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Aula de Aula de Bioqumica I Bioqumica I

Tema: Tema:
Caracterizao de Protenas Caracterizao de Protenas
Prof. Dr. J lio Csar Borges Prof. Dr. J lio Csar Borges
Depto. de Qu mi ca e F si ca Mol ecul ar Depto. de Qu mi ca e F si ca Mol ecul ar DQFM DQFM
Insti tuto de Qu mi ca de So Carl os Insti tuto de Qu mi ca de So Carl os IQSC IQSC
Uni versi dade de So Paul o Uni versi dade de So Paul o USP USP
EE--mai l mai l : borgesjc@i qsc.usp.br : borgesjc@i qsc.usp.br
Eletroforese Eletroforese
Movimento de partculas carregadas num campo eltrico externo. Movimento de partculas carregadas num campo eltrico externo.
-- Tcnica que se baseia no uso das cargas eltricas das biomolculas (DNA, RNA e Tcnica que se baseia no uso das cargas eltricas das biomolculas (DNA, RNA e
Protenas) para separar e analisar as suas propriedades fsico Protenas) para separar e analisar as suas propriedades fsico--qumicas. qumicas.
Alta resoluo de separao Alta resoluo de separao depende do meio e da partcula depende do meio e da partcula
Introduo Introduo
Uma partcula de carga Uma partcula de carga ZZ em um campo eltrico em um campo eltrico EE experimenta a fora experimenta a fora FF
A partcula carregada no campo eltrico sofre a ao contrria da frico A partcula carregada no campo eltrico sofre a ao contrria da frico ((f =coefi ci ente f =coefi ci ente
fri cci onal fri cci onal )), que proporcional velocidade , que proporcional velocidade v v da partcula no meio. da partcula no meio.
No estado No estado--estacionrio estacionrio movimento constante movimento constante
Logo Logo
ZE F =
f
ZE
v vf ZE = =
vf ZE F = = 0
Eletroforese Eletroforese
A Mobilidade A Mobilidade Eletrofortica Eletrofortica de partculas carregadas num campo eltrico externo e de partculas carregadas num campo eltrico externo e
constante, definido como constante, definido como , a velocidade da molcula por unidade de campo eltrico. , a velocidade da molcula por unidade de campo eltrico.
-- Princpio terico de todos os mtodos Princpio terico de todos os mtodos eletroforticos eletroforticos
proporcional razo proporcional razo z/f z/f
z z depende da relao depende da relao pI pI da molcula da molcula versus versus pH da soluo pH da soluo
ff = coeficiente = coeficiente friccional friccional depende das condies experimentais depende das condies experimentais
Portanto, a migrao de uma partcula num campo eltrico dependente: Portanto, a migrao de uma partcula num campo eltrico dependente:
da carga da carga ZZ e coeficiente e coeficiente ff , portanto depende tambm da Massa molecular , portanto depende tambm da Massa molecular MM
/V.sec) (cm
2
f
Z
E
v
= =

H
R r f 6 6 = =
H A
R N
RT
f
kT
D
6
= =
3 / 1
4
3
|
|
.
|

\
|
=
A
bar
sph
N
V M
R

f
ZE
v =
Eletroforese de Protenas Eletroforese de Protenas
Fase estacionria Fase estacionria Gel de Gel de poliacrilamida poliacrilamida
-- Forma polmero com uma rede entrelaada ou entrecruzada Forma polmero com uma rede entrelaada ou entrecruzada
-- Formado pela reao Formado pela reao radicalar radicalar entra entra Acrilamida Acrilamida--Metilenobisacrilamida Metilenobisacrilamida
-- Necessita de Necessita de Persulfato Persulfato de amnio e TEMED de amnio e TEMED
Eletroforese de Protenas Eletroforese de Protenas
Gel de Gel de poliacrilamida poliacrilamida Montado entre duas placas de vidro Montado entre duas placas de vidro
-- Soluo estoque de Soluo estoque de Acrilamida Acrilamida// Bisacrilamida Bisacrilamida 30%/ 2,7% 30%/ 2,7%
Acri l ami da Acri l ami da txi co para o Si stema Nervoso Central e Cancer geno txi co para o Si stema Nervoso Central e Cancer geno
-- Gel de corrida Gel de corrida fase de separao das protenas fase de separao das protenas
-- Gel de concentrao Gel de concentrao fase de aplicao das amostras fase de aplicao das amostras pente pente
Qualidade do Gel depende Qualidade do Gel depende
-- Qualidade da Qualidade da Acrilamida Acrilamida// Bisacrilamida Bisacrilamida
(Pureza); (Pureza);
-- gua deionizada (sem metais pesados); gua deionizada (sem metais pesados);
-- Armazenamento da soluo em vidro mbar Armazenamento da soluo em vidro mbar
(evitar reao (evitar reao Fotoradicalar Fotoradicalar); );
-- Deaerao Deaerao;;
-- Tempo de armazenamento do gel; Tempo de armazenamento do gel;
-- Temperatura Temperatura;;
-- Etc. Etc.
Eletroforese de Protenas Eletroforese de Protenas
Em condies Em condies no no--desnaturantes desnaturantes, a separao depende da , a separao depende da ZZ da protena da protena
Dependendo da relao do Dependendo da relao do pI pI versus versus pH, a pH, a ZZ protena pode ser protena pode ser ++ou ou
-- pI pI pH no qual o somatrio das cargas igual a 0 pH no qual o somatrio das cargas igual a 0
-- Funciona para DNA/ RNA Funciona para DNA/ RNA ZZ total negativo independente do pH total negativo independente do pH
Protena Protena ++migra para o plo migra para o plo Protena Protena migra para o plo migra para o plo ++
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH pH
No net No net
char ge char ge
I nc r easi ng I nc r easi ng
c at i oni c c at i oni c
I nc r easi ng I nc r easi ng
ani oni c ani oni c
Net posi t i ve c har ge Net posi t i ve c har ge
Net negat i ve c har ge Net negat i ve c har ge
++
Eletroforese de Protenas Eletroforese de Protenas
Eletroforese em Gel de Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Poliacrilamida na presena de SDS na presena de SDS
SDS SDS--PAGE PAGE Sodium Sodiumdodecyl dodecyl sulfate sulfate poliacrylamide poliacrylamide gel gel electrophoresis electrophoresis
Interao da protena com SDS deixa a protena com Interao da protena com SDS deixa a protena com ZZ total Negativa total Negativa
SDS SDS
Molcula anfiptica Molcula anfiptica
Desnatura a protena na formao de complexo Desnatura a protena na formao de complexo
SDS:Protena SDS:Protena
1,4g SDS/ 1g de protena 1,4g SDS/ 1g de protena
Z total negativa ser proporcional ao tamanho da Z total negativa ser proporcional ao tamanho da
protena protena
Rateio Rateio Z/M Z/M ser aproximadamente constante (ou ser aproximadamente constante (ou ff) )
para protenas de para protenas de M M diferentes diferentes
-- Densidade de carga Z constante Densidade de carga Z constante
SDS interage mais com a parte hidrofbica da SDS interage mais com a parte hidrofbica da
protena protena
SDS SDS--PAGE PAGE
Permite separao baseada na filtrao molecular da protena na peneira formada pelo Permite separao baseada na filtrao molecular da protena na peneira formada pelo
polmero entrecruzado de polmero entrecruzado de Acrilamida Acrilamida--Bisacrilamida Bisacrilamida
SDS SDS--PAGE PAGE
Permite anlise direta da Permite anlise direta da MM em funo do mobilidade em funo do mobilidade eletrofortica eletrofortica ((RF RF))
SDS normaliza efeitos devido ao formato da partcula, pois desnatura a protena SDS normaliza efeitos devido ao formato da partcula, pois desnatura a protena
Curva padro deve ser corrida nas mesmas condies experimentais Curva padro deve ser corrida nas mesmas condies experimentais
-- mesmo gel preferencialmente mesmo gel preferencialmente
SDS SDS--PAGE PAGE
-- Log Logda da MM versus versus RF RF
b RF a M + = ) ( log
b x a y + = ) (
b RF a
e M
+
=
) (

SDS SDS--PAGE PAGE
Interferncias na determinao da Interferncias na determinao da MM
Resistncia desnaturao qumica e trmica Resistncia desnaturao qumica e trmica
--Efeitos da forma da partcula Efeitos da forma da partcula Menor interao com SDS Menor interao com SDS
-- Menor densidade de carga Menor densidade de carga Z Z Reduz fora Motriz Reduz fora Motriz
-- Migrao anormal Migrao anormal aumenta aumenta MM
App App
Degradao devido desnaturao trmica (principalmente) Degradao devido desnaturao trmica (principalmente)
Necessidade de agentes redutores Necessidade de agentes redutores
Presena de glicosdeos Presena de glicosdeos
Presena de grupos PO Presena de grupos PO
44
33--
Protena muito carregada negativamente ( Protena muito carregada negativamente (pI pI cido) cido)
-- Reduz o nmero de molculas de SDS por protena Reduz o nmero de molculas de SDS por protena repulso entre cargas repulso entre cargas
-- Menor densidade de carga Menor densidade de carga Z Z Reduz fora Motriz Reduz fora Motriz
-- Migrao anormal Migrao anormal aumenta aumenta MM
App App
Protena muito carregada positivamente ( Protena muito carregada positivamente (pI pI bsico) bsico)
-- Grupos positivos agem como fator de resistncia Grupos positivos agem como fator de resistncia Reduz fora Motriz Reduz fora Motriz
-- Migrao anormal Migrao anormal aumenta aumenta MM
App App
Eletroforese Eletroforese
Mtodos de deteco/ visualizao Mtodos de deteco/ visualizao
Colorimtricos Colorimtricos
Colorao com Colorao com Comassie Comassie Brilliant Brilliant Blue Blue RG RG--250 250
-- Limite de deteco Limite de deteco ~0,1 ~0,1--1,0 1,0 g de g de protena protena
Impregnao por Prata (2000 x mais sensvel) Impregnao por Prata (2000 x mais sensvel)
-- Limite de deteco Limite de deteco ~0,01 ~0,01--0,1 0,1 g de g de protena protena
Comassie Comassie Brilliant Brilliant Blue Blue
Impregnao por Prata Impregnao por Prata
Eletroforese Eletroforese
Mtodos de deteco/ visualizao Mtodos de deteco/ visualizao
Radiomtricos Radiomtricos
-- Protenas ou DNA/ RNA marcadas com radioistopos Protenas ou DNA/ RNA marcadas com radioistopos
-- Uso de sondas de DNA/ RNA marcadas com radioistopos Uso de sondas de DNA/ RNA marcadas com radioistopos
Requer: Requer:
1) Transferncia da amostra do gel 1) Transferncia da amostra do gel
2) Imobilizao das molculas numa membrana 2) Imobilizao das molculas numa membrana
de nitro de nitro--celulose celulose
3) Incubao com a Sonda 3) Incubao com a Sonda
4) Exposio ao filme fotogrfico 4) Exposio ao filme fotogrfico
Southern Blot Southern Blot -- DNA DNA
Northern Blot Northern Blot -- RNA RNA
Western Blot Western Blot -- Protenas Protenas
Eletroforese Eletroforese
Mtodos de deteco/ visualizao Mtodos de deteco/ visualizao
Imunolgicos Imunolgicos
-- Deteco intermediada por um anticorpo ou outra sonda especfica Deteco intermediada por um anticorpo ou outra sonda especfica
-- Deteco do anticorpo que interagiu especificamente com a protena de interesse Deteco do anticorpo que interagiu especificamente com a protena de interesse
-- Anticorpos marcados com radioistopos ou um Anticorpos marcados com radioistopos ou um fluorforo fluorforo/ cromforo / cromforo
Mtodos Imunolgicos requerem transferncia do gel de Mtodos Imunolgicos requerem transferncia do gel de poliacrilamida poliacrilamida
Eletroforese Eletroforese
Mtodos de deteco/ visualizao Mtodos de deteco/ visualizao
Quantificao Quantificao
A quantidade de uma determinada banda em uma eletroforese pode ser estimada A quantidade de uma determinada banda em uma eletroforese pode ser estimada
-- Anlise das bandas por Anlise das bandas por densitrometria densitrometria
Uso de padres quantitativos Uso de padres quantitativos
-- Curva padro Curva padro
rea sob a curva rea sob a curva densitromtrica densitromtrica proporcional quantidade proporcional quantidade
Focalizao isoeltrica Focalizao isoeltrica
Metodologia para determinar o Metodologia para determinar o pI pI de uma protena de uma protena
Protena nativa migrar numa mistura de Protena nativa migrar numa mistura de anflitos anflitos orgnicos at alcanar o pH no qual a orgnicos at alcanar o pH no qual a
somatria de suas cargas seja igual a 0. somatria de suas cargas seja igual a 0.
A corrida feita entre tampes com pH cido (ctodo) e bsico ( A corrida feita entre tampes com pH cido (ctodo) e bsico (nodo nodo))
A mistura de A mistura de anflitos anflitos corrida corrida
anteriormente no PAGE e vo se posicionar no anteriormente no PAGE e vo se posicionar no
campo eltrico segundo o balano de cargas campo eltrico segundo o balano de cargas
Gradiente de pH imobilizado Gradiente de pH imobilizado
IPG: Immobilized pH Gradient IPG: Immobilized pH Gradient
Focalizao isoeltrica Focalizao isoeltrica
Metodologia para determinar o Metodologia para determinar o pI pI de uma protena de uma protena
A corrida feita entre tampes com pH cido (ctodo) e bsico ( A corrida feita entre tampes com pH cido (ctodo) e bsico (nodo nodo))
Low LowpH ( pH (++)) High High pH ( pH () )
-- Gradiente de concentrao de substncias com Gradiente de concentrao de substncias com
diferentes diferentes pKa pKa co co--polimerizado com a fase polimerizado com a fase
estacionria ( estacionria (poliacrilamida poliacrilamida))
CH CH
22
CH C N R CH C N R
O O
R= R= carboxil carboxil ou amina 3 ou amina 3
Eletroforese Eletroforese Bi Bi--dimencional dimencional (2 (2--D) D)
1 Dimenso: 1 Dimenso: Focalisao Focalisao isoeltrica isoeltrica
2 Dimenso: SDS 2 Dimenso: SDS--PAGE PAGE
Eletroforese Eletroforese Bi Bi--dimencional dimencional (2 (2--D) D)
GRANDE IMPORTNCIA PARA A PROTEMICA GRANDE IMPORTNCIA PARA A PROTEMICA
Resolve protenas de mesma Resolve protenas de mesma MM
Wapp Wapp
com diferentes com diferentes pI pI
Resolve protenas de diferentes Resolve protenas de diferentes MM
Wapp Wapp
com mesmos com mesmos pI pI
MM
app app
pI pI
Cada Cada spot spot uma protena!! uma protena!!
O O spot spot pode ser retirado do gel pode ser retirado do gel
e identificado por e identificado por
seqenciamento do N seqenciamento do N--terminal ou terminal ou
por Espectrometria de Massas. por Espectrometria de Massas.
Uso em conjunto com banco de Uso em conjunto com banco de
dados dados BIOINFORMTICA BIOINFORMTICA
Mais de 1000 protenas podem Mais de 1000 protenas podem
ser resolvidas e identificadas ser resolvidas e identificadas
num nico gel. num nico gel.
Eletroforese Eletroforese Bi Bi--dimencional dimencional (2 (2--D) D)
Permite anlise diferencial do contedo protico de um clula/ tecido em diferentes Permite anlise diferencial do contedo protico de um clula/ tecido em diferentes
condies experimentais condies experimentais PROTEMICA PROTEMICA
-- Necessidade de padres internos para identificar coordenadas do gel. Necessidade de padres internos para identificar coordenadas do gel.
Cada gel nico!!! Cada gel nico!!!
Dicrosmo Circular Dicrosmo Circular
Assimetria em Biomolculas Assimetria em Biomolculas PROTENAS PROTENAS
-- Estrutura primria Estrutura primria: carbono alfa dos aminocidos (exceo : carbono alfa dos aminocidos (exceo Gly Gly). ).
-- Estrutura secundria Estrutura secundria: transies eletrnicas na cadeia principal e alfa : transies eletrnicas na cadeia principal e alfa--hlice hlice
-- Estrutura terciria Estrutura terciria: molculas simtricas colocadas em um campo assimtrico ( : molculas simtricas colocadas em um campo assimtrico (Tyr Tyr))
Dicrosmo Circular Dicrosmo Circular
Diferena de Absoro entre a luz Circularmente polarizada Diferena de Absoro entre a luz Circularmente polarizada
-- Esquerda Esquerda
-- Direita Direita
) ( ) (
) (
nm nm
Direita Esquerda nm signal
A A CD

= O =
Luz Circularmente Polarizada Luz Circularmente Polarizada
A combinao de duas ondas linearmente polarizadas, uma vertical e outra horizontal, de A combinao de duas ondas linearmente polarizadas, uma vertical e outra horizontal, de
mesma amplitude e eletricamente DEFASADAS em 90 graus, resulta em uma onda mesma amplitude e eletricamente DEFASADAS em 90 graus, resulta em uma onda
CIRCULARMENTE POLARIZADA CIRCULARMENTE POLARIZADA
Amplitudes diferentes Amplitudes diferentes -- uma onda elipticamente polarizada uma onda elipticamente polarizada
http:/ / www.enzim.hu/ ~szia/ cddemo/ edemo1.htm http:/ / www.enzim.hu/ ~szia/ cddemo/ edemo1.htm
Dicrosmo Circular Dicrosmo Circular
Estudo de PROTENAS Estudo de PROTENAS Conformao da estrutura secundria Conformao da estrutura secundria

Comprimento de onda (nm)
Alfa-hlice
Folha-beta paralela
Folha-beta antiparalela
Desordenada
0
-10
+10
Comprimento de onda (nm)
Alfa-hlice
Folha-beta paralela
Folha-beta antiparalela
Desordenada
Comprimento de onda (nm)
Alfa-hlice
Folha-beta paralela
Folha-beta antiparalela
Desordenada
0
-10
+10
1. Enovelamento de Protenas 1. Enovelamento de Protenas
2. Comparao de estruturas 2. Comparao de estruturas
Protenas obtidas de diferentes fontes Protenas obtidas de diferentes fontes
Mutantes de uma mesma protena Mutantes de uma mesma protena
Controle de qualidade de protenas Controle de qualidade de protenas estrutura secundria estrutura secundria
3. Estabilidade Qumica 3. Estabilidade Qumica
pH pH
Desnaturantes Desnaturantes
4. Estabilidade Trmica 4. Estabilidade Trmica
5. Mudanas conformacionais e ensaios de interao 5. Mudanas conformacionais e ensaios de interao
Interaes protena Interaes protena--protena protena
Interaes protenas Interaes protenas--ligantes ligantes
Dicrosmo Circular Dicrosmo Circular
Estudo de PROTENAS Estudo de PROTENAS Conformao da estrutura secundria Conformao da estrutura secundria
Aplicaes Aplicaes
Fluorescncia Intrnseca de Protenas Fluorescncia Intrnseca de Protenas
Energia Energia versus versus tempo tempo
Uma molcula absorve energia quantizada e atinge o estado excitado Uma molcula absorve energia quantizada e atinge o estado excitado
No retorno ao estado basal, parte o excesso de energia perdido na forma de calor No retorno ao estado basal, parte o excesso de energia perdido na forma de calor
O restante perdido na forma de luz O restante perdido na forma de luz

exc exc
280 nm 280 nm Tyr e Tyr e Trp Trp

exc exc
295 nm 295 nm Trp Trp
Espectro de absoro dos aminocidos aromticos Espectro de absoro dos aminocidos aromticos
Fluorescncia de Fluorescncia de
protenas conta com protenas conta com
excitao em 280 excitao em 280 nm nm. .
Maior parte dos Maior parte dos fotons fotons
emitidos deve emitidos deve--se ao se ao
Trp Trp, depois , depois Tyr Tyr e e
ento ento Phe Phe..
Fluorescncia Intrnseca de Protenas Fluorescncia Intrnseca de Protenas
O O
Max Max
de Fluorescncia do de Fluorescncia do Trp Trp sensvel ao ambiente sensvel ao ambiente
Efeito do Enovelamento da Protena na Sonda de fluorescncia Efeito do Enovelamento da Protena na Sonda de fluorescncia
Intensidade de Fluorescncia Intensidade de Fluorescncia Perturbaes do estado enovelado e na dinmica Perturbaes do estado enovelado e na dinmica
--
max max
((nm nm) de emisso a melhor indicao do ambiente do ) de emisso a melhor indicao do ambiente do fluorforo fluorforo
-- Depende do nmero de W na protena Depende do nmero de W na protena
Resduos de Resduos de Trp Trp expostos gua apresentam expostos gua apresentam
max max
de emisso 340 de emisso 340--350 350 nm nm, enquanto , enquanto
totalmente enterrados < 330 totalmente enterrados < 330 nm nm..
300 320 340 360 380 400
0
1
2
3
4
5
6
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

d
e

f
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
comprimento de onda (nm)
trp/gua
trp/EtOH
320 340 360 380 400 420
Comprimento de onda de emi sso (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

(
A
U
)
Hsp70 2 mol/L
Nativa
MgAMP 1 mmol/L
MgADP 1 mmol/L
MgATP 1 mmol/L
Gnd-HCl 6 mol/L
320 340 360 380 400 420
Comprimento de onda de emi sso (nm)
320 340 360 380 400 420
Comprimento de onda de emi sso (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

(
A
U
)
0
1
2
3
4
5
6
7
F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

(
A
U
)
Hsp70 2 mol/L
Nativa
MgAMP 1 mmol/L
MgADP 1 mmol/L
MgATP 1 mmol/L
Gnd-HCl 6 mol/L
Hsp70 2 mol/L
Nativa
MgAMP 1 mmol/L
MgADP 1 mmol/L
MgATP 1 mmol/L
Gnd-HCl 6 mol/L
Fluorescncia Intrnseca de Protenas Fluorescncia Intrnseca de Protenas
O O
Max Max
de Fluorescncia do de Fluorescncia do Trp Trp sensvel ao ambiente sensvel ao ambiente
Sonda para estrutura terciria local Sonda para estrutura terciria local MUDANAS CONFORMACIONAIS MUDANAS CONFORMACIONAIS
UNFOLDING PROBE UNFOLDING PROBE LIGAND PROBE LIGAND PROBE
] log[ log log
0
L n K
F
F F
A
+ =
|
.
|

\
|

Cromatografia de Excluso Molecular Analtica Cromatografia de Excluso Molecular Analtica
Separao pelo tamanho (pela Separao pelo tamanho (pela MM))
Modo Preparativo: purificar protenas Modo Preparativo: purificar protenas
Modo Analtico: analisar macromolculas em soluo Modo Analtico: analisar macromolculas em soluo
Fase Estacionria: Fase Estacionria:
Matriz ou Resina Matriz ou Resina
Porosa Porosa
Inerte Inerte
Esfrica Esfrica
Estvel Estvel
Fase Mvel Fase Mvel
Tampo salino Tampo salino
Eluio isocrtica Eluio isocrtica
Sem variao da fase mvel Sem variao da fase mvel
Existem resinas para 100 a 1x10 Existem resinas para 100 a 1x10
66
Da Da
Cromatografia de Excluso Molecular Analtica Cromatografia de Excluso Molecular Analtica
Determinando a Determinando a MM aparente aparente
Precisa de uma curva padro de protenas de Precisa de uma curva padro de protenas de MM conhecidas; conhecidas;
Sofre influncias do formato da macromolcula de interesse; Sofre influncias do formato da macromolcula de interesse;
A A MM diretamente determinada est relacionada partculas globulares; diretamente determinada est relacionada partculas globulares;
0
0
av
K
V V
V V
t
e

=
b M a + = ) (log K
av
Ultracentrifugao analtica Ultracentrifugao analtica -- UAL UAL
Uso da fora gravitacional para sedimentar uma partcula Uso da fora gravitacional para sedimentar uma partcula
Sedimentao Sedimentao precipitao de partculas dissolvidas em soluo por ao da fora do precipitao de partculas dissolvidas em soluo por ao da fora do
campo gravitacional campo gravitacional
Centrifugao Centrifugao partcula submetida a uma fora externa centrfuga partcula submetida a uma fora externa centrfuga
Baseia Baseia--se em princpios se em princpios
Hidrodinmicos Hidrodinmicos Termodinmicos Termodinmicos
UMA TCNICA ABSOLUTA!!! UMA TCNICA ABSOLUTA!!!
Independe de padres externos Independe de padres externos
Atravs da UAL possvel determinar: Atravs da UAL possvel determinar:
MM sem desnaturao da protena; sem desnaturao da protena;
Coeficiente de sedimentao; Coeficiente de sedimentao;
Formato das partculas (assimetria); Formato das partculas (assimetria);
HHomogeneidade e estados de agregao; omogeneidade e estados de agregao;
Constantes de associao e estequiometria; Constantes de associao e estequiometria;
Tcnica Padro Ouro. Tcnica Padro Ouro.
Em condies Em condies
experimentais experimentais
diversas!!! diversas!!!
Sem interferncias Sem interferncias
externas!!! externas!!!
Theodor Theodor
Svedberg Svedberg
(1884 (1884--1971) 1971)
Nobel Nobel Prize Prize
winner winner for for
Chemistry Chemistry
(1926) (1926)
rm F
C
2
=
L bar L Emp
rmV rm F
2 2
= =
fv F
f
=
= velocidade angular; = velocidade angular;
rr = raio; = raio;
mm = massa da partcula; = massa da partcula;
mm
LL
= massa do lquido deslocado; = massa do lquido deslocado;
Ultracentrifugao Analtica Ultracentrifugao Analtica
As foras sobre uma partcula sob um campo centrfugo As foras sobre uma partcula sob um campo centrfugo
Av
N
M
m =
A m de uma partcula est relacionada com a massa A m de uma partcula est relacionada com a massa
molecular molecular MM desta pelo Nmero de Avogrado. desta pelo Nmero de Avogrado.
VV
bar bar
= volume parcial especfico da partcula; = volume parcial especfico da partcula;

LL
= densidade do Lquido; = densidade do Lquido;
ff = coeficiente friccional. = coeficiente friccional.
L bar L
mV m =
Av
f bar
N
M
f
V r
v
) 1 (
2

=
) ( ) ( 0
2 2
fv V
N
M
r
N
M
r F F F
f bar
Av Av
f Emp C
+ e + e = = + +
s
r
v
f N
V M
Av
f bar

e
=

2
) 1 (
Ultracentrifugao Analtica Ultracentrifugao Analtica
Se a velocidade da partcula constante: a soma das foras sobre ela igual a 0. Se a velocidade da partcula constante: a soma das foras sobre ela igual a 0.
Resolvendo em funo da Velocidade: Resolvendo em funo da Velocidade:
Equao de Equao de Svedberg Svedberg
ss = Coeficiente de Sedimentao = Coeficiente de Sedimentao
= 10 = 10
--13 13
seg seg = S = 1 = S = 1 Svedberg Svedberg
Resolvendo pelos fatores internos e externos!!! Resolvendo pelos fatores internos e externos!!!
O O ss representa a velocidade da partcula por unidade gravitacional e depende das representa a velocidade da partcula por unidade gravitacional e depende das
propriedades das partculas: propriedades das partculas:
MM efetiva e forma da partcula. efetiva e forma da partcula.
f N
V M
s
Av
f bar
) 1 (
=
Ultracentrifugao Analtica Ultracentrifugao Analtica
1) A velocidade de sedimentao de uma partcula depende de sua M 1) A velocidade de sedimentao de uma partcula depende de sua M
Quanto maior a Quanto maior a MM maios o valor de s maios o valor de s
2) O coeficiente de atrito 2) O coeficiente de atrito ff reduz o valor de s reduz o valor de s
Quanto menos globular for uma protena menor a sua velocidade de sedimentao Quanto menos globular for uma protena menor a sua velocidade de sedimentao
3) Quanto maior a densidade de uma partcula maior a sua velocidade de sedimentao 3) Quanto maior a densidade de uma partcula maior a sua velocidade de sedimentao
Quanto maior o valor da componente (1 Quanto maior o valor da componente (1 VV
bar bar

ff
)) maior a velocidade de sedimentao maior a velocidade de sedimentao
OBS: Itens 2 e 3 so importantes para o estudo estrutural de protenas quando comparadas OBS: Itens 2 e 3 so importantes para o estudo estrutural de protenas quando comparadas
a protenas de mesma a protenas de mesma MM
Protein Protein MM((kDa kDa)) s (S) s (S)
Citocromo Citocromo CC 12,3 12,3 1,83 1,83
Mioglobina Mioglobina 17,8 17,8 1,97 1,97
Tripsina Tripsina 23,2 23,2 2,5 2,5
Anidrase Anidrase Carbnica Carbnica 28,8 28,8 3,8 3,8
Malato Malato Desidrogenase Desidrogenase 74,9 74,9 5,76 5,76
Lactato Lactato Desidrogenase Desidrogenase 146,2 146,2 7,54 7,54
Ultracentrifugao Analtica Ultracentrifugao Analtica
4) A velocidade de sedimentao depende da densidade do lquido 4) A velocidade de sedimentao depende da densidade do lquido
ff
-- Se Se VV
bar bar

ff
< 1 < 1 a partcula sedimentar a partcula sedimentar
-- Se Se VV
bar bar

ff
> 1 > 1 a partcula flutuar a partcula flutuar
-- Se Se VV
bar bar

ff
= 1 = 1 a partcula no se movimentar (Zera o numerador da Eq. de a partcula no se movimentar (Zera o numerador da Eq. de Svedberg Svedberg))
Base da tcnica de Centrifugao em gradiente (ou zonal, ou em faixas, ou em bandas) Base da tcnica de Centrifugao em gradiente (ou zonal, ou em faixas, ou em bandas)
-- Gradiente linear de sacarose Gradiente linear de sacarose
Seqenciamento de Aminocidos Seqenciamento de Aminocidos
O conhecimento da seqncia de Aminocidos uma protena o primeiro passo para a O conhecimento da seqncia de Aminocidos uma protena o primeiro passo para a
determinao de sua funo determinao de sua funo
1 1 Permite comparao da seqncia de aminocidos com banco de dados de protenas Permite comparao da seqncia de aminocidos com banco de dados de protenas
para avaliar sua funo, famlia de protenas, tipos de estruturas 3D, localizao, para avaliar sua funo, famlia de protenas, tipos de estruturas 3D, localizao, etc etc
2 2 Comparar protenas de diferentes espcies permite avaliao evolutiva Comparar protenas de diferentes espcies permite avaliao evolutiva
3 3 Avaliar padres de repeties internas Avaliar padres de repeties internas eventos de duplicao de domnios eventos de duplicao de domnios
4 4 Identificas seqncias motivo para sinalizao de processamento, ativao/ inativao Identificas seqncias motivo para sinalizao de processamento, ativao/ inativao
5 5 Permite construir anticorpos especficos Permite construir anticorpos especficos
6 6 permite construir sondas de DNA para engenharia gentica permite construir sondas de DNA para engenharia gentica
O seqenciamento de Aminocidos por intermdio do seqenciamento do DNA O seqenciamento de Aminocidos por intermdio do seqenciamento do DNA
GENOMA GENOMA
Seqenciamento de Aminocidos Seqenciamento de Aminocidos
A seqncia de aminocidos de uma protena pode ser determinada pela ciclo de A seqncia de aminocidos de uma protena pode ser determinada pela ciclo de
degradao de degradao de Edman Edman automatizada automatizada
1 Etapa 1 Etapa Determinar a composio de aminocidos da protena Determinar a composio de aminocidos da protena
AAGGDDFFRRGG
-- Hidrlise cida da ligao peptdica Hidrlise cida da ligao peptdica HCl HCl 6 mol/ L a 110 6 mol/ L a 110
oo
CC
-- Reao com Reao com Ninhidrina Ninhidrina colorao rocha colorao rocha permite deteco permite deteco
Cromatografia de troca inica Cromatografia de troca inica
HPLC: Cromatografia Lquida de HPLC: Cromatografia Lquida de
alta performance alta performance
((Asp Asp, , Arg Arg, Ala, , Ala, Phe Phe, , Gly Gly
22
))
Seqenciamento de Aminocidos Seqenciamento de Aminocidos
2 Etapa 2 Etapa Identificao do AA N Identificao do AA N--
terminal terminal
Marcao do N Marcao do N--terminal com um terminal com um
corante (1 corante (1--fluoro fluoro--2,4 2,4--
dinitrobenzeno dinitrobenzeno) seguida de ) seguida de
hidrlise da cadeia peptdica hidrlise da cadeia peptdica
3 Etapa ( 3 Etapa (Cclica) Cclica)
1 Passo 1 Passo Proteo Proteo Amino Amino--
terminal terminal com com Isoticionato Isoticionato de de fenila fenila
2 Passo 2 Passo Liberao do AA Liberao do AA
marcado (PTC: marcado (PTC: feniltiocarbamoil feniltiocarbamoil) )
em meio levemente cido em meio levemente cido
3 Passo 3 Passo Identificao do Identificao do
derivado de AA da derivado de AA da Feniltioidantona Feniltioidantona
PTH PTH--AA AA
Seqenciamento de Aminocidos Seqenciamento de Aminocidos
Identificao de cada PTH Identificao de cada PTH--
AA por Cromatografia de AA por Cromatografia de
troca inica troca inica
HPLC: Cromatografia HPLC: Cromatografia
Lquida de alta Lquida de alta perfomance perfomance
1 1
ciclo ciclo
2 2
ciclo ciclo
Seqenciamento de Aminocidos Seqenciamento de Aminocidos
A degradao de A degradao de Edman Edman permite seqenciar at 50 resduos permite seqenciar at 50 resduos
--Limitao pela eficincia da clivagem seqencial de 99% por AA Limitao pela eficincia da clivagem seqencial de 99% por AA
Seqenciamento completo de Protenas Seqenciamento completo de Protenas
grandes grandes
A clivagem diferencial de protenas A clivagem diferencial de protenas
por mtodos diferentes por mtodos diferentes
-- mtodo de escolha depende do mtodo de escolha depende do
contedo de aminocidos da protena contedo de aminocidos da protena
Separao dos fragmentos Separao dos fragmentos
Seqenciamento individual dos Seqenciamento individual dos
fragmentos fragmentos
A seqncia de aminocidos de A seqncia de aminocidos de
protenas grandes pela sobreposio de protenas grandes pela sobreposio de
seqncias individuais dos fragmentos seqncias individuais dos fragmentos
Mesmo princpio empregado para o Mesmo princpio empregado para o
seqenciamento seqenciamento Genmico Genmico..
Seqenciamento de Aminocidos Seqenciamento de Aminocidos
Sntese de peptdeos Sntese de peptdeos
Seqncias de at 50 resduos podem ser sintetizados pelo Mtodo de Fase slida Seqncias de at 50 resduos podem ser sintetizados pelo Mtodo de Fase slida
1) 1) Uso na produo de Anticorpos Uso na produo de Anticorpos
2) 2) Identificao de receptores Identificao de receptores
3) 3) Como medicamentos Como medicamentos
4) 4) Estudos Estruturais diversos Estudos Estruturais diversos
-- Envolve eventos de Ancoragem na resina e Envolve eventos de Ancoragem na resina e
ciclos de ciclos de Desproteo Desproteo e Acoplamento e e Acoplamento e
finalmente liberao da resina finalmente liberao da resina
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas Mass Mass Spectrometry Spectrometry (MS) (MS)
Depende da relao Depende da relao m/ Z m/ Z:: ons mais leves so mais rpidos no campo eltrico ons mais leves so mais rpidos no campo eltrico
Permite determinar a Permite determinar a MMde uma protena com preciso de 0,1 de uma protena com preciso de 0,1--0,2 Da 0,2 Da
A A MMdeterminada por determinada por MS MS pode ser considerada como um rtulo e permite identificar a pode ser considerada como um rtulo e permite identificar a
protena se for conhecido o Genoma do organismo fonte protena se for conhecido o Genoma do organismo fonte Bioinformtica Bioinformtica
Permite identificar modificaes Permite identificar modificaes ps ps--traducionais traducionais
Grande aplicao na Grande aplicao na Protemica Protemica em conjunto com Eletroforese 2D em conjunto com Eletroforese 2D
Ionizao o fator limitante Ionizao o fator limitante
MALDI: Espectrometria por MALDI: Espectrometria por desabsoro desabsoro e ionizao e ionizao
a laser, assistida por matriz a laser, assistida por matriz
((Matrix Matrix Assisted Assisted Laser Laser Desorption Desorption// Ionization Ionization))
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
ESI: Espectrometria por Eletro ESI: Espectrometria por Eletro--nebulizao nebulizao
((Electrospray Electrospray ionization ionization) )
(m/ z) (m/ z)
22
do pico 2 do pico 2
MMda protena da protena
nn
22
: nmero de cargas : nmero de cargas
(m/ z) (m/ z)
11
do pico 1 do pico 1
MMda protena da protena
nn
22
: nmero de cargas : nmero de cargas
XX: m do grupo : m do grupo
adicionado adicionado
MMe e nn
22
so as incgnitas em duas equaes so as incgnitas em duas equaes
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
Seqenciamento de Aminocidos por MS Seqenciamento de Aminocidos por MS
Depende do uso de uma Espectrmetro de Massas em Depende do uso de uma Espectrmetro de Massas em Tandem Tandem MS/ MS MS/ MS
1 Etapa: 1 Etapa: Clivagem da protena com Clivagem da protena com
Tripsina; Tripsina;
2 Etapa: 2 Etapa: Determinao da Determinao da MMdo do
peptdeo peptdeo nn
11
no MS no MS--1; 1;
3 Etapa: 3 Etapa: Seleo e Isolamento do Seleo e Isolamento do
peptdeo peptdeo nn
11
em anlise na cmara entre em anlise na cmara entre
o MS o MS--1 e MS 1 e MS--2; 2;
4 Etapa: 4 Etapa: Fragmentao das ligaes Fragmentao das ligaes
peptdicas do fragmento peptdicas do fragmento nn
1 1
com carga com carga
adequada; adequada;
--No ocorre hidrlise No ocorre hidrlise vcuo vcuo
-- Permite identificar AA N Permite identificar AA N-- e C e C--terminal terminal
5 Etapa: 5 Etapa: Determinao Determinao MMda mistura de da mistura de
peptdeos gerados pelo MS peptdeos gerados pelo MS--22
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
Os picos sucessivos possuem Os picos sucessivos possuem mmque diferem pela que diferem pela MMdo aminocido no peptdeo original do aminocido no peptdeo original
Superposio de seqncias de diferentes fragmentos permite identificar a seqncia de Superposio de seqncias de diferentes fragmentos permite identificar a seqncia de
aminocidos da protena completa aminocidos da protena completa
Se o Genoma est disponvel, a seqncia de AA de um nico fragmento pode resultar na Se o Genoma est disponvel, a seqncia de AA de um nico fragmento pode resultar na
identificao da protena identificao da protena Bioinformtica Bioinformtica
FFPPGGQQ(I/ L) (I/ L)NNAADD(I/ L) (I/ L)RR
Identificao limitada para Identificao limitada para
Leu e Leu e Ile Ile
Cristalografia de Protenas Cristalografia de Protenas
Permite a determinao da estrutura de protenas em alta resoluo Permite a determinao da estrutura de protenas em alta resoluo
-- Primeiro mtodo de estudo estrutural de protenas em alta resoluo Primeiro mtodo de estudo estrutural de protenas em alta resoluo
-- Representa uma foto da protena em uma de suas conformaes possveis Representa uma foto da protena em uma de suas conformaes possveis
-- Sensvel s condies experimentais e presena de ligantes na Sensvel s condies experimentais e presena de ligantes na Etapa Etapa de Cristalizao de Cristalizao
Cristais de insulina Cristais de insulina
Etapas Etapas
1) 1) Cristalizao de protenas Cristalizao de protenas
-- Protena precisa sair da fase aquosa e se organizar em uma Protena precisa sair da fase aquosa e se organizar em uma
estrutura cristalina estrutura cristalina salting salting out out alto alto SS
-- Representa o passo limitante do processo Representa o passo limitante do processo
2) 2) Coleta de dados de difrao Coleta de dados de difrao
3) 3) Anlise de dados por sistemas computacionais Anlise de dados por sistemas computacionais
Cristalografia de Protenas Cristalografia de Protenas
Os eltrons da protena dispersam Raios X Os eltrons da protena dispersam Raios X
As ondas dispersadas pelos eltrons de As ondas dispersadas pelos eltrons de
um cristal de protena foram ondas um cristal de protena foram ondas
convergentes. convergentes.
O padro de formao de ondas O padro de formao de ondas
convergentes depende do arranjo dos convergentes depende do arranjo dos
tomos no cristal. tomos no cristal.
Ressonncia Magntica Nuclear Ressonncia Magntica Nuclear
Espectrometria sensvel a tomos com Spin nuclear com momento angular Espectrometria sensvel a tomos com Spin nuclear com momento angular
11
H, H,
13 13
C, C,
15 15
N, N,
19 19
F e F e
31 31
PP
O spin nuclear se orienta perante um campo magntico O spin nuclear se orienta perante um campo magntico
Absorve Energia do campo Absorve Energia do campo
-- A energia absorvida depende do tomo e do ambiente que A energia absorvida depende do tomo e do ambiente que
ele experimenta ele experimenta
Permite o estudo estrutural e conformacional de Permite o estudo estrutural e conformacional de
protenas em soluo protenas em soluo
-- Fator limitante Fator limitante tamanho da protena e alta [Protena] tamanho da protena e alta [Protena]
RMN RMN
11
H em uma protena H em uma protena
Ressonncia Magntica Nuclear Ressonncia Magntica Nuclear
A RMN bi A RMN bi--dimensional permite determinar a relao espacial entre os AA numa protena dimensional permite determinar a relao espacial entre os AA numa protena
13 13
C e C e
15 15
NN podem ser inseridos na protena por engenharia gentica podem ser inseridos na protena por engenharia gentica
1) Atravs dos sinais possvel identificar as relaes espaciais entre os AA 1) Atravs dos sinais possvel identificar as relaes espaciais entre os AA
2) Sabendo das relaes espaciais 2) Sabendo das relaes espaciais Modelagem da protena Modelagem da protena
A estrutura obtida por RMN representa as vrias Estruturas dinmicas Possveis A estrutura obtida por RMN representa as vrias Estruturas dinmicas Possveis
1 1
2 2