Protenas

Las protenas son la clase de macromolculas biolgicas de las que se tienen mejor definidas las propiedades fisicoqumicas, pues el papel central que las stas juegan en los procesos biolgicos, ha sido reconocido desde los primeros das de la bioqumica, lo que las convierte en las biomolculas ms estudiadas. Importancia biolgica Casi todo lo que sucede en la clula requiere la intervencin de una o ms protena. Las protenas proporcionan estructura, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo una multitud de tareas. Su papel centra en la clula queda reflejado en el hecho que la informacin gentica se expresa en ltimo trmino en forma de protenas. Existe para cada protena un segmento de DNA que codifica la informacin que especifica su secuencia de aminocidos. Es as como, para una clula tpica, existen miles de protenas diferentes, cada una codificada por un gen y encargada de realizar una tarea especfica. Clasificacin de las protenas Las protenas tienen muchas funciones biolgicas diferentes, de tal forma que las podemos clasificar segn sus papeles biolgicos. Enzimas. Son las protenas ms variadas y ms altamente especializadas, tienen actividad cataltica. Catalizan la hidrlisis de enlaces peptdicos. Una de las caractersticas mas importantes de la enzimas es su alta especificidad. Se clasifican por su mecanismo cataltico en: serina proteasa, cistena proteasa, asprtico proteasas, metaloproteasas, proteasas con mecanismo cataltico desconocido. Protenas de transporte. stas estn adaptadas para fijar glucosa, aminocidos u otras sustancias para llevarlas de algn lugar a otro especfico, a travs de la membrana. Protenas de nutrientes y de reserva. Tal cual su nombre lo indica, almacenan nutrientes requeridos para el crecimiento. Protenas contrctiles o motiles. stas confieren a la clula y orgnulos la capacidad de contraerse, cambiar de forma o moverse. Protenas estructurales. Muchas de estas protenas actan como filamentos de soporte, cables u hojas para conferir fuerza o proteccin a las estructuras biolgicas. Protenas de defensa. Defienden a los organismos contra la invasin por especies o los protegen contras las heridas.

Propiedades y Composicin de las protenas Las protenas estn compuestas por subunidades llamadas aminocidos. De hecho se define a las protenas como los polmeros de 20 aminocidos distintos. Entonces, si se conoce la qumica de estos mismos, se conocen las propiedades y la composicin de la protena misma, ya que la naturaleza de la protena est dada por los aminocidos que la forman.

Los aminocidos de las protenas

Las protenas estn conformadas por unidades monomricas llamadas aminocidos. El anlisis de un vasto nmero de protenas ha mostrado que todas estas estn compuestas de veinte aminocidos esenciales, llamados -aminocidos porque, con excepcin de la prolina, ellas tienen un grupo amino primario y un grupo de cido carboxlico sustituyente en el mismo tomo de carbono. Al carbono de cada aminocido tambin estn unidos un tomo de hidrgeno y una cadena lateral R. (fig. 1) Fig. 1 Estructura de los -aminocidos.

Precisamente gracias a este grupo R se diferencian los -aminocidos. Propiedades fisicoqumicas de los aminocidos

La representacin de la Fig. 1 para los aminocidos, es qumicamente correcta, pero no toma en cuenta las condiciones in vivo, as que como veremos a continuacin la forma inica de -aminocido depender el pH. Los valores de pK de los veinte -aminocidos esenciales se muestran en la tabla 5.1. Su pK1 y su pK2 se refieren a los grupos amino primario y cido carboxlico respectivamente, mientras que su pKR se refiere a algn otro sustituyente con propiedades cidas o bsicas. Se notar que a un rango de pH 2.2-3.5 los -aminocidos se encuentran en sus formas carboxiladas, mientras que en un rango cercano a 9.4 stos se hallan en sus formas aminadas. Esto permite mencionar la primera propiedad estructural importante: En el rango de pH fisiolgico (7.3 - 7.5) tanto el cido carboxlico como el grupo amino de los -aminocidos se encuentran completamente ionizados.

Por lo tanto, un aminocido puede comportarse como una base como un cido transformndolos en molculas afotricas y son referidos como anfolitos (electrolitos anfotricos). Es as como pueden formar zwitteriones o iones dipolares si su carga neta positiva est en la misma proporcin que su carga neta negativa. El pK donde un aminocido presenta esta propiedad se conoce como punto isoelctrico.

Debido a esto, los aminocidos tienen las mismas propiedades fisicoqumicas que los compuestos inicos, teniendo puntos de fusin cercanos a 300C. Adems, como cualquier otro compuesto inico., estos son ms solubles en solventes polares que en solventes no polares.

Esteroqumica

S observamos todos los aminocidos estndar de la tabla 5.1 todos los aminocidos excepto uno (la glicina) el carbono alfa es asimtrico, estando unido a cuatro grupos sustituyentes diferentes: un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo R y un tomo de hidrgeno, convirtiendo al carbono alfa en un centro quirlico. As es que, debido al ordenamiento tetradrico de los orbitales de enlace, los cuatro grupos sustituyentes distintos pueden ocupar dos ordenamientos en el espacio no superponibles, convirtindolos tambin en enantimeros y pticamente activos. Sin embargo es un hecho notable que todos los aminocidos de las protenas sean L-estereoismeros. Enlace peptdico

En las protenas, el grupo alfa-carboxlico de un aminocido se une al grupo alfa-amnico de otro aminocido por medio de un enlace peptdico (tambin llamado enlace amdico). La formacin de un dipptido a partir de dos aminocidos por la prdida de una molcula de agua va originando las protenas. Sin embargo, el equilibrio de esta reaccin esta desplazado hacia la hidrlisis en vez de hacia la sntesis. De aqu que la biosntesis de los enlaces peptdicos requieran una adicin de energa. Es as como muchos aminocidos vienen unidos en enlaces peptdicos para formar una cadena polipeptdica. (Fig 2) Fig 2. Formacin del enlace peptdico entre dos aminocidos con el desprendimiento de una molcula de agua.

Puentes disulfuro

Algunas protenas contienen puentes disulfuro. Estos enlaces cruzados se forman por la oxidacin de los residuos de cistena. El compuesto disulfurado resultante se llama cistina.

Determinacin cualitativa de protenas: pruebas coloreadas para su identificacin Reaccin de Biuret. Entre todos los mtodos colorimtricos, este ensayo provee una medida exacta, con pocas variaciones en el color de protena a protena. Esto es porque la cadena de pptidos, ms all del tamao de los grupos, reaccionan con el reactante. ste ensayo involucra el uso de sulfato cprico, que en condiciones alcalinas, reacciona con los enlaces peptdicos de la protena, resultando en un complejo tetradentado de cobre. Sin embargo, el mecanismo de reaccin no es bien comprendido se teoriz que el in cprico (Cu2+) debera reaccionar con los enlaces peptdicos produciendo iones cuprosos que a su vez formarn un complejo tetradentado con el par opuesto de los nitrgenos unidos por el enlaces peptdico. Las ventajas

son la poca variacin de coloracin entre protenas y su relacin lineal entre absorcin y protena, mientras que las desventajas son su baja sensibilidad adems de una interferencia del ensayo con presencia de pequeas cantidades de detergentes o reductores. Prueba de Million. Es debida a la presencia de un grupo hidroxifenilico en la molcula proteica. Identifica cualquier compuesto fenlico no sustituido en la posicin 3,5. El mecanismo es poco conocido, posiblemente se deba a la rio formacin del complejo de xido de mercurio y fenol. Prueba de azufre para cistina y cistena. La reaccin consiste en someter la muestra a una hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio. De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo. Si aparece una coloracin negra en el precipitado, la reaccin ser positiva, indicando la presencia de azufre. En la presente situacin, azufre procede de la cistena. Prueba de reaccin Xantoproteica. Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro. Reaccin de Hopkins-Cole. Implica la reaccin del grupo indol del triptfano con el cido glioxlico, en presencia de cido sulfrico concentrado.

Determinacin cuantitativa de protenas. Reaccin de Bradford El ensayo de protenas de Bradford se ha convertido en el mtodo preferido de muchos investigadores, pues es simple y rpida. Y ms an, pues este ensayo es comparativamente libre de interferencia por agentes comunes, excepto los detergentes. La prueba involucra el uso de azul de Coomassie, que reacciona primariamente para aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. El ensayo se basa en la absorbencia intermedia entre los 470nm y 595nm que puede ocurrir gracias a la tincin de los enlaces de la protena en solucin cida. El mecanismo de la tincin de los enlaces puede ser explicado por la existencia de tres especies absorbentes: unos cationes rojos (470nm), unas especies naturales verde (650nm) y especies aninicas azules (595nm). Los cambios de color son sucesivos a la perdida de la carga. Precisamente, esta absorbencia le permite realizar el anlisis cuantitativo de las protenas. Sus ventajas son prcticamente que es muy sensible y rpido, adems de poder tomarla como una reaccin cualitativa. Mtodo de Acido Bicinconinico. Se basa en el principio de que las protenas reducen los iones cpricos a iones cuprosos bajo condiciones alcalinas. Los iones cuprosos reaccionan con el BCA (verdoso) para formar un color morado. El color formado es proporcional al contenido proteico de la muestra. Las ventajas son que tienen una

sensibilidad de .5 a 10 mg, la mezcla es de fcil realizacin, es un reactivo estable, y las sales buffer y detergentes no interfieren. Las desventajas son que el color no es estable con el tiempo y los azucares no reductores interfieren con la reaccin, y que la respuesta en la absorbencia no es lineal. Manipulacin y tcnicas de purificacin de protenas La visin bioqumica sobre la estructura y funcin de las protenas provienes del estudio de muchas protenas individuales. Para estudiar una protena en cierto detalle es necesario separarla del resto de protenas de la clula y al mismo tiempo deben existir tcnicas que permitan determinar sus propiedades. Pero, siempre la preparacin de una protena es esencial antes de determinar sus propiedades, composicin de aminocidos y secuencia. Tal cul una receta de cocina, lo primero es obtener el homogenado de protenas a separar, mediante un fraccionamiento celular. La fuente de una protena es generalmente un tejido o clula microbiana; stas deben romperse liberando la protena en una solucin denominada extracto crudo. La tcnica de fraccionamiento celular es usada para investigar un la composicin de un organelo fuera del ambiente del complejo celular. Despus, y solo en casos de ser necesario, puede utilizarse la centrifugacin diferencial cuya funcin es preparar fracciones celulares que contengan a la protena de inters, o bien, aislar orgnulos del homogenado. En sta tcnica el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentando progresivamente pequeos homogenados de partcula. Primero se obtienen las clulas completas citoesqueletos, membranas plasmticas y el sobrenadante que se vuele a meter al centrifugado, donde sale mitocondria lisosomas y peroxisomas y de nuevo un sobrenadante que se vuelve a meter a centrifugacin y se obtienen microsomas y vesculas pequeas, y por ltimo el sobrenadante restante se vuelve a meter ala centrifugado donde sale queda ribosomas virus y macromolculas, y protenas solubles. Tcnicas de separacin

Una vez con la muestra de protenas, se procede a separarlas mediante procedimientos de fraccionamiento. En una serie de etapas independientes, las diversas propiedades fisicoqumicas de las protenas de inters se usan para separarla de manera progresiva de otras sustancias. La idea no es necesariamente llevar al mnimo la prdida de la protena deseada, sino eliminar en forma selectiva los dems componentes de la mezcla de manera que quede slo la sustancia buscada. Es as como la purificacin de protenas se considera tanto un arte como una ciencia, y hay varias opciones para cada paso. Mientras que una aproximacin del tipo ensayo-error puede funcionar, saber algo sobre la protena diana (objetivo) simplifica la eleccin del procedimiento de separacin. Algunos

de los procedimientos que planteamos y las caractersticas de la protena de las cuales dependen se muestran en la sig. tabla: Tabla 1.1 Caracterstica de la protena Solubilidad Carga inica Procedimiento de purificacin Disminucin de la solubilidad (salting out) Cromatografa de intercambio de iones Electroforesis Isoelectroenfoque Polaridad Tamao Cromatografa de interaccin hidrfoba Cromatografa por filtracin en gel SDS-PAGE Ultracentrifugacin Especificidad de unin Cromatografa de afinidad

Solubilidad de las protenas

Dado que una protena contiene varios grupos cargados, su solubilidad depende de la concentracin de sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura. Algunas de estas variables o todas de ellas pueden manipularse para precipitar de manera selectiva ciertas protenas, mientras otras se mantienen disueltas. El fenmeno que ocurre en este tipo de tcnica se debe a que la solubilidad de una protena es una concentracin baja de iones aumenta a medida que se agrega sal (salting in), pero si se agrega ms sal, es especial sales de sulfato, la solubilidad de la protena disminuye considerablemente pues la sal agregada y los otros solutos disueltos compiten contra las protenas por las molculas de solvente. (Fig. 3) Fig 3. a) La sal elegida, en general sulfato de amonio, se agrega a la solucin de macromolculas en una concentracin justo por debajo del punto de precipitacin de la protena de inters. b) Luego se decantan las protenas no deseadas (esferas rojas) y se agrega ms sal al sobrenadante para precipitar la protena deseada (esfera verde) restando es solucin la sal adicionada.

Cromatografa En la mayora de los procesos cromatogrficos modernos, una mezcla de sustancias que se fraccionarn se disuelve en un lquido (la fase mvil) y se percola a travs de una columna que contiene una matriz slida porosa (la fase estacionaria). A medida que los solutos atraviesan la columna, interactan con la fase estacionaria y retardan su paso. Las fuerzas de retencin dependen de las propiedades de cada soluto. Cromatografa de intercambio de iones En sta tcnica las molculas cargadas se unen a los grupos catinicos de los intercambiadores de aniones y los cationes se unen a grupos aninicos de los intercambiadores de cationes. Es as como las protenas y otros polielectrlitos que llevan cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a intercambiadores de cationes como de aniones. La afinidad de unin de una protena en especial depende de la presencia de otros iones que compiten con la protena por la unin con el intercambiador de iones y del pH de la solucin que influye en la carga neta de la protena. As, las protenas que van a separase se disuelven en una solucin reguladora de pH y una concentracin adecuada de sales y se aplica a la columna que contiene el intercambiador de iones. La columna luego se lava con la solucin reguladora de manera que mientras esto ocurre, las protenas con afinidad relativamente baja por el intercambiador se mueven con ms rapidez que las protenas que se unen con mayor afinidad. El efluente de la columna se recoge en una serie de fracciones. Para las protenas que se unen estrechamente a la columna pueden eluirse si se aplica a la columna un regulado que contenga mayor concentracin de solutos o un pH que reduzca la afinidad con la cual la matriz se une a la protena.

Carga neta positiva grande Carga neta positiva Carga neta negativa Carga neta negativa grande

Fig 4. Las protenas se mueven a travs de la columna a determinados rangos de acuerdo con su carga neta al pH usado. Con este intercambiador de cationes, la protena con la carga ms negativa se mueve ms rpido y eluye ms pronto.

Cromatografa de filtracin en gel Este mtodo tambin llamado cromatografa de exclusin por tamao o de matriz molecular, se basa en separar las molculas de acuerdo con su tamao. La fase estacionaria est formada por esferas de gel que contienen poros de un rango relativamente estrecho. As que, si una solucin acuosa de molculas de tamaos diversos pasa a travs de una columna que contiene este tamiz molecular, no permitir pasar fcilmente las molculas que son demasiado grandes, en contraste con las molculas pequeas que pueden alojar es esos poros; de tal forma que el tamao de poro del gel vara en cierto grado, la filtracin puede usarse para separar un rango de molculas: las ms grandes con menor acceso a los poros eluye antes que las pequeas que acceden ms al volumen interior del gel.

Cromatografa de afinidad Una caracterstica llamativa de muchas protenas es su capacidad de unirse fuertemente a molculas especficas, pero de manera no covalente. Esta propiedad puede usarse para purificar estas protenas mediante este tipo de cromatografa. Aqu una molcula (un ligando) que se une de manera especfica a la protena de inters se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando una solucin de protena impura pasa a travs de este material cromatogrfico, la protena deseada se une al ligando inmovilizado, mientras que otras sustancias se lavan de la columna con la solucin reguladora. La protena deseada puede entonces recuperarse en una forma purificada si se cambian las condiciones de elucin para liberarla de la matriz. La gran ventaja de la cromatografa de afinidad es su capacidad de explotar las propiedades bioqumicas nicas de la protena deseada en lugar de pequeas diferencias fisicoqumicas. Electroforesis La electroforesis es la migracin de iones en un campo elctrico. ste generalmente se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida con un tamao de poro caracterstico, de manera que la separacin de las molculas se basa en la filtracin por gel (tamao) as como en la movilidad electrofortica (carga elctrica), pero se diferencia de la filtracin en gel en que esta movilidad es mayor para las molculas pequeas que la de las ms grandes cuando la densidad de carga es la misma. El pH del gel es suficientemente alto, como para que todas las protenas tengan cargas netas negativas y se muevan hacia el nodo en el que se aplica la corriente. Las molculas de tamao y carga similar se mueven en forma de banda a travs del gel. Luego dela electroforesis, las bandas separadas pueden visualizarse en el gel mediante una tcnica adecuada. Una de ellas sera si se sumerge el gel en una solucin colorante que se una fuertemente a las protenas como el azul brillante de Coomassie. (fig 5.) Para pesos moleculares de 7 kDa y 8kDa se necesita acrilamida entre el 12 y 15%, pero para 100kDa en necesita al 10%

Fig. 5

Adems de los geles de poliacrilamida existen los geles de agarosa (producto natural que forma una matriz inerte y no txica)pues ste es inerte, transparente, estable y con un amplio rango de pH, temperatura y fuerza inica. Enzimas Las enzimas son protenas altamente especializadas que tienen como funcin la catlisis o regulacin de la velocidad de las reacciones qumicas que se llevan a cabo en los seres vivos. De hecho, en una reaccin catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S) , es decir la sustancia sobre la que acta la enzima. El sustrato es modificado qumicamente y se convierte en uno o ms productos. Casi todas las reacciones qumicas de las clulas son catalizadas por enzimas, con la particularidad de que cada enzima solo cataliza una reaccin, por lo que existiran tantas enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no biolgicos son inespecficos. Esto les confiere a las enzimas la peculiaridad de la especificidad.

Especificidad

Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominada sitio activo, donde tiene lugar la catlisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus ismeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunci: "el sustrato se adapta al centro activo o cataltico de una enzima como una llave a una cerradura". Clases de Enzimas El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las enzimas revelan la especificidad de su funcin: Oxido-reductasas: catalizan reacciones de oxido-reduccin, las que implican la ganancia (o reduccin) o prdida de electrones (u oxidacin). Las ms importantes son las deshidrogenasas y las oxidasas Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molcula a otra. Ej.: quinasas; transfieren fosfatos del ATP a otra molcula. Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales -H y -OH. Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces. Isomerasas: convierten los sustratos ismeros unos en otros. Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energa de la ruptura del ATP. Ej: polimerasas.

Mtodos para determinar actividad enzimtica en geles y en tejidos. La protena se puede probar para la actividad enzimtica en una variedad de situaciones, la protena puede ser cristalizado por lo que su estructura terciaria se puede estudiar, o, en la industria farmacutica, la actividad de nuevos frmacos contra la protena pueden ser estudiados. En general, en los tejidos, una enzima puede estar presente en una proporcin de 1/10 a 1/100 del material total. Es necesario definir una unidad enzimtica arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificacin. La unidad enzimtica se define en forma particular para cada reaccin segn sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad de producto (desaparicin de reactivo) en un tiempo dado. Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.