Burkholderia cepacia compleja : clulas epiteliales enfrentamientos patgenos y las posibilidades de intervencin teraputica Siobha'n McClean y Ma 'ire Callaghan

Burkholderia cepacia (CCO) es un patgeno importante y virulenta de los pacientes con fibrosis qustica. Las interacciones entre el patgeno y el epitelio pulmonar que lo recibe estn siendo ampliamente investigado, pero an no se han dilucidado. El complejo es muy verstil y sus interacciones con las clulas epiteliales del pulmn son muchas y variadas. Los primeros pasos en la interaccin son la penetracin de la mucosa y la posterior adhesin a la superficie de la clula epitelial. Una gama de receptores epiteliares se han informado obligatoriamente a la Bcc.. El siguiente paso en la patognesis es la invasin de los clulas epiteliales de pulmn y tambin la translocacin a travs del epitelio a lado seroso. Por otra parte,patognesis est mediada por una gama de factores de virulencia que provocan sus efectos sobre el epitelio celular . Esta revisin describe estas interacciones y examina las implicaciones teraputicas de la comprensin de los mecanismos de la patognesis de esta difcil, resistente a los antibiticos, oportunistas patgeno. Introduccin Burkholderia cepacia (Bcc) es un grupo cerrado de las bacterias Gram-negativas relacionadas que surgieron como patgenos oportunistas en los aos 1980 en los pacientes con fibrosis qustica (CF) y la enfermedad granulomatosa crnica (CGD) (Islas et al., 1984). B. cepacia fue identificado ms de 50 aos Hace como un patgeno de plantas (Burkholder, 1950), y es ampliamente aislados de la biosfera. El gnero Burkholderia ahora comprende por lo menos 43 especies, que son muy diversos y verstil (Vial y col., 2007). Mientras Bcc tiene muchas usos potenciales en el medio ambiente, en particular en la biorremediacin, la patognesis de la Bcc en poblaciones susceptibles es una causa importante de preocupacin (Parke y Gurian- Sherman, 2001). Hay por lo menos 15 especies dentro de la complejo (Coenye et al, 2001, 2003;.. Vanlaere et al, 2008). Adems, los aislados de dos posibles adicionales Se estn estudiando las especies y se clasifican actualmente juntos como Grupo K (Mahenthiralingam et al., 2006). Las diferencias geogrficas en la prevalencia de las especies Bcc existe: en Amrica del Norte, la cepa ms predominante es Burkholderia cenocepacia, sin embargo, en Europa, Burkholderia multivorans predomina (Govan et al., 2007). Aunque Bcc , ha causado infecciones en slo el 3,5% de los pacientes con FQ en el mundo, esto representa un significativo problema, ya que los pacientes con FQ colonizados con experiencia Bcc un descenso ms rpido de los colonizados con la ms comnmente adquiridos patgeno Pseudomonas aeruginosa (Courtney et al., 2004). Los primeros nueve especies identificadas han sido ampliamente estudiados y difieren mucho en trminos de su virulencia y la transmisibilidad. Todos Bcc especies y aislamientos del Grupo K se han aislado de pacientes con FQ; Sin embargo, de estos, B. y B. multivorans son cenocepacia particularmente

virulenta (Mahenthiralingam et al., 2005). Una vez un paciente est colonizado con una cepa , Bcc el organismo es Rara vez erradicada. Infeccin Bcc generalmente se adquiere tarde en el curso de la enfermedad y el resultado de la infeccin puede variar, que van desde el mantenimiento de un respiratoria estable funcionar a una disminucin rpida, y en ltima instancia fatal, clnica. Bcc ha surgido como un patgeno grave para los pacientes con FQ para las siguientes razones. (1) La infeccin puede resultar en 'cepacia sndrome ', una condicin que ocurre en aproximadamente 20% de los Los pacientes con FQ infectados con Bcc, que se caracteriza por fiebre, neumona y bacteriemia (Isles et al., 1984). (2) Bcc es inherentemente resistentes al tratamiento antimicrobiano y Se observa una mayor resistencia a la formacin de Bcc biopelculas in vitro. Es resistente a los aminoglucsidos, quinolonas y blactmicos (Chernish y Aaron, 2003), puede utilizar la penicilina G como una fuente de carbono (Beckman y Lessie, 1979), y tambin es inherentemente resistentes a los antimicrobianos pptidos (Taylor et al., 2007). Por otra parte, la formacin de Bcc biopelculas se ha demostrado que aumenta an ms la resistencia a los antibiticos in vitro (Caraher et al., 2007b). (3) Finalmente, Cepas Bcc puede transmitirse de paciente a paciente. Hay cepas de B. multivorans y B. cenocepacia que son altamente transmisible, aunque otras especies, por ejemplo, Burkholderia dolosa, tambin se ha demostrado que es transmisible (LiPuma et al., 1990). En particular, una cepa de B. cenocepacia, conocida como la cepa ET12, ha sido aislado de pacientes en diferentes pases en ambos lados del Atlntico (Mahenthiralingam et al., 2005). La transmisin se considera que es debida al contacto directo, Journal of Medical Microbiology (2009), 58, 1-12 DOI 10.1099/jmm.0.47788-0 47788 T 2009 SGM Impreso en Gran Bretaa 1 pero exactamente cmo se propaga CCO de un paciente con CF otro tiene que ser determinado. McDowell et al. (2004) mostr que mientras que el mayor riesgo de transmisin fue asociado con B. cenocepacia, tambin han sido otras especies encontrado a participar en la infeccin cruzada. El Reino Unido CF Fideicomiso directrices (http://www.cftrust.org.uk/aboutcf/publications/ consensusdoc/C_Burkholderia_cepacia_Sep_2004.pdf) recomendados que las medidas de segregacin deben poner en lugar para todos los pacientes con infeccin por el Bcc, independientemente de la especie o cepa. Propagacin de paciente a paciente de otras especies Bcc fue posteriormente confirmado (Agodi et al, 2001;.. Biddick et al, 2003). De hecho, una reciente revisin sistemtica de aislamiento procedimientos apoyaran el uso de medidas de aislamiento para reducir la transmisin de Bcc (Festini et al., 2006). Aunque B. cenocepacia y B. multivorans predominan, existen prevalencias inusuales de algunas especies debido a incidencias aisladas. Un centro de CF Portugus en Lisboa inform que B. cepacia (antes genomovar I) fue aislado de 85% de los pacientes colonizados CCO-CF, la mayora probablemente debido a la contaminacin de una solucin salina no estril en una preparacin para la aplicacin nasal (Cunha et al., 2007). En

Adems, un brote de B. dolosa (genomovar VI) en un Hospital de Nios de Boston se asoci con un disminucin acelerada de la funcin pulmonar y una reduccin en supervivencia (Kalish et al., 2006). Los brotes tambin surgen en la noPoblaciones CF, por ejemplo, B. cenocepacia surgi como una patgeno nosocomial en pacientes sin FQ y tiene como resultado de la mortalidad sustancial debido a bacteriemia (Woods et al., 2004). Por otra parte, B. cepacia era evidente en cultivos de sangre de nios sin FQ siguiente a la administracin de un aerosol nasal salbutamol contaminada, y el uso concomitante de budesonida mejora considerablemente el riesgo de infeccin (Ghazal et al., 2006). En un estudio reciente, se demostr utilizando la secuencia de multilocus escribiendo que ms del 20% de los aislados clnicos fueron indistinguibles a partir de cepas ambientales (Baldwin et al., 2007), que plantea una serie de preguntas. Lo que hace Bcc tanto xito? Por otra parte, cmo ha logrado sobrevivir y florecer en el medio ambiente y la CF pulmn? Ahora es evidente que los patgenos humanos comparten muchos mecanismos de la patognesis y factores de virulencia que genes tienden a estar agrupados en islas distintas en bacterias cromosomas y en plsmidos. Estos mecanismos comunes en el epitelio inclyen r la unin de clulas husped, invasin, la supervivencia intracelular, la adquisicin de hierro y regulacin de la virulencia (Finlay y Falkow, 1997). En efecto, una isla de patogenicidad (cci) ha sido identificado en el B. cenocepacia genoma que incluye los genes para la persistencia, mecanismos de virulencia y metablicos (Baldwin et al., 2004). Las interacciones entre el Bcc y las clulas epiteliales del pulmn comparten muchas caractersticas comunes con otros patgenos de las mucosas (Fig. 1). En esta revisin, las interacciones que tiene con Bcc con estas clulas se identifican con el fin de estudiar su mecanismos de la patognesis y su capacidad para sobrevivir en el pulmn con FQ. Las implicaciones de estas investigaciones al desarrollo de mejores tratamientos contra la Bcc son tambin resaltado. Antes de esto, una descripcin de la clula husped en un ambiente en particular a la infeccin Bcc ayudar a entender este concepto..

Barrera de clulas epiteliales de las vas areas: La funcin del epitelio respiratorio se basa en la estrecha asociacin entre las clulas epiteliales vecinas, formando una barrera apretada (Godfrey, 1997). La trquea y los bronquios estn revestidos con clulas epiteliales columnares ciliadas y hasta los bronquiolos, que tienen una estructura ms simple con tanto las clulas epiteliales columnares ciliadas y no ciliadas Estas clulas estn polarizadas, con distintas protenas apical y basolateral y la expresin de lpidos. Por encima de las clulas epiteliales se encuentra una capa superficial del lquido que contiene glndulas mucosas y secreciones de clulas caliciformes y anticuerpos. Los cuales contribuyen a la proteccin contra la infeccin por bacterias inhaladas. Eliminacin del moco es un importante mecanismo de defensa innata la mediacin de la eliminacin de los sustancias prcticamente todos inhalados de

las vas respiratorias, y defectos en este mecanismo estn asociados con una gama de enfermedades crnicas de las vas respiratorias en los seres humanos (Boucher, 2007). La integridad de la barrera epitelial es mantenida por uniones estrechas, que se encuentran en las fronteras apicolateral de epitelio las clulas de los pulmones y son responsables de la regulacin selectiva de los iones, el agua, otras pequeas molculas neutras y las clulas inmunes a travs de la ruta paracelular (Denker y Nigam, 1998). El apretado nudo est formado por numerosas protenas incluyendo ZO-1, claudins y occludins que forman anillos contiguos alrededor de las clulas epiteliales y unidas a los anillos de actinomyosina de otras clulas. Estas protenas tienen diferentes papeles en la formacin y funcin de la apretada cruce (Maher et al., 2008). En particular, ZO-1 expresin se correlaciona inversamente con la unin en las clulas epiteliales del pulmn (Winton et al., 1998). Ms abajo en el tracto respiratorio, los alvolos se alinean con una sola capa delgada de clulas: las clulas epiteliales del tipo 1, el cual constituyen el 93% de la superficie alveolar y son responsables para el intercambio gaseoso, y la produccin de tensioactivo de tipo-II clulas, que estn implicados en el transporte apical a basolateral de sodio (Adamson y Bowden, 1974; Evans et al, 1975.) Epitelio de las vas respiratorias de los pulmones en la fibrosis quistica El defecto primario en la FQ est relacionada con mutaciones en el regulador transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR) (Riordan et al., 1989). Patognesis de la FQ est directamente relacionada con CF patologa de las vas respiratorias (Boucher, 2004). El aumento de moco debido a defectuosa eliminacin del moco, la funcin anormal de la glndula submucosa adems de una mayor respuesta inflamatoria y la reduccin de la eficacia pptido antimicrobiano, todo contribuye a las infecciones persistentes que son el sello de la enfermedad pulmonar de la FQ. Esta acumulacin de moco proporciona un entorno ideal para la colonizacin de patgenos y se relaciona directamente con el defecto CFTR (Boucher, 2007). En efecto, Se ha demostrado que cinco especies de Bcc son aptas para unirse a las vas respiratorias por su moco, y el tratamiento con dextrano resultaron en una reduccin en el espesor de este moco y una disminucin de la adherencia Bcc (Sajjan et al., 2004b). La mutacin CFTR conduce a un defecto en la regulacin de la canal de iones de sodio (ENaC) y la combinacin de CFTR defectuosa con un aumento de resultados de la actividad CENa en un agotamiento de las vas respiratorias con superficie lquida. Esto, a su vez, se traduce en una reduccin de la altura de la capa de lquido por encima de las vas respiratorias clulas epiteliales que conducen a los cilios aplanado, y en consecuencia transporte reducido de la mucosa ya est deshidratado. Este que parece ser un sntoma primario tan pronto post mortem Los estudios mostraron que los recin nacidos tenan obstruccin va area de los bronquiolos terminales, antes de cualquier indicacin de infeccin o inflamacin (Zuelzer & Newton, 1949).

Otra funcin directa de la mutacin CFTR en la fibrosis qustica patognesis se ha atribuido a CFTR acta como un molcula de reconocimiento de patrones implicados en el aclaramiento de P.aeruginosa. La activacin celular y la estimulacin asociada del factor de transcripcin NF-kB estaba ausente en las clulas y ratones transgnicos con la mutacin DF508 (Schroeder et al., 2001). Las alteraciones en las clulas epiteliales de las vas respiratorias CF tambin han sido descritas que el compuesto an ms la cuestin de la susceptibilidad a la infeccin, proporcionando receptores para agentes patgenos que se adhieren a ellos.. CF vas respiratorias muestran un aumento de la sulfatacin molecular alta de las glicoprotenas de masa molecular, y, en particular, el aumento Azcares 6-sulfatados en CF mucinas (Xia et al., 2005). Si bien esto fue pensado originalmente para ser debido a una adquirida anormalidad, debido a la extensa inflamacin, que tiene tambin se ha demostrado que persiste en la cultura primaria y era un caracterstica determinada genticamente de CF vas respiratorias epiteliales clulas (No et al., 1997). Aumento fucosilacin y reducida sializacin son otras caractersticas de CF y son directamente relacionado con el defecto CFTR (Rhim et al., 2000). En en particular, en comparacin con las clulas no-CF CF clulas tienen una mayor relacin de asializacion GM1 (aGM1) a sialinizacion GM1, y ms clulas CF que las clulas no expresan CF superficie aGM1 (Saiman & Prince, 1993). Esto es significativo como P. aeruginosa y Bcc ambos se han reportado para enlazar a esta asializacion glicolpido (Krivan et al, 1988;. Saiman & Prince, 1993). Por otra parte, el aumento de fucosilacin y alteraciones en especfica residuos de fucosil de glicopptidos de membrana (Glick et al.,2001) tambin tienen relevancia en la microbiologa de la CF, por ejemplo, P. aeruginosa expresa una lectina que especficamente reconoce a1, 3/4 que contienen motivos de fucosa de CF epitelial clulas, lo que podra explicar, al menos en parte, la alta incidencia de ese patgeno en el pulmn CF (Mitchell et al., 2002). Por ltimo, recientemente se ha demostrado que la deficiencia de CFTR condujo a una reduccin de la actividad de la esfingomielinasa cida, lo que permite la acumulacin de ceramida en el tejido pulmonar (Teichgrber et al., 2008). Esto dio como resultado tanto una mayor inflamacin y aumento de la susceptibilidad a la infeccin por P. aeruginosa y aparecido a ser revertido por el tratamiento de ratones con amitriptilina. Las interacciones entre Bcc y receptores de la protena del epitelio pulmonar Despus de atrapamiento de Bcc en la capa mucosa, la adherencia del rganismo a la superficie epitelial es la primer paso en la interaccin clula husped. Se adhiere a Bcc a las clulas epiteliales a travs de protenas y receptores de glicolpidos, adems de las mucinas secretoras. En un primer estudio, 19 de los 22 aislamientos Bcc , se mostr a las mucinas purificadas (Sajjan et al, 1992.),

Sin embargo, la especiacin exacta de estos aislamientos no fue identificado. Los aislados que eran capaces de unin a mucinas secretoras expresaron el fenotipo pilus cable. El receptor de la clula epitelial para el cable pili asociado a la adhesina (una protena de 22 kDa) de cierta B. cepas cenocepacia fue identificado como citoqueratina 13, una Protena de 55 kDa que est enriquecido en las clulas epiteliales CF (Sajjan et al., 2000). La unin de piliated B. cenocepacia a zonas de pulmn de pacientes con FQ fue mayor que la de los otros B. cenocepacia asla mientras que otras especies dentro de la Interacciones Bcc con elcomplejo del epitelio pulmonar . el cual no mostr ninguna unin a zonas de pulmn con FQ. Sin embargo, la citoqueratina 13/22 k Da adhesina interaccin no era tan clara como pareca en un principio. Estudios posteriores mostraron que las cepas de B. cenocepacia que no presenten Cbl pili en su superficie en la eschericia coli pueden no ser suficientes para mediar la unin al receptor epitelial. Esta expresin combinada de la adhesina 22kDa y el Cbl pili fue requerida para una optima unin a la cytokeratina (Sajjan et al., 2001). A pesar de esto, el 22 kDa adhesina implicado en la unin todava puede tener un papel en patognesis, como el bloqueo de la cepa B. cenocepacia BC7 con anticuerpos previos a la infeccin de las clulas epiteliales reducen tanto citotoxicidad y la secrecin de IL-8 en cultivos primarios de las clulas epiteliales bronquiales (Sajjan et al., 2002). Curiosamente, este mecanismo de unin se limita a ciertas cepas de B. cenocepacia y no es frecuente entre los ET12 cepas. Ms recientemente, se ha surgido que B. cenocepacia cepa FC7 tambin se une a un segundo receptor de 55 kDa, a saber, el receptor de TNF 1 (TNFR1). Esta interaccin no utiliza los 22 kDa protena como una adhesina, pero se considera en parte responsable para la respuesta pro-inflamatoria potente provocada por este cepa virulenta Bcc (Sajjan et al., 2008). Queda por ver si TNFR1 es tambin un receptor para otros miembros de B. cenocepacia, o si se trata de un receptor ms general para otras especies dentro del complejo, como un todo. La adhesin de Bcc a los receptores de glicolpidos La segunda clase de receptores de la clula husped para la unin son receptores glicolpidos, aunque las pruebas en que glicolpidos estn involucrados son contradictorios. Krivan et al. (1988) demostraron que los miembros de la Bcc ounidos a glicoesfingolpidos que contiene secuencias GalNAcb1-4Gal ya sea terminal o internamente, incluyendo aGM1 y AGM2 (Tabla 1). Las mismas cepas no se unen a globosidos, que contener un terminal GalNAcb1-3 Gal secuencia, o a GM1 y GM2. Por el contrario, un informe posterior identific que una cepa no identificada de la B. cepa cenocepacia unido de manera ptima a los globotriosylceramides (Gb3, trihexoxylceramides), que contienen un galactosa no sustituido en el terminal, y mostr unin relativamente dbil para aGM1 y AGM2 (Sylvester et al., 1996). Mientras que los estudios anteriores (Krivan et al., 1988) te indic que no hubo unin a Gb3, la especie exacta de la cepa utilizada en este estudio no fue identificado, el cualpermite la posibilidad de que la unin glicolpidos pueden ser especfico de la especie. Ciertamente, la ausencia o presencia de Cbl pili afecta la afinidad a los receptores glicolipidos, sin embargo, el papel

fundamental de estos receptores en patognesis no se explor. El aGM1 glicolpido, que es un receptor para flagelos de la cepa P. aeruginosa PAO1, esta situado en la superficie apical de 16HBE14oepithelial polarizada clulas de pulmn y por lo tanto, est disponible para unin bacteriana (Adamo et al., 2004). Mientras tanto P. aeruginosa y Bcc han demostrado la unin a GM1, hay competencia por vinculante se observ entre estos dos patgenos en las clulas traqueales bovina, sino la unin de cepas Bcc fue mejorado en la presencia de P. aeruginosa sobrenadantes y clulas enteras (Saiman et al., 1990). Ha habido mucha controversia con respecto a la fijacin de P. aeruginosa a glicolpidos. P. aeruginosa tipo IV pili, se mostr a mediar la interaccin con aGM1 de rin epitelial polarizado las clulas, lo que resulta posteriormente en la citotoxicidad y la internalizacin de las bacterias (Comolli et al., 1999). Sin embargo, informes posteriores mostraron que P. aeruginosa clnica aislamientos no se unen aGM1 o AGM2 ya sea en las vas respiratorias y clulas epiteliales de rin o en forma purificada (Emam et al., 2006). Adems, el uso de anticuerpos antiGM1antibodies bloquean sitios de unin ha sido sugerido para ser apropiado, debido a la unin no especfica de estos anticuerpos a LPS y otros P. antgenos aeruginosa (Schroeder et al., 2001). En epitelios polarizados , aGM1 est generalmente presente en un bajo nivel en la superficie apical de las clulas en buen estado sana; Sin embargo, este receptor vuelve a estar disponible despus de la lesin o en los epitelios de FQ (de Bentzmann et al, 1996;. Saiman y Prince, 1993), proporcionando receptores mejoradas a CF patgenos. Otros patgenos tambin explotan receptores glicolpidos; por ejemplo, la toxina Shiga-like se une a varios Gala1- Receptores glicolpidos 4Gal que contienen, como Gb3 (Samuel et al., 1990), mientras que uropatgeno E. coli utiliza al menos cuatro globosidos como receptores, incluyendo los Gb3 y Gb4 (Stapleton et al., 1998). Adems, estos glucolpidos pueden provocar intracelular sealizacin, provocando as la respuesta inflamatoria. Las balsas de lpidos son dominios de la membrana pequeas compuestas de glucoesfingolpidos y colesterol, que desempean un papel en la interacciones husped-patgeno entre muchas bacterias, incluyendo P. aeruginosa y E. coli, que incluye tanto internalizacin y la induccin de citoquinas como se revis por Riethmuller et al. (2006). Las clulas epiteliales del pulmn polarizadas que fueron estimulados con la cepa de P. aeruginosa PAO1 movilizado TLR2 a la superficie apical junto con aGM1 (Soong et al., 2004). La interaccin de los patgenos con este Glicolpidos puede sen central a la respuesta pro inflamatoria intensa . Implicaciones teraputicas de la adhesin Aclarar la unin de Bcc a las clulas husped epiteliales se permite el desarrollo de estrategias de lucha contra la adherencia y debe tambin permitir un mejor desarrollo de la vacuna. Tres estudios tienen examinado el potencial para la inhibicin de la adhesin de las cepas de Bcc con hidratos de carbono. Los dextranos inhibi la unin de una gama de especies Bcc a las clulas A549, pero tena una relativamente menor efecto en Cbl cepas + B. cenocepacia (Chiu et al.,

2001). El uso de dextranos de alto peso molecular de masa y un azcar alcohol, xilitol, tambin se sugiri como un medio de inhibir adherencia de Bcc antes o despus de un trasplante de pulmn (Sajjan et al., 2004a). En ambos casos, la inhibicin era no especfico, sin embargo, en el ltimo caso se sugiri que la inhibicin de la adherencia era indirectamente asociado con la eliminacin o alteracin de la superficie del moco. Thomas & Brooks (2004) demostraron que un nmero de di-y tri-sacridos (incluyendo GalNAcb13 Gal, GalNAcb1-4Gal, NeuAca2-3Galb1-4Glc) inhibi la unin de la cepa de B. cenocepacia 9091 a A549 epiteliales clulas en un 80%. Adems, los polisacridos tales como dextrano, sulfato de dextrano y heparina tambin redujeron archivo adjunto en la misma medida. La amplia gama de sacrido estructuras que se han encontrado para inhibir la unin fue sugerido que se debe al requisito de Bcc para adjuntar a muchas superficies ambientales. El potencial teraputico de los inhibicin de la unin de Bcc a las clulas pulmonares todava tiene que ser establecido, sin embargo, dextranos aerosol han reducido neumona en ratones cuando desafi con P. aeruginosa (Bryan et al., 1999). Adems, la carga neumoccica fue reducido y la proteccin de la bacteriemia fue conferido en un conejo modelo despus de la administracin de oligosacridos y derivados sialilados (Idnpn-Heikkila et al,. 1997). Si bien hay un largo camino por recorrer, sobre todo en evitar complicaciones tales como edema, basada en sacridos inhibidores de la adhesin pueden ser explotados como a terapias prevenir la infeccin con una alta resistencia a los antibiticos patgenos tales como Bcc. . Invasin intracelular de las clulas epiteliales Muchos estudios han demostrado que el Bcc puede invadir y sobrevivir dentro de las clulas epiteliales in vitro (Cieri et al, 2002;.. Duff et al, 2006; Martin & Mohr, 2000). Utilizando un panel de 29 cepas, una clara correlacin entre la invasin de las clulas A549 y infeccin in vivo en un modelo de ratn se ha demostrado en (Cieri et al., 2002). Invasin intracelular est mediada a travs de un vacuola de membrana despus de la alineacin inicial de bacterias a lo largo de la membrana epitelial (Fig. 2). Sin embargo,diferentes vas de invasin del epitelio pulmonar primaria culturas se han observado para varias especies de Bcc incluyendo la invasin como un biofilm, reordenamiento del citoesqueleto y destruccioin posterior de la celula penetracin a travs del epitelio por paracytosis (Schwab et al., 2002). Los flagelos funcionales son requeridos para la invasin pero no para la adherencia Nuestros estudios han mostrado tambin diferentes mecanismos de invasin de especies Bcc mediadas por receptores en ubicaciones distintas dentro de la polarizada clula epitelial (Duff et al., 2006). La lipasa juega un papel importante en la invasin del Bcc. El proceso de actina reordenamiento de B. cenocepacia fue confirmada por separados estudios, pero era comn a la vez viables y no viables bacterias (Sajjan et al., 2006). Las cepas de B. multivorans tambin promueven interrupcin de la red de filamentos de actina, y entrada de una sola clula y translocacin de cultivos primarios de Interacciones Bcc con el epitelio pulmonar y las clulas epiteliales del pulmn por B. multivorans se vio facilitada por la interrupcin de la actina n (Schwab et al., 2003). En contraste, intacta se requieren filamentos de actina

solamente para la entrada de biopelculas de B. multivorans, pero no para la entrada de una sola clula o paracytosis. Flagelos funcional se requiere para la invasin, aunque no parecen ser esenciales para la adhesin. No mvil mutantes de B. cenocepacia cepa J2315 con una interrupcin en cualquiera de los genes FliI FliG o ambos mostraron un tres a cuatro veces reduccin de la invasin de las clulas A549, que no se debi a una alteracin en la adherencia (Tomich et al., 2002). Por otra parte, la lipasa parece desempear un papel en la invasin de CCO (Mullen et al., 2007). El destino intracelular de la cepa B. cenocepacia K-562 despus de invasin ha sido examinado en la va area CF-derivado lnea celular epitelial IB3 (Sajjan et al., 2006). Las bacterias vivas evitar la digestin lisosomal por residir dentro endoplsmico autofagosomas retculo-derivado y replicacin en el retculo endoplsmico. En contraste, no viables K-562 las clulas fueron digeridos dentro de 6 h de la absorcin en las clulas epiteliales. Los efectores bacterianos de este proceso en otros patgenos pulmonares se han relacionado con el tipo sistemas de secrecin IV, por ejemplo, en Legionella pneumophila (Molofsky y Swanson, 2004). Translocacin a travs del epitelio Un factor importante a la mortalidad en los pacientes con FQ colonizados con Bcc es el desarrollo de bacteriemia en un subgrupo de los pacientes, as como su rpida disminucin posterior (Islas et al.,1984). Con el fin de lograr esto, Bcc tiene que penetrar a travs del epitelio pulmonar con el fin de obtener acceso a la sistema sanguneo. Bcc altera las uniones estrechas intercelulares y transloca desde el lado apical hacia el lado basolateral de las monocapas epiteliales intactas in vitro (Duff et al, 2006.;Kim et al., 2005). Los aislados de cuatro especies diferentes Bcc mostraron niveles comparables de translocacin, lo que demuestra que el potencial de causar septicemia no se limita slo a las dos especies ms virulentas (Duff et al., 2006). En tanto estudios, las protenas que se encuentran en un nudo apretado son interrumpidas . La expresin de ZO-1 se redujo en las clulas Calu-3 siguiendo Aplicacin Bcc, mientras que en 16HBE14o-clulas, la t ranslocacin fue acompaado por la desfosforilacin de ocludina y su la eliminacin de la unin estrecha (Duff et al, 2006;. Kim et al., 2005). Sobrenadantes libres de clulas slo contribuyeron parcialmente a este efecto, y la lipasa, que se produce en grandes cantidades por los miembros del complejo, no alterararon la integridad de la unin estrecha de Calu-3 clulas (Mullen et al., 2007). Interrupcin del apretado nudo es tambin un mecanismo de patognesis y la translocacin de otras bacterias, incluyendo Salmonella enterica y E. coli enteropatgenas (Jepson et al, 2000;. Simonovic et al, 2001).. P. aeruginosa tambinaltera la integridad de la unin estrecha y se transloca a travs epitelios de las vas respiratorias por un mecanismo asociado con ramnolpido la secrecin y la incorporacin dentro de la membrana de la clula husped membrana (Zulianello et al., 2006). En contraste, la translocacin de Mycobacterium tuberculosis a travs de bicapas clulas epiteliales y endoteliales est mediada primero por la invasin de clulas epiteliales (Bermdez et al., 2002).

Implicaciones teraputicas de la invasin y translocacin epitelial de Bcc La capacidad de Bcc de invadir, a superar la degradacin celular y trasladar a travs del epitelio tiene implicaciones para el desarrollo de futuras terapias con antibiticos. Ser importante considerar organismos intracelulares y los que han penetrado ms all del epitelio en la lucha contra la infeccin persistente Bcc crnica.

Factores de virulencia Adems de los procesos de unin y la invasin, Bcc produce factores de virulencia que mejoran su patogenicidad en las clulas epiteliales (Tabla 2). Los que no estn directamente relacionados con la interaccin de clulas epiteliales se describen en otro aparte por lo tanto no se incluyen a continuacion

La lipasa La Burkholderia gnero es uno de los ms importantes en la produccin de lipasa en trminos de la biotecnologa aplicaciones, y aunque las lipasas se identificaron en Bcc aislados ya en 1984 (McKevitt & Woods, 1984), poco se saber acerca de su papel en la patognesis. Una via de secrecin de tipo II se ha identificado para la secrecin de lipasa, que al igual muchas de las vas de secrecin de tipo II est bajo quorum sensing de control (Weingart y Hooke, 1999), aunque su regulacin en Bcc es independiente del sistema de deteccin de qurum cepIR (Gotschlich et al., 2001). Expresin lipasa entre los aislamientos de Bcc es ms alto entre las cepas de B. multivorans seguido por B. cenocepacia (Mullen et al., 2007). Adems, el tratamiento de cepas con un inhibidor de la lipasa especfica redujeron el posibilidad de invasin, lo que sugiere que la lipasa juega un papel en la invasin de las clulas epiteliales del pulmn. Otros patgenos tambin utilizar lipasa como un factor de virulencia. La lipasa de Entamoeba histolytica tambin mejora su invasin y colonizacin intestinal (Gilchrist et al., 2006). La lipasa tambin juega un papel en la patognesis de otros diversos patgenos, incluyendo Helicobacter pylori y el Propionibacterium acnes (Miskin et al, 1997;. Piotrowski et al, 1994).. Metaloproteasas Metaloproteasas bacterianas pueden desempear un papel en la patognesis de patgenos pulmonares como Bcc . Bcc cepas secretan metaloproteasas de zinc extracelulares que pueden desempear un papel en la virulencia (Corbett et al., 2003). Uno de stos, ZmpA, tiene han identificado en cinco especies de la Bcc incluyendo B. cenocepacia, pero no en otras especies, incluyendo B. multivorans o B. dolosa (Gingues et al., 2005). Otro, ZmpB, es proteolticamente activo contra muchas protenas que se encuentran en el matriz extracelular, incluyendo el colgeno tipo IV y fibronectina, y en contra de los miembros clave del sistema inmune, incluyendo neutrfilos a-1 inhibidor de la proteinasa y interferonc, ilustrando su potencial de dao al tejido pulmonar y de acogida respuesta (Kooi et al., 2006). Muchos otros patgenos, para S. McClean y M. Callaghan 6 Journal of Medical Microbiology 58

ejemplo, Vibrio cholerae, metaloproteinasas que secretan causar una prdida de la resistencia transepitelial en epitelial monocapas (Fullner et al., 2001). P. aeruginosa virulencia factores, elastasa ms probable, se ha demostrado que overactivate metaloproteasa de acogida y evitar la formacin de TJ durante reparacin (de Bentzmann et al., 2000). Las metaloproteasas son tambin upregulated en el pulmn con FQ (Lpez-Boado et al., 2001), el cual puede agravar an ms el problema. Las serina-proteasas Otra proteasa, HtrA, una serina proteasa periplsmica, recientemente se ha identificado como un factor de virulencia en B. cenocepacia cepa K-562 (Flannagan et al., 2007). previamente ha demostrado que es importante para invasin intracelular y la virulencia en Legionella pneumophila y Listeria monocytogenes (Pedersen et al, 2001.; Wilson et al., 2006). En general, htrAnegativo K-562 mutantes fueron incapaces de sobrevivir en una infeccin de pulmn de la rata modelo. Una proteasa de serina tambin se ha demostrado ser responsable de la capacidad de B. cenocepacia para utilizar ferritina como una fuente de hierro. Ferritina, no previamente determinado entre otras bacterias patgenas como una plancha fuente, ha sido identificado como una fuente de Bcc (Whitby et al., 2006). La capacidad de utilizar el hierro de la ferritina, la cual puede secuestrar ms de 4.000 tomos de hierro, representa un ventaja significativa para Bcc, como el pulmn CF los niveles de ferritina significativamente ms altos que el de pulmn no de CF (Whitby y col., 2006). LPS El LPS de Bcc es distinta de la de otros Gram-negativas bacterias debido a las diferencias en ambos ncleo oligosacrido y la fraccin de lpido A (Silipo et al., 2007). Se juega un doble papel en patogenia: contribucin a la resistencia pptido antimicrobiano y la promocin de una respuesta pro-inflamatoria potente (Bamford et al., 2007). Sus interacciones no se limitan a sede de clulas inmunes; B. cenocepacia LPS inducida por IL-8 secrecin en las clulas epiteliales de las vas respiratorias y se demostr que era ms potente de LPS de P. aeruginosa (Reddi et al., 2003). Otros factores de virulencia potenciales necesitan ser estudiados adems de investigar el papel exacto que desempean en patognesis y si interactan con el pulmn epitelio. Por ejemplo, electroforesis en dos dimensiones estudios han identificado la prdida de un hidroperxido subunidad reductasa, una protena relacionada con el estrs, en un B. cenocepacia variante de cepa que fue ms persistente en un modelo de ratn (Chung y Speert, 2007). Esta variante tambin mostr la motilidad amplificado. El vnculo entre protenas reguladoras del stress y persistencia Bcc in vivo an no ha sido explorado a fondo. Consecuencias de los factores de virulencia para la terapia potencial contra Bcc Los factores de virulencia tales como metaloproteasas se estn considerados como objetivos para el desarrollo de vacunas.

La inmunizacin de ratas con una metaloproteasa de zinc conservada pptido disminuye la gravedad de la infeccin Bcc (Corbett et al., 2003). Tambin se demostr que el pptido eptopos de P. aeruginosa elastasa disminuy dao pulmonar por 70% (Sokol et al., 2000). Adems, el dao pulmonar fue reduccin de 50% en el desafo con una cepa Bcc despus la inmunizacin con estos pptidos. Recientemente, una potencial vacuna se ha descrito que es un trisacrido basado en la unidad de repeticin de un polisacrido en el LPS de un aislado clnico de B. cepacia (Faure et al., 2007). Modelos para el estudio de la interaccin de clulas epiteliales Modelos de clulas epiteliales Invasin intracelular de las clulas epiteliales del pulmn es un simple modelo que ha sido ampliamente utilizado para examinar la virulencia y las interacciones epiteliales de cepas CCO (Caraher et al., 2007a; Martin & Mohr, 2000). Se basa en el asesinato de bacterias extracelulares y la proteccin de intracelular las bacterias de los antibiticos. Como se mencion anteriormente, Se encontr correlacin entre la invasin de las clulas epiteliales y la infeccin in vivo en un modelo de ratn (Cieri et al., 2002) Una limitacin que de vez en cuando se cit para este tipo de ensayo es la resistencia intrnseca a antibiticos de cepas Bcc Sin embargo, esto se puede superar fcilmente por validacin previa del ensayo para garantizar que todas las cepas a examinar estn muertas tras el tratamiento antibitico que se utiliza clulas epiteliales de pulmn tambin representan un buen modelo para el estudio de la interacciones con las clulas husped, incluyendo la interrupcin de la integridad de la unin estrecha epitelial y translocacin (Duff et al, 2006;. Kim et al, 2005).. Calu-3 clulas y 16HBE14ocells estn bien caracterizados y la forma diferenciada epitelial monocapas cuando se cultivan sobre soportes semipermeables en condiciones bien definidas. El grado de diferenciacin de las clulas epiteliales de las vas es importante en la interpretacin de estos tipos de estudios. Mientras que las clulas A549 representar un modelo til para comparar el potencial invasivo de una gama de cepas, que no polarizan o forman fcilmente monocapas epiteliales ajustados y por lo tanto, no es ideal para estudios sobre el mecanismo de invasin o destino bacterial (Duff et al., 2006). La polarizacin y la unin estrecha formacin ha tenido efectos significativos en estudios realizados sobre P. aeruginosa. Las clulas que no eran polarizada y no tienen uniones estrechas intactos fcilmente internalizados P.aeruginosa, mientras que no se observaron bacterias dentro de las clulas que tenan uniones estrechas intactos (Plotkowski et al., 1999). Clulas epiteliales polarizadas tambin se pueden utilizar para examinar la destino intracelular de las cepas Bcc internalizados (Sajjan et al., 2006). Clulas epiteliales de pulmn primarias Las clulas epiteliales del pulmn primarios son el modelo ms potente para el examen de las interacciones husped-epiteliales a nivel molecular y el nivel celular. En particular, los experimentos comparativos entre las clulas de

pulmn de pacientes con FQ y clulas de pulmn de personas sin FQ son tiles para discernir las interacciones involucradas en la patognesis microbiana. Una limitacin de este tipo de trabajo es el acceso a pulmn de buena calidad tejido, generalmente aislado en el momento del trasplante. En Adems, la obtencin de tejido CF estril es particularmente difcil. Cuando aisladas y cultivadas en filtros, la primarias clulas epiteliales diferenciadas retienen su ciliado mucusproducing fenotipo para un mximo de 2-4 semanas (Schwab et al., 2002). Otros modelos utilizados para examinar las interacciones husped de Bcc El elegans modelo de muerte celular Caenorhabditis ha sido utilizado para identificar el papel de un sistema de percepcin de qurum y para examinar el papel de los sistemas de secrecin tipo III de Bcc (Huber et al, 2004;. Markey et al, 2006.). Ms recientemente, larvas de Galleria mellonella se han utilizado para determinar la la virulencia de las cepas de CCO en vivo (Seed & Dennis, 2008). Ambos sistemas han sido bien caracterizados y son especialmente adecuado para el examen de la respuesta inmune innata a patgenos o factores de virulencia, pero son poco probable que sea adecuado para el estudio de las interacciones en la interfaz epitelial. Rata de agar modelos de taln y modelos de taln de agar murinos tienen ha utilizado para evaluar la virulencia de los aislados y Bcc especies. El modelo de grano de agar de rata se ha usado, por ejemplo, para examinar el papel de HtrA como un factor de virulencia (Flannagan et al., 2007). Ambos modelos de rata y de ratn tienen una ventaja sobre las larvas de insectos y nematodos en que el interacciones con el epitelio pulmonar y otras clulas husped pueden ser examinado a nivel microscpico. En la infeccin Bcc reciente estudios, los (gp91phox2 / 2) ratones con EGC tambin representaron una buen modelo para la evaluacin de la virulencia Bcc (Sousa et al., 2007). En particular, la comparacin de cepas virulentas con mutantes de factores de virulencia tales como EPS y qurum deteccin mostr diferencias significativas en trminos de supervivencia tiempo, c.f.u. aisladas en el pulmn y la tasa de mortalidad entre cepas virulentas y no virulentas. A pesar de las limitaciones en la modelo fueron identificados como una falta de compartimentacin de infeccin y la depuracin mucociliar funcionamiento, parece para ser adecuado para la comparacin de los factores de virulencia. Observaciones finales La eleccin de los aislados y cepas utilizadas en estos estudios es la clave para el xito elucidacin de los mecanismos de patognesis de la Bcc en pacientes con FQ. Una vez que un particular, mecanismo ha sido observado y examinado en detalle utilizando un aislado, los estudios deben ampliarse para incluir clnica aislados de una especie individual y tambin para incluir otros especies dentro del complejo. A pesar de que, la

el resultado clnico de la infeccin por Bcc es difcil de predecir en grupos de pacientes con CF infectados con la misma cepa epidmica (Govan y Nelson, 1993) debido a la funcin de hospedador mltiple factores, destacando la necesidad de terapias que previenen colonizacin. En general, estos tipos de investigaciones permitirn el desarrollo de tratamientos no antibiticos alternativos contra mltiples especies Bcc y ser beneficioso en la mejora de la calidad de vida de las personas con FQ.