UROCULTIVO

1- Objetivo
Realizaremos un urocultivo para la determinacin de los diferentes tipos de microorganismos presentes en dos muestras de orina. Realizando las diferentes pruebas para el diagnostico de las posibles enfermedades o infecciones urinarias.

2- FUNDAMENTO
El urocultivo se basa en la identificacin del nmero y de los tipos de bacterias presentes en la orina. Es necesario que el mtodo de recogida sea el adecuado siguiendo unos protocolos de higiene evitando as posibles contaminaciones de la muestra. Para la identificacin del nmero de bacterias, realizaremos un recuento bacteriano (Hygicult TPC) y para la identificacin de los tipos de bacterias presentes en la orina y sus patologias, se realizara una siembra en medios de cultivo diferentes con la tcnica de siembra comnmente utilizado en el urocultivo, segn el tipo de microorganismo comnmente encontrado en la muestra. Los diferentes cultivos que vamos a utilizar sern: CLED, Agar: Es un medio de cultivo diferencial para aislar y contar las bacterias presentes en la orina. Tambin se utiliza para la diferenciacin de bacterias fermentadoras de la lactosa o las no fermentadoras. Es comnmente utilizado para el crecimiento de enterobacterias y bacilos Gram presentes en las orinas patolgicas. CPS3: se utiliza para el aislamiento, recuento e identificacin directa de Escherichia coli, Proteus y Enterococcus. CNA: es un medio selectivo para el aislamiento y permite el crecimiento de bacterias Gram positivas, aunque en ocasiones puede haber crecimiento de alguna Gram negativas. Agar nutritivo: medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. En nuestro caso ser utilizado para el cultivo de Cndida albicans y Streptococcus. Por otro lado utilizaremos el kit Urin system, panel utilizado para el contaje, identificacin presuntiva y susceptibilidad antibitica de microorganismos presentes en infecciones urinarias. Este consta de 24 pocillos los cuales se dividen en 2 pocillos para el recuento, 7 pocillos de cultivo para la identificacin y 15 para las pruebas de sensibilidad (antibiograma). Tambin se realizar un examen macroscpico y microscpico de la muestra y del cultivo. En el examen macroscpico de la muestra se deber observar el color, olor, la densidad, turbidez, volumen, la qumica seca (tiras reactivas) y el diagnostico del pH y el examen microscpico en fresco de la orina. En el examen macroscpico del cultivo ha de visualizarse la forma, color, forma de sus bordes y la superficie de las colonias. Y en el examen microscpico del cultivo la

diferenciacin de las bacterias Gram positivas de gram negativas y las diferentes formas que presenten (coco, bacilo, estafilococos)

3- Materiales
Asas de siembra desechables Portaobjetos Placas de Petri Mechero Pinzas Papel platina Papel de filtro Vasos de muestra Pipeta Microscopio Tubos de ensayo Gradilla Jeringa Suero fisiolgico

Reactivos
Urin system plus (kit de recuento, identificacin y sensibilidad) Hygicult tpc (recuento) Tiras reactivas Kit de gram

Medios de cultivo
CLED Agar, CNA, Agar nutritivo, CPS3.

Muestra
Muestra 1 Muestra 2

4- PROCEDIMIENTO:
Recogida de muestra: Se utilizar un recipiente de muestra desechable. La orina que se recoger ser la primera orina de la maana, por ser una orina ms concentrada. Para su recogida se lavara cuidadosamente la zona genital, con agua y jabn y se secara con una

gasa estril o una toalla limpia. Hay que recoger la porcin de orina que corresponda a la mitad de la miccin, desechando la porcin inicial y final de la miccin y recogiendo el resto en el frasco estril. Por ltimo se tapa bien el frasco y se proceder a su anlisis.

Anlisis de la muestra: Ante todo realizaremos los siguientes medos de cultivo: Cled agar, CPS3 y CNA, y mientras se van auto clavando procederemos a la observacin macroscpica de la muestra, para ello observaremos el volumen, la densidad, la turbidez, mediremos el PH y utilizaremos las tiras reactivas para conocer si existe presencia de sangre, de nitritos, de cetonas, de acido ascrbico, tambin para conocer la cantidad de protenas y de leucocitos. Para realizar esta prueba vamos a introducir la tira reactiva dentro del recipiente con la ayuda de unas pinzas. Luego la tira la depositaremos sobre un papel de filtro y procederemos rpidamente a su lectura, comparando los colores con los del bote.

Despus vamos a realizar un examen microscpico. Para ello vamos a utilizar la tcnica de la tincin de Gram para conocer la presencia de bacterias Gram + y Gram-. Una vez se hallan autoclavado los medios, los dejaremos solidificar y realizaremos la siembra con asas desechables en los correspondientes medios de cultivo. Luego los rotulamos con la fecha y el nmero de la muestra (en este caso 1 2) y los incubamos a 37C durante 24 horas. Por otra parte utilizaremos la tcnica hygicult tpc para obtener el recuento de bacterias que aproximadamente hay en la orina, para ello, impregnamos el cultivo especfico, colocado en forma de gel, dentro de la muestra y lo ponemos a cultivar de 18-24 horas. La otra prueba que realizaremos ser la URIN SYSTEM PLUS que consiste en realizar dos suspensiones. Una suspensin A (donde cogeremos 05ml de muestra con una pipeta y 15ml de suero salino) y otra B (donde tomaremos 02ml de la suspensin A mas suero m dium del kit). Procedemos a aadir a cada pocillo 02ml con la pipeta de las dos suspensiones hasta los pocillos 9 con la suspensin A y el resto con la suspensin B. Ponemos a cultivar 24 horas y leemos resultados. Pasadas las 24 horas observaremos el crecimiento obtenido: Con respecto a los medios de cultivo de cada muestra, realizaremos un examen macroscpico de las colonias, observando sus bordes, sus tamaos, su forma y su superficie. Con lo observado anteriormente iremos buscando posibles microorganismos teniendo siempre en cuenta las caractersticas de los medios. Luego haremos la tincin de Gram para comparar y descartar las cuestiones antes analizadas. Realizaremos un inoculo por cada muestra, luego realizaremos las extensiones necesarias y teiremos con Gram. Por ltimo observamos al microscopio y copiamos los resultados para luego compararlos con los posibles resultados de las colonias observadas. Con respecto a la lectura de la tcnica hygicult TPC utilizaremos unas pinzas para sujetar los geles de cultivo y colocarlos en un portaobjetos, para as observar mejor el crecimiento y apuntar los resultados obtenidos de la concentracin bacteriana. En cuanto a la los resultados de la prueba URIN SYSTEM PLUS observamos los cambios de colores y anotamos la presencia de microorganismos comparando con la hoja de resultados que posee el kit.

5- Resultados
Examen macroscpico de la orina Muestra 1:presenta un olor caracterstico a caf. Con un color amarillento fuerte y con
presencia de sedimentos en el fondo del recipiente. Con una densidad normal y una ligera turbidez. El pH que obtuvimos ha sido 7.5. El resultado de las tiras reactivas ha sido el siguiente: bilirrubina negativa, Urobilingeno normal, cetonas normal, cido ascrbico negativo, glucosa normal, protenas negativo, sangre negativo, pH 7.5, nitritos negativo, leucocitos negativo y una densidad de 1,015.

Muestra 2:presenta un olor caracterstico, con un color amarillo claro, sin presencia de
sedimentos ni turbidez con una densidad normal. El pH ha sido 5. El resultado de las tiras reactivas ha sido: bilirrubina negativa, Urobilingeno normal, cetonas normal, cido ascrbico negativo, glucosa normal, protenas negativo, sangre negativo, pH 5, nitritos positivos, leucocitos negativo y una densidad de 1,020.

Examen microscpico de la orina en fresco Muestra 1:presencia de cocos, bacilos, clulas epiteliales. Muestra 2:presencia de cocos, bacilos, clulas epiteliales y cristales. Examen macroscpico de los medios de cultivo Muestra 1:
- Cled agar: presencia de colonias de color amarillo, de tamao grande, con bordes circulares y superficie convexa.

- CPS3: presencia de diferentes colonias: o Colonias de color marrn oscuro, de grandes tamao y medianas, bordes circulares, superficie elevada y se encuentran en gran cantidad. o Colonias de color verde, de pequeos tamaos, bordes circulares, se encuentra en poca cantidad. o Colonias blancuzcas, de diminuto tamao, cricas y brillantes.

- CNA: presencia de dos tipos de colonias: o Colonias con halo: las colonias son de color blanco, mientras que el halo es amarillento, su forma es circular, sus bordes regulares y presentan superficie cncava. o Colonias sin halo: forma circular y bordes regulares.

- Agar nutritivo: observacin de dos tipos de colonias. o Colonias de color blanco: de pequeo tamao, brillantes, redondeadas. o Colonias de color naranjadas: con bordes redondeados y de tamao normal.

Muestra 2:
- Cled agar: presencia de colonias de color amarillo, con bordes circulares y presentes en poca cantidad. - CPS3: presencia de diferentes colonias:

o Colonias de color verde, de grandes tamao, bordes circulares y estn presentes en mayor proporcin o Colonias de color blanco, de pequeos tamaos, - CNA: presencia de dos tipos de colonias: o Colonias con halo: las colonias son blancas y sus halos amarillos, tienen forma circular, sus bordes son regulares y tienen una superficie elevada. o Colonias sin halo: son de color blanco, su forma es circular.

Examen microscpico de los medios de cultivo Muestra 1: tincin de gram, observacin por colonias y medios.
- Cled agar: Colonias amarillas: E.coli se observan bacilos cortos de color rosa (presenta una leve acidificacin del medio, estando este de color amarillo) y Enterococcus se observan diplococos gram positivos.

- CPS3: Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados. Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa. Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas esporas, hifas.

- CNA: Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosa. Colonias blancas con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis.

- Agar nutritivo: Streptococcus: de color azul.

Muestra 2: tincin de gram, observacin por colonias y medios.

- Cled agar: Colonias amarillas: E.coli se observan bacilos cortos de color rosa (presenta una leve acidificacin del medio, estando este de color amarillo) y Enterococcus se observan diplococos gram positivos. - CPS3: Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados. Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa. Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas esporas, hifas. - CNA: Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosa. Colonias blancas con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis. - Agar nutritivo: Presencia de Streptococcus, bacilos cortos, diplococos, cocos, cocobacilos.

Resultados de la tcnica hygicult tpc

En la muestra 1 obtuvimos una concentracin bacteriana de 106 bact/ml y en la muestra 2 la concentracin bacteriana obtenida fue de 105 bact/ml.

Resultados de la prueba URIN SYSTEM PLUS Muestra 1:

Bacteriuria: CFU/ml > 106 E.coli: positivo Proteus: positivo Pseudomonas spp: negativo Klebsiella: negativo Enterococcus spp: positivo Staphylococcus spp: negativo Candida albicans: positivo PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) No es susceptible a TZP, FOS, AMS, AUG y C. Resistente frente a CAZ y SXT. No han sido concluyentes: AK, CN, TOB, CFP, CTX, NA, CIP, LEV.

Muestra 2:
Bacteriuria: CFU/ml > 105 E.coli: positivo Proteus: positivo Pseudomonas spp: negativo Klebsiella: negativo Enterococcus spp: positivo Staphylococcus spp: negativo Candida albicans: positivo PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) No es susceptible a TZP, FOS, AMS, AUG y C.

Resistente frente a CAZ y SXT. No han sido concluyentes: AK, CN, TOB, CFP, CTX, NA, CIP, LEV.

6- Conclusin
Cada una de las anteriores pruebas han sido realizadas con un propsito y para corroborar que nuestras sospechas tras la observacin del cultivo es cierta. Para ello tras la observacin de la siembra y el cultivo, al observar las colonias, decidimos realizas las observaciones microscpicas con la elaboracin de la tincin de gram, para verificar que, cada una de esas colonias se corresponde con la forma que debe de presentar cada bacteria de estas. Tras la realizacin de cada una de las pruebas nombradas con anterioridad durante todo el desarrollo hemos podido llegar a la conclusin que, ambas muestra presentan E.coli y Proteus vulgaris, Enterococcus, Streptococcus y Candida albicans. Ambas muestras poseen un alto nmero de bacterias, presentan una alta bacteriuria. En la qumica seca poseen unos valores normales.