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MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE

Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa

AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA

MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

Copyright 2013 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total dessa obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A Anvisa, igualmente, no se responsabiliza pelas idias contidas nessa publicao. 1 edio 2010 Elaborao, distribuio e informaes: AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA SIA Trecho 5, rea Especial 57 CEP: 71205-050 Braslia DF Tel.: (61) 3462-6000 Home page: www.anvisa.gov.br Diretoria Dirceu Brs Aparecido Barbano Diretor-Presidente Jaime Cesar de Moura Oliveira Jos Agenor lvares da Silva Adjuntos de Diretor Luiz Roberto Klassmann Luciana Shimizu Takara Neilton Araujo de Oliveira Doriane Patricia Ferraz de Souza Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS Magda Machado de Miranda Costa Coordenao Tcnica: Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP Redao: Ana Lcia Roscani Calusni Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Maria Jos Franco Landi Bartelega Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Paula Virginia Bottini Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Reviso tcnica Anvisa: Andr Anderson Carvalho Fabiana Cristina de Sousa Heiko Thereza Santana Magda Machado de Miranda Suzie Marie Gomes Cooperao tcnica: Termo de Cooperao N 64 Organizao Pan-Americana da Sade Organizao Mundial da Sade Representao Brasil Joaquin Molina Representante Enrique Vazquez Coordenador da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Rogrio da Silva Lima Consultor Nacional da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Projeto Grfico e Diagramao: All Type Assessoria Editorial Ltda Capa: Camila Contarato Burns Anvisa

Ficha Catalogrfica Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica/Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013. 44p.: il.9 volumes ISBN 1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.

Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Captulo 1: Segurana em laboratrio de Microbiologia Clnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.1 Biossegurana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.2 Classificao dos laboratrios, segundo Nvel de Biossegurana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.1 Nvel 1 de Biossegurana (NB-1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.2 Nvel 2 de Biossegurana (NB-2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.3 Nvel 3 de Biossegurana (NB-3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.2.4 Nvel 4 de Biossegurana (NB-4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3 Classes de agentes de Risco Biolgico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.4 Recomendaes de Biossegurana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.5 Instalaes laboratoriais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.6 Equipamentos de proteo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.6.1 Equipamento de Proteo Individual (EPI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.6.2 Equipamento de Proteo Coletiva (EPC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.7 Conduta em laboratrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.7.1 BPLCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.7.2 Transporte de Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.7.3 Utilizao de Cabines de Segurana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.7.4 Controle da Gerao de Aerossis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.8 Limpeza e desinfeco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.8.1 Higienizao das mos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.9 Resduos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.10 Acidentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.10.1 Acidente com derramamento de Material Biolgico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.10.2 Quebra de tubos contendo Material Biolgico em Centrfuga . . . . . . . . . . . . . 19 1.10.3 Acidente com derramamento de Produtos Qumicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.11 Referncias Bibliogrficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Captulo 2: Garantia da qualidade em Microbiologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.2 Manual de procedimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.3 Recursos humanos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.4 rea fsica e instalaes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.5 Fase pr-analtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.5.1 Requisio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.5.2 Coleta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.5.3 Transporte e conservao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.5.4 Critrios de rejeio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

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Fase analtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.6.1 Microbiologia geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.6.2 Bacteriologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.6.3 Procedimentos analticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.6.4 Micobacteriologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 2.6.5 Micologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 2.6.6 Processos Automatizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2.6.7 Testes de Proficincia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 Fase ps-analtica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.7.1 Conferncia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.7.2 Liberao dos laudos e notificao de resultados crticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Referncias Bibliogrficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a disseminao da resistncia microbiana. Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar, atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade. Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber: Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais. A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.

Captulo 1: Segurana em laboratrio de Microbiologia Clnica


Maria Jos Franco Landi Bartelega

Laboratrios so estabelecimentos que prestam servios especficos populao e apresentam uma diversidade de atuaes em sade que expem seus profissionais a grande variedade de agentes de riscos biolgicos, qumicos e fsicos, associados aos materiais e mtodos utilizados. Visando minimizar tais riscos, essencial o estabelecimento de um Programa de Biossegurana especfico, que dever dotar o laboratrio de estrutura fsica, administrativa e tcnica compatvel com as atividades desenvolvidas, promovendo assim aes preventivas.

1.1 Biossegurana
Conjunto de medidas destinadas a prevenir riscos inerentes s atividades dos laboratrios de assistncia, ensino, pesquisa e desenvolvimento tecnolgico, que possam comprometer a sade dos profissionais e o meio ambiente. A responsabilidade legal pela segurana em ambientes de trabalho cabe aos administradores, no entanto os funcionrios devem incorporar em sua rotina de trabalho as Boas Tcnicas Microbiolgicas e as Normas de Biossegurana. (NR-32 MTE) Deve-se designar uma pessoa ou Comisso de Biossegurana que vise:

Implementar as normas preconizadas em Biossegurana a fim de prevenir riscos para funcionrios, alunos, pacientes e meio ambiente. Padronizar e normatizar procedimentos que regulamentem as normas de segurana. Identificar e classificar reas de risco.

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Estabelecer programas de treinamento para preveno de acidentes e monitorar acidentes de trabalho.

1.2 Classificao dos laboratrios, segundo Nvel de Biossegurana


O nvel de Biossegurana de um procedimento ser determinado segundo o agente biolgico de maior classe de risco envolvido. Quando no se conhece a patogenicidade do agente biolgico deve-se realizar uma avaliao do risco para estimar o nvel de conteno. A Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) responsvel pelas atribuies relativas ao estabelecimento de normas, anlise de risco, definio dos Nveis de Biossegurana e classificao de Organismos Geneticamente Modificados (OGM). As caractersticas fsicas, estruturais e de conteno de um laboratrio determinam o tipo de micro-organismo que pode ser manipulado em suas dependncias. 1.2.1 Nvel 1 de Biossegurana (NB-1) Adequado ao trabalho que envolva agente com menor grau de risco (Classe de Risco I) para profissionais do laboratrio e para o meio ambiente. Aplicao das BPLs e utilizao de EPIs. O trabalho geralmente conduzido em bancadas abertas, no exigindo equipamentos especiais de conteno. Os profissionais devero ter treinamento especfico nos procedimentos realizados e trabalhar sob superviso. O acesso ao laboratrio ser limitado ou restrito de acordo com definio do responsvel e no ser permitida a entrada de animais e crianas. Procedimentos tcnicos e administrativos descritos. O laboratrio no est separado das demais dependncias do edifcio. Deve possuir uma pia especfica para lavar as mos. Nvel 2 de Biossegurana (NB-2) Adequado ao trabalho que envolve agentes de risco moderado para os profissionais e para o meio ambiente, em geral agentes causadores de doenas infecciosas (Classe de Risco II). As instalaes exigidas devem atender as especificaes estabelecidas para o NB-1 acrescidas das seguintes exigncias: 1) autoclave disponvel para descontaminao no interior ou prxima ao laboratrio de modo a permitir a descontaminao de todo o material antes do seu descarte;

1.2.2

Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

2) cabine de Segurana Biolgica Classe I ou II e centrfuga com caapa protegida sempre que houver manipulao de materiais em que possa existir a formao de aerossis. Os profissionais devero ter treinamento especfico no manejo de agentes patognicos, ser orientados sobre os possveis riscos e trabalhar sob superviso. O acesso ao laboratrio ser limitado durante os procedimentos operacionais.

1.2.3

Nvel 3 de Biossegurana (NB-3) Adequado ao trabalho com micro-organismos com elevado risco infeccioso (Classe de Risco III) podendo causar doenas sistmicas srias e potencialmente letais como Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetti e Brucella spp., entre outros. Barreiras de proteo individual devem ser utilizadas e toda manipulao realizada em cabine de segurana biolgica classe II ou III, com filtro HEPA. Oferecer treinamento especfico aos funcionrios no manejo de agentes patognicos e potencialmente letais, orientar sobre os possveis riscos e trabalhar sob superviso. Quando no houver condies especficas para o NB-3 e instalaes laboratoriais sem rea de acesso especfica, com ambientes selados ou fluxo de ar unidirecional, as atividades de rotina e operaes repetitivas podem ser realizadas em laboratrio com instalao NB-2, acrescidas de equipamentos de conteno e das prticas recomendadas para NB-3. Cabe ao pesquisador principal a deciso de implementar essas modificaes, comunicando-as a CIBio e CTNBio (Biossegurana em Laboratrio de Sade Pblica Oda, Leila, vila, Suzana et al. Braslia). O acesso ao laboratrio ser controlado. Menores de idade no sero permitidos dentro do laboratrio. Nvel 4 de Biossegurana (NB-4) Representa o nvel mximo de segurana. Adequado ao manuseio de agentes infecciosos que possuem alto risco de infeco individual e de transmisso pelo ar e sempre que o trabalho envolver OGM resultante de organismo receptor ou parenteral classificado como classe de risco NB-4. Responsvel tcnico tem a responsabilidade final no controle do acesso ao laboratrio.

1.2.4

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1.3 Classes de agentes de Risco Biolgico


Agentes biolgicos humanos e animais so divididos em classes de acordo com critrios de patogenicidade: alterao gentica ou recombinao gnica, estabilidade, virulncia, modo de transmisso, endemicidade, consequncias epidemiolgicas, disponibilidade de medidas profilticas e tratamento eficaz (Diretrizes Gerais para o Trabalho em Conteno com Material Biolgico Ministrio da Sade).
Classe de Risco I Nenhum ou baixo risco individual e comunitrio. Microrganismo que tenha pouca probabilidade de causar enfermidades humanas e em animais. Ex: Bacillus subtilis, Lactobacillus casei Risco individual moderado e risco comunitrio limitado. A exposio ao agente patognico pode provocar doena humana ou animal, porm se dispe de medidas eficazes de tratamento e preveno, sendo o risco de propagao limitado. Ex: Clostridium tetani, Staphylococcus aureus, Cndida albicans, Schistosoma mansoni, Plasmodium etc. Risco individual elevado e risco comunitrio limitado. A exposio pode causar doenas graves ao homem podendo propagar-se de uma pessoa infectada para outra, entretanto existe profilaxia e/ou tratamento. Ex: Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacterium tuberculosis, Histoplasma, Toxoplasma gondii, Trypanossoma cruzi, virus da Hepatite, HIV. Elevado risco individual e comunitrio. Os agentes patognicos representam grande ameaa para as pessoas e animais, com fcil propagao de um indivduo a outro, direta e indiretamente, no existindo profilaxia nem tratamento. Ex: vrus de febres hemorrgicas, vrus Ebola, certos arbovrus etc. Elevado risco de causar doena animal e disseminao no meio ambiente. Aplica-se a agentes de doena animal, no existente no Pas e que, embora no sejam patgenos de importncia para o homem, podem gerar graves perdas econmicas. Os agentes devem ter sua importao proibida e manipulados em laboratrio de conteno mxima NB-4.

Classe de Risco II

Classe de Risco III

Classe de Risco IV

Classe de Risco V

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1.4 Recomendaes de Biossegurana


Prticas Boas Prticas Microbiolgicas (BPLs) NB-1 acrescido de: Acesso limitado Sinalizao de risco Manual de biossegurana definindo polticas de vigilncia mdica e necessidade de descontaminao dos resduos NB-2 acrescido de: Acesso controlado Descontaminao de todo resduo Descontaminao do avental antes da lavagem Banco de soro de funcionrios na admisso NB-3 acrescido de: Trocar de roupa antes de entrar no laboratrio Tomar banho na sada Todo material deve ser descontaminado antes de sair do laboratrio Barreiras Primrias: Cabine de Segurana Classe I ou II, usada para manipulao de todos os materiais EPI: avental, luvas, mscaras quando necessrio Barreiras Primrias: Cabine de Segurana Classe I ou II, usada para manipulao de todos materiais que possam formar aerossol ou que haja risco de respingo. EPI: avental, luvas e protetor facial quando necessrio NB-1 acrescido de: Autoclave disponvel Equipamento de Proteo Individual (EPI) avental e luvas Bancada aberta e pia para a lavagem das mos Barreiras de Conteno e Equipamentos de segurana Instalaes

NB

Agentes

Pouca probabilidade de causar doenas em adultos sadios

Agentes associados a doenas Risco individual moderado e limitado para comunidade Vias de transmisso: leso cutnea, ingesto, exposio de mucosa

Agentes que provocam infeces graves ou potencialmente letais. Risco individual alto e limitado para comunidade. Transmisso potencial por formao de aerossis

NB-2 acrescido de: Separao fsica de corredor de acesso Porta com fechamento automtico, dupla porta de acesso Ar no recirculado Presso negativa no laboratrio NB-3 acrescido de: Construo separada ou rea isolada Sistema de exausto Fornecimento de ar e vcuo Descontaminao

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Agentes com alto risco de causar doena letal Risco individual e para comunidade elevado Ocorrncias de infeces causadas por transmisso por aerossis ou risco de transmisso desconhecido

Barreiras Primrias: Manipulaes conduzidas em cabine de Segurana Classe II B ou Classe III

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1.5 Instalaes laboratoriais


NB 1 Instalaes Fcil limpeza e descontaminao. Superfcie das bancadas impermevel e resistente a cidos, lcalis, solventes e calor. Espao entre bancadas e equipamentos que permita a limpeza. Pia para lavagem das mos. NB-1 acrescida de: Autoclave para descontaminao (dentro ou prximo). NB-2 acrescido de: Separado de reas de trnsito. Sistema de dupla porta. Superfcies internas, pisos e tetos resistentes a gua. Portas com fechamento automtico. Sistema de ar independente, ventilao unidirecional, sem recirculao de ar e filtrado com filtro HEPA para eliminao. Linhas de vcuo protegidas por sifo contendo desinfetante e filtro HEPA ou semelhantes. NB-3 acrescido de: Cmara de entrada e sada de pessoal separada por chuveiro. Sistema de autoclave de dupla porta, cmara de fumigao. Paredes, tetos e pisos construdos com sistema de vedao interna. Sistema coletor de descontaminao de lquidos. O ar deve ser insuflado atravs de filtros HEPA e eliminado para o exterior atravs de dutos de exausto.

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OBS: As instalaes devero ser verificadas uma vez por ano e filtros substitudos quando necessrio.

1.6 Equipamentos de proteo


Considera-se Equipamento de Proteo Individual (EPI) todo dispositivo ou produto, de uso individual utilizado pelo trabalhador, destinado proteo de riscos suscetveis de ameaar a segurana e a sade no trabalho (NR 6 MTE). regulamentado pela Portaria 485, de 11 de novembro de 2005, que aprova a NR 32 (Segurana e Sade no Trabalho em Estabelecimentos de Sade) do Ministrio do Trabalho, competindo ao profissional us-los e conserv-los. 1.6.1 Equipamento de Proteo Individual (EPI) Avental: uso para todos que trabalham em ambiente laboratorial, confeccionado em algodo, com manga longa e punho sanfonado, na altura dos joelhos e usado abotoado. No usar fora da rea de trabalho, nem guardar junto com objetos pessoais. Para laboratrios NB-3, recomenda-se que o abotoamento do avental seja nas costas. H necessidade de descontaminao antes da lavagem. Apesar do avental de algodo no ser considerado EPI por no ter n de CA, seu uso deve ser obrigatrio. Avental Impermevel: evita a contaminao do vesturio.

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Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

Luvas: uso para todos que trabalham em ambiente laboratorial, na manipulao de amostras biolgicas, preparo de reagentes, lavagem de materiais, atendimento ao paciente. Descartar sempre que estiverem contaminadas ou quando sua integridade estiver comprometida. .. Nitrilica: usadas em trabalhos gerais, preparo de solues, lavagem de materiais. .. De latex ou silicone descartvel: usadas em procedimentos que necessitem de proteo contra material biolgico. Devem ser desprezadas aps uso. Kevlar: usadas para trabalhar em baixas ou altas temperaturas (autoclaves e estufas e freezer a 80). Mscaras e Respiradores: proteo de boca e nariz contra respingos e inalao de partculas em aerossol e substncias qumicas volteis e txicas. .. Mscara N-95: composta de 4 camadas de fibras sintticas impermeveis a fludos, com densidade e porosidade capazes de atuar como barreira a micro-organismos transportado pelo ar (aerossis) com eficincia de filtrao maior ou igual a 95%/ partculas de 0,3 m. .. Respirador PFF2 + VO: usado quando da manipulao de reagentes qumicos volteis. culos de Proteo: destinado proteo dos olhos contra respingos de material biolgico, substncias qumicas e partculas. Protetor Facial: destinado proteo da face contra respingos de material biolgico, substncias qumicas e partculas. Deve ser leve, resistente, com visor em acrlico. Sapatos: devem ser fechados, evitando-se assim impactos e respingos.

1.6.2

Equipamento de Proteo Coletiva (EPC) Cabine de Segurana Biolgica: o principal equipamento de conteno fsica para agentes infecciosos. Protegem o material e o profissional, na manipulao de materiais biolgicos altamente infectantes, substncias txicas e cultura de clulas. Cumprir os prazos de reviso e troca de filtros. As cabines devem estar em local de pouco trnsito e distantes de portas. Existem trs tipos de cabine de segurana biolgica (Classes I, II e III). .. Classe I: uma cabine em que o fluxo de ar ocorre de fora para dentro, pela abertura frontal, sem recirculao do ar. O ar da cabine passa por um filtro HEPA antes de ser liberado para o interior do laboratrio. Essas cabines protegem o operador, mas no o material que est sendo manipulado e podem ser usadas quando se est trabalhando com micro-organismos de baixo ou moderado risco.

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Classe II: uma cabine com abertura frontal na qual uma parte do ar recirculado. Esse tipo de cabine protege o operador, o material a ser manipulado e o meio ambiente. Existem dois tipos de cabine classe II: 1) Classe II A: 30% de ar ambiente entra pela abertura frontal, 70% recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA e 30% exaurido para dentro ou fora do laboratrio passando por filtro HEPA. Usadas na ausncia de substncias qumicas volteis, radioativas ou txicas. 2) Classe II B: 70% de ar ambiente entra pela abertura frontal, 30% recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA e 70% exaurido para fora do laboratrio atravs de outro filtro HEPA, por um sistema de exausto. So indicadas para manipulao de cultura de micobactrias e com algumas substncias txicas, volteis e/ou radioativas. .. Classe III: uma cabine hermeticamente fechada, impermevel a gases, e todo o trabalho realizado com luvas de borracha que esto presas cmara. O ar que entra passa por um filtro HEPA e o ar que sai pelo exaustor passa por dois filtros HEPA dispostos sequencialmente. Todos os equipamentos necessrios (centrfuga, incubadora etc.) devem estar dentro da cabine. indicada para o trabalho com micro-organismos de alto poder infectante. Oferece o mais alto grau de proteo ao operador e ao meio ambiente. Lava-olhos: usado quando ocorrem acidentes onde haja contato de material biolgico ou substncia qumica, com os olhos e/ou a face. Os profissionais devem estar treinados quanto ao seu uso e as orientaes localizadas prximas ao equipamento. Manter o acesso facilitado. Chuveiro de Segurana: usados quando ocorrem acidentes com derramamento de grande quantidade de material biolgico ou substncia qumica sobre as roupas e pele do profissional, ou quando as roupas estiverem em chamas. Os profissionais devem ser treinados quanto ao seu uso e as orientaes localizadas prximas ao equipamento. Manter o acesso facilitado. Proteo de Linha de Vcuo: evita contaminao do sistema de vcuo com aerossis e fluidos derramados. Autoclave: esterilizao por calor eficaz, tornando material infeccioso seguro para ser eliminado ou reutilizado. Garrafas com Tampa de Rosca: produz confinamento eficaz contra aerossis e derrames. Microincineradores de ala: gs ou eletricidade tm escudo de vidro ou cermica que minimizam salpicos ou borrifos quando se esterilizam as alas.
..

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Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

1.7 Conduta em laboratrio


O diretor e/ou coordenador do laboratrio responsvel por assegurar a implementao das Normas de Biossegurana e as Condutas em Laboratrio.

Programa de Preveno de Risco Ambiental (PPRA) avaliado anualmente (NR-32 Ministrio do Trabalho). Exame pr-admissional e peridico (Clnico e Laboratorial) Programa de Controle Mdico de Sade Ocupacional (PCMSO) anual. Programa de Vacinao atualizado. Registro de doenas e acidentes de trabalho. BPLCs (Boas Prticas em Laboratrio Clnico) implantadas e seguidas. Acesso limitado ao laboratrio. BPLCs Proibido comer, beber, fumar, guardar alimentos e aplicar cosmticos na rea tcnica. Prender os cabelos e evitar o uso de bijuterias. vedado o uso de calados abertos (chinelos e sandlias). Toda amostra biolgica deve ser considerada potencialmente contaminada. Obrigatrio o uso de EPIs. Proibido pipetar com a boca. Obrigatria a descontaminao das bancadas de trabalho antes e aps o desenvolvimento das atividades. Proibido reencapar e entortar agulhas aps o uso. Nunca manipular materiais no identificados. Segregar e acondicionar adequadamente resduos biolgicos, qumicos e ionizantes. Depositar todo material contaminado em recipientes apropriados para autoclavao. Higienizar sempre as mos. Transporte de Amostras Utilizar caixas rgidas preferencialmente providas de tampas higienizveis, contendo estantes que permitam que os frascos permaneam na posio vertical, evitando acidente por derramamento. Devem ser resistentes a desinfetante qumico ou calor. Devem ser lavadas frequentemente e sempre que ocorrer derramamento. Utilizao de Cabines de Segurana Ligar a cabine e a luz 10 a 15 minutos antes do uso.
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1.7.1

1.7.2

1.7.3

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Fechar as portas do laboratrio e evitar circulao de pessoas durante o uso da cabine. Colocar os equipamentos, meios de cultura, vidrarias etc. no plano de atividade da rea de trabalho. Limpar todos os objetos antes de introduzi-los na cabine e organizar os materiais de modo que no se misturem os itens limpos e contaminados. Bicos de Bunsen no devem ser utilizados dentro da cabine, pois o calor pode acarretar danos ao filtro HEPA e interromper o fluxo laminar de ar, causando turbulncia. Usar pipetador automtico. Conduzir as manipulaes no centro da cabine. Minimizar os movimentos dentro da cabine. Terminado o trabalho, a superfcie de trabalho da cabine deve ser limpa com desinfetante apropriado. Deixar a cabine ligada 10 a 15 minutos antes de deslig-la. Fazer controle da contagem de tempo do uso das lmpadas UV, e de utilizao da cabine para fim de manuteno e troca do pr-filtro.

1.7.4

Controle da Gerao de Aerossis A manipulao de micro-organismos, sangue, fludos orgnicos, p e substncias qumicas poder levar formao de aerossis, podendo contribuir para ocorrncia de enfermidades ocupacionais. Algumas operaes contribuem para formao de aerossis.

Uso de agitadores. Remoo de tampas de borracha, de rosca ou de algodo de tubos de ensaio. Flambagem de alas de maneira inadequada. Inoculao de culturas com pipeta ou ala de forma inadequada. Remoo de meio de cultura lquido com seringa e agulha. Destampar frasco de cultivo ou suspenso de lquidos imediatamente aps agit-lo. Romper clulas com ultrassom. Soprar a ltima gota de cultivo ou substncia qumica de uma pipeta. No vedar adequadamente frascos de substncias txicas volteis.

1.8 Limpeza e desinfeco


As superfcies contaminadas podem servir como reservatrio de agentes patognicos, mas normalmente no so associadas diretamente transmisso de infeces para Profissionais da rea da Sade ou pacientes. Mesmo diminuindo o impacto des16

Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica

sa transmisso atravs da higienizao das mos, a realizao da limpeza e desinfeco das superfcies fundamental para a reduo da incidncia de infeces. Os fatores que influenciam na escolha do procedimento de desinfeco das superfcies so: a) natureza do item a ser desinfetado; b) nmero de micro-organismos presentes; c) resistncia do micro-organismo aos efeitos do germicida; d) quantidade de matria orgnica presente; e) tipo e concentrao do germicida usado; f) durao e temperatura do contato com o germicida; g) as especificaes e indicaes de uso do produto pelo fabricante. Eficincia dos agentes qumicos frente aos tipos comuns de micro-organismos
Desinfetante Sabo Detergente Quaternrio de amnia Cloro Comp. Fenlicos Hexaclorofeno lcoois Glutaraldedo Bactria gram (+) 0 2 3 3 3 3 3 3 Bactria gram (-) 0 1 2 3 3 1 3 3 Bacilo Tuberculose 0 0 0 0 0 0 3 3 Esporo 0 0 0 0 0 0 0 2 Vrus 0 0 2 2 2 2 2 3 Fungo 0 0 2 2 2 2 2 3

Nveis: 3 = Bom 2 = Satisfatrio 1 = Insatisfatrio 0 = No ativo Fonte: Segurana no Ambiente Hospitalar, Ministrio da Sade

1.8.1

Higienizao das mos Mos contaminadas podem ser as principais vias de transmisso de infecco. O simples ato de lavar as mos com gua e sabo lquido, visando a remoo de bactrias transitrias e algumas residentes, como tambm clulas descamativas, pelos, suor, sujidades e oleosidade da pele, contribui para a diminuio do risco de infeco.

Abrir a torneira e molhar as mos sem encostar-se pia. Ensaboar as mos com sabo lquido. Friccionar as mos por cerca de 30 segundos, realizando todos os movimentos a seguir: a) friccione circularmente palma com palma; b) friccione circularmente dorso com palma; c) lavar os espaos interdigitais deslizando uma mo sobre a outra; d) friccione as articulaes de uma mo sobre a palma da outra; e) lave o polegar com auxlio da outra mo;

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f ) friccione circularmente as unhas (pontas dos dedos) na palma da outra mo; g) friccionar os pulsos com a palma da mo. Enxaguar as mos retirando todo o resduo de sabo. Enxugar as mos com papel toalha e fechar a torneira utilizando o mesmo papel (se a torneira no for com acionamento automtico). Torneiras manuais devem ser mantidas abertas at o trmino da lavagem das mos.

1.9 Resduos
O laboratrio responsvel pelo correto gerenciamento de todos os resduos gerados, atendendo as normas e exigncias legais, desde o momento de sua gerao at seu destino final. Os Resduos de Servios de Sade (RSS), segundo a RDC n 306 de 2004 da Anvisa, so classificados em cinco grupos, a saber:

Grupo A: resduos com a possvel presena de agentes biolgicos que, por suas caractersticas, podem apresentar risco de infeco. Grupo B: resduos contendo substncias qumicas que podem apresentar risco sade pblica ou ao meio ambiente, dependendo de suas caractersticas de inflamabilidade, corrosividade, reatividade e toxicidade. Grupo C: quaisquer materiais resultantes de atividades que contenham radionucldeos em quantidades superiores ao nvel de iseno estabelecida pelas normas da Comisso Nacional de Energia Nuclear (CNEN). Grupo D: resduos que no apresentam risco biolgico qumico ou radiolgico podendo ser equiparado a resduo domstico, passvel de segregao para reciclagem. Grupo E: materiais perfurocortantes ou escarificantes.

Num laboratrio de Microbiologia, todos os resduos gerados como culturas e estoques de micro-organismo, meios de cultura e instrumentais utilizados para transferncia, inoculao ou mistura de culturas, amostras biolgicas, devem ser acondicionados de maneira compatvel com o processo de tratamento a ser utilizado, que poder ser um processo fsico ou outro que venha a ser validado para obteno de reduo ou eliminao da carga microbiana. Se o processo utilizado no promover a descaracterizao fsica das estruturas, o mesmo dever ser acondicionado em saco branco leitoso com simbologia de substncia infectante conforme NBR 7500 da ABNT que ser substitudo sempre que atingirem 2/3 de sua capacidade ou pelo menos uma vez ao dia.
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Havendo descaracterizao fsica das estruturas, podem ser acondicionados como resduos do Grupo D. Materiais perfurocortantes devem ser descartados em recipientes rgidos, resistentes punctura, ruptura e vazamento, devidamente identificados e autoclavados antes do descarte. Os instrumentos de trabalho a serem reutilizados devero ser colocados em recipientes preferencialmente plsticos contendo soluo desinfetante e permanecer o tempo estabelecido pelo fabricante para posterior autoclavagem, lavagem e reutilizao.

1.10 Acidentes
1.10.1 Acidente com derramamento de Material Biolgico Isolar a rea atingida. Impedir a manipulao no local por pelo menos 30 minutos. Usar EPIs. Colocar papel toalha sobre o material derramado e sobre o mesmo, soluo de hipoclorito de sdio a 2%, ou cloro ativo, aguardar 15 minutos. Recolher em recipiente com saco para resduo infectante ou saco autoclavvel as toalhas de papel, luvas e todo material usado na descontaminao. Estilhaos de vidro ou plstico devero ser recolhidos em caixa de perfurocortante. Refazer a descontaminao da rea com soluo de hipoclorito de sdio a 2%. 1.10.2 Quebra de tubos contendo Material Biolgico em Centrfuga Desligar a centrfuga e manter fechada por 30 minutos para disperso de aerossis: Usar EPIs. Retirar estilhaos com auxlio de pina e descartar em caixa de perfurocortante. Limpar caapas, pinos e rotor com soluo de hipoclorito de sdio a 2%. Limpar internamente a centrfuga com gaze embebida com soluo de hipoclorito de sdio a 2% e aps com pano embebido em gua e sabo. Descartar todo o material usado na descontaminao em recipiente com saco para resduo infectante. 1.10.3 Acidente com derramamento de Produtos Qumicos Utilizar EPIs.
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Conter o lquido derramado em rea reduzida. Cobrir o resduo com vermiculina ou areia e aguardar sua absoro. Recolher todo o resduo e o material utilizado para limpar a rea em saco plstico preto para posterior descarte.

1.11 Referncias Bibliogrficas


Isenberg, HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. ABNT. Biossegurana no Laboratrio Clnico. Normas Brasileiras. CTN Bio. Fleming, D, Richardson, JH, Tulis, JJ, Wesley, D. Laboratory Safety Principles and Practices. ASM Press, USA 2 ed., 1995. Oda, LM. Capacity Building Programer on Biosafety A guide to supervisors, RJ 1998. Oda, LM, vila, SM. Biosssegurana em Laboratrio de Sade Pblica. Ministrio da Sade,1998. Teixeira, P, Valle, S. Biossegurana Uma Abordagem Multidisciplinar. FIOCRUZ Rio de Janeiro, 1996. Oplustil, CP, Zoccoli, CM, Tabouti, NR, Sinto, IS. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. Organizaao Mundial Da Saude (OMS). Manual de Segurana Biolgica em Laboratrio, 3 edio. Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria Nacional de Assistncia Sade. Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Hospitalar. 1991. Brasil. Ministrio do Trabalho. Portaria n 458, de 11 de novembro de 2005. Norma Regulamentadora n 32. Segurana e Sade no Trabalho em Estabelecimentos de Sade. Brasil. Ministrio da Sade. Anvisa. RDC n 306, de 07 de dezembro de 2004. Regulamento Tcnico para Gerenciamento de Resduos de Sade. Brasil. Ministrio do Meio Ambiente. Conama. Resoluo n 358, de 29 de abril de 2005. Tratamento e Disposio Final dos Resduos dos Servios de Sade.

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Captulo 2: Garantia da qualidade em Microbiologia


Ana Lucia Roscani Calusni Paula Virginia Bottini

2.1 Introduo
Um Servio de Microbiologia pode compreender diversos setores, dependendo da forma de estruturao da rea. De maneira geral podemos subdividir a microbiologia em Microbiologia Geral, Bacteriologia, Micobacteriologia, Micologia alm de Virologia e Parasitologia, sendo que os dois ltimos habitualmente constituem servios separados na maioria dos laboratrios clnicos. O laboratrio clnico de Microbiologia responsvel por providenciar informao precisa e relevante quanto ao diagnstico do paciente. O valor e a preciso clnica das anlises do material clnico e o respectivo isolamento do(s) micro-organismo(s) so dependentes do programa de qualidade que, por sua vez, avalia a qualidade do material, documenta a validade do mtodo aplicado, monitora a performance dos procedimentos, reagentes, meios, instrumentos e do indivduo que executou a anlise e verifica os resultados do teste quanto aos erros e relevncia clnica. Um programa de qualidade efetivo depende de um processo de avaliao contnuo e do seu constante aprimoramento. Os principais erros em Microbiologia incluem tipo de amostra inadequada para o exame a ser realizado, frascos de coleta no estreis, o no uso de meios de transporte adequados, demora no transporte, uso de meios de cultura no apropriados, informao incorreta dos achados, desconsiderar um achado na anlise, desconhecimento do papel dos interferentes e no analisar todos os achados em conjunto.

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2.2 Manual de procedimentos


Todos os laboratrios devem possuir um manual de procedimentos atualizado e disponvel na rea de trabalho. Esses procedimentos operacionais (POPs) tm o objetivo de padronizar e minimizar a ocorrncia de desvios na execuo de tarefas fundamentais para a qualidade do exame, independentemente de quem as faa. Assim, garante-se que sejam tomadas as aes na fase pr-analtica, analtica e ps-analtica para assegurar que a qualidade de seus exames seja a mesma, de uma rodada para a outra, de um turno para outro, de um dia para outro, aumentando-se a previsibilidade de seus resultados e minimizando as variaes causadas por impercia e adaptaes aleatrias da metodologia. Todos os POPs do laboratrio contm, no mnimo, as seguintes informaes:

Nome do laboratrio Ttulo Identificao, assinatura e data da elaborao, reviso e aprovao do POP Nmero da verso atual Nmero do documento Abrangncia e distribuio Nmero de cpias Princpio do teste Aplicao clnica Amostra analisada (tipo de amostra e suas condies necessrias) Padres, controles, reativos e outros insumos Equipamentos (uso, calibrao e manuteno preventiva) Passo a passo do ensaio (fase analtica detalhada) Clculos (quando aplicvel: converso de unidades ou aplicao de fatores) Controle da Qualidade (externo e interno com periodicidade e faixa de aceitao de valores) Interferentes e reaes cruzadas Valores de referncia (referentes populao atendida) Linearidade, limites de deteco e limitaes do mtodo (que devero estar congruentes com as necessidades do usurio: sensibilidade, robustez contra fatores externos, incertezas de medio etc.) Interpretao dos resultados Referncias Bibliogrficas (fontes dos dados obtidos no procedimento)

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2.3 Recursos humanos


O dimensionamento do quadro de pessoal leva em conta algumas caractersticas dos laboratrios, tais como: nmero de amostras processadas por dia, perfil dos pacientes atendidos, presena ou no de atividade cientfica e/ou didtica concomitante, necessidade de superviso constante, alm do horrio de funcionamento e prazo determinado para liberao dos laudos. Em termos de qualificao recomenda-se que os ensaios microbiolgicos sejam realizados e supervisionados por pessoal experiente, qualificado em microbiologia ou equivalente. A gerncia do laboratrio tem o papel de garantir que todo pessoal tenha recebido treinamento adequado para o desempenho competente de ensaios e operao de equipamentos. Isso inclui treinamento em tcnicas bsicas, tais como semeadura em placas, contagem de colnias, trabalhos em condio de assepsia etc., com o uso de critrios para determinar nveis de aceitao. O pessoal do laboratrio somente pode realizar os ensaios se for reconhecidamente capacitado para faz-lo ou se estiver sob superviso adequada. A capacitao contnua deve ser monitorada, sendo capaz de detectar necessidades de reciclagem, cuja periodicidade necessita ser estabelecida e documentada. A interpretao dos resultados de ensaio para identificao e verificao de micro-organismos fortemente relacionada com a experincia do analista e deve ser monitorada regularmente. Vale lembrar que importante que o pessoal que realiza ensaios que exigem avaliao de cores seja testado com relao a possvel dificuldade de discriminao destas. Isso no significa que pessoas com dificuldade de discriminao de cores no possam atuar em microbiologia, mas apenas que devem exercer outras funes compatveis com discromatopsias.

2.4 rea fsica e instalaes


A rea fsica deve ser suficiente para permitir que as reas de trabalho sejam mantidas limpas e arrumadas, sendo o espao proporcional ao volume de anlises realizadas e organizao interna do laboratrio. Dependendo dos tipos de ensaio realizados, h necessidade de o acesso ao laboratrio microbiolgico ser restrito ao pessoal autorizado. O planejamento da rea fsica de um laboratrio de microbiologia necessita atender a alguns requistos bsicos:

Fluxo de trabalho que minimize riscos de contaminao cruzada. Para tanto pode-se executar as rotinas de maneira sequencial ou separando atividades por tempo
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ou espao. So consideradas necessrias reas independentes para preparao de meios de cultura, pesquisa e cultura de micobatrias e fungos. Ventilao e temperatura apropriada. Isso pode ser obtido por ventilao natural ou forada ou pelo uso de um condicionador de ar. Uso de filtros apropriados quando do uso de condicionadores de ar, inspecionados, conservados e substitudos de acordo com o tipo de trabalho realizado. A temperatura deve ser adequada aos procedimentos realizados e ao fluxo de trabalho da rea, mantendo-se registros dirios de sua variao. Iluminao adequada. No se recomenda apenas insolao direta, pois esta muito varivel. Recomenda-se que o controle da iluminao seja setorial para que possa ser regulada para as diversas atividades que requerem maior ou menor incidncia de luz. Programa de limpeza documentado para instalaes, equipamentos e superfcies de laboratrio, bem como um procedimento para lidar com derramamentos.

2.5 Fase pr-analtica


2.5.1 Requisio Para garantir a qualidade do exame, essencial que as requisies para anlises microbiolgicas contenham algumas informaes adicionais relevantes, tais como origem da amostra, tipo de infeco, micro-organismo esperado, uso de antimicrobianos, presena de imunodeficincia, entre outras. Coleta A coleta da amostra depende da anlise a ser realizada. No manual de coleta constam todas as informaes necessrias para coleta dos diversos materiais biolgicos (tais como escarro, urina, secrees, feridas, sangue, entre outros), incluindo o procedimento detalhado para sua obteno, tempo mximo para entrega ao laboratrio aps a coleta, meios de transporte utilizados (quando apropriado) e mtodos de preservao da amostra em caso de demora para processamento. Como frequentemente amostras para exames microbiolgicos so coletados por pessoal externo ao laboratrio (ex: mdicos e equipe de enfermagem), necessria a existncia de orientaes especficas sobre conservao, manuseio seguro e transporte dos materiais biolgicos para o laboratrio. No caso de lquido cefalorraquidiano (LCR), este deve ser coletado em frasco estril, sem gel separador e sem a adio de qualquer tipo de conservante. O volume a ser coletado varia de acordo com a idade e as condies do paciente.

2.5.2

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Da mesma forma, material proveniente de derrames cavitrios tambm so coletados em frasco estril sem gel separador e sem a adio de qualquer tipo de conservante. Grandes volumes de amostra podem ser tambm encaminhados em frascos de hemocultura pois a positividade das culturas aumenta quando um volume maior utilizado. Para realizao de urocultura, deve-se coletar uma amostra isolada de urina, jato mdio aps assepsia, tendo o paciente mantido de duas a quatro horas de estase vesical. Essa amostra pode ser randmica (coletada a qualquer momento do dia) ou na primeira urina da manh. No caso de hemoculturas, geralmente duas coletas so suficientes, com amostras obtidas antes do pico febril e com um intervalo mnimo de 15 a 20 minutos entre as punes. Havendo solicitao mdica de uma terceira amostra esta pode obtida aps 15 a 20 minutos da coleta anterior ou prazo de at 24 horas. O volume de sangue coletado uma das variveis mais crticas para a positividade do exame. Quanto maior o volume coletado maior a probabilidade de positividade, respeitando-se sempre o volume padronizado para cada frasco. No caso de pacientes com dados clnicos e achados radiolgicos sugestivos de tuberculose, recomenda-se que as amostras de escarro para pesquisa e cultura para micobactrias sejam coletadas preferencialmente em trs dias consecutivos ou alternados (3 amostras matinais). 2.5.3 Transporte e conservao Aps a coleta, as amostras necessitam ser encaminhadas o mais rapidamente possvel ao laboratrio a fim de eliminar possvel crescimento da microbiota normal. O objetivo primrio no transporte de amostras para diagnstico laboratorial consiste em manter a integridade do material biolgico, evitando-se a deteriorao. Deve-se evitar condies ambientais adversas como exposio ao frio e calor intensos ou dessecamento excessivo. Para minimizar os riscos aos transportadores necessria a utilizao de recipientes adequados, isotrmicos, higienizveis, impermeveis, com tampa e devidamente sinalizados para material biolgico. Para pesquisa de BAAR e cultura de BK as amostras devem ser entregues ao laboratrio prontamente, idealmente dentro de 30 minutos, ou serem refrigeradas dentro da primeira hora aps a coleta e entregues ao laboratrio em at 48 horas aps a coleta.

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2.5.4

Critrios de rejeio Os critrios de rejeio podem variar para cada laboratrio, mas obrigatoriamente incluem: requisio incompleta ou ilegvel, material mal identificado ou com contaminao visvel a olho nu, material coletado em frascos no estreis ou com conservantes e amostras insuficientes. Outro critrio de rejeio inclui amostras inadequadas para realizao do teste solicitado (ex: sonda Foley, material de colostomia, etc.).

2.6 Fase analtica


2.6.1 Microbiologia geral Reagentes Os reagentes ou insumos preparados ou aliquotados pelo laboratrio devem conter em seus rtulos: nome, concentrao, nmero do lote (se aplicvel), data de preparo, identificao do responsvel pelo preparo (quando aplicvel), data de validade, condies de armazenamento, alm de informaes referentes a riscos potenciais e precaues de segurana. Da mesma forma, todos os reagentes, kits e meios de cultura comerciais necessitam de armazenamento segundo as orientaes do fabricante e devem ser utilizados dentro do prazo de validade. Os laboratrios so responsveis por assegurar que a qualidade dos reagentes utilizados seja apropriada para o ensaio em questo. A verificao da adequao de cada lote de reagentes crticos para o ensaio, inicialmente e durante sua validade, realizada atravs do uso de micro-organismos-controle positivos e negativos que sejam rastreveis a colees de culturas nacionais ou internacionais reconhecidas. Havendo mltiplos componentes em um conjunto de reagentes (kit), os diferentes componentes sero utilizados apenas com conjuntos de mesmo lote, a no ser que o fabricante permita o uso interlotes. O desempenho dos reagentes sempre avaliado antes ou durante a sua colocao em uso. Para as pesquisas diretas, o uso de materiais de referncia ou o teste em paralelo dos reagentes novos versus antigos so aceitveis e seus resultados so documentados apropriadamente. No caso de pesquisas diretas de antgenos em amostras, por meio de conjuntos diagnsticos (kits) dotados de controles internos, recomenda-se testar tambm controles independentes, um positivo e um negativo (organismo ou extrato antignico) com resultados documentados para cada novo lote ou para cada nova partida recebida. Os controles internos fornecidos pelo fabricante podem ser
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usados da em diante. No havendo controles internos como parte integrante dos kits deve-se testar um controle positivo e um negativo (organismo ou extrato antignico) a cada dia em que se analisam amostras de pacientes. Para painis ou baterias, so usados controles para cada antgeno bacteriano pesquisado. Para testes complexos, que incluem uma fase de extrao, o sistema verificado a cada dia de uso por meio de um organismo sabidamente positivo. Equipamentos Os equipamentos existentes no laboratrio dependem da complexidade e da demanda dos servios. Os equipamentos, sejam eles nacionais ou importados, devem estar regularizados junto a Anvisa/Ministrio da Sade, de acordo com a legislao vigente. obrigatrio que todo laboratrio tenha um programa documentado para a manuteno, calibrao e verificao de desempenho de seus equipamentos. A manuteno de equipamentos crticos realizada em intervalos especificados, de acordo com vrios fatores, como, por exemplo, as especificaes do fabricante e a taxa de uso, com registros detalhados de sua execuo. Na Tabela 1 encontram-se os equipamentos mais utilizados em um laboratrio de microbiologia, bem como os procedimentos de controle de qualidade, periodicidade e limites de tolerncia. Tabela 1 Procedimentos para o controle de qualidade de alguns equipamentos
EQUIPAMENTO Refrigeradores Freezers Estufas Banho-Maria Aquecedores Estufas de CO2 PROCEDIMENTO Registro de temperatura* PERIODICIDADE Dirio ou contnuo LIMITES DE TOLERNCIA 2oC a 8oC -8oC a 20 oC / -60oC a -75oC 35,5oC 1oC 36oC a 38oC / 55oC a 57oC 1oC do estabelecido 5 a 10%

Medida do contedo de CO2: Usar analisador de gases sanguneos ou dispositivo Fyrite1 Teste com tiras de esporos (Bacillus stearothermophilus) Testes com solues para calibrar pH

Dirio ou duas vezes ao dia

Autoclaves

Semanalmente

O no crescimento de esporos indica corrida estril. 0,1 unidade de pH do pado em uso.

Medidor de pH

A cada uso

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EQUIPAMENTO Jarras de anaerobiose Cmera anaerbia com luvas

PROCEDIMENTO Tira indicadora com azul de metileno Cultivo de Clostridium novyi tipo B Soluo indicadora de azul de metileno

PERIODICIDADE A cada uso

LIMITES DE TOLERNCIA A converso da tira de azul para branco indica baixa tenso de CO2. O crescimento indica baixa tenso de O2. Utilizada apenas quando preciso uma tenso de O2 extremamente baixa. A soluo permanece incolor se a tenso de O2 for baixa. 180 rpm 10 rpm Dentro de 5% do estabelecido no indicador. Fluxo de 1,52m de fluxo de ar/minuto 0,152 m/ minuto.

Peridico

Rotador de sorologia Centrfugas Cabines de segurana

Contagem de rpm Controlar revolues com tacmetro Medir a velocidade do ar atravs da abertura para o rosto2

A cada uso Mensalmente Semestral ou trimestralmente

* cada termmetro de controle deve ser calibrado contra um termmetro padro. 1. Bacharach Instrument Co, Pittsburgh, PA. 2. Velometer Jr., Alnor Instrument Co., Chicago, IL.

obrigatrio que o laboratrio mantenha um programa para calibrao e verificao de desempenho dos equipamentos que possuem influncia direta sobre os resultados dos ensaios. A frequncia de calibrao e a verificao de desempenho so determinadas pelo histrico documentado do equipamento e baseadas na necessidade, tipo e desempenho anterior do equipamento (Tabela 2) Tabela 2 Calibrao e verificaes de calibrao sugesto de periodicidade
EQUIPAMENTO Termmetros de referncia (lquido em vidro) REQUISITO Recalibrao inteiramente rastrevel Um nico ponto (p. ex.: verificao do ponto de congelamento) Recalibrao inteiramente rastrevel Verificao com termmetro de referncia Verificao com termmetro de referncia no ponto de congelamento e/ou faixa de temperaturas operacionais Calibrao inteiramente rastrevel PERIODICIDADE SUGERIDA A cada 5 anos Anualmente

Termopares de referncia

A cada 3 anos Anualmente Anualmente

Termmetros de trabalho e Termopares de trabalho Balanas

Anualmente

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EQUIPAMENTO Pesos de calibrao Peso (s) aferidor (es)

REQUISITO Calibrao inteiramente rastrevel Verificao com peso calibrado ou verificao na balana imediatamente aps a calibrao rastrevel Calibrao gravimtrica na tolerncia exigida Calibrao rastrevel de micrmetro de mesa (onde apropriado) Calibrao rastrevel Calibrao rastrevel ou verificao com um tacmetro

PERIODICIDADE SUGERIDA A cada 5 anos Anualmente

Vidrarias volumtricas Microscpios

Anualmente Aps a instalao, antes do uso inicial Anualmente Anualmente

Higrmetros Centrfugas

Uso de controles As amostras de controle da qualidade so testadas da mesma maneira que as amostras de pacientes e pelo mesmo pessoal que rotineiramente realiza os testes de pacientes. Os resultados dos controles so sempre avaliados antes da emisso do laudo, havendo aes corretivas documentadas quando o controle excede os limites de tolerncia. Resultados de controle que se encontrem fora dos critrios de aceitabilidade especificados devem ser imediatamente reportados ao supervisor responsvel para que aes corretivas imediatas sejam tomadas. Resultados de pacientes obtidos em uma rotina analtica cujos controles encontram-se fora dos limites de aceitao ou desde a ltima rotina aceitvel sero re-analisados para determinar se existe alguma diferena clinicamente significativa nos resultados obtidos. Controle de microscopia A maneira pela qual o exame microscpico realizado tem de ser consistente. Para garantir a reprodutibilidade, uma vez que na maioria dos casos no se dispe de controles de qualidade comerciais, pode-se adotar a prtica da dupla observao, e/ou avaliao de um mesmo material por todos os indivduos e/ou uso de slides ou figuras previamente validadas por consenso. Mensalmente utilizar anlise de replicatas ou duplo-cego. fundamental que o laboratrio disponha de um arquivo de micro-organismos no usuais, como tambm de atlas, figuras ou outras publicaes que auxiliem na identificao dos elementos presentes nos diversos materiais biolgicos.
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Recomenda-se guardar todas as lminas por pelo menos uma semana para possvel reviso ou referncia. Lminas com achados raros devem ser conservadas por perodos de tempo mais longos, dependendo do espao disponvel. Nesse caso fixar a preparao atravs de meios de incluso rpida para microscopia e cobertas com lamnulas. Vale lembrar que a conservao e manuteno dos microscpios so fundamentais para a qualidade da anlise microscpica. Diariamente realiza-se a limpeza de partculas de sujeira na ocular, objetivas e condensador com leno de papel ou lenos prprios para limpeza de lentes. No utilizar gaze ou papel higinico. Ao final da rotina retirar resduos de leo utilizando um cotonete umedecido com uma soluo de lcool ter (1:1) ou lcool isoproplico 70% (nunca usar xilol), evitando contato com a regio perifrica das lentes. Pode-se utilizar ainda solues prprias para limpeza de lentes disponveis em pticas. Semestralmente procede-se limpeza da parte interna das oculares e objetivas. 2.6.2 Bacteriologia Meios de cultura O laboratrio responsvel por garantir que todos os meios de cultura usados, tanto comprados prontos como de preparo prprio, sejam estreis, capazes de permitir o crescimento adequado dos micro-organismos e apresentem a reatividade bioqumica apropriada. Em geral, o laboratrio mantm em estoque cepas de micro-organismos para testar os meios antes ou simultaneamente ao uso, mantendo os registros adequados. Os micro-organismos empregados para o controle de qualidade devem ser mantidos no laboratrio por meio de subcultivos de isolados recuperados como parte do trabalho de rotina ou micro-organismo de referncia como os da ATCC. Meios preparados no laboratrio O desempenho apropriado dos meios de cultura, diluentes e outras solues preparadas no laboratrio deve ser verificado com relao sobrevivncia ou recuperao do micro-organismo-alvo, inibio ou supresso dos micro-organismos no-alvo, s propriedades bioqumicas (diferenciais e diagnsticas) e s propriedades fsicas (por exemplo: pH, volume e esterilidade). Na Tabela 3, encontram-se listados os microganismos-controle e as reaes esperadas para o controle de qualidade dos meios de cultura, segundo Winn 2006.

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Tabela 3 Micro-organismos-controle e reaes para o controle de qualidade dos meios de cultura


MEIO gar-sangue gar bile-esculina MICRORGANISMO Streptococcus do Grupo A Streptococcus pneumoniae Espcies de Enterococcus Streptococcus alfa-hemoltico no do grupo D Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli gar citrato de Simmons Klebsiella pneumoniae Escherichia coli gar cistina-tripticase (ACT) - Dextrose - Sacarose - Maltose Neisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Espcies de Salmonella ou Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamicus Neisseria gonorrhoeae Klebsiella pneumoniae Enterobacter sakasakii Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Proteu mirabilis Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Serratia marcescens REAO Bom crescimento, beta-hemlise Bom crescimento, alfa-hemlise Bom crescimento, cor negra Nenhum crescimento, sem colorao do meio Bom crescimento Bom crescimento Toda a superfcie de cor rosa (positivo) Inclinao do meio rosa (positivo parcial) Cor amarela (negativo) Crescimento ou cor azul (positivo) Sem crescimento, permanece verde (negativo) - Cor amarela (positivo) - No modifica a cor (negativo) - Cor amarela (positivo) - No modifica a cor (negativo) - Cor amarela (positivo) - No modifica a cor (negativo) - Cor amarela (positivo) - No modifica a cor (negativo) - Cor azulada (positivo) - Cor amarela (negativo) - Cor azulada (positivo) - Cor amarela (negativo) - Cor azulada (positivo) - Cor amarela (negativo) Zona de clarificao (adicionar HCl 1 N) Sem zona de clarificao

gar chocolate gar uria de Christensen

- Lactose Descarboxilases - Lisina - Arginina - Ornitina DNAse

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MEIO gar eosina azul-de-metileno

MICRORGANISMO Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Shigella flexneri

REAO Bom crescimento, brilho verde metlico Bom crescimento, prpuras, sem brilho Bom crescimento, transparentes (lactosenegativas) Verdes com centro negro Verdes transparentes Crescimento algo inibido, alaranjadas Cor vermelha (positivo) Ausncia de cor vermelha (negativo) Profundidade e inclinao prpura + H2S Inclinao prpura / profundidade amarela Inclinao vermelha / profundidade amarela Colnias vermelhas (lactosepositivas) Colnias incolores, sem disseminao Sem crescimento Sem crescimento Bom crescimento, cor azul (positivo) Meio turvo (positivo) Sem borda plumosa em estria (negativo) Cor vermelha ao adicionar reativos Ausncia de cor vermelha (negativo) Bom crescimento Sem crescimento Cor amarela (positivo) Incolor (negativo) Cor verde (adicionar FeCl3 a 10%) Ausncia de cor verde (negativo) Colnias incolores, centro negro Sem crescimento Cor vermelha (adicionar reativos) No desenvolve cor (negativo)

gar de Hecktoen

Salmonella typhimurium Shigella flexneri Escherichia coli Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Shigella flexneri Proteus mirabilis

Indol

gar lisina-ferro

gar MacConkey

Escherichia coli Proteus mirabilis Espcies de Enterococcus

Malonato

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Acinetobacter lwoffi

Motilidade

Caldo ou gar nitrato

gar sangue fenletil lcool o-Nitrofil-betaDgalactopiranosdeo (ONPG) Fenilalanina desaminase gar Salmonella-Shigella Voges-Proskauer

Espcies de Streptococcus Escherichia coli Serratia marcescens Salmonella typhimurium Proteus mirabilis Escherichia coli Salmonella typhimurium Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Escherichia coli

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MEIO gar xilose-lisina-dextrose (XLD)

MICRORGANISMO Espcies de Salmonella Escherichia coli Espcies de Shigella

REAO Colnias vermelhas (lisinapositivas) Colnias amarelas (positiva para acares) Colnia transparentes (negativo)

Matrias-primas (formulaes comerciais desidratadas e constituintes individuais) devem ser armazenadas sob condies apropriadas, em ambiente frio, seco, protegido da luz e em recipientes hermeticamente fechados, especialmente aqueles com meios desidratados. Meios que apresentem qualquer tipo de alterao de cor ou aspecto no podem ser usados. A gua utilizada na preparao dos meios pode ser destilada, deionizada, ou produzida por osmose reversa, livre de substncias bactericidas, inibidoras ou interferentes. A validade dos meios preparados, mantidos nas condies definidas de armazenamento, deve ser determinada e controlada. Meios prontos para uso Para meios comprados prontos para uso, o laboratrio deve ter registros de que cada lote tenha sido testado quanto esterilidade, capacidade de favorecer o crescimento dos organismos pretendidos e reatividade bioqumica, antes ou coincidentemente ao incio do uso. obrigao do fabricante fornecer as especificaes de qualidade do seu produto, incluindo: Nome dos meios e lista dos ingredientes, incluindo quaisquer suplementos. Prazo de validade e critrios de aceitao aplicados. Condies de armazenamento. Frequncia de amostragem. Verificao da esterilidade. Verificao de crescimento dos micro-organismos de controle-alvo e no-alvo (com suas referncias da coleo de cultura) e Critrios de aceitao. Verificaes fsicas e critrios de aceitao aplicados. Data de edio da especificao. Lotes de meios devem ser identificveis, sendo acompanhados pela evidncia de que satisfazem a especificao de qualidade. O laboratrio dever se certificar de que o fabricante notificar quaisquer alteraes na especificao da qualidade do produto.

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Corantes Todos os procedimentos de colorao so controlados, com seu desempenho registrado pelo menos semanalmente e para cada novo lote ou partida de corante em uso, com organismos de referncia sabidamente gram-positivos e gram-negativos. Outras coloraes que no a de Gram (coloraes no-imunofluorescentes e no-imunolgicas) so testadas com o uso de controles positivos e negativos para a reatividade pretendida a cada dia de uso e a cada novo lote ou partida recebida. Controles positivos e negativos so processados em todas as coloraes especiais para bactrias. As coloraes so verificadas a cada dia de uso ou pelo menos semanalmente (o que for mais adequado) para a reatividade pretendida de modo a garantir o desempenho consistente da colorao. Da mesma forma, controles positivos e negativos so processados a cada vez em que se utilizam coloraes fluorescentes. Reagentes e controles Para cada novo lote de reagentes para testes qualitativos, a mnima verificao cruzada inclui a anlise de uma amostra sabidamente positiva e de uma amostra sabidamente negativa. prefervel que essas validaes sejam realizadas utilizando-se amostras de pacientes que tenham sido testados anteriormente, ou que possam ser testadas simultaneamente com o lote anterior. Em alguns casos as comparaes entre lotes podem apresentar dificuldades prticas, como por exemplo para a pesquisa direta de Shigella nas fezes, uma vez que amostra instvel e os positivos so raros. Em situaes em que a maior parte das amostras ou organismos provenientes de pacientes reage muito intensamente ao teste de interesse pode ser prefervel usar controles bem caracterizados, fracamente positivos, para validar a sensibilidade do novo lote de reagentes. Controles positivos e negativos so testados e registrados para cada novo lote, novo lote ou nova partida recebida dos seguintes testes: reagentes para catalase, coagulase, oxidase; discos para bacitracina, optoquina, ONPG, X, V e XV; e sistemas de identificao. Controles positivos e negativos tambm so testados e registrados para cada novo lote recebido de anti-soros (exceto Salmonella e Shigella que so testados quando preparados ou abertos e a partir da uma vez a cada seis meses). Da mesma forma, controles positivos e negativos para beta-lactamase (que no cefinase) so testados e registrados a cada dia de uso. Por outro lado, no caso da cefinase, h necessidade de testar apenas a cada novo lote.

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Tiras de azul de metileno, culturas de organismos anaerbicos fastidiosos ou outros procedimentos adequados so usados para a verificao da anaerobiose nos sistemas como jarras, cmaras e sacos para anaerobiose. Antibiograma Falhas na deteco do padro de resistncia podem estar relacionadas a diversos fatores, tais como: m qualidade do meio de cultura, disco com baixa concentrao de antimicrobiano, problemas no procedimento, inculo com concentrao de micro-organismos fora do preconizado, tempo e temperatura de incubao inapropriados. A potncia dos discos para antibiograma verificada por meio de testes utilizando organismos de referncia cujos padres de susceptibilidade so conhecidos. Limites de tolerncia para a potncia dos antimicrobianos (intervalo dos halos) so estabelecidos, sempre que possvel de acordo com o CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute, antigo NCCLS). As cepas de referncia tm um nmero mximo de geraes ao qual podem ser submetidos, so cinco passagens a partir da cepa de referncia original. O nmero indefinido de passagens pode comprometer principalmente a pureza da cultura e as caractersticas fenotpicas de algumas bactrias. As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e mtodos empregados para testes de isolados clnicos. A frequncia dos testes de controle interno deve ser no mnimo mensal. Entretanto, publicaes recentes da Anvisa, em seu projeto de Monitoramento e Preveno da Resistncia Microbiana em Servios de Sade, e do CLSI preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas se a estrutura ou a capacidade do laboratrio permitir. A introduo do programa de controle interno da qualidade inicia-se com a realizao de testes dirios, passando, em fase posterior, para a realizao mensal dos testes.

Teste dirio Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos e documentar os resultados. Para passar a realizao dos testes de diria para mensal, nenhuma das cinco leituras de halos, para cada combinao de agente/antimicrobiano, pode estar fora dos limites aceitveis. Teste mensal Testar todas as cepas de CIQ no mnimo mensalmente e sempre que qualquer novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo

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lote de meio de cultura, um novo lote de discos ou outro fabricante de insumos). obrigatrio que a realizao dos testes de controle da qualidade seja documentada, anotando-se os nmeros dos lotes, meios de cultura, reagentes, discos de antibiticos testados nas respectivas datas. Caso algum resultado do teste mensal de controle da qualidade encontrar-se fora da faixa aceitvel, faz-se necessrio implantar ao corretiva. Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanas importantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes, estes devem ser realizados por cinco dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma frequncia mensal. O controle da acurcia dos testes realizados deve ser feito utilizando-se as cepas de referncia para o gnero ou espcie do micro-organismo ou classe de antimicrobiano que est sendo testado. Sero testados os antimicrobianos que fazem parte do antibiograma utilizado na rotina do laboratrio. Por exemplo: se o laboratrio testa para Enterococcus spp. ampicilina, ciprofloxacina, clorafenicol, teicoplanina, vancomicina, quinupristin/dalfopristin, estes mesmos antimicrobianos sero testados com a cepa referncia S. aureus ATCC 25923 para avaliar a qualidade da prova realizada, e os halos encontrados sero comparados com os valores de referncia. Os limites aceitveis para os halos encontrados para as cepas de referncias e os diversos antimicrobianos so descritos no documento M100-S16/CLSI ou norma substituta. recomendvel que o laboratrio de microbiologia hospitalar estabelea intercmbios com a equipe mdica (CCIH) e a farmcia para desenvolver uma lista de antibiticos a ser reportada no laudo para os diferentes organismos isolados de diferentes locais. Essa lista baseada nas diretrizes do CLSI, nas tabelas de rotina (Grupo A) e seletiva (Grupo B). Limitaes ao nmero de antimicrobianos reportados, chamada de laudo em cascata, em geral significa reportar no mais do que 4 agentes potenciais aos quais, pelo menos em uma instncia, o organismo susceptvel. O laudo seletivo ajuda a melhorar a relevncia clnica e ajuda a minimizar a seleo de cepas multirresistentes e a evitar o abuso de agentes de amplo espectro. O laboratrio pode, igualmente, reportar apenas os agentes antimicrobianos efetivos no local do isolamento, havendo documentao da padronizao adotada. Os laboratrios hospitalares devem participar da CCIH de forma a manter e reportar ao corpo clnico relatrios cumulativos do perfil de susceptibilidade antimicrobiana, pelo menos anualmente.

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Resultados aceitveis derivados dos testes das cepas controle no garantem resultados acurados dos isolados de pacientes. Quando forem observados resultados incomuns ou inconsistentes de isolados de pacientes, os resultados so analisados criticamente para a garantia da sua acurcia. Recomenda-se inicialmente verificar a pureza da cultura e confirmar a identificao usando procedimentos alternativos (se disponveis), principalmente quando observa-se:

Escherichia coli resistente ao imipenem; Klebsiella spp. suscetvel a ampicilina; Proteus mirabilis resistante a ampicilina; Staphylococcus aureus resistante a vancomicina.

2.6.3

Procedimentos analticos Os itens a seguir definem padres mnimos para a rotina. Isso no impede o uso de culturas de triagem (estudos limitados) e no implica que todas as culturas de rotina exijam meios especiais, mas sim que estes estejam disponveis quando necessrios. Culturas de material proveniente do trato respiratrio Inicialmente, sugere-se a realizao rotineira de um esfregao corado pelo Gram em todos os escarros expectorados para determinar a aceitabilidade da amostra para a cultura e a abrangncia das pesquisas a serem realizadas. As amostras inaceitveis no devem ser processadas, e/ou o mdico assistente deve ser notificado para que seja providenciada uma amostra adequada de imediato. Potenciais patgenos podem fazer parte da flora oral dos pacientes e pode no ser necessria identificao e realizao de antibiogramas, quando houver evidncias de contaminao grosseira do escarro com saliva. Deve-se tentar estabelecer uma correlao entre os resultados das culturas com os resultados da colorao de Gram e, quando possvel, com informaes clnicas obtidas junto ao mdico assistente quanto a evidncias de uma possvel pneumonia. Os procedimentos de rotina para a cultura de amostras aceitveis de escarro permitem o isolamento de pneumococos, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, e Enterobacteriaceae. Culturas de Urina O padro mnimo para a avaliao das culturas de urina inclui uma estimativa do nmero de organismos isolados e sua classificao em Gram-positivos
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ou Gram-negativos. As culturas quantitativas (contagem de colnias) devem ser realizadas rotineiramente, utilizando-se meios e procedimentos adequados ao isolamento e identificao tanto de Gram-positivos como de Gram-negativos. Culturas de Material Ginecolgico A triagem para Streptococcus Grupo B em mulheres grvidas feita de acordo com as diretrizes atuais, que recomendam a triagem universal para colonizao vaginal e retal por estreptococos do Grupo B para todas as mulheres gestantes entre a 35-37 semanas. Coproculturas Os procedimentos de rotina para o processamento de amostras quanto a patgenos devem permitir o isolamento e a identificao de patgenos entricos relevantes em pacientes com diarria. Culturas de Lquor Amostras de lquor para cultura necessitam ser processadas imediatamente aps seu recebimento no laboratrio. Esfregaos para colorao de Gram so preparados de rotina, e os resultados positivos so liberados de acordo com a poltica de comunicao de resultados potencialmente crticos. Os tipos de meios inoculados e os mtodos de incubao devem garantir a recuperao de patgenos comuns e exigentes como a Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e o Haemophilus influenzae. Quando se utiliza mtodos de pesquisa de antgenos, culturas de segurana so realizadas, tanto para amostras positivas como para amostras negativas. Hemoculturas O volume de sangue coletado deve obedecer as especificaes do fabricante dos frascos de hemocultura. Os sistemas de uso na rotina para a realizao de hemoculturas permitem o isolamento e a identificao de aerbios e, quando indicado, de anaerbios. Todas as culturas negativas macroscopicamente so verificadas por meio de colorao de Gram ou de subcultivo aerbico, em algum momento, antes de serem liberadas como negativas, lembrando que hemoculturas automatizadas no necessitam dessa conferncia adicional desde que tenham sido monitorizadas por pelo menos 5 dias. As hemoculturas positivas so liberadas de acordo com a poltica de comunicao de resultados potencialmente crticos.

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Culturas de material de feridas Para as feridas profundas, os procedimentos mnimos permitem a recuperao e a identificao de organismos aerbios e moderadamente anaerbios. Esfregaos diretos corados pelo Gram so preparados e examinados de rotina. Os procedimentos para a coleta e o manejo de amostras de feridas so capazes de recuperar organismos anaerbios, quando indicado e em material coletado adequadamente 2.6.4 Micobacteriologia Meios de cultura Da mesma forma que na bacteriologia uma amostra adequada de cada meio e aditivo preparados pelo laboratrio verificada com relao a esterilidade (caso sejam adicionados aditivos aps a esterilizao inicial), capacidade de favorecer o crescimento (quando aplicvel) por meio de cultivo de cepas controle ou de testes em paralelo com lotes anteriores e reatividade bioqumica (quando adequado). Meios micobacteriolgicos deteriorados so descartados. Colorao As coloraes para bactrias lcool cido resistentes so controladas a cada dia de uso por meio de cepas controle adequadas e os resultados registrados. As coloraes fluorescentes so verificadas com o uso de controles positivos e negativos a cada dia e os resultados so registrados. Resultados positivos na pesquisa para micobacterias so liberados de acordo com a poltica de comunicao de resultados crticos. Procedimentos Concentrao, inoculao e incubao Amostras potencialmente contaminadas com outros micro-organismos (ex. escarro, lavado brnquico) quando submetidas cultura para micobactrias so descontaminadas e concentradas. A colorao para B.A.A.R. realizada em lminas preparadas do material antes e aps a concentrao. Havendo uma quantidade adequada de material, o laboratrio inocula as amostras (que no sangue) em meio apropriado. Culturas e identificao Caso o laboratrio oferea a identificao completa necessria uma variedade de testes diferenciais suficientes para a diferenciao acurada dos diferentes tipos de micobactrias. Controles positivos e negativos so testados rotineiramente e seus resultados registrados.

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2.6.5

Micologia Meios de cultura Assim como na bacteriologia e na micobacteriologia, todos os meios so verificados quanto esterilidade (se forem adicionados aditivos aps a esterilizao), quanto capacidade de favorecer o crescimento e quanto reatividade bioqumica (quando aplicvel) por meios de cepas controle ou testes em paralelo contra lotes anteriores. Coloraes Todos os procedimentos de colorao so verificados e seus resultados registrados para cada novo lote de corante preparado, e pelo menos diariamente, contra cepas controle sabidamente positivas e negativas. Controle para preparaes de KOH no so necessrios. Controles para o lactofenol-azul de algodo no precisam ser feitos a cada dia de uso, mas devem ser feitos a cada novo ou preparado. Para certas coloraes, como Prata Metenamina de Gomori e Giemsa, a prpria lmina serve de controle negativo. Procedimentos e testes O princpio da garantia da qualidade dos procedimentos analticos em micologia baseia-se no uso de meios e condies de cultura variados o suficiente para permitir o isolamento de patgenos significativos, com a menor interferncia possvel de contaminantes. Os procedimentos preliminares, de triagem tais como KOH 10%, tinta da China ou Giemsa esto disponveis e so realizados quando indicado. Os procedimentos de isolamento e identificao incluem a triagem preliminar pelo exame de preparaes diretas ou coradas, pelo uso de meios seletivos para dermatfitos e fungos sistmicos e pelo uso de meios contendo agentes antimicrobianos. Meios adicionais ou diferentes so usados para a cultura de dermatfitos e/ ou fungos sistmicos. Meios contendo agentes antimicrobianos so usados, quando indicado, para a supresso do crescimento de bactrias, embora alguns agentes antimicrobianos possam inibir algumas leveduras ou a fase levedurifome de organismos dimrficos. As temperaturas de incubao para o crescimento e o isolamento de dermatfitos e de fungos sistmicos devem estar definidas e seguidas rigorosamente. Quando as culturas so deixadas temperatura ambiente (2226C), esta deve controlada, verificada e registrada a cada dia.

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2.6.6

Processos Automatizados obrigatrio o controle e registro dos lotes e validade dos insumos em uso. No caso da utilizao de turbidmetro, deve-se calibrar e registrar a transmitncia diariamente. Os requisitos mnimos para controle de qualidade em processos automatizados so os que se seguem: Cepas de referncia recomendadas para testes de identificao Recomenda-se testar no mnimo uma cepa de referncia por painel. Para painis de Gram-negativos: .. E. coli 25922 (qualidade da prova). .. P. mirabilis 7002 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-negativo). .. K. pneumoniae 13883 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-negativo). Para painis de Gram-positivos: S. aureus 29213 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-positivo). E. faecalis 29212 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-positivo). Para painis de Leveduras: C. albicans 14053 (qualidade da prova de identificao de leveduras). Cepas de referncia recomendadas para testes de sensibilidade Para painis de Gram-negativos: E. coli 25922 (qualidade da prova). E. coli 35218 (para inibidores de lactamase). E. coli 51446 (ESBL). P. aeruginosa 27853 (concentrao de ctions e pH com aminoglicosdeos). E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT). K. pneumoniae 700603 (ESBL). K. pneumoniae BAA 1705 (Controle positivo para carbapenemase) K. pneumoniae BAA 1706 (Controle negativo para carbapenemase) Para painis de Gram-positivos: S. aureus 29213 (qualidade da prova). E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT). E. faecalis 51299 (resistncia a vancomicina). E. coli 35218 (para inibidores de lactamase).

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Validao Protocolo de controle da qualidade dirio Prova diria por 5 dias Sem erro, seguir com o controle peridico. 1 de cada 5 ensaios apresentarem erro, tomar aes corretivas: erros bvios: testar novamente no mesmo dia e, se o resultado for o esperado, continuar com as provas dirias. erros no bvios: testar novamente no mesmo dia e controlar por cinco dias consecutivos. Se todos os resultados estiverem dentro do esperado, passar ao controle mensal. Protocolo de controle da qualidade peridico Recomenda-se realizar os controles a cada ms, utilizando as listas de cepas de referncia acima mencionadas. Tambm deve ser realizado um controle a cada troca de lote do painel. Se os testes mensais apresentarem erros, tomar aes corretivas e retornar aos testes dirios. 2.6.7 Testes de Proficincia obrigatria a participao em um programa de proficincia em ensaios laboratoriais. Para as anlises no cobertas por programa de proficincia, o laboratrio deve dispor de um sistema alternativo documentado para avaliao da confiabilidade dos resultados. A utilizao do controle alternativo baseia-se em grande parte em documentos do CLSI no caso o GP29-A, que estabelece que inicialmente o laboratrio tem que identificar os testes no cobertos pelos programas de proficincia e desenvolver uma alternativa de controle. Uma vez definido como ser feito esse controle, document-lo, estabelecer limites de aceitao e definir a frequncia de utilizao. Na prtica, o uso de controles alternativos permitem uma estimativa da exatido dos resultados liberados na rotina e permite que o laboratrio atenda aos requisitos dos programas de gesto de qualidade. Entretanto, uma prtica difcil de gerenciar e de estabelecer os limites de aceitao dos resultados. Assim, o controle de qualidade alternativo no pode ser encarado como um substituto dos testes de proficincia, mas sim como uma alternativa possvel na indisponibilidade dos ensaios de proficincia.

2.7 Fase ps-analtica


2.7.1 Conferncia Todo laboratrio necessita de um sistema documentado para detectar e corrigir erros significativos de transcrio que poderiam afetar a conduta clnica. Uma alternativa a reviso e conferncia dos resultados finais por um indiv-

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duo qualificado para tal, antes da liberao final dos resultados, uma vez que a maioria dos resultados no so interfaceados e sim digitados manualmente. O sistema de informtica pode dispor de alertas, na etapa de digitao, para resultados improvveis ou absurdos. Cada laboratrio define quais os resultados que sero reportados imediatamente ao mdico responsvel pelo paciente. 2.7.2 Liberao dos laudos e notificao de resultados crticos O laboratrio deve possuir polticas e instrues escritas para a emisso de laudos que contemplem as situaes de rotina, os plantes e as urgncias. Essas instrues incluem quem pode liberar os resultados e para quem, contemplando tambm a liberao de resultados verbais e de laudos provisrios, quando aplicvel e necessrio. necessrio que os resultados das culturas sejam reportados o mais rapidamente possvel, dispondo-se de critrios documentados para notificao imediata ao mdico ou responsvel de resultados potencialmente crticos que possam implicar a necessidade de atuao mdica imediata. As comunicaes verbais e os laudos provisrios so registrados e identificados como tal, gerando-se laudos definitivos adequados no menor intervalo possvel. Essa atividade deve ser devidamente registrada, mesmo quando o contato no for conseguido. Esses registros incluem o resultado potencialmente crtico, a data e horrio da notificao, o responsvel pela comunicao e a pessoa notificada ou ainda a impossibilidade de comunicao e motivo.

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2.8 Referncias Bibliogrficas


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