ELECTROFOREZA

1. Principiile de baza ale electroforezei Termenul de electroforeza descrie migrarea unei particule incarcate sub influenta unui camp electric.

In conditii de viteza constanta, forta motrice exercitata asupra particulei reprezinta produsul dintre sarcina efectiva a particulei si gradientul de potential E si este echilbrata de rezistenta de frecare f a mediului. In solutie libera, ea se conformeaza legii lui Stokes, astfle ca:

f=6rv
unde r este raza particulei care se deplaseaza cu viteza v intr-un mediu de vascozitate . Cu toate acestea, legea lui Stokes nu este strict respectata in gel si f depinde de un numar de factori ce include densitatea gelului si marimea particulei. Mobilitatea electroforetica m este definita drept distanta d parcursa in intervalul t de o particula aflata sub influenta gradientului de potential E, astfel incat:

m=d/tE sau m=v/E

Distantele de migrare masurate sunt proportionale cu mobilitatile electroforetice, insa compararea directa a diferitelor experimente se poate face doar daca produsele tE sunt egale in

toate cazurile. De aici decurge si faptul ca, in mod ideal, daca toate celelalte conditii sunt identice, un al doilea experiment, desfasurat la dublul gradientului de concentratie (tensiunii) intr-un timp redus la jumatate va avea ca rezultat migrarea particulei la aceasi distanta ca in primul experiment. Cu toate acestea, relatia este doar in parte adevarata, ea fiind influentata de un numar de factori ce includ in deosebi efectele excesului de caldura generat de cresterea curentului. Calcularea rapida a produsului dintre numarul de volti si timp poate servi drept un prim indiciu de evidentiere a faptului ca modificarea oricaruia dintre cei doi factori se va repercuta in desfasurarea uei separari electroforetice. Gradientul de potential corespunde si raportului dintre densitatea de curent J si conductivitatea specifica k, astfel ca viteza particulelor incarcate poate fi exprimata sub forma:

v=Em=mJ/k
Cele mai multe molecule de dimensiuni mari poseda in structura lor atat grupari anionice cat si grupari cationice, din aceasta pricina fiind numite amfioni. Constantele de disociere (pK) ale acestor grupari vor diferi mult, sarcina neta a unei asemenea molecule va depinde de pH-ul mediului, care in acest chip va influenta si mobilitatea moleculei. Forta ionica, denumita potentialul electrocinetic care va reduce sarcina neta la valoarea sarcinii efective, stiindu-se ca mobilitatea particulei cu sarcina este aproximativ invers proportionala cu radacina patrata a fortei ionice. Fortele ionice scazute permit o rata inalta a migrarii, in timp ce fortele ionice inalte dau rate mai lente, dar practic si zone mai nete de separare, comparativ cu tampoanele de tarie ionica redusa. Din pacate, cu cat este mai mare forta ionica a tamponului, cu atat creste conductivitatea, ca si cantitatea de caldura generata. Temperatura ridicata produce cresterea vitezelor de difuzie a ionilor si, totodata, o crestere a mobilitatii de pana la 2-4% spor de temperatura per grad Celsius. In acest timp, vascozitatea mediului scade odata cu cresterea temperaturii. In felul acesta, scade rezistenta electrica si, la tensiune constanta, curentul va creste, sporind si mai mult producerea de caldura. Din aceasta cauza, alegerea tariei ionice a tamponului se dovedeste a fi hotaratoare, ea determinand efectiv puterea electrica ce poate fi aplicata sistemului. O intrare de putere prea mare are drept urmare generarea de caldura in exces ce poat conduce la o viteza inacceptabila de evaporare a solventului din mediu, iar pentru sistemele in solutie libera - formarea unor cirenti de convectie si intrepatrunderea zonelor de separare. In cazurile relativ sensibile de caldura, se poate produce chiar denaturarea proteinelor sau pierderea activitatii enzimatice. In schimb, o putere prea mica la intrare evita problemele de incalzire, dar poate provoca o slaba separare, ca rezultat al difuziei crescute ce are loc, la timpi de functionare prea lungi.

Indepartarea caldurii generate de trecerea curentului electric constituie una dintre problemele majore in cele mai multe forme de electroforeza, racirea producand inevitabil un gradient de temperatura intre partile mai bine racite ale mediului si celelalte. Datorita factorilor mentionati, orice gradient ori diferenta de temperatura va produce distorsionarea benzilor de molecule separate, datorita variatiilor vitezei de migrare prin mediu. In formele de electroforeza realizate in tuburi cilindrice sau pe placi, racirea este mai eficienta la extrenitatile mediului decat la mijlocul lui, benzile astfel rezultate fiind arcuite. De aceea, caldura produce variatii atat ale curentului, cat si ale tensiunii, iar pentru reducerea acestor fluctuatii, utilizarea surselor de curent reglabile in regim de tensiune/curent constant este un lucru obisnuit. Desi nici una dintre ele nu poate realiza un control complet al producerii de caldura, sursele sunt relativ ieftine si potrivite celor mai multe dstinatii. Recent, au fost scoase de pe piata generatoarele de curent constant, independent de variatiile rezistentei electrice si ele sunt indicate pentru lucrarile analitice de maxima acuratete. Desigur ca ele garanteaza doar producerea constanta de caldura in cursul functionarii, insa nu rezolva din start si problemele asociate producerii de caldura sau incercarile de eliminare ale acestora, intrucat este probabil ca, in cele mai multe cazuri, cheltuielile suplimentare presupuse de aceste sisteme sa nu se justifice. Evident ca cel mai bine este ca experimentele de electroforeza sa se desfasoare la temperatura constanta , de mare ajutor fiind utilizarea izolatiilor pe coloanele de preparatie, ca si a incintelor de racire. Electroforeza se refera doar la deplasarea ionilor printr-un mediu, astfel incat factorii de influenta luati in discutie pana acum se aplica la toate formele de electroforeza, fie ea in solutie libera, ca de pilda electroforeza frontala, fie in mediile stabilizante, cum sunt gelurile de amidon si poliacrilamina, acetatul de celuloza sau hartia. Cu toate acestea, la utilizarea unui mediu-suport, pot intervenii factori suplimentari in mobilitatea si rezolutia separarii. Acestia se refera la efectele de absorbtie pe suport, neomogenitatile matricei-suport, schimburile ionice cu gruparile incarcate electric ale moleculelor-suport si electroendosmoza. Primele trei se explica de la sine, dar electroendosmoza apare, in general, datorita gruparilor incarcate electric din materialulsuport.

Procedeul de electroendosmoza

De pilda, hartia contine un numar de grupari carbonil, iar agaroza poseda grupari sulfonice acide. In tampoanele neutre sau bazice, in cursul electroforezei, acestea vor fi ionizate si apoi atrase spre anod. Intr-un mediu solid, deplasarea spre electrozi este, fireste, imposibila, incat efectul este compensat prin migrarea ionilor H+ (sub forma de protoni hidratati H3O+) spre catod, ceea ce rezulta intr-o deplasare a solventului fata de mediul-suport. Moleculele fara sarcina sunt purtate apoi spre catod, desi nu au grupari izolate. Amploarea electroendosmozei poate fi masurata prin studierea miscarii unor molecule neincarcate electric, de tipul ureei, dex tranului, deoxiribozei sau al albastrului de dextran. Albastrul de dextran este foarte potrivit, caci poate fi usor observat datorita colorarii sale puternice, fara alte determinari. Se poate deci vedea ca electroforeza reprezinta un concept extrem de simplu, dar ca inaintarea particulelor incarcate electric sau a ionilor prin prin mediu este influentata de un numar surprinzator de factori. Totusi, tocmai datorita acestor numeroase influente, principiul general poate fi intors in folosul cercetatorului. De exemplu, fara interventia factorului dimensional nu ar exista separarea particulelor mari de cele mici cu aceasi sarcina electrica. La fel, o matrice-suport neomogena este deliberat introdusa in tehnica electroforezei in gradient de gel, pentru a facilita separarea, in timp ce egalizarea sarcinilor gruparilor anionice si cationice in scopul producerii de molecule lipsite de sarcina neta constituie cerinta fundamentala a focalizarii izoelectrice.

Tipuri de electroforeze

2. Aplicatiile electroforezei Electroforeza poate fi utilizata: - in analiza si aprecierea puritatii proteinelor - pentru separarea si identificarea proteinelor - in investigatiile medicale (majoritatea lichidelor biologicepot fi examinate electroforetic in functie de continutul lor in proteine) - pentru separarea, identificarea si dozarea polipeptidelor, aminoacizilor, acidului uric, creatinei din plasma sau alte lichide biologice

Schema separarii proteinelor - electroforeza in gel

Bibliografie: A.T. Andrews Electroforeza. Teorie, tehnici si aplicatii biochimice si clinice en.wikipedia.org Student: Gavri Iulia-Teodora Sectia: CISOPC, an IV