Disciplina: Biologia Molecular Professora: Izabel Paixo Turma: Farmcia 2011.

2 Aluna: Tain Rodrigues Ed Bibliotecas

1. Que caracterstica um plasmdeo de clonagem deve ter para se construir uma biblioteca genmica? Um stio de restrio nico para determinada enzima e uma origem de replicao. 2. Descreva os principais passos da construo do cDNA: H a sntese de uma fita simples de cDNA usando um primer e transcriptase reversa, depois h a remoo da fita original de RNAm com calor. Forma-se ento uma ala na extremidade 3, que servir de molde para a DNA polimerase, depois ocorre a sntese da fita complementar e clivagem da ala pela nucleasse S1. 3. Como feita a triagem de uma biblioteca genmica? Primeiramente h o plaqueamento de uma alquota da biblioteca genmica em placas de Petri. Cada bactria formar uma colnia. Como elas carregam plasmdeos recombinantes, cada colnia conter alm do DNA genmico das bactrias, tambm o DNA plasmidial e, dentro dele, um trecho do DNA do genoma do organismo em estudo. Ento, quando as colnias estiverem pequenas ainda, deve-se cobrir a placa de Petri com uma membrana de nylon ou outro material que tenha tendncia a ligar DNA Depois de 2 a 4 horas o filtro (membrana) retirado, obtendo-se assim uma rplica das colnias da placa no filtro. A placa de Petri original vai para a geladeira, bem selada com plstico adesivo para no secar nem contaminar. A rplica obtida na membrana ainda tem as bactrias ntegras (e vivas) e o DNA est dentro delas! Ento, preciso inicialmente lisar as bactrias, o que libera os DNAs, que ficam aderidos ao nylon da membrana. Ela ento colocada num saquinho plstico e incubada com a sonda marcada radiativamente. Para isso o DNA precisa estar aberto, o que pode ser obtido aquecendo previamente a membrana a 85 - 90 C ou usando solues desnaturantes. Aps adio da sonda as condies de hibridizao so restauradas. Depois da incubao com a sonda, o excesso dela lavado e a membrana e sobreposta a um filme de raio X, indo o conjunto num cassete plstico para o freezer. Ocorre ento a revelao do auto radiograma, que mostrar a localizao da colnia que contiver os clones de interesse. Volta-se ento placa master e

repicam-se as colnias selecionadas para tubos de ensaio com o meio de cultura adequado. Ao final, se desejar saber o que cada plasmdeo (clone) est carregando, ser preciso sequenciar. 4. Na triagem de uma biblioteca de cDNA de msculo de tartaruga, foi empregado o soro de um coelho imunizado contra a miosina de lagarto .O que deve ser encontrado? Por que? Deve-se encontrar clones de cDNA expressando a miosina (parte dela, ao menos) de tartaruga. Porque os anticorpos dirigidos contra partes da miosina de lagarto provavelmente reconhecero tambm ao menos algumas das partes da miosina de tartaruga, j que os dois vertebrados so rpteis.