T) n 8. Onde: 1. R = constante universal dos gases 2. T = temperatura em Kelvin 3. n = variao do nmero de mols 4. n = np - nr n reagiu (Quantidade que reagiu at o equilbrio) 1. n reagiu (Quantidade que reagiu at o equilbrio) 2. = 3. n inicial (Quantidade inicial do reagente) 4. Obs: - valor expressos em mol; 5. - varia entre 0 e 1 (ou entre 0% ou 100%). Muitos dos processos que ocorrem so espontneos, ou seja, uma vez iniciados prosseguem sem a necessidade de ajuda externa. 1. Muitos dos processos que ocorrem so espontneos, ou seja, uma vez iniciados prosseguem sem a necessidade de ajuda externa. 2. Ex: dissoluo de sal em gua e queima de carvo 3. .No espontneos: cozimento de alimentos e obteno de metais. 4. Entropia 5. Grandeza termodinmica representada por S. 6. Exemplo: 7. a evaporao de um lquido: no estado gasoso as molculas movimentam-se com mais liberdade do que no estado lquido

8. a dissoluo de qualquer substncia em um liquido Quando um sistema em equilbrio perturbado, por variao de concentrao, de presso total, ou de temperatura, a alterao que nele se opera de molde a reduzir o efeito imediato daquela perturbao. 1. Quando um sistema em equilbrio perturbado, por variao de concentrao, de presso total, ou de temperatura, a alterao que nele se opera de molde a reduzir o efeito imediato daquela perturbao. 2. Quando um fator externo age sobre um sistema em equilbrio, este se desloca, procurando diminuir a ao do fator aplicado, at o sistema atingir um novo estado de equilbrio." Variao da concentrao: 1. Variao da concentrao: 1. O aumento da concentrao de uma substncia desloca o equilbrio no sentido de consumo desta substncia e a diminuio da concentrao de uma substncia desloca o equilbrio no sentido da sua formao. 2. Variao de presso: 1. O aumento da presso de uma reao desloca o equilbrio no sentido da contrao do volume e uma diminuio da presso desloca o equilbrio no sentido da expanso do volume 3. 4. Variao da temperatura: 1. O aumento da temperatura de uma reao desloca o equilbrio no sentido da reao endotrmica e a diminuio da temperatura desloca o equilbrio no sentido da reao exotrmica. Dada a reao genrica: 1. Dada a reao genrica: 2. aA(g) + bB(g) cC(g) + dD(g) As lentes fotocromticas possuem cristais de cloreto de prata (AgCl) incorporados diretamente ao vidro. 1. As lentes fotocromticas possuem cristais de cloreto de prata (AgCl) incorporados diretamente ao vidro.

2. Na reao direta, quanto maior a incidncia de luz, maior o nmero de tomos de prata formados, fazendo a lente escurecer. 3. Na reao inversa o tomos de prata e de cloro se recombinam para formar AgCl e liberar energia. 4. A diminuio da incidncia de luz desloca o equilbrio para a esquerda, clareando a lente 5. AgCl + energia luminosa Ag + Cl

Cintica enzimtica
Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre.

Imagem gerada por computador de um modelo da estrutura tridimensional da enzima purina nuclesido fosforilase bacteriana.

A cintica enzimtica estuda as reaces qumicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reaco. O estudo da cintica de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo cataltico, o seu papel nometabolismo, como controlada a sua actividade na clula e como pode ser inibida a sua actividade por drogas ouvenenos, ou potenciada por outro tipo de molculas.
ndice
[esconder]

1 Introduo

1.1 Enzimas

2 Princpios gerais 3 Ensaios enzimticos 4 Reaces mono-substrato

o o o

4.1 Cintica de MichaelisMenten 4.2 Representao da equao de Michaelis-Menten 4.3 Importncia prtica das constantes cinticas

5 Reaces multi-substrato

o o

5.1 Mecanismos de complexo ternrio 5.2 Mecanismos pingpong

6 Cintica no-michaeliana 7 Cintica do estado pr-estacionrio 8 Mecanismo qumico 9 Inibio enzimtica

o o

9.1 Inibidores reversveis 9.2 Inibidores irreversveis

10 Mecanismos de catlise 11 Notas 12 Referncias 13 Leituras adicionais 14 Ligaes externas

[editar]Introduo [editar]Enzimas
Ver artigo principal: Enzima As enzimas so macromolculas com a capacidade de manipular outras molculas, denominadas substratos. Um substrato pode unir-se ao centro cataltico da enzima que o reconhea e transformar-se num produto ao longo de uma srie de passos denominados mecanismo enzimtico. Algumas enzimas podem unir vrios substratos diferentes e/ou libertar diversos produtos, como o caso das proteases ao romper uma protena em dois polipptidos. Noutros casos, produz-se a unio simultnea de dois substratos, como no caso da DNA polimerase, que capaz de incorporar um nucletido (substrato 1) a uma cadeia de ADN (substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa srie de passos, tambm podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda a reaco. Este passo

limitante pode consistir numa reaco qumica ou numa mudana de forma da enzima ou do substrato. O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas til na interpretao dos dados cinticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto durante a catlise, que mudanas de forma ocorrem durante a reaco, ou mesmo o papel em particular de determinados aminocidos no mecanismo cataltico. Algumas enzimas modificam a sua forma significativamente durante a reaco, em cujo caso pode ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se anlogos que se unem mas no permitem levar a cabo a reaco e mantm a enzima permanentemente na forma de substrato unido). Os mecanismos enzimticos podem ser divididos em mecanismos de substrato nico e mecanismos de mltiplos substratos. Os estudos cinticos com enzimas que apenas unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una enzima que une vrios substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cintica enzimtica pode mostrar tambm a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos. Nem todas as catlises biolgicas so efectuadas por enzimas proteicas. Existem molculas catalticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e a traduo do ARNm, respectivamente. A principal diferena entre as ribozimas e os ribossomas radica no limitado nmero de reaces que as primeiras podem efectuar, embora os seus mecanismos de reaco e as suas cinticas possam ser estudados e classificados pelos mesmos mtodos.

[editar]Princpios

gerais

A velocidade de reaco aumenta com a concentrao do substrato, eventualmente ficando a enzima saturada a altas concentraes de substrato.

A reaco catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reao no catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catlise, as enzimas no alteram em absoluto oequilbrio da reaco entre substrato e produto.[1] Ao contrrio do que acontece noutras reaces qumicas, as enzimassaturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalticos estaro ocupados, o que incrementar a eficincia

da reaco, at ao momento em que todos os stios possveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se- alcanado o ponto de saturao da enzima e, embora se adicione mais substrato, no aumentar mais a eficincia. As duas propriedades cinticas mais importantes de uma enzima so: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto mximo de saturao. O conhecimento destas propriedades torna possvel formular hipteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responder frente a mudanas nessas condies.

[editar]Ensaios

enzimticos

Ensaios enzimticos so procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reaces enzimticas. Uma vez que as enzimas no so consumidas pelas reaces que catalisam, nos ensaios seguem-se habitualmente mudanas na concentrao de substratos ou produtos para medir a taxa de reaco. H vrios mtodos de medida: os ensaiosespectrofotomtricos medem a mudana de absorbncia da luz entre produtos e reagentes; ensaios radiomtricos envolvem a incorporao ou libertao de radioactividade para medir a quantidade de produto que surge ao longo do tempo. Os ensaios espectrofotomtricos so mais convenientes pois permitem a medio contnua da velocidade de reaco. Embora os ensaios radiomtricos exijam a remoo e contagem de amostras (ou seja, so ensaios descontnuos), so habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vrios nveis da actividade enzimtica.[2] Uma abordagem anloga usada na espectrometria de massa para aferir a incorporao ou libertao de istopos estveis medida que o substrato convertido em produto. Os ensaios enzimticos mais sensveis usam lasers focados por um microscpio para observar mudanas em molculas enzimticas individuais medida que decorre a reaco. Estas medidas usam geralmente mudanas na fluorescncia de cofactores durante o mecanismo de reaco, ou fluorforos adicionados a locais especficos da protena que registam movimentos que ocorrem durante a catlise.[3] Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cintica e dinmica de molculas individuais, em oposio tradicional cintica enzimtica, que observa o comportamento mdio de populaes com milhes de molculas enzimticas.[4][5]

[editar]Reaces

mono-substrato

Entre as enzimas com mecanismos mono-substrato incluem-se as isomerases como a triose-fosfato isomerase ou bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como aadenilato ciclase e a ribozima, uma liase de RNA.[6] Porm, algumas enzimas que apenas tm um substrato no se agrupam nesta categoria de mecanismos. A catalase um exemplo, pois reage com uma molcula de substrato de perxido de hidrognio, oxida-se e ento reduzida por uma segunda molcula de substrato. Embora um nico substrato esteja envolvido, a existncia de um intermedirio que uma enzima modificada significa que o mecanismo de catlise um mecanismo ping-pong (tipo de mecanismo discutido mais abaixo).

[editar]Cintica

de MichaelisMenten

Curva de saturao para uma enzima mostrando a relao entre a concentrao do substrato (abcissas) e a velocidade de reaco (ordenadas).

As reaces catalisadas por enzimas so saturveis, e a sua velocidade de catlise no indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reaco medida sobre uma escala de concentraes de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reaco (v) aumenta com o acrscimo de [S]. Todavia, medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor mximo Vmax. No modelo da cintica de Michaelis-Menten de uma reaco mono-substrato existe uma reaco bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimtico para a reaco unimolecular possa ser bastante

complexo, h tipicamente um passo na determinao da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo cataltico simples de velocidade constante k2. (Eq. 1). k2 tambm designado como kcat ou turnover, o valor mximo de reaces enzimticas catalisadas por segundo. Com baixas concentraes de substrato [S], a enzima permanece em equilbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] custa de [E], mudando o equilbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reaco depende da concentrao [ES], a velocidade sensvel a pequenas alteraes de [S]. Todavia, com altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condies, a velocidade (vk2[E]tot=Vmax) insensvel a pequenas alteraes de [S]; assim, [E]tot a concentrao total enzimtica

que aproximadamente igual concentrao [ES] em condies de saturao.

A equao de MichaelisMenten[7] descreve como a velocidade de reaco v depende da posio do equilbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis eMenten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximao de equilbrio), pode obter-se a seguinte equao:

(Eq. 2) Esta equao de Michaelis-Menten a base da maior parte da cintica enzimtica mono-substrato. A constante de Michaelis Km definida como a concentrao para a qual a velocidade da reaco enzimtica metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equao de Michaelis-Menten. Se o passo de determinao da velocidade for lento, quando comparado com a dissociao do substrato (k2 << k-1), ento a constante de Michaelis Km aproximadamente constante de dissociao do complexo ES, embora tal situao seja relativamente rara. A situao mais normal d-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cintica de Briggs-Haldane.[8] A equao ainda se verifica em condies mais gerais, como provm daaproximao ao estado estacionrio. Durante o perodo inicial, a velocidade de reaco v relativamente constante, indicando que [ES] tambm aproximadamente constante (cf. equao 1):

Assim, a concentrao [ES] dada pela frmula

em que a constante de Michaelis Km definida por

([E] a concentrao de enzima livre). Em conjunto, a frmula geral para a velocidade de reaco v vem pela equao de Michaelis-Menten:

A constante de especificidade

uma medida da

eficincia de converso pela enzima do substrato em produto. Usando a definio da constante de Michaelis escreve-se na forma , a equao

sendo [E] a concentrao de enzima livre. Assim, a constante de especificidade um modo eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres na reaco com substrato livre para formao de produto. A constante de especificidade limitada pela frequncia com que o substrato e a enzima se encontram na soluo, podendo atingir 1010 M1 s1.[9] Esta taxa mxima amplamente no dependente da dimenso do substrato ou da enzima.[10] A razo entre constantes de especificidade para dois substratos uma comparao quantitativa da eficincia da enzima na converso dos substratos. O declive do grfico de Michaelis-Menten com baixa concentrao de substrato [S] (i.e. [S] << Km) tambm resulta na constante de especificidade.

[editar]Representao

da equao de

Michaelis-Menten
Ver artigo principal: Diagrama de Lineweaver-Burke Ver artigo principal: Diagrama de Eadie-Hofstee

O grfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recproco mostra o significado dos pontos de intercepo entre a recta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade.

O grfico de velocidade face a [S] mostrado anteriormente no linear. Embora a baixas concentraes de substrato se mantenha linear, vai curvando medida que aumenta a concentrao de substrato. Antes da chegada dos

computadores, que permitem ajustar regresses no lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difcil estimar os valores deKm e Vmax nos grficos no lineares. Isto deu lugar a que vrios investigadores concentrassem os seus esforos em desenvolver mtodos de linearizao da equao de Michaelis-Menten, dando como resultado o grfico de Lineweaver-Burke, o diagrama de Eadie-Hofstee e o grfico de Hanes-Woolf. Com o seguinte tutorial da cintica de MichaelisMenten realizado na Universidade de Virgnia , pode-se simular o comportamento de uma enzima variando as constantes cinticas. O grfico de Lineweaver-Burk ou representao de duplo recproco a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados cinticos, apesar de no ser a mais fivel. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equao de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representao uma linha recta cuja equao e = mx + c, sendo o ponto de intercepo entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepo entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.
a

Evidentemente no se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mnimo valor possvel 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentrao infinita de substrato, e da 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intercepo entre a recta e o eixo x uma extrapolao de dados experimentais obtidos em laboratrio. Geralmente, os grficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentraes de substrato e isto pode dar lugar a estimativas no muito exactas de Vmax e de Km.[11] Um modelo linear muito mais exacto o diagrama de Eadie-Hofstee, mas nas investigaes cientficas actuais, todo este tipo de linearizaes tornou-se obsoleto e foi substitudo por mtodos mais fiveis baseados na anlise de regresso no linear. Para analisar os dados conveniente a normalizao dos mesmos, j que isto pode

ajudar diminuio da quantidade de trabalho experimental a realizar e incremento da fiabilidade da anlise.[12]

[editar]Importncia

prtica das constantes

cinticas
O estudo da cintica enzimtica importante por duas razes principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinticas acima definidas, Km e Vmax, so crticas na compreenso do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo. Fazer estas previses no trivial, mesmo para sistemas simples. Por exemplo, o oxaloacetato formado pela malato desidrogenase no interior da mitocndria e pode ser consumido pela citrato sintase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou a transaminase glutmico-oxalactica, entrando no ciclo do cido ctrico, gluconeognese ou biossntese docido asprtico, respectivamente. A capacidade de previso de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua concentrao e da concentrao e cintica de cada uma das enzimas. Esta capacidade preditiva do comportamento metablico atinge a sua expresso mais complexa na sntese de grandes quantidades de dados cinticos e genticos em modelos matemticos de organismos inteiros. Embora este objectivo seja longnquo para qualquer eucariota, fazem-se tentativas para atingi-lo nas bactrias, com modelos do metabolismo da Escherichia coli.[13][14]

[editar]Reaces

multi-substrato

As reaes multi-substrato seguem uma srie de complexas equaes que descrevem como se unem os substratos e em que ordem o fazem. A anlises destas reaes muito mais simples se a concentrao do substrato A se mantiver constante e a do substrato B

variar. Nestas condies, a enzima se comporta igual a uma enzima de nico substrato, pelo que num grfico de velocidade a concentrao do substrato dar um dos valores aparentes das constantes cinticas, Km e Vmax, para o substrato B. Se se realizarem uma srie de medidas a diferentes concentraes fixas de substrato A, os dados obtidos permitiro saber a que tipo de mecanismo pertence a reao enzimtica. Para uma enzima que una dois substratos A e B, e os transforme em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismos descritos.

[editar]Mecanismos

de complexo ternrio

Mecanismo de complexo ternrio para uma reaco enzimtica. A enzima E une os substratos A e B e liberta os produtos P e Q em ordem no definida.

As enzimas (E) que apresentam este mecanismo de reaco unem ao mesmo tempo os dois substratos (A e B), dando lugar a um complexo ternrio EAB. A ordem sequencial da unio dos substratos pode ser ao acaso (mecanismo aleatrio) ou seguir uma ordem em particular (mecanismo ordenado). Se se fixar a concentrao do substrato A e variar a de B, ao representar-se graficamente o comportamento da enzima mediante um diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas com um ponto de interseco comum a todas elas. Entre as enzimas que apresentam este mecanismo podemos encontrar a glutatio S-transferase,[15] a dihidrofolato redutase[16] e a DNA polimerase.[17] As seguintes ligaes mostram animaes do mecanismo de complexo ternrio da di-hidrofolato redutase polimerase .

e da DNA

[editar]Mecanismos

pingpong

Como se pode ver na figura da direita, as enzimas com um mecanismo de ping-pong podem apresentar dois estados: a conformao normal (E) e a conformao modificada quimicamente (E*) ou conformao intermdia. Nesse tipo de mecanismo, o substrato A une-se enzima E, que passa a um estado intermedirio E*, por exemplo, por transferncia de um grupo qumico ao centro activo da enzima, podendo j ser libertado na forma de produto P. Apenas quando o substrato A foi j libertado do centro activo da enzima se pode unir ao substrato B, que devolve a enzima modificada E* ao seu estado original E, e libertlo em forma de produto Q. Se se fixar a concentrao de A e variar a de B, e se se representar graficamente uma enzima com mecanismo de ping-pong num diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas paralelas entre si.

Mecanismo de ping-pong para uma reao enzimtica. A unio dos substratos A e B tem lugar numa ordem definida e sequencial, por meio de um intermedirio enzimtico modificado, E*.

Entre as enzimas com este tipo de mecanismo encontramse algumas oxirredutases, como a tiorredoxima peroxidase,[18] transferases, como a acilneuraminato citidilo transferase,[19] e proteases de serina, como atripsina e a quimiotripsina.[20] As proteases de serina formam uma famlia diversa de enzimas muito comuns, que incluem enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina e elastase), vrias enzimas do processo de coagulao e muitas outras. Nas proteases de serina, o estado intermedirio E* uma espcie acilada numa serina do centro cataltico da enzima. Mostra-se uma animao do mecanismo cataltico da quimiotripsina na ligao seguinte: .

[editar]Cintica

no-michaeliana

Ver artigo principal: Regulao alostrica Algumas reaces enzimticas do lugar a curvas do tipo sigmide, ao ser representadas numa curva de saturao, o que pode indicar uma ligao cooperativa do substrato ao centro cataltico da enzima. Isto significa que a unio de uma molcula de substrato influencia a unio das molculas de substrato posteriores. Este comportamento o mais comum nas enzimas multimricas, que apresentam diversas zonas de interaco com o substrato.[21] O mecanismo de cooperao semelhante ao observado na hemoglobina. A unio de una molcula de substrato a uma das zonas de interaco altera significativamente a afinidade pelo substrato das restantes zonas de interaco. As enzimas com este tipo de comportamento so denominadas alostricas. A cooperatividade positiva tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida incrementa a afinidade do resto de zonas de interaco. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida reduz a afinidade da enzima por novas molculas de substrato. Exemplos de enzimas com cooperatividade positiva incluem a aspartato transcarbamilase bacteriana [22] e a fosfofructoquinase,[23] e com cooperatividade negativa, a tirosilo-RNAt transferase de mamferos.[24] A cooperatividade um fenmeno bastante comum e pode chegar a ser crucial na regulao da resposta enzimtica a mudanas na concentrao de substrato. A cooperatividade positiva faz que a enzima seja muito mais sensvel concentrao de substrato. Com isto, a actividade pode chegar a variar fortemente, mesmo em intervalos muito estreitos de concentrao de substrato. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa faz com que a enzima seja insensvel a pequenas mudanas na concentrao de substrato. A equao de Hill [25] pode ser utilizada para descrever quantitativamente o grau de cooperatividade em cinticas no michaelianas. O coeficiente de Hill (n) indica quantas

das zonas de unio de substrato de uma enzima afectam a afinidade da unio do substrato no resto das zonas de unio. O coeficiente de Hill pode tomar valores maiores ou menores que 1:

n < 1: indica cooperatividade negativa. n > 1: indica cooperatividade positiva.

[editar]Cintica

do estado pr-

estacionrio

Curva do progresso pr-estacionrio, mostrando a fase inicial de uma reaco enzimtica.

Ao realizar um ensaio enzimtico e misturar a enzima com o substrato, existe um breve perodo inicial em que no se produz nem sntese de produto, nem estado intermdio da enzima. O estudo dos milissegundos seguintes mistura denominado cintica do estado pr-estacionrio e est relacionado com a formao e consumo dos intermedirios enzima-substrato (ES ou E*) at ao momento em que se alcanam certas concentraes e comea o estado estacionrio. A primeira enzima em que se estudou este processo, durante a reaco de hidrlise, foi a quimiotripsina.[26] A deteco de intermedirios costuma ser a principal prova necessria para saber sob que mecanismo actua a enzima. Por exemplo, ao realizar um ensaio de cintica rpida de uma reaco enzimtica governada por um mecanismo de ping-pong, pode seguir-se a libertao de produto P e

medir a formao de intermedirios enzimticos modificados E*.[27] No caso da quimiotripsina, o intermedirio enzimtico produzido por um ataque nucleoflico do substrato a uma serina do centro cataltico, o que gera uma forma intermediria acilada da quimiotripsina. Na figura da direita, pode-se observar como a enzima passa rapidamente a um estado intermdio E* durante os primeiros segundos da reaco. Posteriormente, quando alcanado o estado estacionrio, a velocidade diminui. Esta primeira fase da reaco proporciona a taxa de converso da enzima. Portanto, a quantidade de produto liberado durante esta fase (que pode obter-se prolongando a recta correspondente ao estado estacionrio at cortar o eixo y) tambm d a quantidade de enzima funcional presente no ensaio.[28]

[editar]Mecanismo

qumico

Um dos objectivos mais importantes no estudo da cintica enzimtica determinar o mecanismo qumico que subjaza na reaco enzimtica, por exemplo, determinar a sequncia ordenada de eventos que ocorrem na transformao de substrato em produto. As aproximaes cinticas discutidas anteriormente podem proporcionar informao relacionada com a velocidade de reaco dos intermedirios enzimticos formados, mas no iro permitir identificar que intermedirios so formados. Com o intuito de determinar a etapa limitante da reaco ou os intermedirios que se formam durante a mesma, podem fazer-se ensaios enzimticos em diversas condies com enzimas ou substratos ligeiramente modificados, que tragam dados relacionados. Um exemplo caracterstico de etapa limitante de uma reaco aquela na qual se rompe umaligao covalente dando lugar a um tomo de hidrognio. Se se trocar cada tomo de hidrognio pelo seu istopo estvel, o deutrio, poderemos saber qual dos possveishidrognios transferidos o que determina a etapa limitante. A velocidade sofrer uma

variao quando o hidrognio crtico seja substitudo, devido ao efeito isotpico cinticoprimrio, cuja origem se encontra na maior estabilidade das pontes de deutrio, mais difceis de romper que as de hidrognio.[29] Tambm possvel medir efeitos similares por meio de outras substituies isotpicas, tais como 13C/12C ou 18O/16O, mas os efeitos produzidos nestes casos so mais difceis de detectar. Os istopos tambm podem ser utilizados para obter informao sobre o destino de diversas partes da molcula de substrato quando este transformado em produto. Por exemplo, por vezes difcil determinar a origem de um tomo de oxignio no produto final, j que pode vir da gua ou da molcula de substrato. Isto pode resolver-se mediante a substituio sistemtica dos tomos de oxignio das molculas que participem na reaco, pelo seu istopo estvel 18O, fazendo depois uma procura do istopo no produto obtido. O mecanismo qumico tambm pode ser elucidado estudando os efeitos cinticos e isotpicos sob diferentes condies de pH,[30] alterando os nveis de ies metlicos ou outros cofactores,[31] por mutagnese dirigida de aminocidos conservados, ou pelo estudo do comportamento da enzima na presena de anlogos do substrato.

[editar]Inibio

enzimtica

Ver artigo principal: Inibio enzimtica

Esquema cintico para inibidores enzimticos reversveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor

Os inibidores enzimticos so molculas que reduzem ou eliminam a actividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversveis (quando a remoo do inibidor restaura a actividade enzimtica) e os irreversveis (quando o inibitor inactiva de modo permanente a enzima).

[editar]Inibidores

reversveis

Os inibidores enzimticos reversveis podem ser classificados como competitivos, acompetitivos, nocompetitivos emistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinticas Km e Vmax. Este efeito depender da unio do inibidor enzima E, ao complexo enzimasubstrato ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cintica enzimtica em funo da concentrao de inibidor. Os quatro tipos de inibio do lugar a diagramas de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee [11] que variam de diferente forma com a concentrao de inibidor. Para abreviar, usam-se dois smbolos:

y onde Ki e K'i so as constantes de dissociao para se unir enzima e ao complexo enzima-substrato, respectivamente. Na presena de um inibidor reversvel, os valores aparentes de Km e Vmax passam a ser (/')Km e (1/')Vmax, respectivamente, como se pode ler na tabela abaixo para os casos mais comuns.

Tipo de inibio ( apenas Ki ) apenas Ki' ( ) ( Ki = Ki' ) ( Ki Ki' ) mista no competitiva acompetitiva competitiva

Km aparente

Vmax aparente

Os ajustes por regresso no linear dos dados de cintica enzimtica [32] podem proporcionar estimativas muito precisas das constantes de disociao Ki e Ki'.

[editar]Inibidores

irreversveis

Os inibidores enzimticos tambm se podem unir e inactivar uma enzima de forma irreversvel, geralmente por meio de modificaes covalentes de resduos do centro cataltico da enzima. Estas reaces decaem de forma exponencial e so habitualmente saturveis. Abaixo dos nveis de saturao, mantm uma cintica de primeira ordem em relao ao inibidor.

[editar]Mecanismos

de catlise

Ver artigo principal: Catlise enzimtica

A variao de energia como funo de uma coordenada de reaco mostra a estabilizao do estado de transio quando essa reaco efectuada por umaenzima.

O modelo de ajuste induzido o mais utilizado em estudos de interaco enzima-substrato.[33] Este modelo prope que as interaces iniciais entre a enzima e o substrato so relativamente dbeis, embora suficientes para produzir certas

mudanas estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a fora da interaco. Estas mudanas de forma implicam uma srie de aminocidoscatalticos do centro activo, nos quais se produzem as ligaes qumicas correspondentes entre a enzima e o substrato. Depois da unio, um ou mais mecanismos de catlise diminuem a energia doestado de transio da reaco, por meio de uma via alternativa reaco. Os mecanismos de catlise classificam-se com base em diferentes critrios: catlise covalente, catlise por proximidade e alinhamento de orbitais, catlise cido-base geral, catlise por ies metlicos e catlise electrosttica. Os estudos de cintica enzimtica no permitem obter o tipo de catlise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinticos podem proporcionar uma srie de indcios que levem a realizar outro tipo de estudos dirigidos a determinar certo tipo de catlise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cintica do estado pr-estacionrio poder estar a sugerir uma catlise de tipo covalente. Por outro lado, variaes no pH podem produzir efeitos drsticos em V max mas no em Km, o que poderia indicar que um resduo do centro activo precisa um estado concreto de ionizao para que se possa efectuar a catlise enzimtica.

[editar]Notas
. ^ Link: Interactive MichaelisMenten kinetics tutorial (Java required) . ^ Link: dihydrofolate reductase mechanism (Gif) . ^ Link: DNA polymerase mechanism (Gif) . ^ Link: Chymotrypsin mechanism (Flash required)

Referncias
1. Ebbing, D.D. General chemistry (4th ed.) Houghton Mifflin Co. 1993, ISBN 0-395-63696-5

2.

Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) ISBN 0-19-963820-9

3.

Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141

4.

Lu H. (2004). "Single-molecule spectroscopy studies of conformational change dynamics in enzymatic reactions". Current pharmaceutical biotechnology 5 (3): 261-9. PMID 15180547.

5.

Schnell J, Dyson H, Wright P. (2004). "Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase". Annual review of biophysics and biomolecular structure 33: 11940. PMID 15139807.

6.

Hammann C, Lilley DM. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem. 2002 Aug 2;3(8):690700. PMID 11779233

7.

Michaelis L., Menten M.L. Kinetik der Invertinwirkung Biochem. Z. 1913; 49:333 369 Traduo do artigo Kinetik der Invertinwirkung em ingls Acesso 6 Abril 2007

8.

Briggs GE, Haldane JB. A Note on the Kinetics of Enzyme Action. Biochem J. 1925;19(2):3389. PMID 16743508

9.

Stroppolo ME, Falconi M, Caccuri AM, Desideri A. (2001). "Superefficient enzymes". Cell. Mol. Life Sci. 58 (10): 1451 60. PMID 11693526.

10. Davis ME, Madura JD, Sines J, Luty BA, Allison SA, McCammon JA. (1991). "Diffusioncontrolled enzymatic reactions". Meth. Enzymol. 202: 47397. PMID 1784185. 11.
a b

Tseng SJ, Hsu JP. A comparison of the

parameter estimating procedures for the MichaelisMenten model. J Theor Biol. 1990 Aug 23;145(4):45764. PMID 2246896

12. Bravo, I.G., Busto, F., De Arriaga, D., Ferrero, M. A., Rodrguez-Aparicio, L. B., MartnezBlanco H., Reglero, A. A normalised plot as a novel and time-saving tool in complex enzyme kinetic analysis Biochem. J. (2001). 358, 573583. PMID 11577687 13. Almaas E, Kovacs B, Vicsek T, Oltvai ZN, Barabasi AL. Global organization of metabolic fluxes in the bacterium Escherichia coli. Nature. 2004 Feb 26;427(6977):839-43. PMID 14985762 14. Reed JL, Vo TD, Schilling CH, Palsson BO. An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR). Genome Biol. 2003;4(9):R54. PMID 12952533 15. Dirr H, Reinemer P, Huber R. X-ray crystal structures of cytosolic glutathione Stransferases. Implications for protein architecture, substrate recognition and catalytic function. Eur J Biochem. 1994 Mar 15;220(3):645-61. PMID 8143720 16. Stone SR, Morrison JF. Dihydrofolate reductase from Escherichia coli: the kinetic mechanism with NADPH and reduced acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate as substrates.Biochemistry. 1988 Jul 26;27(15):5493-9. PMID 3052577 17. Fisher PA. Enzymologic mechanism of replicative DNA polymerases in higher eukaryotes. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994;47:371-97. PMID 8016325 18. Akerman SE, Muller S. 2-Cys peroxiredoxin PfTrx-Px1 is involved in the antioxidant defence of Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 2003 Aug 31;130(2):75-81. PMID 12946843 19. Bravo, I.G., Barrallo, S., Ferrero, M. A., Rodrguez-Aparicio, L. B., Martnez-Blanco H., Reglero, A. "Kinetic properties of the

Acylneuraminate Cytidylytransferase from Pasteurella haemolytica A2". Biochem. J. (2001) 358, 585-598. [1] 20. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu Rev Biochem. 1977;46:331-58. PMID 332063 21. Ricard J, Cornish-Bowden A. Co-operative and allosteric enzymes: 20 years on. Eur J Biochem. 1987 Jul 15;166(2):255-72. PMID 3301336 22. Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH., Allosteric regulation of catalytic activity: Escherichia coli aspartate transcarbamoylase versus yeast chorismate mutase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001 Sep;65(3):404-21 PMID 11528003 23. Schirmer T, Evans PR., Structural basis of the allosteric behaviour of phosphofructokinase. Nature. 1990 Jan 11;343(6254):140-5. PMID 2136935 24. Ward WH, Fersht AR., Tyrosyl-tRNA synthetase acts as an asymmetric dimer in charging tRNA. A rationale for half-of-the-sites activity. Biochemistry. 1988 Jul 26;27(15):552530.PMID 3179266 25. Hill, A. V. The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves. J. Physiol. (Lond.), 1910 40, iv-vii. 26. Hartley B.S., Kilby B.A. The reaction of pnitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin. Biochem J. 1954 Feb;56(2):28897. PMID 13140189 27. Alan Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science : A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman, 1998. ISBN 0-7167-3268-8 28. Bender ML, Begue-Canton ML, Blakeley RL, Brubacher LJ, Feder J, Gunter CR, Kezdy FJ,

Killheffer JV Jr, Marshall TH, Miller CG, Roeske RW, Stoops JK. The Determination of the Concentration of Hydrolytic Enzyme Solutions : a-Chymotrypsin, Trypsin, Papain, Elastase, Subtilisin, and Acetylcholinesterase. J Am Chem Soc. 1966 Dec 20;88(24):5890-913. PMID 5980876 29. Cleland WW. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. Arch Biochem Biophys. 2005 Jan 1;433(1):2-12. PMID 15581561 30. Cleland WW. Use of isotope effects to elucidate enzyme mechanisms. CRC Crit Rev Biochem. 1982;13(4):385-428. PMID 6759038 31. Christianson DW, Cox JD. Catalysis by metalactivated hydroxide in zinc and manganese metalloenzymes. Annu Rev Biochem. 1999;68:33-57. PMID 10872443 32. Leatherbarrow RJ. Using linear and non-linear regression to fit biochemical data. Trends Biochem Sci. 1990 Dec;15(12):4558. PMID 2077683 33. Koshland DE, Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1958 Feb;44(2):98104. PMID 16590179

[editar]Leituras .

adicionais

Cintica enzimtica
Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre.

Imagem gerada por computador de um modelo da estrutura tridimensional da enzima purina nuclesido fosforilase bacteriana.

A cintica enzimtica estuda as reaces qumicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reaco. O estudo da cintica de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo cataltico, o seu papel nometabolismo, como controlada a sua actividade na clula e como pode ser inibida a sua actividade por drogas ouvenenos, ou potenciada por outro tipo de molculas.
ndice
[esconder]

1 Introduo

1.1 Enzimas

2 Princpios gerais 3 Ensaios enzimticos 4 Reaces mono-substrato

o o o

4.1 Cintica de MichaelisMenten 4.2 Representao da equao de Michaelis-Menten 4.3 Importncia prtica das constantes cinticas

5 Reaces multi-substrato

5.1 Mecanismos de complexo ternrio

5.2 Mecanismos pingpong

6 Cintica no-michaeliana 7 Cintica do estado pr-estacionrio 8 Mecanismo qumico 9 Inibio enzimtica

o o

9.1 Inibidores reversveis 9.2 Inibidores irreversveis

10 Mecanismos de catlise 11 Notas 12 Referncias 13 Leituras adicionais 14 Ligaes externas

[editar]Introduo [editar]Enzimas
Ver artigo principal: Enzima As enzimas so macromolculas com a capacidade de manipular outras molculas, denominadas substratos. Um substrato pode unir-se ao centro cataltico da enzima que o reconhea e transformar-se num produto ao longo de uma srie de passos denominados mecanismo enzimtico. Algumas enzimas podem unir vrios substratos diferentes e/ou libertar diversos produtos, como o caso das proteases ao romper uma protena em dois polipptidos. Noutros casos, produz-se a unio simultnea de dois substratos, como no caso da DNA polimerase, que capaz de incorporar um nucletido (substrato 1) a uma cadeia de ADN (substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa srie de passos, tambm podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda a reaco. Este passo limitante pode consistir numa reaco qumica ou numa mudana de forma da enzima ou do substrato. O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas til na interpretao dos dados cinticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto durante a catlise, que mudanas de forma ocorrem durante a reaco, ou mesmo o papel em particular de determinados aminocidos no mecanismo cataltico. Algumas enzimas modificam a sua forma significativamente durante a reaco, em cujo caso pode ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se anlogos que se unem mas no permitem levar a cabo a reaco e mantm a enzima permanentemente na forma de substrato unido).

Os mecanismos enzimticos podem ser divididos em mecanismos de substrato nico e mecanismos de mltiplos substratos. Os estudos cinticos com enzimas que apenas unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una enzima que une vrios substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cintica enzimtica pode mostrar tambm a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos. Nem todas as catlises biolgicas so efectuadas por enzimas proteicas. Existem molculas catalticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e a traduo do ARNm, respectivamente. A principal diferena entre as ribozimas e os ribossomas radica no limitado nmero de reaces que as primeiras podem efectuar, embora os seus mecanismos de reaco e as suas cinticas possam ser estudados e classificados pelos mesmos mtodos.

[editar]Princpios

gerais

A velocidade de reaco aumenta com a concentrao do substrato, eventualmente ficando a enzima saturada a altas concentraes de substrato.

A reaco catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reao no catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catlise, as enzimas no alteram em absoluto oequilbrio da reaco entre substrato e produto.[1] Ao contrrio do que acontece noutras reaces qumicas, as enzimassaturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalticos estaro ocupados, o que incrementar a eficincia da reaco, at ao momento em que todos os stios possveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se- alcanado o ponto de saturao da enzima e, embora se adicione mais substrato, no aumentar mais a eficincia. As duas propriedades cinticas mais importantes de uma enzima so: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto mximo de saturao. O conhecimento destas propriedades torna possvel formular hipteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responder frente a mudanas nessas condies.

[editar]Ensaios

enzimticos

Ensaios enzimticos so procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reaces enzimticas. Uma vez que as enzimas no so consumidas pelas reaces que catalisam, nos

ensaios seguem-se habitualmente mudanas na concentrao de substratos ou produtos para medir a taxa de reaco. H vrios mtodos de medida: os ensaiosespectrofotomtricos medem a mudana de absorbncia da luz entre produtos e reagentes; ensaios radiomtricos envolvem a incorporao ou libertao de radioactividade para medir a quantidade de produto que surge ao longo do tempo. Os ensaios espectrofotomtricos so mais convenientes pois permitem a medio contnua da velocidade de reaco. Embora os ensaios radiomtricos exijam a remoo e contagem de amostras (ou seja, so ensaios descontnuos), so habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vrios nveis da actividade enzimtica.[2] Uma abordagem anloga usada na espectrometria de massa para aferir a incorporao ou libertao de istopos estveis medida que o substrato convertido em produto. Os ensaios enzimticos mais sensveis usam lasers focados por um microscpio para observar mudanas em molculas enzimticas individuais medida que decorre a reaco. Estas medidas usam geralmente mudanas na fluorescncia de cofactores durante o mecanismo de reaco, ou fluorforos adicionados a locais especficos da protena que registam movimentos que ocorrem durante a catlise.[3] Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cintica e dinmica de molculas individuais, em oposio tradicional cintica enzimtica, que observa o comportamento mdio de populaes com milhes de molculas enzimticas.[4][5]

[editar]Reaces

mono-substrato

Entre as enzimas com mecanismos mono-substrato incluem-se as isomerases como a triose-fosfato isomerase ou bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como aadenilato ciclase e a ribozima, uma liase de RNA.[6] Porm, algumas enzimas que apenas tm um substrato no se agrupam nesta categoria de mecanismos. A catalase um exemplo, pois reage com uma molcula de substrato de perxido de hidrognio, oxida-se e ento reduzida por uma segunda molcula de substrato. Embora um nico substrato esteja envolvido, a existncia de um intermedirio que uma enzima modificada significa que o mecanismo de catlise um mecanismo ping-pong (tipo de mecanismo discutido mais abaixo).

[editar]Cintica

de MichaelisMenten

Curva de saturao para uma enzima mostrando a relao entre a concentrao do substrato (abcissas) e a velocidade de reaco (ordenadas).

As reaces catalisadas por enzimas so saturveis, e a sua velocidade de catlise no indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reaco medida sobre uma escala de concentraes de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reaco (v) aumenta com o acrscimo de [S]. Todavia, medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor mximo Vmax. No modelo da cintica de Michaelis-Menten de uma reaco mono-substrato existe uma reaco bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimtico para a reaco unimolecular possa ser bastante

complexo, h tipicamente um passo na determinao da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo cataltico simples de velocidade constante k2. (Eq. 1). k2 tambm designado como kcat ou turnover, o valor mximo de reaces enzimticas catalisadas por segundo. Com baixas concentraes de substrato [S], a enzima permanece em equilbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] custa de [E], mudando o equilbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reaco depende da concentrao [ES], a velocidade sensvel a pequenas alteraes de [S]. Todavia, com altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condies, a velocidade (vk2[E]tot=Vmax) insensvel a pequenas alteraes de [S]; assim, [E]tot a concentrao total enzimtica

que aproximadamente igual concentrao [ES] em condies de saturao. A equao de MichaelisMenten[7] descreve como a velocidade de reaco v depende da posio do equilbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis eMenten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximao de equilbrio), pode obter-se a seguinte equao:

(Eq. 2) Esta equao de Michaelis-Menten a base da maior parte da cintica enzimtica mono-substrato. A constante de Michaelis Km definida como a concentrao para a qual a velocidade da reaco enzimtica metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equao de Michaelis-Menten. Se o passo de determinao da velocidade for lento,

quando comparado com a dissociao do substrato (k2 << k-1), ento a constante de Michaelis Km aproximadamente constante de dissociao do complexo ES, embora tal situao seja relativamente rara. A situao mais normal d-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cintica de Briggs-Haldane.[8] A equao ainda se verifica em condies mais gerais, como provm daaproximao ao estado estacionrio. Durante o perodo inicial, a velocidade de reaco v relativamente constante, indicando que [ES] tambm aproximadamente constante (cf. equao 1):

Assim, a concentrao [ES] dada pela frmula

em que a constante de Michaelis Km definida por

([E] a concentrao de enzima livre). Em conjunto, a frmula geral para a velocidade de reaco v vem pela equao de Michaelis-Menten:

A constante de especificidade

uma medida da

eficincia de converso pela enzima do substrato em produto. Usando a definio da constante de Michaelis escreve-se na forma , a equao

sendo [E] a concentrao de enzima livre. Assim, a constante de especificidade um modo eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres na reaco com substrato livre para formao de produto. A constante de especificidade limitada pela frequncia com que o substrato e a enzima se encontram na soluo, podendo atingir 1010 M1 s1.[9] Esta taxa mxima amplamente no dependente da dimenso do substrato ou da enzima.[10] A razo entre constantes de especificidade para dois substratos uma

comparao quantitativa da eficincia da enzima na converso dos substratos. O declive do grfico de Michaelis-Menten com baixa concentrao de substrato [S] (i.e. [S] << Km) tambm resulta na constante de especificidade.

[editar]Representao

da equao de

Michaelis-Menten
Ver artigo principal: Diagrama de Lineweaver-Burke Ver artigo principal: Diagrama de Eadie-Hofstee

O grfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recproco mostra o significado dos pontos de intercepo entre a recta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade.

O grfico de velocidade face a [S] mostrado anteriormente no linear. Embora a baixas concentraes de substrato se mantenha linear, vai curvando medida que aumenta a concentrao de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regresses no lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difcil estimar os valores deKm e Vmax nos grficos no lineares. Isto deu lugar a que vrios investigadores concentrassem os seus esforos em desenvolver mtodos de linearizao da equao de Michaelis-Menten, dando como resultado o grfico de Lineweaver-Burke, o diagrama de Eadie-Hofstee e o grfico de Hanes-Woolf. Com o seguinte tutorial da cintica de MichaelisMenten realizado na Universidade de Virgnia , pode-se simular o comportamento de uma enzima variando as constantes cinticas.
a

O grfico de Lineweaver-Burk ou representao de duplo recproco a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados cinticos, apesar de no ser a mais fivel. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equao de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representao uma linha recta cuja equao e = mx + c, sendo o ponto de intercepo entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepo entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.

Evidentemente no se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mnimo valor possvel 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentrao infinita de substrato, e da 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intercepo entre a recta e o eixo x uma extrapolao de dados experimentais obtidos em laboratrio. Geralmente, os grficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentraes de substrato e isto pode dar lugar a estimativas no muito exactas de Vmax e de Km.[11] Um modelo linear muito mais exacto o diagrama de Eadie-Hofstee, mas nas investigaes cientficas actuais, todo este tipo de linearizaes tornou-se obsoleto e foi substitudo por mtodos mais fiveis baseados na anlise de regresso no linear. Para analisar os dados conveniente a normalizao dos mesmos, j que isto pode ajudar diminuio da quantidade de trabalho experimental a realizar e incremento da fiabilidade da anlise.[12]

[editar]Importncia

prtica das constantes

cinticas
O estudo da cintica enzimtica importante por duas razes principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinticas acima definidas, Km e Vmax, so crticas

na compreenso do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo. Fazer estas previses no trivial, mesmo para sistemas simples. Por exemplo, o oxaloacetato formado pela malato desidrogenase no interior da mitocndria e pode ser consumido pela citrato sintase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou a transaminase glutmico-oxalactica, entrando no ciclo do cido ctrico, gluconeognese ou biossntese docido asprtico, respectivamente. A capacidade de previso de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua concentrao e da concentrao e cintica de cada uma das enzimas. Esta capacidade preditiva do comportamento metablico atinge a sua expresso mais complexa na sntese de grandes quantidades de dados cinticos e genticos em modelos matemticos de organismos inteiros. Embora este objectivo seja longnquo para qualquer eucariota, fazem-se tentativas para atingi-lo nas bactrias, com modelos do metabolismo da Escherichia coli.[13][14]

[editar]Reaces

multi-substrato

As reaes multi-substrato seguem uma srie de complexas equaes que descrevem como se unem os substratos e em que ordem o fazem. A anlises destas reaes muito mais simples se a concentrao do substrato A se mantiver constante e a do substrato B variar. Nestas condies, a enzima se comporta igual a uma enzima de nico substrato, pelo que num grfico de velocidade a concentrao do substrato dar um dos valores aparentes das constantes cinticas, Km e Vmax, para o substrato B. Se se realizarem uma srie de medidas a diferentes concentraes fixas de substrato A, os dados obtidos permitiro saber a que tipo de mecanismo pertence a reao enzimtica. Para uma enzima que una dois substratos A e B, e os transforme em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismos descritos.

[editar]Mecanismos

de complexo ternrio

Mecanismo de complexo ternrio para uma reaco enzimtica. A enzima E une os substratos A e B e liberta os produtos P e Q em ordem no definida.

As enzimas (E) que apresentam este mecanismo de reaco unem ao mesmo tempo os dois substratos (A e B), dando lugar a um complexo ternrio EAB. A ordem sequencial da unio dos substratos pode ser ao acaso (mecanismo aleatrio) ou seguir uma ordem em particular (mecanismo ordenado). Se se fixar a concentrao do substrato A e variar a de B, ao representar-se graficamente o comportamento da enzima mediante um diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas com um ponto de interseco comum a todas elas. Entre as enzimas que apresentam este mecanismo podemos encontrar a glutatio S-transferase,[15] a dihidrofolato redutase[16] e a DNA polimerase.[17] As seguintes ligaes mostram animaes do mecanismo de complexo ternrio da di-hidrofolato redutase polimerase .

e da DNA

[editar]Mecanismos

pingpong

Como se pode ver na figura da direita, as enzimas com um mecanismo de ping-pong podem apresentar dois estados: a conformao normal (E) e a conformao modificada quimicamente (E*) ou conformao intermdia. Nesse tipo de mecanismo, o substrato A une-se enzima E, que passa a um estado intermedirio E*, por exemplo, por transferncia de um grupo qumico ao centro activo da enzima, podendo j ser libertado na forma de produto P. Apenas quando o substrato A foi j libertado do centro activo da enzima se pode unir ao substrato B, que devolve

a enzima modificada E* ao seu estado original E, e libertlo em forma de produto Q. Se se fixar a concentrao de A e variar a de B, e se se representar graficamente uma enzima com mecanismo de ping-pong num diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas paralelas entre si.

Mecanismo de ping-pong para uma reao enzimtica. A unio dos substratos A e B tem lugar numa ordem definida e sequencial, por meio de um intermedirio enzimtico modificado, E*.

Entre as enzimas com este tipo de mecanismo encontramse algumas oxirredutases, como a tiorredoxima peroxidase,[18] transferases, como a acilneuraminato citidilo transferase,[19] e proteases de serina, como atripsina e a quimiotripsina.[20] As proteases de serina formam uma famlia diversa de enzimas muito comuns, que incluem enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina e elastase), vrias enzimas do processo de coagulao e muitas outras. Nas proteases de serina, o estado intermedirio E* uma espcie acilada numa serina do centro cataltico da enzima. Mostra-se uma animao do mecanismo cataltico da quimiotripsina na ligao seguinte: .

[editar]Cintica

no-michaeliana

Ver artigo principal: Regulao alostrica Algumas reaces enzimticas do lugar a curvas do tipo sigmide, ao ser representadas numa curva de saturao, o que pode indicar uma ligao cooperativa do substrato ao centro cataltico da enzima. Isto significa que a unio de uma molcula de substrato influencia a unio das molculas de substrato posteriores. Este comportamento o mais comum nas enzimas multimricas, que apresentam diversas zonas de interaco com o substrato.[21] O mecanismo de cooperao semelhante ao observado na hemoglobina. A unio de una molcula de substrato a

uma das zonas de interaco altera significativamente a afinidade pelo substrato das restantes zonas de interaco. As enzimas com este tipo de comportamento so denominadas alostricas. A cooperatividade positiva tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida incrementa a afinidade do resto de zonas de interaco. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida reduz a afinidade da enzima por novas molculas de substrato. Exemplos de enzimas com cooperatividade positiva incluem a aspartato transcarbamilase bacteriana [22] e a fosfofructoquinase,[23] e com cooperatividade negativa, a tirosilo-RNAt transferase de mamferos.[24] A cooperatividade um fenmeno bastante comum e pode chegar a ser crucial na regulao da resposta enzimtica a mudanas na concentrao de substrato. A cooperatividade positiva faz que a enzima seja muito mais sensvel concentrao de substrato. Com isto, a actividade pode chegar a variar fortemente, mesmo em intervalos muito estreitos de concentrao de substrato. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa faz com que a enzima seja insensvel a pequenas mudanas na concentrao de substrato. A equao de Hill [25] pode ser utilizada para descrever quantitativamente o grau de cooperatividade em cinticas no michaelianas. O coeficiente de Hill (n) indica quantas das zonas de unio de substrato de uma enzima afectam a afinidade da unio do substrato no resto das zonas de unio. O coeficiente de Hill pode tomar valores maiores ou menores que 1:

n < 1: indica cooperatividade negativa. n > 1: indica cooperatividade positiva.

[editar]Cintica

do estado pr-

estacionrio

Curva do progresso pr-estacionrio, mostrando a fase inicial de uma reaco enzimtica.

Ao realizar um ensaio enzimtico e misturar a enzima com o substrato, existe um breve perodo inicial em que no se produz nem sntese de produto, nem estado intermdio da enzima. O estudo dos milissegundos seguintes mistura denominado cintica do estado pr-estacionrio e est relacionado com a formao e consumo dos intermedirios enzima-substrato (ES ou E*) at ao momento em que se alcanam certas concentraes e comea o estado estacionrio. A primeira enzima em que se estudou este processo, durante a reaco de hidrlise, foi a quimiotripsina.[26] A deteco de intermedirios costuma ser a principal prova necessria para saber sob que mecanismo actua a enzima. Por exemplo, ao realizar um ensaio de cintica rpida de uma reaco enzimtica governada por um mecanismo de ping-pong, pode seguir-se a libertao de produto P e medir a formao de intermedirios enzimticos modificados E*.[27] No caso da quimiotripsina, o intermedirio enzimtico produzido por um ataque nucleoflico do substrato a uma serina do centro cataltico, o que gera uma forma intermediria acilada da quimiotripsina. Na figura da direita, pode-se observar como a enzima passa rapidamente a um estado intermdio E* durante os primeiros segundos da reaco. Posteriormente, quando

alcanado o estado estacionrio, a velocidade diminui. Esta primeira fase da reaco proporciona a taxa de converso da enzima. Portanto, a quantidade de produto liberado durante esta fase (que pode obter-se prolongando a recta correspondente ao estado estacionrio at cortar o eixo y) tambm d a quantidade de enzima funcional presente no ensaio.[28]

[editar]Mecanismo

qumico

Um dos objectivos mais importantes no estudo da cintica enzimtica determinar o mecanismo qumico que subjaza na reaco enzimtica, por exemplo, determinar a sequncia ordenada de eventos que ocorrem na transformao de substrato em produto. As aproximaes cinticas discutidas anteriormente podem proporcionar informao relacionada com a velocidade de reaco dos intermedirios enzimticos formados, mas no iro permitir identificar que intermedirios so formados. Com o intuito de determinar a etapa limitante da reaco ou os intermedirios que se formam durante a mesma, podem fazer-se ensaios enzimticos em diversas condies com enzimas ou substratos ligeiramente modificados, que tragam dados relacionados. Um exemplo caracterstico de etapa limitante de uma reaco aquela na qual se rompe umaligao covalente dando lugar a um tomo de hidrognio. Se se trocar cada tomo de hidrognio pelo seu istopo estvel, o deutrio, poderemos saber qual dos possveishidrognios transferidos o que determina a etapa limitante. A velocidade sofrer uma variao quando o hidrognio crtico seja substitudo, devido ao efeito isotpico cinticoprimrio, cuja origem se encontra na maior estabilidade das pontes de deutrio, mais difceis de romper que as de hidrognio.[29] Tambm possvel medir efeitos similares por meio de outras substituies isotpicas, tais como 13C/12C ou 18O/16O, mas os efeitos produzidos nestes casos so mais difceis de detectar.

Os istopos tambm podem ser utilizados para obter informao sobre o destino de diversas partes da molcula de substrato quando este transformado em produto. Por exemplo, por vezes difcil determinar a origem de um tomo de oxignio no produto final, j que pode vir da gua ou da molcula de substrato. Isto pode resolver-se mediante a substituio sistemtica dos tomos de oxignio das molculas que participem na reaco, pelo seu istopo estvel 18O, fazendo depois uma procura do istopo no produto obtido. O mecanismo qumico tambm pode ser elucidado estudando os efeitos cinticos e isotpicos sob diferentes condies de pH,[30] alterando os nveis de ies metlicos ou outros cofactores,[31] por mutagnese dirigida de aminocidos conservados, ou pelo estudo do comportamento da enzima na presena de anlogos do substrato.

[editar]Inibio

enzimtica

Ver artigo principal: Inibio enzimtica

Esquema cintico para inibidores enzimticos reversveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor

Os inibidores enzimticos so molculas que reduzem ou eliminam a actividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversveis (quando a remoo do inibidor restaura a actividade enzimtica) e os irreversveis (quando o inibitor inactiva de modo permanente a enzima).

[editar]Inibidores

reversveis

Os inibidores enzimticos reversveis podem ser classificados como competitivos, acompetitivos, no-

competitivos emistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinticas Km e Vmax. Este efeito depender da unio do inibidor enzima E, ao complexo enzimasubstrato ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cintica enzimtica em funo da concentrao de inibidor. Os quatro tipos de inibio do lugar a diagramas de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee [11] que variam de diferente forma com a concentrao de inibidor. Para abreviar, usam-se dois smbolos:

y onde Ki e K'i so as constantes de dissociao para se unir enzima e ao complexo enzima-substrato, respectivamente. Na presena de um inibidor reversvel, os valores aparentes de Km e Vmax passam a ser (/')Km e (1/')Vmax, respectivamente, como se pode ler na tabela abaixo para os casos mais comuns.

Tipo de inibio ( apenas Ki ) apenas Ki' ( ) ( Ki = Ki' ) ( Ki Ki' ) mista no competitiva acompetitiva competitiva

Km aparente

Vmax aparente

Os ajustes por regresso no linear dos dados de cintica enzimtica [32] podem proporcionar estimativas muito precisas das constantes de disociao Ki e Ki'.

[editar]Inibidores

irreversveis

Os inibidores enzimticos tambm se podem unir e inactivar uma enzima de forma irreversvel, geralmente por meio de modificaes covalentes de resduos do centro cataltico da enzima. Estas reaces decaem de

forma exponencial e so habitualmente saturveis. Abaixo dos nveis de saturao, mantm uma cintica de primeira ordem em relao ao inibidor.

[editar]Mecanismos

de catlise

Ver artigo principal: Catlise enzimtica

A variao de energia como funo de uma coordenada de reaco mostra a estabilizao do estado de transio quando essa reaco efectuada por umaenzima.

O modelo de ajuste induzido o mais utilizado em estudos de interaco enzima-substrato.[33] Este modelo prope que as interaces iniciais entre a enzima e o substrato so relativamente dbeis, embora suficientes para produzir certas mudanas estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a fora da interaco. Estas mudanas de forma implicam uma srie de aminocidoscatalticos do centro activo, nos quais se produzem as ligaes qumicas correspondentes entre a enzima e o substrato. Depois da unio, um ou mais mecanismos de catlise diminuem a energia doestado de transio da reaco, por meio de uma via alternativa reaco. Os mecanismos de catlise

classificam-se com base em diferentes critrios: catlise covalente, catlise por proximidade e alinhamento de orbitais, catlise cido-base geral, catlise por ies metlicos e catlise electrosttica. Os estudos de cintica enzimtica no permitem obter o tipo de catlise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinticos podem proporcionar uma srie de indcios que levem a realizar outro tipo de estudos dirigidos a determinar certo tipo de catlise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cintica do estado pr-estacionrio poder estar a sugerir uma catlise de tipo covalente. Por outro lado, variaes no pH podem produzir efeitos drsticos em V max mas no em Km, o que poderia indicar que um resduo do centro activo precisa um estado concreto de ionizao para que se possa efectuar a catlise enzimtica.

[editar]Notas
. ^ Link: Interactive MichaelisMenten kinetics tutorial (Java required) . ^ Link: dihydrofolate reductase mechanism (Gif) . ^ Link: DNA polymerase mechanism (Gif) . ^ Link: Chymotrypsin mechanism (Flash required)

Referncias
1. Ebbing, D.D. General chemistry (4th ed.) Houghton Mifflin Co. 1993, ISBN 0-395-63696-5 2. Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) ISBN 0-19-963820-9 3. Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141 4. Lu H. (2004). "Single-molecule spectroscopy studies of conformational change dynamics in

enzymatic reactions". Current pharmaceutical biotechnology 5 (3): 261-9. PMID 15180547. 5. Schnell J, Dyson H, Wright P. (2004). "Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase". Annual review of biophysics and biomolecular structure 33: 11940. PMID 15139807. 6. Hammann C, Lilley DM. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem. 2002 Aug 2;3(8):690700. PMID 11779233 7. Michaelis L., Menten M.L. Kinetik der Invertinwirkung Biochem. Z. 1913; 49:333 369 Traduo do artigo Kinetik der Invertinwirkung em ingls Acesso 6 Abril 2007 8. Briggs GE, Haldane JB. A Note on the Kinetics of Enzyme Action. Biochem J. 1925;19(2):3389. PMID 16743508 9. Stroppolo ME, Falconi M, Caccuri AM, Desideri A. (2001). "Superefficient enzymes". Cell. Mol. Life Sci. 58 (10): 1451 60. PMID 11693526. 10. Davis ME, Madura JD, Sines J, Luty BA, Allison SA, McCammon JA. (1991). "Diffusioncontrolled enzymatic reactions". Meth. Enzymol. 202: 47397. PMID 1784185. 11.
a b

Tseng SJ, Hsu JP. A comparison of the

parameter estimating procedures for the MichaelisMenten model. J Theor Biol. 1990 Aug 23;145(4):45764. PMID 2246896 12. Bravo, I.G., Busto, F., De Arriaga, D., Ferrero, M. A., Rodrguez-Aparicio, L. B., MartnezBlanco H., Reglero, A. A normalised plot as a novel and time-saving tool in complex enzyme kinetic analysis Biochem. J. (2001). 358, 573583. PMID 11577687 13. Almaas E, Kovacs B, Vicsek T, Oltvai ZN, Barabasi AL. Global organization of metabolic

fluxes in the bacterium Escherichia coli. Nature. 2004 Feb 26;427(6977):839-43. PMID 14985762 14. Reed JL, Vo TD, Schilling CH, Palsson BO. An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR). Genome Biol. 2003;4(9):R54. PMID 12952533 15. Dirr H, Reinemer P, Huber R. X-ray crystal structures of cytosolic glutathione Stransferases. Implications for protein architecture, substrate recognition and catalytic function. Eur J Biochem. 1994 Mar 15;220(3):645-61. PMID 8143720 16. Stone SR, Morrison JF. Dihydrofolate reductase from Escherichia coli: the kinetic mechanism with NADPH and reduced acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate as substrates.Biochemistry. 1988 Jul 26;27(15):5493-9. PMID 3052577 17. Fisher PA. Enzymologic mechanism of replicative DNA polymerases in higher eukaryotes. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994;47:371-97. PMID 8016325 18. Akerman SE, Muller S. 2-Cys peroxiredoxin PfTrx-Px1 is involved in the antioxidant defence of Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 2003 Aug 31;130(2):75-81. PMID 12946843 19. Bravo, I.G., Barrallo, S., Ferrero, M. A., Rodrguez-Aparicio, L. B., Martnez-Blanco H., Reglero, A. "Kinetic properties of the Acylneuraminate Cytidylytransferase from Pasteurella haemolytica A2". Biochem. J. (2001) 358, 585-598. [1] 20. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu Rev Biochem. 1977;46:331-58. PMID 332063

21. Ricard J, Cornish-Bowden A. Co-operative and allosteric enzymes: 20 years on. Eur J Biochem. 1987 Jul 15;166(2):255-72. PMID 3301336 22. Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH., Allosteric regulation of catalytic activity: Escherichia coli aspartate transcarbamoylase versus yeast chorismate mutase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001 Sep;65(3):404-21 PMID 11528003 23. Schirmer T, Evans PR., Structural basis of the allosteric behaviour of phosphofructokinase. Nature. 1990 Jan 11;343(6254):140-5. PMID 2136935 24. Ward WH, Fersht AR., Tyrosyl-tRNA synthetase acts as an asymmetric dimer in charging tRNA. A rationale for half-of-the-sites activity. Biochemistry. 1988 Jul 26;27(15):552530.PMID 3179266 25. Hill, A. V. The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves. J. Physiol. (Lond.), 1910 40, iv-vii. 26. Hartley B.S., Kilby B.A. The reaction of pnitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin. Biochem J. 1954 Feb;56(2):28897. PMID 13140189 27. Alan Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science : A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman, 1998. ISBN 0-7167-3268-8 28. Bender ML, Begue-Canton ML, Blakeley RL, Brubacher LJ, Feder J, Gunter CR, Kezdy FJ, Killheffer JV Jr, Marshall TH, Miller CG, Roeske RW, Stoops JK. The Determination of the Concentration of Hydrolytic Enzyme Solutions : a-Chymotrypsin, Trypsin, Papain, Elastase, Subtilisin, and Acetylcholinesterase. J Am Chem

Soc. 1966 Dec 20;88(24):5890-913. PMID 5980876 29. Cleland WW. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. Arch Biochem Biophys. 2005 Jan 1;433(1):2-12. PMID 15581561 30. Cleland WW. Use of isotope effects to elucidate enzyme mechanisms. CRC Crit Rev Biochem. 1982;13(4):385-428. PMID 6759038 31. Christianson DW, Cox JD. Catalysis by metalactivated hydroxide in zinc and manganese metalloenzymes. Annu Rev Biochem. 1999;68:33-57. PMID 10872443 32. Leatherbarrow RJ. Using linear and non-linear regression to fit biochemical data. Trends Biochem Sci. 1990 Dec;15(12):4558. PMID 2077683 33. Koshland DE, Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1958 Feb;44(2):98104.PMID 16590179editar

Cintica enzimtica
Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre.

Imagem gerada por computador de um modelo da estrutura tridimensional da enzima purina nuclesido fosforilase bacteriana.

A cintica enzimtica estuda as reaces qumicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reaco. O estudo da cintica de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo cataltico, o seu papel nometabolismo, como controlada a sua actividade na clula e como pode ser inibida a sua actividade por drogas ouvenenos, ou potenciada por outro tipo de molculas.
ndice
[esconder]

1 Introduo

1.1 Enzimas

2 Princpios gerais 3 Ensaios enzimticos 4 Reaces mono-substrato

o o o

4.1 Cintica de MichaelisMenten 4.2 Representao da equao de Michaelis-Menten 4.3 Importncia prtica das constantes cinticas

5 Reaces multi-substrato

5.1 Mecanismos de complexo ternrio

5.2 Mecanismos pingpong

6 Cintica no-michaeliana 7 Cintica do estado pr-estacionrio 8 Mecanismo qumico 9 Inibio enzimtica

o o

9.1 Inibidores reversveis 9.2 Inibidores irreversveis

10 Mecanismos de catlise 11 Notas 12 Referncias 13 Leituras adicionais 14 Ligaes externas

[editar]Introduo [editar]Enzimas
Ver artigo principal: Enzima As enzimas so macromolculas com a capacidade de manipular outras molculas, denominadas substratos. Um substrato pode unir-se ao centro cataltico da enzima que o reconhea e transformar-se num produto ao longo de uma srie de passos denominados mecanismo enzimtico. Algumas enzimas podem unir vrios substratos diferentes e/ou libertar diversos produtos, como o caso das proteases ao romper uma protena em dois polipptidos. Noutros casos, produz-se a unio simultnea de dois substratos, como no caso da DNA polimerase, que capaz de incorporar um nucletido (substrato 1) a uma cadeia de ADN (substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa srie de passos, tambm podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda a reaco. Este passo limitante pode consistir numa reaco qumica ou numa mudana de forma da enzima ou do substrato. O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas til na interpretao dos dados cinticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto durante a catlise, que mudanas de forma ocorrem durante a reaco, ou mesmo o papel em particular de determinados aminocidos no mecanismo cataltico. Algumas enzimas modificam a sua forma significativamente durante a reaco, em cujo caso pode ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se anlogos que se unem mas no permitem levar a cabo a reaco e mantm a enzima permanentemente na forma de substrato unido).

Os mecanismos enzimticos podem ser divididos em mecanismos de substrato nico e mecanismos de mltiplos substratos. Os estudos cinticos com enzimas que apenas unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una enzima que une vrios substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cintica enzimtica pode mostrar tambm a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos. Nem todas as catlises biolgicas so efectuadas por enzimas proteicas. Existem molculas catalticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e a traduo do ARNm, respectivamente. A principal diferena entre as ribozimas e os ribossomas radica no limitado nmero de reaces que as primeiras podem efectuar, embora os seus mecanismos de reaco e as suas cinticas possam ser estudados e classificados pelos mesmos mtodos.

[editar]Princpios

gerais

A velocidade de reaco aumenta com a concentrao do substrato, eventualmente ficando a enzima saturada a altas concentraes de substrato.

A reaco catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reao no catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catlise, as enzimas no alteram em absoluto oequilbrio da reaco entre substrato e produto.[1] Ao contrrio do que acontece noutras reaces qumicas, as enzimassaturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalticos estaro ocupados, o que incrementar a eficincia da reaco, at ao momento em que todos os stios possveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se- alcanado o ponto de saturao da enzima e, embora se adicione mais substrato, no aumentar mais a eficincia. As duas propriedades cinticas mais importantes de uma enzima so: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto mximo de saturao. O conhecimento destas propriedades torna possvel formular hipteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responder frente a mudanas nessas condies.

[editar]Ensaios

enzimticos

Ensaios enzimticos so procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reaces enzimticas. Uma vez que as enzimas no so consumidas pelas reaces que catalisam, nos

ensaios seguem-se habitualmente mudanas na concentrao de substratos ou produtos para medir a taxa de reaco. H vrios mtodos de medida: os ensaiosespectrofotomtricos medem a mudana de absorbncia da luz entre produtos e reagentes; ensaios radiomtricos envolvem a incorporao ou libertao de radioactividade para medir a quantidade de produto que surge ao longo do tempo. Os ensaios espectrofotomtricos so mais convenientes pois permitem a medio contnua da velocidade de reaco. Embora os ensaios radiomtricos exijam a remoo e contagem de amostras (ou seja, so ensaios descontnuos), so habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vrios nveis da actividade enzimtica.[2] Uma abordagem anloga usada na espectrometria de massa para aferir a incorporao ou libertao de istopos estveis medida que o substrato convertido em produto. Os ensaios enzimticos mais sensveis usam lasers focados por um microscpio para observar mudanas em molculas enzimticas individuais medida que decorre a reaco. Estas medidas usam geralmente mudanas na fluorescncia de cofactores durante o mecanismo de reaco, ou fluorforos adicionados a locais especficos da protena que registam movimentos que ocorrem durante a catlise.[3] Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cintica e dinmica de molculas individuais, em oposio tradicional cintica enzimtica, que observa o comportamento mdio de populaes com milhes de molculas enzimticas.[4][5]

[editar]Reaces

mono-substrato

Entre as enzimas com mecanismos mono-substrato incluem-se as isomerases como a triose-fosfato isomerase ou bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como aadenilato ciclase e a ribozima, uma liase de RNA.[6] Porm, algumas enzimas que apenas tm um substrato no se agrupam nesta categoria de mecanismos. A catalase um exemplo, pois reage com uma molcula de substrato de perxido de hidrognio, oxida-se e ento reduzida por uma segunda molcula de substrato. Embora um nico substrato esteja envolvido, a existncia de um intermedirio que uma enzima modificada significa que o mecanismo de catlise um mecanismo ping-pong (tipo de mecanismo discutido mais abaixo).

[editar]Cintica

de MichaelisMenten

Curva de saturao para uma enzima mostrando a relao entre a concentrao do substrato (abcissas) e a velocidade de reaco (ordenadas).

As reaces catalisadas por enzimas so saturveis, e a sua velocidade de catlise no indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reaco medida sobre uma escala de concentraes de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reaco (v) aumenta com o acrscimo de [S]. Todavia, medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor mximo Vmax. No modelo da cintica de Michaelis-Menten de uma reaco mono-substrato existe uma reaco bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimtico para a reaco unimolecular possa ser bastante

complexo, h tipicamente um passo na determinao da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo cataltico simples de velocidade constante k2. (Eq. 1). k2 tambm designado como kcat ou turnover, o valor mximo de reaces enzimticas catalisadas por segundo. Com baixas concentraes de substrato [S], a enzima permanece em equilbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] custa de [E], mudando o equilbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reaco depende da concentrao [ES], a velocidade sensvel a pequenas alteraes de [S]. Todavia, com altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condies, a velocidade (vk2[E]tot=Vmax) insensvel a pequenas alteraes de [S]; assim, [E]tot a concentrao total enzimtica

que aproximadamente igual concentrao [ES] em condies de saturao. A equao de MichaelisMenten[7] descreve como a velocidade de reaco v depende da posio do equilbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis eMenten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximao de equilbrio), pode obter-se a seguinte equao:

(Eq. 2) Esta equao de Michaelis-Menten a base da maior parte da cintica enzimtica mono-substrato. A constante de Michaelis Km definida como a concentrao para a qual a velocidade da reaco enzimtica metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equao de Michaelis-Menten. Se o passo de determinao da velocidade for lento,

quando comparado com a dissociao do substrato (k2 << k-1), ento a constante de Michaelis Km aproximadamente constante de dissociao do complexo ES, embora tal situao seja relativamente rara. A situao mais normal d-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cintica de Briggs-Haldane.[8] A equao ainda se verifica em condies mais gerais, como provm daaproximao ao estado estacionrio. Durante o perodo inicial, a velocidade de reaco v relativamente constante, indicando que [ES] tambm aproximadamente constante (cf. equao 1):

Assim, a concentrao [ES] dada pela frmula

em que a constante de Michaelis Km definida por

([E] a concentrao de enzima livre). Em conjunto, a frmula geral para a velocidade de reaco v vem pela equao de Michaelis-Menten:

A constante de especificidade

uma medida da

eficincia de converso pela enzima do substrato em produto. Usando a definio da constante de Michaelis escreve-se na forma , a equao

sendo [E] a concentrao de enzima livre. Assim, a constante de especificidade um modo eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres na reaco com substrato livre para formao de produto. A constante de especificidade limitada pela frequncia com que o substrato e a enzima se encontram na soluo, podendo atingir 1010 M1 s1.[9] Esta taxa mxima amplamente no dependente da dimenso do substrato ou da enzima.[10] A razo entre constantes de especificidade para dois substratos uma

comparao quantitativa da eficincia da enzima na converso dos substratos. O declive do grfico de Michaelis-Menten com baixa concentrao de substrato [S] (i.e. [S] << Km) tambm resulta na constante de especificidade.

[editar]Representao

da equao de

Michaelis-Menten
Ver artigo principal: Diagrama de Lineweaver-Burke Ver artigo principal: Diagrama de Eadie-Hofstee

O grfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recproco mostra o significado dos pontos de intercepo entre a recta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade.

O grfico de velocidade face a [S] mostrado anteriormente no linear. Embora a baixas concentraes de substrato se mantenha linear, vai curvando medida que aumenta a concentrao de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regresses no lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difcil estimar os valores deKm e Vmax nos grficos no lineares. Isto deu lugar a que vrios investigadores concentrassem os seus esforos em desenvolver mtodos de linearizao da equao de Michaelis-Menten, dando como resultado o grfico de Lineweaver-Burke, o diagrama de Eadie-Hofstee e o grfico de Hanes-Woolf. Com o seguinte tutorial da cintica de MichaelisMenten realizado na Universidade de Virgnia , pode-se simular o comportamento de uma enzima variando as constantes cinticas.
a

O grfico de Lineweaver-Burk ou representao de duplo recproco a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados cinticos, apesar de no ser a mais fivel. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equao de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representao uma linha recta cuja equao e = mx + c, sendo o ponto de intercepo entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepo entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.

Evidentemente no se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mnimo valor possvel 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentrao infinita de substrato, e da 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intercepo entre a recta e o eixo x uma extrapolao de dados experimentais obtidos em laboratrio. Geralmente, os grficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentraes de substrato e isto pode dar lugar a estimativas no muito exactas de Vmax e de Km.[11] Um modelo linear muito mais exacto o diagrama de Eadie-Hofstee, mas nas investigaes cientficas actuais, todo este tipo de linearizaes tornou-se obsoleto e foi substitudo por mtodos mais fiveis baseados na anlise de regresso no linear. Para analisar os dados conveniente a normalizao dos mesmos, j que isto pode ajudar diminuio da quantidade de trabalho experimental a realizar e incremento da fiabilidade da anlise.[12]

[editar]Importncia

prtica das constantes

cinticas
O estudo da cintica enzimtica importante por duas razes principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinticas acima definidas, Km e Vmax, so crticas

na compreenso do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo. Fazer estas previses no trivial, mesmo para sistemas simples. Por exemplo, o oxaloacetato formado pela malato desidrogenase no interior da mitocndria e pode ser consumido pela citrato sintase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou a transaminase glutmico-oxalactica, entrando no ciclo do cido ctrico, gluconeognese ou biossntese docido asprtico, respectivamente. A capacidade de previso de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua concentrao e da concentrao e cintica de cada uma das enzimas. Esta capacidade preditiva do comportamento metablico atinge a sua expresso mais complexa na sntese de grandes quantidades de dados cinticos e genticos em modelos matemticos de organismos inteiros. Embora este objectivo seja longnquo para qualquer eucariota, fazem-se tentativas para atingi-lo nas bactrias, com modelos do metabolismo da Escherichia coli.[13][14]

[editar]Reaces

multi-substrato

As reaes multi-substrato seguem uma srie de complexas equaes que descrevem como se unem os substratos e em que ordem o fazem. A anlises destas reaes muito mais simples se a concentrao do substrato A se mantiver constante e a do substrato B variar. Nestas condies, a enzima se comporta igual a uma enzima de nico substrato, pelo que num grfico de velocidade a concentrao do substrato dar um dos valores aparentes das constantes cinticas, Km e Vmax, para o substrato B. Se se realizarem uma srie de medidas a diferentes concentraes fixas de substrato A, os dados obtidos permitiro saber a que tipo de mecanismo pertence a reao enzimtica. Para uma enzima que una dois substratos A e B, e os transforme em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismos descritos.

[editar]Mecanismos

de complexo ternrio

Mecanismo de complexo ternrio para uma reaco enzimtica. A enzima E une os substratos A e B e liberta os produtos P e Q em ordem no definida.

As enzimas (E) que apresentam este mecanismo de reaco unem ao mesmo tempo os dois substratos (A e B), dando lugar a um complexo ternrio EAB. A ordem sequencial da unio dos substratos pode ser ao acaso (mecanismo aleatrio) ou seguir uma ordem em particular (mecanismo ordenado). Se se fixar a concentrao do substrato A e variar a de B, ao representar-se graficamente o comportamento da enzima mediante um diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas com um ponto de interseco comum a todas elas. Entre as enzimas que apresentam este mecanismo podemos encontrar a glutatio S-transferase,[15] a dihidrofolato redutase[16] e a DNA polimerase.[17] As seguintes ligaes mostram animaes do mecanismo de complexo ternrio da di-hidrofolato redutase polimerase .

e da DNA

[editar]Mecanismos

pingpong

Como se pode ver na figura da direita, as enzimas com um mecanismo de ping-pong podem apresentar dois estados: a conformao normal (E) e a conformao modificada quimicamente (E*) ou conformao intermdia. Nesse tipo de mecanismo, o substrato A une-se enzima E, que passa a um estado intermedirio E*, por exemplo, por transferncia de um grupo qumico ao centro activo da enzima, podendo j ser libertado na forma de produto P. Apenas quando o substrato A foi j libertado do centro activo da enzima se pode unir ao substrato B, que devolve

a enzima modificada E* ao seu estado original E, e libertlo em forma de produto Q. Se se fixar a concentrao de A e variar a de B, e se se representar graficamente uma enzima com mecanismo de ping-pong num diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas paralelas entre si.

Mecanismo de ping-pong para uma reao enzimtica. A unio dos substratos A e B tem lugar numa ordem definida e sequencial, por meio de um intermedirio enzimtico modificado, E*.

Entre as enzimas com este tipo de mecanismo encontramse algumas oxirredutases, como a tiorredoxima peroxidase,[18] transferases, como a acilneuraminato citidilo transferase,[19] e proteases de serina, como atripsina e a quimiotripsina.[20] As proteases de serina formam uma famlia diversa de enzimas muito comuns, que incluem enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina e elastase), vrias enzimas do processo de coagulao e muitas outras. Nas proteases de serina, o estado intermedirio E* uma espcie acilada numa serina do centro cataltico da enzima. Mostra-se uma animao do mecanismo cataltico da quimiotripsina na ligao seguinte: .

[editar]Cintica

no-michaeliana

Ver artigo principal: Regulao alostrica Algumas reaces enzimticas do lugar a curvas do tipo sigmide, ao ser representadas numa curva de saturao, o que pode indicar uma ligao cooperativa do substrato ao centro cataltico da enzima. Isto significa que a unio de uma molcula de substrato influencia a unio das molculas de substrato posteriores. Este comportamento o mais comum nas enzimas multimricas, que apresentam diversas zonas de interaco com o substrato.[21] O mecanismo de cooperao semelhante ao observado na hemoglobina. A unio de una molcula de substrato a

uma das zonas de interaco altera significativamente a afinidade pelo substrato das restantes zonas de interaco. As enzimas com este tipo de comportamento so denominadas alostricas. A cooperatividade positiva tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida incrementa a afinidade do resto de zonas de interaco. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida reduz a afinidade da enzima por novas molculas de substrato. Exemplos de enzimas com cooperatividade positiva incluem a aspartato transcarbamilase bacteriana [22] e a fosfofructoquinase,[23] e com cooperatividade negativa, a tirosilo-RNAt transferase de mamferos.[24] A cooperatividade um fenmeno bastante comum e pode chegar a ser crucial na regulao da resposta enzimtica a mudanas na concentrao de substrato. A cooperatividade positiva faz que a enzima seja muito mais sensvel concentrao de substrato. Com isto, a actividade pode chegar a variar fortemente, mesmo em intervalos muito estreitos de concentrao de substrato. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa faz com que a enzima seja insensvel a pequenas mudanas na concentrao de substrato. A equao de Hill [25] pode ser utilizada para descrever quantitativamente o grau de cooperatividade em cinticas no michaelianas. O coeficiente de Hill (n) indica quantas das zonas de unio de substrato de uma enzima afectam a afinidade da unio do substrato no resto das zonas de unio. O coeficiente de Hill pode tomar valores maiores ou menores que 1:

n < 1: indica cooperatividade negativa. n > 1: indica cooperatividade positiva.

[editar]Cintica

do estado pr-

estacionrio

Curva do progresso pr-estacionrio, mostrando a fase inicial de uma reaco enzimtica.

Ao realizar um ensaio enzimtico e misturar a enzima com o substrato, existe um breve perodo inicial em que no se produz nem sntese de produto, nem estado intermdio da enzima. O estudo dos milissegundos seguintes mistura denominado cintica do estado pr-estacionrio e est relacionado com a formao e consumo dos intermedirios enzima-substrato (ES ou E*) at ao momento em que se alcanam certas concentraes e comea o estado estacionrio. A primeira enzima em que se estudou este processo, durante a reaco de hidrlise, foi a quimiotripsina.[26] A deteco de intermedirios costuma ser a principal prova necessria para saber sob que mecanismo actua a enzima. Por exemplo, ao realizar um ensaio de cintica rpida de uma reaco enzimtica governada por um mecanismo de ping-pong, pode seguir-se a libertao de produto P e medir a formao de intermedirios enzimticos modificados E*.[27] No caso da quimiotripsina, o intermedirio enzimtico produzido por um ataque nucleoflico do substrato a uma serina do centro cataltico, o que gera uma forma intermediria acilada da quimiotripsina. Na figura da direita, pode-se observar como a enzima passa rapidamente a um estado intermdio E* durante os primeiros segundos da reaco. Posteriormente, quando

alcanado o estado estacionrio, a velocidade diminui. Esta primeira fase da reaco proporciona a taxa de converso da enzima. Portanto, a quantidade de produto liberado durante esta fase (que pode obter-se prolongando a recta correspondente ao estado estacionrio at cortar o eixo y) tambm d a quantidade de enzima funcional presente no ensaio.[28]

[editar]Mecanismo

qumico

Um dos objectivos mais importantes no estudo da cintica enzimtica determinar o mecanismo qumico que subjaza na reaco enzimtica, por exemplo, determinar a sequncia ordenada de eventos que ocorrem na transformao de substrato em produto. As aproximaes cinticas discutidas anteriormente podem proporcionar informao relacionada com a velocidade de reaco dos intermedirios enzimticos formados, mas no iro permitir identificar que intermedirios so formados. Com o intuito de determinar a etapa limitante da reaco ou os intermedirios que se formam durante a mesma, podem fazer-se ensaios enzimticos em diversas condies com enzimas ou substratos ligeiramente modificados, que tragam dados relacionados. Um exemplo caracterstico de etapa limitante de uma reaco aquela na qual se rompe umaligao covalente dando lugar a um tomo de hidrognio. Se se trocar cada tomo de hidrognio pelo seu istopo estvel, o deutrio, poderemos saber qual dos possveishidrognios transferidos o que determina a etapa limitante. A velocidade sofrer uma variao quando o hidrognio crtico seja substitudo, devido ao efeito isotpico cinticoprimrio, cuja origem se encontra na maior estabilidade das pontes de deutrio, mais difceis de romper que as de hidrognio.[29] Tambm possvel medir efeitos similares por meio de outras substituies isotpicas, tais como 13C/12C ou 18O/16O, mas os efeitos produzidos nestes casos so mais difceis de detectar.

Os istopos tambm podem ser utilizados para obter informao sobre o destino de diversas partes da molcula de substrato quando este transformado em produto. Por exemplo, por vezes difcil determinar a origem de um tomo de oxignio no produto final, j que pode vir da gua ou da molcula de substrato. Isto pode resolver-se mediante a substituio sistemtica dos tomos de oxignio das molculas que participem na reaco, pelo seu istopo estvel 18O, fazendo depois uma procura do istopo no produto obtido. O mecanismo qumico tambm pode ser elucidado estudando os efeitos cinticos e isotpicos sob diferentes condies de pH,[30] alterando os nveis de ies metlicos ou outros cofactores,[31] por mutagnese dirigida de aminocidos conservados, ou pelo estudo do comportamento da enzima na presena de anlogos do substrato.

[editar]Inibio

enzimtica

Ver artigo principal: Inibio enzimtica

Esquema cintico para inibidores enzimticos reversveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor

Os inibidores enzimticos so molculas que reduzem ou eliminam a actividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversveis (quando a remoo do inibidor restaura a actividade enzimtica) e os irreversveis (quando o inibitor inactiva de modo permanente a enzima).

[editar]Inibidores

reversveis

Os inibidores enzimticos reversveis podem ser classificados como competitivos, acompetitivos, no-

competitivos emistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinticas Km e Vmax. Este efeito depender da unio do inibidor enzima E, ao complexo enzimasubstrato ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cintica enzimtica em funo da concentrao de inibidor. Os quatro tipos de inibio do lugar a diagramas de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee [11] que variam de diferente forma com a concentrao de inibidor. Para abreviar, usam-se dois smbolos:

y onde Ki e K'i so as constantes de dissociao para se unir enzima e ao complexo enzima-substrato, respectivamente. Na presena de um inibidor reversvel, os valores aparentes de Km e Vmax passam a ser (/')Km e (1/')Vmax, respectivamente, como se pode ler na tabela abaixo para os casos mais comuns.

Tipo de inibio ( apenas Ki ) apenas Ki' ( ) ( Ki = Ki' ) ( Ki Ki' ) mista no competitiva acompetitiva competitiva

Km aparente

Vmax aparente

Os ajustes por regresso no linear dos dados de cintica enzimtica [32] podem proporcionar estimativas muito precisas das constantes de disociao Ki e Ki'.

[editar]Inibidores

irreversveis

Os inibidores enzimticos tambm se podem unir e inactivar uma enzima de forma irreversvel, geralmente por meio de modificaes covalentes de resduos do centro cataltico da enzima. Estas reaces decaem de

forma exponencial e so habitualmente saturveis. Abaixo dos nveis de saturao, mantm uma cintica de primeira ordem em relao ao inibidor.

[editar]Mecanismos

de catlise

Ver artigo principal: Catlise enzimtica

A variao de energia como funo de uma coordenada de reaco mostra a estabilizao do estado de transio quando essa reaco efectuada por umaenzima.

O modelo de ajuste induzido o mais utilizado em estudos de interaco enzima-substrato.[33] Este modelo prope que as interaces iniciais entre a enzima e o substrato so relativamente dbeis, embora suficientes para produzir certas mudanas estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a fora da interaco. Estas mudanas de forma implicam uma srie de aminocidoscatalticos do centro activo, nos quais se produzem as ligaes qumicas correspondentes entre a enzima e o substrato. Depois da unio, um ou mais mecanismos de catlise diminuem a energia doestado de transio da reaco, por meio de uma via alternativa reaco. Os mecanismos de catlise

classificam-se com base em diferentes critrios: catlise covalente, catlise por proximidade e alinhamento de orbitais, catlise cido-base geral, catlise por ies metlicos e catlise electrosttica. Os estudos de cintica enzimtica no permitem obter o tipo de catlise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinticos podem proporcionar uma srie de indcios que levem a realizar outro tipo de estudos dirigidos a determinar certo tipo de catlise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cintica do estado pr-estacionrio poder estar a sugerir uma catlise de tipo covalente. Por outro lado, variaes no pH podem produzir efeitos drsticos em V max mas no em Km, o que poderia indicar que um resduo do centro activo precisa um estado concreto de ionizao para que se possa efectuar a catlise enzimtica.

[editar]Notas
. ^ Link: Interactive MichaelisMenten kinetics tutorial (Java required) . ^ Link: dihydrofolate reductase mechanism (Gif) . ^ Link: DNA polymerase mechanism (Gif) . ^ Link: Chymotrypsin mechanism (Flash required)

Referncias
1. Ebbing, D.D. General chemistry (4th ed.) Houghton Mifflin Co. 1993, ISBN 0-395-63696-5 2. Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) ISBN 0-19-963820-9 3. Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141 4. Lu H. (2004). "Single-molecule spectroscopy studies of conformational change dynamics in

enzymatic reactions". Current pharmaceutical biotechnology 5 (3): 261-9. PMID 15180547. 5. Schnell J, Dyson H, Wright P. (2004). "Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase". Annual review of biophysics and biomolecular structure 33: 11940. PMID 15139807. 6. Hammann C, Lilley DM. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem. 2002 Aug 2;3(8):690700. PMID 11779233 7. Michaelis L., Menten M.L. Kinetik der Invertinwirkung Biochem. Z. 1913; 49:333 369 Traduo do artigo Kinetik der Invertinwirkung em ingls Acesso 6 Abril 2007 8. Briggs GE, Haldane JB. A Note on the Kinetics of Enzyme Action. Biochem J. 1925;19(2):3389. PMID 16743508 9. Stroppolo ME, Falconi M, Caccuri AM, Desideri A. (2001). "Superefficient enzymes". Cell. Mol. Life Sci. 58 (10): 1451 60. PMID 11693526. 10. Davis ME, Madura JD, Sines J, Luty BA, Allison SA, McCammon JA. (1991). "Diffusioncontrolled enzymatic reactions". Meth. Enzymol. 202: 47397. PMID 1784185. 11.
a b

Tseng SJ, Hsu JP. A comparison of the

parameter estimating procedures for the MichaelisMenten model. J Theor Biol. 1990 Aug 23;145(4):45764. PMID 2246896 12. Bravo, I.G., Busto, F., De Arriaga, D., Ferrero, M. A., Rodrguez-Aparicio, L. B., MartnezBlanco H., Reglero, A. A normalised plot as a novel and time-saving tool in complex enzyme kinetic analysis Biochem. J. (2001). 358, 573583. PMID 11577687 13. Almaas E, Kovacs B, Vicsek T, Oltvai ZN, Barabasi AL. Global organization of metabolic

fluxes in the bacterium Escherichia coli. Nature. 2004 Feb 26;427(6977):839-43. PMID 14985762 14. Reed JL, Vo TD, Schilling CH, Palsson BO. An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR). Genome Biol. 2003;4(9):R54. PMID 12952533 15. Dirr H, Reinemer P, Huber R. X-ray crystal structures of cytosolic glutathione Stransferases. Implications for protein architecture, substrate recognition and catalytic function. Eur J Biochem. 1994 Mar 15;220(3):645-61. PMID 8143720 16. Stone SR, Morrison JF. Dihydrofolate reductase from Escherichia coli: the kinetic mechanism with NADPH and reduced acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate as substrates.Biochemistry. 1988 Jul 26;27(15):5493-9. PMID 3052577 17. Fisher PA. Enzymologic mechanism of replicative DNA polymerases in higher eukaryotes. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994;47:371-97. PMID 8016325 18. Akerman SE, Muller S. 2-Cys peroxiredoxin PfTrx-Px1 is involved in the antioxidant defence of Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 2003 Aug 31;130(2):75-81. PMID 12946843 19. Bravo, I.G., Barrallo, S., Ferrero, M. A., Rodrguez-Aparicio, L. B., Martnez-Blanco H., Reglero, A. "Kinetic properties of the Acylneuraminate Cytidylytransferase from Pasteurella haemolytica A2". Biochem. J. (2001) 358, 585-598. [1] 20. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu Rev Biochem. 1977;46:331-58. PMID 332063

21. Ricard J, Cornish-Bowden A. Co-operative and allosteric enzymes: 20 years on. Eur J Biochem. 1987 Jul 15;166(2):255-72. PMID 3301336 22. Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH., Allosteric regulation of catalytic activity: Escherichia coli aspartate transcarbamoylase versus yeast chorismate mutase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001 Sep;65(3):404-21 PMID 11528003 23. Schirmer T, Evans PR., Structural basis of the allosteric behaviour of phosphofructokinase. Nature. 1990 Jan 11;343(6254):140-5. PMID 2136935 24. Ward WH, Fersht AR., Tyrosyl-tRNA synthetase acts as an asymmetric dimer in charging tRNA. A rationale for half-of-the-sites activity. Biochemistry. 1988 Jul 26;27(15):552530.PMID 3179266 25. Hill, A. V. The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves. J. Physiol. (Lond.), 1910 40, iv-vii. 26. Hartley B.S., Kilby B.A. The reaction of pnitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin. Biochem J. 1954 Feb;56(2):28897. PMID 13140189 27. Alan Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science : A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman, 1998. ISBN 0-7167-3268-8 28. Bender ML, Begue-Canton ML, Blakeley RL, Brubacher LJ, Feder J, Gunter CR, Kezdy FJ, Killheffer JV Jr, Marshall TH, Miller CG, Roeske RW, Stoops JK. The Determination of the Concentration of Hydrolytic Enzyme Solutions : a-Chymotrypsin, Trypsin, Papain, Elastase, Subtilisin, and Acetylcholinesterase. J Am Chem

Soc. 1966 Dec 20;88(24):5890-913. PMID 5980876 29. Cleland WW. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. Arch Biochem Biophys. 2005 Jan 1;433(1):2-12. PMID 15581561 30. Cleland WW. Use of isotope effects to elucidate enzyme mechanisms. CRC Crit Rev Biochem. 1982;13(4):385-428. PMID 6759038 31. Christianson DW, Cox JD. Catalysis by metalactivated hydroxide in zinc and manganese metalloenzymes. Annu Rev Biochem. 1999;68:33-57. PMID 10872443 32. Leatherbarrow RJ. Using linear and non-linear regression to fit biochemical data. Trends Biochem Sci. 1990 Dec;15(12):4558. PMID 2077683 33. Koshland DE, Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1958 Feb;44(2):98104. PMID 16590179