Prctica 1

Fermentacin de carbohidratos por la levadura Sacharomyces cerevisiae

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PACHUCA

LABORATORIO DE FISFER
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FERMENTACIONES INDUSTRIALES

PRCTICA 1: Fermentacin de carbohidratos por la levadura Sacharomyces cerevisiae

M. en C. Jorge lvarez Cervantes

GRUPO: 27265

INTEGRANTES Hernndez Hernndez Yenni Leidy Luna Valdez Mara Ofelia Marcelino Prez Gabriel Reyes Mata Silvia Denisse Snchez Martnez Rosa Gloria

FIRMA

MAYO AGOSTO 2013

FECHA DE ELABORACION DE LA PRCTICA: 22 DE MAYO DE 2013 FECHA DE ENTREGA DEL REPORTE: 29 DE MAYO 2013

Ingeniera en Biotecnologa

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Fermentacin de carbohidratos por la levadura Sacharomyces cerevisiae

INTRODUCCIN La fermentacin es el catabolismo anaerobio de un compuesto orgnico en el que el compuesto sirve tanto de donador de electrones como de aceptor como de aceptor de electrones, y en el que el ATP se produce normalmente por fosforilacin a nivel del sustrato (T. Madigan et al. 2009). El proceso de fermentacin es producido por accin de las enzimas, lo cual conlleva cambios qumicos en las sustancias orgnicas (Y. Stanier, 2005). Son diversos los productos que se pueden obtener de una fermentacin tales como: Alcoholes y solventes: acetona, butanol, 2,3-butanodiol, etanol, glicerol. cidos orgnicos: actico, ctrico, fumrico, glucnico, itacnico, lctico. Aminocidos: lisina, metionina, triptfano, valina. Antibiticos: bacitracina, Esteptomiciana, neomicina, penicilina, riboflavina. Esteroides: cortisona, hidrocortisona, testosterona, etc. (Garca Garibay, 2005) Las levaduras son organismos vivos, vegetales microscpicos de una sola clula, ms especficamente hongos, crecen bien en un medio constituido por aun azcar, fosfatos y extracto de lavadura. El pH ms favorable para ella se encuentra entre 3-5 y 4-5. Tambin es posible clasificar a las fermentaciones por la presencia o ausencia de oxigeno molecular durante el proceso. Los procesos se pueden denominar, fermentacin aerobia y anaerobia. (M. Prescott, 2002).

En la fermentacin aerobia, el aceptor final de electrones es el oxgeno; su presencia implica el desarrollo del microorganismo y la produccin del compuesto fundamental biomasa, dixido de carbono y agua. Mientras que la fermentacin anaerobia, el proceso de produccin del metabolito de inters se desarrolla en ausencia de oxigeno; los productos finales son sustancias orgnicas, en este proceso los microorganismo producen mucho menor energa que los aerobias y por suplir sus necesidades de energa metabolizan mayor cantidad de azucares, por tanto elaboran ms metabolitos, por lo que controlar la presencia de oxgeno para incrementar la produccin (Pares Arras, 2002). Es de gran importancia conocer las rutas bioqumicas de degradacin de compuestos orgnicos, ya que ello ayuda a determinar que compuestos se obtendr, sino tambin por la posibilidad de manipular el proceso. Existen varias rutas, sin embargo nicamente las ms relevantes son la dela glucolisis (Va Embden-Meyerhof-Parnas), el ciclo de Krebs que ayudan a transportar electrones durante el metabolismo aerobio y la cadena respiratoria (T. Madigan, M. Martinko, V. Dunlap, & P. Clark, 2009). Ingeniera en Biotecnologa Fermentaciones Industriales

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En la elaboracin del pan las levaduras transforman el almidn (un azcar complejo) en glucosa. Lo hacen mediante la enzima amilasa (otras enzimas: glucosidasas y amiloglucosidasas). La mayor parte de los azcares que desdobla la levadura los utiliza la propia levadura para vivir y desarrollarse, y otra parte quedan en la masa del pan, dndole parte de su sabor y el color dorado del horneado (Garca Garibay, 2005). OBJETIVO
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Determinar el sustrato (carbohidratos) a que la levadura Saccharomyces cerevisiae metaboliza ms rpidamente tenindola a diferentes temperaturas (ambiente y 37 C) y al mismo tiempo entender el cambio que sufren las molculas de los carbohidratos. HIPTESIS La fermentacin que se llevar a cabo depender directamente del tipo de carbohidrato, su asimilacin por el microorganismo y las distintas temperaturas a las que se sometern. METODOLOGA MATERIALES 5 vasos de precipitado de 50 ml 2 vasos de precipitados de 600 ml 1 vaso de precipitados de 150 ml Termmetro 16 tubos de fermentacin 1 vidrio de reloj 1 probeta de 100 ml 1 parrilla de calentamiento 1 gradilla 1 esptula 1 propipeta 5 pipetas de 10 ml REACTIVOS 90 ml Agua destilada 60 ml Lactosa 60 ml Almidn 60 ml Sacarosa 60 ml Glucosa

MICROORGANISMOS 9g de Sacharomyces cerevisiae.

PROCEDIMIENTO: 1) Activacin de la levadura

Se pesan 9g de levadura

Se activa en 90 ml de H2O a 37C

Levadura activada a 37C

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2) Fermentacin de Glucosa

Glucosa Se toman 15 ml de glucosa

Se vaca 15 ml de glucosa en 4 tubos

Se agrega 5 ml levadura

2 tubos a temperatura ambiente 2 tubos a 37 C Mezclar 5 ml de levadura en los 4 tubos con glucosa

Medir el CO2 en cm (la burbuja que se form) 5 minutos despus

Repetir medicin a 0, 15, 30 y 45 minutos

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3) Fermentacin de Almidn

Almidn
Se toman 15 ml de almidn Se vaca 15 ml de almidn en 4 tubos Se agrega 5 ml levadura

2 tubos a temperatura ambiente 2 tubos a 37 C Mezclar 5 ml de levadura en los 4 tubos con almidn

Medir el CO2 en cm (la burbuja que se form) 5 minutos despus

Repetir medicin a 0, 15, 30 y 45 minutos

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4) Fermentacin de Sacarosa

Sacarosa Se toman 15 ml de sacarosa Se vaca 15 ml de sacarosa en 4 tubos Se agrega 5 ml levadura

2 tubos a temperatura ambiente 2 tubos a 37 C Mezclar 5 ml de levadura en los 4 tubos con sacarosa

Medir el CO2 en cm (la burbuja que se form) 5 minutos despus

Repetir medicin a 0, 15, 30 y 45 minutos

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5) Fermentacin de Lactosa

Lactosa Se toman 15 ml de lactosa Se vaca 15 ml de lactosa en 4 tubos Se agrega 5 ml levadura

2 tubos a temperatura ambiente 2 tubos a 37 C Mezclar 5 ml de levadura en los 4 tubos con sacarosa

Medir el CO2 en cm (la burbuja que se form) 5 minutos despus

Repetir medicin a 0, 15, 30 y 45 minutos

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RESULTADOS En la presente practica se llev a cabo la fermentacin de azucares (glucosa 10%, sacarosa 10%, lactosa 10% y almidn 10%) por la levadura Saccharomyces cerevisiae en diferentes temperaturas que fueron a temperatura ambiente y a 37 C. Tabla 1. Tiempo y produccin de CO2 por Saccharomyces cerevisiae al metabolizar glucosa. GLUCOSA Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo A 0 0.7 4.1 7.2 9.5 Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo B 0 2.5 4.5 7.6 8.9 Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo C 0 0.3 1.2 3.3 5.4

Tiempo (minutos) 0 5 15 30 45

Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo D 0 0.6 1.1 3 5.1

Saccharomyces cerevisiae en Glucosa

10 9 8 7 CO2 (cm2) 6 5 4 3 2.5 2 1 0 0 0 0.7 0.6 0.3 10 1.2 1.1 4.5 4.1 3.3 3 5.4 5.1 7.6 7.2 9.5 8.9 Tubo A a 37 C Tubo B a 37 C Tubo C a temp. Ambiente Tubo D a temp. Ambiente

20

30

40

50

Tiempo (minutos)

Figura 1.- Produccin de CO2 a dos diferentes temperaturas en determinado tiempo.

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Tabla 2. Tiempo y produccin de CO2 por Saccharomyces cerevisiae al metabolizar sacarosa. SACAROSA Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo A 0 2.3 5 6.7 6.9 Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo B 0 2.2 4.4 5.6 6.2 Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo C 0 0.5 1.5 2.7 3.4 Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo D 0 0.8 1.3 4 4.2

Tiempo (minutos) 0 5 15 30 45

Saccharomyces cerevisiae en Sacarosa

8 7 6 5.6 5 CO2 (cm2) 4 3 2 1 0 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (minutos) 2.3 2.2 1.5 1.3 0.8 0.5 5 4.4 4 4.2 3.4 2.7 6.9 6.2 Tubo A a 37 C Tubo B a 37 C Tubo C a temp. ambiente Tubo D a temp. ambiente 6.7

Figura 2.-Produccin de CO2 a dos diferentes temperaturas en determinado tiempo.

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Tabla 3.- Tiempo y produccin de CO2 por Saccharomyces cerevisiae al metabolizar Lactosa. LACTOSA Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo A 0 0 0.2 0.4 0.5 Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo B 0 0 0.1 0.3 0.35 Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo C 0 0 0 0.1 0.15 Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo D 0 0 0 0.1 0.2

Tiempo (minutos)

0 5 15 30 45

Saccharomyces cerevisiae en Lactosa

0.6 Tubo A a 37 C Tubo B a 37 C 0.5 0.5 Tubo C (Ambiente) Tubo D (ambiente) 0.4 CO2 (cm2) 0.4 0.35

Figura 3.-Produccin de CO2 a dos diferentes temperaturas en determinado tiempo.

0.3 0.3

0.2

0.2

0.2 0.15

0.1

0.1

0.1

0 0

0 10

0 20 30 40 50 Tiempo (minutos)

Figura 3.-Produccin de CO2 a dos diferentes temperaturas en determinado tiempo.

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Tabla 4. Tiempo que tardo la levadura en consumir el Almidn. ALMIDN Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo A Cantidad de CO2 producido (cm2) a 37 C tubo B Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo C Cantidad de CO2 producido (cm2) a temperatura ambiente tubo D

Tiempo (minutos)

No se observ produccin de CO2 en las dos diferentes temperaturas durante los 45 minutos que dur el experimento por este sustrato.

Tabla 5. Balance energtico de azucares fermentados por levaduras Azcar Estequiometria Energa libre 1. Etanol/CO2= Glucosa 238.8 kJ/mol de glucosa fementada. Sacarosa Sacarosa fosforilasa -D-glucosa + 1-Pfructosa Al deshacerse el disacrido se obtienen -Dglucosa + 1-P-fructosa los cuales son introducidos rpidamente a la va de la glucolisis obtenindose el doble de productos que con una sola molcula de glucosa. 2. Etanol/CO2= 477.6 kJ/mol de sacarosa fementada.

Lactosa

-Galactosidasa + H2 O (Galactosa + Glucosa)

Al igual que la sacarosa pasa lo mismo con la lactosa se obtienen dos monosacridos que son galactosa y glucosa, solo que aqu hay una diferencia ya que la galactosa lleva a cabo una serie de trasformaciones que se muestran en la imagen 4 hasta llegar -D-glucosa-6-fosfato para entrar a la ruta de la glucolisis.

3. Etanol/CO2= 477.6 kJ/mol de lactosa fementada

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Figura 4. Transformaciones de la Galactosa para entrar a la va de la Glucolisis. (M. Prescott, 2002)

DISCUSIN En la Figura 1 se muestra la grfica de produccin de CO2, la cual fue construida con los datos de la Tabla 1 y se observa una mayor eficiencia de fermentacin de la Glucosa a 37 C que a temperatura ambiente al igual que cualquier otro carbohidrato probado en esta prctica ya que se obtuvo hasta 9.5 cm2 de CO2 resultado de la fermentacin de la glucosa en 45 minutos , debido a que es el azcar que metaboliza preferentemente las levaduras del genero Saccharomyces aunque en algunos casos prefiere fructosa como las levaduras del vino. Otras fuentes de carbono que puede utilizar Saccharomyces cerevisiae son: maltosa, sacarosa, maltiotriosa, galactosa, suero hidrolizado y en algunos casos particulares puede utilizar etanol (Owen P. , 1989). El rendimiento

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terico posiblemente obtenido por gramo de glucosa es de 0.51 g de etanol y 0.49 g de CO2. Y si el rendimiento quiz no se obtuvo porque no se tuvieron las condiciones ptimas como los son la velocidad de fermentacin que aumenta generalmente entre los 15 y los 35 C y nuestra temperatura utilizada fue de 37 C. Otro factor que pudo afectar el experimento fue que no se midi el pH y es indispensable para la formacin de subproductos el cual debe estar en un rango de entre 3-6 que son favorables para la actividad fermentara (T. Madigan et al. 2009). Sacarosa fue el segundo carbohidrato en mostrar una buena fermentacin a 37 C, obteniendo una mxima produccin de CO2 de 6.9 cm2 en 45 minutos, estos datos se visualizan en Tabla 2, en la Figura 2 se observa la produccin gradual de CO2 conforme trascurre el tiempo con y sin temperatura. Esta no fue tan eficiente como la glucosa, ya que para llevar a cabo la fermentacin tuvo que excretar una enzima para poder hidrolizar al disacrido (glucosa y fructosa conforman a la sacarosa), en este caso la enzima que excreto fue una invertasa, para que despus los monosacridos (glucosa y fructosa) sean transportados a travs de la membrana celular ya sea por transporte activo o pasivo en donde intervienen permeasas producidas constitutivamente o inducibles para despus entrar a la va de Embden-Meyerhof en el caso de la glucosa y para la fructosa a la va de la pentosas fosfato para despus incorporarse a la va de EmbdenMeyerhof (T. Madigan et al. 2009). Los datos arrojados en el experimento con Lactosa mostrados en la Figura 3 y Tabla 3 nos dicen que Saccharomyces cerevisiae metaboliza la Lactosa en mnimas proporciones casi nada a 37 C y mucho menos a temperatura ambiente, pero Owen P. en 1989 reporta que Saccharomyces cerevisiae puede fermentar la lactosa, debido q que tiene un sistema lactosa permeasa para transportar la lactosa dentro de la clula, donde se hidroliza a glucosa y galactosa, que entran a la va de la glucolisis. Probablemente no se obtuvieron estos resultados causados por las condiciones de temperatura y pH explicados anteriormente. En el caso del almidn no se observ produccin alguna de CO2 con y sin temperatura (37C) debido a que las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar el almidn y las dextrinas (T. Madigan et al. 2009). Por lo cual, el empleo de materiales basados en almidn para la fermentacin alcohlica requieren la accin de enzimas extracelulares como las y -amilasas (glucoamilasas) y pululanasas (Owen P. , 1989). CONCLUSIN

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CUESTIONARIO

1) Menciona las diferencias entre la fermentacin alcohlica y lctica La fermentacin lctica ocurre en algunas bacterias y gracias a este proceso obtenemos productos de origen lcteo tales como yogurt, crema agria y quesos. Este proceso sucede tambin en el msculo esqueletal humano cuando hay deficiencia de oxgeno, como por ejemplo, durante el ejercicio fuerte y continuo. La acumulacin del cido lctico causa el dolor caracterstico cuando ejercitamos los msculos excesivamente. Se realiza por las bacterias del cido lctico gracias a la presencia de una enzima, llamada lactato deshidrogenasa. En este tipo de fermentacin es el cido pirvico producto de la gluclisis, el que acepta los electrones y se convierte en cido lctico. En la fermentacin alcohlica suceden dos reacciones consecutivas:

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cido pirvico Acetaldehdo CO2 Acetaldehdo + NADH+H+ Etanol + NAD+

Este tipo de fermentacin ocurre en levaduras, ciertos hongos y algunas bacterias, producindose CO2 y alcohol etlico (etanol). Las molculas de glucosa (presentes en la masa) sufren gluclisis originando cido pirvico, este cido pirvico en condiciones anaerbicas se descarboxila para transformarse en acetaldehdo, el cual se reduce a alcohol etlico por accin del NADH2 convirtindose as en el aceptor final de los electrones del NADH obtenido en la gluclisis. La diferencia entre estas fermentaciones inicia desde el microorganismo, debido a que la fermentacin alcohlica es llevada por levaduras y bacterias, mientras que la fermentacin lctica es llevada por bacterias. (M. Prescott, 2002) Los productos al fin de la fermentacin en la alcohlica se obtiene etanol, CO2 y 2ATP, mientras que la fermentacin lctica depende si es homofermentativa se obtiene 2 lactatos y 2 ATP, si heterofermentativa se obtendr 1 ATP, 1 lactato, 1 etanol y 1 CO2 por una molcula de glucosa fermentativa. (Respiracion Celular , 2010)

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Figura 5. Ruta de la gluclisis

Figura 6. Fermentacin alcohlica 2) En trminos evolutivos Cul de las dos rutas debi surgir primero? La fermentacin alcohlica, debido a que hace 3,500 millones de aos la atmosfera de la Tierra contena muy poco oxgeno, por lo cual los organismo primitivos surgieron en una atmosfera sin oxgeno, desarrollaron un mecanismo bioqumico sencillo y primitivo de produccin de energa libre sin necesidad de este elemento, Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2). (Macias, 2008)

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3) Cul es el propsito de la fermentacin? El propsito de la fermentacin es que los microorganismos produzcan metabolitos o biomasa a partir de la utilizacin de sustancias orgnicas en ausencia o presencia de oxgeno. La descomposicin de los sustratos se llevara a cabo por enzimas producidas por microorganismos para la finalidad. (Hernandez, 2009) 4) Qu pasara si en vez de llevar a cabo la fermentacin lctica que nosotros llevamos utilizramos la fermentacin alcohlica? Tendramos que cambiar el microorganismo por que la fermentacin alcohlica es llevada por levaduras y bacterias, mientras que la fermentacin lctica es llevada por bacterias. Lo que pasara seria la obtencin de productos en la fermentacin lctica, obtendramos ATP, lactato, etanol y CO2 mientras que en la alcohlica obtenemos ATP, alcohol y CO2. (Respiracion Celular , 2010) 5) En qu parte de una clula Eucariota debe ocurrir la fermentacin? En el citosol, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energa. (Planeta Saber, 2012) BIBLIOGRAFA Planeta Saber (2012). Clulas Eucariotas. Recuperado el 28 de Mayo de 2013, de http://www.planetasaber.com/celulas_eucariotas/biology/32456/ Garca Garibay, M. (2005). Biotecnologa alimentaria. Mxico: Limusa. Hernandez, A. (2009). Microbiologia Industrial . Argentina . M. Prescott, L. (2002). Microbiologa. Madrid: McGraw-Hill. Macias, E. B. (2008). Fermentacin por Saccharomyces cerevisae de algunos tipos de glsidos. Congreso de la Investigacin, 2-3. Owen P. , W. (1989). Biotecnologa de la Fermentacin. (M. Calvo Rebollar, Trad.) Madrid, Primera Edicin: ACRIBIA, S. A. Pares Arras, R. (2002). Bioqumica de los microorganismos. Barcelona:REVERT,S.A. Respiracion Celular . (14 de Marzo de 2010). Recuperado el 28 de Mayo de 2013, de http://academic.uprm.edu/~jvelezg/lab8.pdf T. Madigan, M., M. Martinko, J., V. Dunlap, P., & P. Clark, D. (2009). Biologa de los microorganismos (Duodcima Edicin ed.). Barcelona: PEARSON EDUCACIN, S.A. Y. Stanier, R. (2005). MICROBIOLOGA (SEGUNDA EDICIN ed.). Barcelona: REVERT, S. A.
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