Ingeniera tisular y biomateriales en regeneracin de nervios perifricos

Biomateriales e Ingenieria Tisular Garca Valiente, Rodrigo

1. Introduccin -Impacto social -Ingeniera tisular 2. Sistema Nervioso Perifrico: estructuras y respuestas fisiolgicas al dao -Estructuras -Respuestas fisiolgicas al dao 3. Panorama actual de la ingeniera tisular en el SNP. Biomateriales. -Biomateriales 4. Perspectivas de la ingeniera tisular en el SNP 5. Conclusiones 6. Bibliografa consultada

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Glosario
Axonotmesis Condicin en nervios perifricos daados en la que se ha producido la interrupcin axonal con el epineuro intacto. Clula de Schwann Clulas gliales perifricas que se forman en la cresta neural embrionaria y acompaan a la neurona, recubriendo sus axones de mielina. Degeneracin walleriana Desestructuracin del axn y de su vaina de mielina tras una lesin en la parte proximal del axn o del soma. Los restos celulares son fagocitados por macrfagos y clulas de Schwann. Neuropraxia Condicin daados en la que se ha de la mielina. Neurotmesis Condicin daados en la que se interrupcin del mismo. en nervios perifricos producido la alteracin en nervios perifricos ha producido la total

Reaccin cromatoltica Serie de modificaciones celulares en cuerpo de la clula nerviosa, incluyendo el engrosamiento del soma, la fragmentacin de la red endoplsmica, la variacin en la posicin del ncleo y variacin en la expresin gnica.

1. Introduccin
-Impacto social Hay varios factores que pueden dar lugar a daos en el sistema nervioso perifrico, tales como enfermedades sistmicas (diabetes), infecciones (enfermedad de Lyme) y trauma directo o presin sobre el nervio, resultado de, por ejemplo, accidentes de coche, cadas, lesiones deportivas, etc. Actualmente, el 5% de las heridas en extremidades se complican por daos en nervios perifricos, y en un 0,12% de los partos los nervios perifricos se daan por traccin. 1

nicamente en los Estados Unidos, por estos motivos se llevan a cabo 200000 operaciones quirrgicas anualmente. En Europa cada ao hay ms de 300000 casos de daos en nervios perifricos. Las consecuencias de estos daos varan desde dolor y sensibilidad disminuida a debilidad muscular y parlisis. Es vital avanzar en el tratamiento de estas lesiones para poder mejorar la calidad de vida de los pacientes. -Ingeniera tisular Las neuronas tradicionalmente se han definido como clulas permanentes, incapaces de replicarse en la vida postnatal, y por ende se supone que conforman tejidos incapaces de regenerarse. No obstante, los axones poseen una habilidad intrnseca para volver a crecer bajo ciertos estmulos ambientales, lo que hace que la regeneracin nerviosa sea una meta posible y real. La ingeniera tisular ayuda a inducir esta regeneracin de tejidos mediante la identificacin de los factores endgenos que previenen la regeneracin espontnea y modificando el microambiente celular tras el dao de forma que se suprima o limite la accin de estos factores inhibitorios. No obstante, incluso en los casos donde se ha conseguido una cierta recuperacin axonal, la completa recuperacin de las funciones sensoras o motoras se halla muy lejos de conseguirse. Hoy da, en el caso de neurotmesis en el SNP el tratamiento clnico se basa en un trasplante autlogo de tejido nervioso; en ingeniera tisular se est investigando alternativas que ofrezcan mejores resultados y compensen los inconvenientes de este tipo de trasplante.

2. Sistema Nervioso Perifrico: estructuras y respuestas fisiolgicas al dao

-Estructuras En vertebrados el sistema nervioso est organizado en dos unidades principales: el sistema nervioso central o SNC y el sistema nervioso perifrico o SNP. El primero incluye el cerebro y la mdula espinal, mientras que el segundo est formado por los nervios emergentes de ste. El nervio ptico se considera parte del SNC. El sistema nervioso se halla formado por varios tipos de clulas, los cuales se pueden agrupar en neuronas, la unidad funcional, morfolgicamente dividida en varias secciones (Fig. 1) y las clulas gliales, que recubren los axones con mielina, lo cual mejora la transmisin del impulso elctrico. Las clulas microgliales juegan un papel importante en procesos de inflamacin en el SN, actuando como fagocitos.

Fig. 1: En ingls, vista esquemtica de

una neurona. Se recibe un estmulo en forma de neurotransmisores en las dendritas y ste es transmitido por impulsos elctricos a lo largo del axn, recubierto de vainas de mielina, hasta los elementos presinpticos, donde se liberar el neurotransmisor.

-Respuestas fisiolgicas al dao En la mayora de los daos al SNP los axones estn afectados. En la Fig. 2 se puede observar la estructura bsica de un nervio perifrico.

Fig. 2: En ingls, vista esquemtica de una seccin de nervio perifrico. El nervio consiste en haces de fibras nerviosas rodeadas por tres capas de tejido conectivo. El epineurio es la envoltura de tejido conectivo ms externa, que rodea y protege a los fascculos. El mesoneurio es un tejido aerolar holgado, que permite el movimiento de los fascculos. El endoneurio rodea y protege a cada axn. Est en contacto con las clulas de Schwann.

En neuropraxias, cuando el tronco nervioso no est cortado y la lmina basal de clulas de Schwann no est daada, los nervios perifricos afectados son capaces de regenerarse espontneamente En axonotmesis, donde el axn se halla interrumpido pero la membrana basal y el tejido estromal unidos a ste se hallan completos, tambin se puede conseguir regeneracin. sta ocurre despus de una degeneracin en el extremo proximal, va reaccin cromatoltica, reversible, y otra degeneracin en el segmento distal, Walleriana, en la que los restos celulares son eliminados por macrfagos y clulas de Schwann. Tras esto, las clulas de Schwann forman estructuras lineales denominadas bandas de Bnger por toda la membrana basal mientras desde el final del extremo proximal surgen brotes axnicos, atrados por los factores de crecimiento sintetizados por esas mismas clulas de Schwann. As, estos brotes crecen y llegan al segmento distal, reinervando finalmente el tejido. En neurotmosis, donde hay una interrupcin completa del tejido nervioso, se produce un trauma vascular local que lleva a hemorragia y a edema. As, proliferan los fibroblastos, formando una cicatriz densa y fibrosa en ambos extremos. Esta cicatriz, sumada a la distancia entre los extremos nerviosos, interfiere con la regeneracin axnica. En estos casos se puede estimular sta mediante el trasplante autlogo de tejidos nerviosos o el empleo de injertos sintticos que unan los extremos de la herida. No obstante, no siempre se consigue.

3. Panorama actual de la ingeniera tisular en el SNP. Biomateriales.

Como se ha mencionado anteriormente, en neuropraxia y axonotmesis la regeneracin y la recuperacin funcional ocurren espontneamente, mientras que la neurotmesis requiere de intervencin quirrgica. En el caso de interrupciones menores de 5 milmetros se puede realizar una unin quirrgica de los dos extremos, pues no se causa tensin a ste, lo que afectara negativamente a su recuperacin. Para interrupciones mayores, el tratamiento ms habitual consiste en unir mediante tejido autlogo de brazo o pierna. Actualmente es el tratamiento de referencia. No obstante, el dao causado al sitio donante, la posible ausencia de suficiente tejido donante y la variedad del resultado, debido a la edad, sitio daado, etc. hacen interesante la bsqueda de injertos sintticos. Asimismo, la recuperacin de la funcin motora es usualmente menor del 40%, e interesa mejorar este porcentaje. Por tanto, se est investigando en tubos sintticos que permitan sustituir el transplante autlogo, lo que, adems, reduce el tiempo de ciruga. -Biomateriales La estructura tubular proporciona un ambiente cerrado, que se supone vital para la elongacin axonal por realizar funciones tales como permitir la formacin de una matriz de fibrina para dirigir a los axones desde el extremo proximal al distal, concentrar los factores de crecimiento secretados, prevenir la infiltracin de los tejidos circundantes y minimizar la formacin de la cicatriz. Inicialmente se estudi la regeneracin nerviosa mediante el empleo de tubos de silicona, que dieron buenos resultados. No obstante, al ser un material no reabsorbible, a la larga provocaban reacciones inmunolgicas. Adems de la silicona, entre los conductos no reabsorbibles, cabe destacar aquellos basados en polmeros piezoelctricos, que pueden promover el crecimiento axonal por estimulacin elctrica, y aquellos hechos de hidrogeles sintticos, como los hidrogeles PHEMAMMA. Actualmente se trabaja tanto con polmeros degradables, de origen natural, sinttico y mezclas de ambos. Los polmeros de origen natural estn formados principalmente por macromolculas derivadas de la matriz extracelular, tales como colgeno, laminina y chitosn, aunque este ltimo debido a su fragilidad se suele combinar con los polmeros sintticos. Se puede controlar su degradacin y su fuerza mecnica, no variando su composicin, sino mediante el grado de entrecruzamiento, de forma que a mayor entrecruzamiento, mayor rigidez y menor tasa de degradacn. Es muy importante que el proceso mediante el que se consigue este entrecruzamiento no produzca molculas txicas. Frente a los polmeros naturales se suelen preferir polmeros sintticos para desarrollar el conducto, pues sus propiedades mecnicas y su degradacin son ms fcilmente modificables que los naturales. Los ms habituales son aquellos formados por cido polilctico (PLA), cido poligliclico (PGA), poli--caprolactona (PCL) (Fig. 3) y sus copolmeros. Tambin se han investigado polifosfosteres y poliuretanos, pero su tasa de degradacin limita su empleo.

Fig. 3. Micrografa de una nanored de PLC, aumentos a a) 900x b) 2000x c) 4300x d) 55000x, Su mtodo de sntesis libre de solventes (y por ende, de contaminantes txicos) hace que sea un material muy a tener en cuenta en el diseo de conductos.

En cuanto al diseo de un conducto nervioso, la experiencia demuestra que las caractersticas ideales que debera cumplir son: -Ser reabsorbible, con una tasa de degradacin similar a la de regeneracin del nervio. -Ser flexible y a la vez capaz de retener la forma durante la implantacin y la regeneracin. -Ser fcilmente esterilizable y procesable. -Ser fcil de manejar y suturar. Asimismo, hasta ahora se han identificado una serie de factores relacionados con una mejora de la calidad de la regeneracin del nervio, entre ellos la antes mencionada degradabilidad del material, que cuanto ms similar sea a la tasa de regeneracin del medio, mejor. Otro factor bastante estudiado es la permeabilidad del material. Debe ser lo suficientemente poroso para permitir el transporte de oxgeno y nutrientes hacia el tejido y a la vez evitar infiltraciones de tejidos adyacentes y formacin de tejido fibroso, por lo que el tamao de poro es un factor muy a tener en cuenta. Asimismo, es importante la orientacin de estos poros, como se ha demostrado con tubos basados en colgeno cuyos poros se hayan alineados radialmente: la pared

interior es permeable a las clulas y la exterior no, de forma que as se regula la migracin y la unin de miofibroblastos. Por contra, los conductos compuestos por PLGA-plurnico poseen la estructura inversa: la pared interior es impermeable, al contrario que la exterior; de esta forma, se permite el buen transporte de oxgeno y nutrientes y se asla el defecto de tejidos fibrosos externos. No obstante, en algunos casos, la presencia de poro es negativa, como ocurre en algunos conductos basados en polister, probablemente debido a que stos alteran sus propiedades. La estructura del tubo, tanto a nivel macroscpico como a nivel microscpico, depende del mtodo de procesamiento usado para la produccin del conducto. Actualmente se emplean distintas combinaciones de procesos para aumentar la manipulacin del producto a nivel microscpico. Entre otras cosas, se intenta aumentar el rea de contacto de ste mediante la creacin de microsurcos en el producto, de forma que se gua mejor a las clulas de Schwann y a los axones. Otro factor que se debe tener en cuenta es la longitud de la interrupcin del nervio, que determinar la longitud del conducto. Parece haber un tamao crtico relacionado con la especie animal a partir del cual la capacidad del tubo para inducir la regeneracin axonal cae por debajo del 50%. Asimismo, es importante tener en cuenta el dimetro del nervio, que marcar el dimetro interno del conducto, ligeramente mayor para que se acomoden los extremos daados. Por tanto, se habla de que el volumen del conducto (que contempla dimetro y longitud), es el factor limitante en la regeneracin nerviosa. Una posible explicacin es que a mayor volumen del conducto hay una menor concentracin de factores neurotrficos en el mismo. Actualmente existe un problema de estandarizacin en este campo, en las investigaciones independientes se emplean especies animales y modelos de dao el nervio muy distintos, de forma que es difcil estimar el volumen del nervio mximo tratado con xito.

4. Perspectivas de la ingeniera tisular en el SNP

Actualmente slo un pequeo nmero de conductos se emplean en clnica (Tabla 1), y su uso est limitado al tratamiento de pequeos defectos no mayores de 30 mm en nervios de pequeo dimetro. Todava no se ha creado un conducto que d mejores resultados que el injerto autlogo. Las investigaciones actuales en el campo buscan aumentar el tamao y el dimetro conectable de la interrupcin as como mejorar la calidad del tronco nervioso regenerado, que debe ser lo ms similar posible al original.

Tabla 1: En ingls, conductos comercializados actualmente para gua de nervios perifricos.

Uno de los puntos clave es el relleno del conducto, fundamental para mejorar la regeneracin nerviosa al proveer de un soporte neurotrfico y una gua direccional adecuados, necesarios en los casos en los que la interrupcin es demasiado grande. Se han investigado como relleno matrices de poro o fibra orientados, hidrogeles, suspensiones celulares, suspensiones de factores reguladores y las diversas combinaciones de stos (Fig. 4).

FIg. 4: En ingls, aproximaciones experimentales para la regeneracin de nervios perifricos. ECM = Molculas de la matriz extracelular

Las matrices de poro orientado intentan mimetizar la estructura de la conexin de fibrina entre los extremos del nervio daado, de forma que in vivo suelen recubrirse de fibrina endgena, proveyendo de soporte para la migracin de clulas de Schwann y para la elongacin de axones. El tamao de poro determina la bioactividad de la

matriz al afectar al rea especfica de superficie disponible. Se ha probado que el tamao ptimo es de 20 m. Las matrices de fibra orientada, formadas por la unin de fibras de diversos biomateriales, tales como colgeno, polisteres y seda, estn tambin en estudio. Sin embargo, no se ha encontrado una configuracin ptima todava. Ambos tipos de matrices son ptimos para contener clulas exgenas y/o factores reguladores, pues ello mejora la regeneracin nerviosa. Esta regeneracin no requiere de clulas exgenas, pero stas pueden aportar valiosos factores reguladores que favorecern el proceso. Estos elementos tambin podran incluirse en hidrogeles, pero la conformacin amorfa de stos dificulta la recuperacin axnica. En cuanto a las clulas exgenas, las prometedoras para el transplante autlogo son las clulas de Schwann, muy por encima de las clulas madre mesenquimales y las clulas del epitelio olfativo. La posibilidad de un transplante heterlogo de clulas se ha dejado por ahora de lado debido a problemas ticos y a la necesidad de una terapia inmunosupresora. Se est investigando en terapia gnica para poder sobreexpresar los factores neurotrficos de inters en las clulas transfectadas (ex vivo o in vivo). No obstante, existen problemas con los vectores y la relacin beneficio-coste hace ms conveniente el empleo de esta terapia en estudios relacionados con el SNC, donde el beneficio ser mayor. La capacidad regenerativa del nervio puede ser mejorada mediante la adicin de factores de crecimiento neurotrfico exgenos, tales como el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3), el factor neurotrfico derivado del cerebro (BDNF), GDNF, factores de crecimiento de fibroblasto, etc. El principal problema que posee el empleo de estos factores es que su vida media in vivo es muy corta, por lo que se prefiere la produccin de stos por las clulas que se aadan con el conducto. No obstante, se puede solventar con el empleo de medios de liberacin controlada, como matrices de hidrogel o microesferas polimricas. Otro problema a solventar es la determinacin de la dosis teraputica de estos factores, pues slo se conoce para muy pocos casos.

Fig. 5: Micrografas de clulas PC12 crecidas en soporte de PLGA y tratadas con distintos factores neurotrficos. Ntese cmo se adhieren al material en funcin de la orientacin de sus microfibras, a) al azar, b) transversal.

5. Conclusiones
Hoy da la ingeniera tisular no ha avanzado lo suficiente como para poder producir injertos sintticos que superen en resultados y eficiencia al transplante autlogo en los casos de neurotmesis. No obstante, se est investigando en mejorar el microambiente del nervio para optimizar la regeneracin axonal, y as poder recuperar la funcin motora del nervio daado. El avance de la ingeniera tisular en el mbito neuronal es vital para poder mejorar la calidad de vida de los pacientes, sean vctimas de dao en el SNC o en el SNP, pues por la naturaleza de estos, las perspectivas suelen ser poco halageas. Y este avance ir, como siempre, impulsado por los descubrimientos en biomateriales.

6. Bibliografa consultada
-Sannino, A.; Madaghiele, M.; Salvatore, L. et al. Nerve Tissue Engineering. Elsevier Biomaterials 2011. -L. Bechara; Judson, A.; Popat. K. Template sinthesized poly(-caprolactone) nanowire sufaces for neural tissue engineering. Elsevier Biomaterials 31, 2010, 23492-3501. -B. Gumera, Christian. New Materials and Scaffold Fabrication Method for Nerve Tissue Engineering. Georgia Institute Technology Thesis, May 2009. -Hart, A.; Terenghi, G. & Wiberg, M. Tissue Engineering for Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Engineering 2011; 2, 245-262. -Subramanian, A.; Maheswai, U. et al. Development of biomaterial scaffold for nerve tissue engineering. Journal of Biomedical Science, Nov. 2009, 16-108.