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Hemostasia Veterinria

Regina Kiomi Takahira

TCNICAS - EXAMES LABORATORIAIS


HEMOSTASIA PRIMRIA CONTAGEM DE PLAQUETAS: A contagem realizada em cmara de Neubauer, utilizando como diluente uma soluo de oxalato de amnio a 1% (lquido de Brecher). Preencher a pipeta de Thoma para glbulos vermelhos com sangue homogeneizado at a marca 1 Limpar a extremidade com gase Completar com o diluente at a marca 101 (diluio 1:100) Agitar, desprezar as primeiras gotas e preencher ambos os lados da cmara de Neubauer por capilaridade Contar as plaquetas de cinco quadrados mdios centrais de ambos os lados, preferencialmente em microscpio com contraste de fase Multiplicar o resultado por 2500 (resultado em plaquetas/ L) A trombocitopenia no tem relao direta com o grau de sangramento, e pode estar relacionada a: Diminuio da produo (Depresso da M.O. por drogas, viroses ou radiao, Doenas mieloproliferativas, etc) Aumento da destruio / consumo / seqestro A trombocitose ( no de plaquetas) geralmente est associada a anemia regenerativa, a neoplasias, infeces, processos inflamatrios (trombocitose reativa); psesplenectomia, ou numa condio mais rara de leucemia megacarioctica.

AVALIAO DO ESFREGAO SANGNEO CORADO A avaliao do esfregao sanguneo corado permite uma avaliao aproximada (normal, aumentada ou diminuda) da quantidade de plaquetas presente na amostra e traz informaes a respeito da morfologia das plaquetas, como a presena de macro ou microplaquetas. A avaliao do esfregao serve tambm para conferir a contagem obtida nas contagens manuais ou eletrnicas e deve ser feita por um profissional experiente e em microscpio aferido para garantir a acurcia da estimativa. EXAME DE MEDULA SSEA O mielograma avalia quantitativa e qualitativamente a megacariocitopoese, diferenciando os processos de consumo ou destruio perifrica de plaquetas dos defeitos de produo, como por exemplo, nas doenas mieloproliferativas.

TEMPO DE SANGRAMENTO Avalia a integridade vascular e a funo plaquetria.

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Aps tricotomia, realizar pequeno corte na pele (padronizar o comprimento e profundidade do corte) em regies com pouco plo (pavilho interno da orelha, parte medial da coxa ou preferencialmente na mucosa gengival) Remover o sangue com papel de filtro de 30 em 30 segundos sem tocar a pele Valores normais - 1 - 5 minutos. O tempo de sangria encontra-se prolongado em vasculites, aumento da fragilidade capilar, trombocitopenias, trombocitopatias, na Doena de Von Willebrand, etc. AGREGAO PLAQUETRIA A funo plaquetria pode ser avaliada por meio de provas de agregao, onde um agonista adicionado a uma suspenso de plaquetas (plasma rico em plaquetas - PRP), estimulando-as e promovendo sua agregao. Essa agregao diminui a turbidez do plasma rico em plaquetas, alterando a transmisso de luz por essa suspenso, que mensurada pelo agregmetro de plaquetas. Os agonistas mais importantes so o ADP, o colgeno, a adrenalina e a ristocetina e avaliam a capacidade de resposta e a reserva de substncias nos grnulos citoplasmticos das plaquetas. O sangue citratado centrifugado a baixas rotaes (500rpm 30 g) por 10 minutos para a obteno do plasma rico em plaquetas (PRP). Aps a remoo do sobrenadante, que corresponde ao PRP, o restante novamente centrifugado a altas rotaes (2.000rpm 360g) por 10 minutos para a obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). A concentrao do PRP padronizada para uma contagem de 100.000 a 300.000 plaquetas/L, procedendo-se diluio com PPP quando necessrio. A agregao plaquetria realizada mediante a adio de 50 L do agonista, previamente reconstitudo, em 400L de PRP. A resposta das plaquetas frente ao agonista mensurada por turbidimetria em um agregmetro de plaquetas e expresso em porcentagem de agregao em relao a um branco, em que o PPP corresponde a 100% de agregao. RETRAO DE COGULO A retrao do cogulo avalia de forma pouco sensvel a funo plaquetria. Deve ser realizada em animais com uma contagem normal de plaquetas. Colher 5 mL de sangue total sem anticoagulante colocar em um tubo de vidro graduado de 10 mL Espere o sangue coagular totalmente Coloque em banho-maria a 37C por 1 hora Mensure o volume de soro formado aps a retrao do cogulo Compare o volume de soro como uma porcentagem em relao ao sangue total (exemplo 1,8mL de soro de 5 mL de sangue = 36%) Como o volume de soro depende do hematcrito do animal, corrigir o valor, que deve ser de cerca de 90% do volume de plasma. HEMOSTASIA SECUNDRIA

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TEMPO DE COAGULAO Prova de triagem para a avaliao dos fatores de coagulao Mtodo do tubo capilar: Preencher alguns capilares de microhematcrito com sangue sem anticoagulante Quebrar o capilar a cada 30 segundos e verificar a formao de um fio de fibrina (incio da coagulao) Contar o tempo a partir do surgimento do sangue no mbolo da seringa Prolongado na deficincia dos fatores da via intrnseca ou comum. Mtodo de Lee-White: um mtodo mais preciso, pois se padroniza a temperatura da reao e o dimetro do tubo para a realizao do teste. Colher cerca de 3 ml de sangue em seringa plstica Cronometrar o tempo assim que o sangue aparecer na seringa Colocar 1 ml de sangue em 3 tubos de vidro (10 x 75 mm) Incubar em banho-maria a 370C Aps 2 minutos girar levemente o tubo no 1 Gir-lo a intervalos de 1 minuto Quando o tubo n o 1 coagular, realizar o mesmo procedimento com o segundo e depois com o terceiro tubo Tempo de coagulao: surgimento do sangue na seringa at a coagulao no terceiro tubo

TEMPO DE COAGULAO ATIVADO - TCA um teste que avalia a via intrnseca da cascata da coagulao e um teste de triagem mais sensvel que o TC, pois a presena de um ativador da coagulao (terra diatomcea) encurta o tempo de coagulao. pr-aquecer o tubo de TCA (tubo comercial) em banho-maria a 37C colher cuidadosamente 2 mL de sangue em seringa plstica adicionar o sangue ao tubo e disparar o cronmetro homogeneizar o tubo por inverso cinco vezes incubar o tubo no banho-maria por um minuto inverter o tubo a cada 5 segundos para observar a coagulao parar o cronmetro ao primeiro sinal de coagulao Valor de referncia de cerca de 60 a 90 segundos.

TP - Tempo de Protrombina Avalia a via extrnseca e a comum, pela adio de um fator tecidual, estimulando a coagulao pela via extrnseca. Plasma colhido em citrato de sdio Adio de tromboplastina tecidual (fator extrnseco) e recalcificao da amostra Cronometrar at a formao do cogulo de fibrina

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O valor normal depende da atividade dos reagentes e do laboratrio empregado, porm o tempo de coagulao que seria de minutos passa a ser de alguns segundos, pela adio do fator tecidual. TTPA - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada Avalia a via intrnseca e comum, pela adio de um fator de ativao por contato. Plasma colhido em citrato de sdio Adio de caolin (ativa fator XII) ou cefalina (substituto do fator plaquetrio) Recalcificar a amostra e cronometrar at a formao do cogulo TT - Tempo de trombina Avalia basicamente o tempo para formao da fibrina a partir do fibrinognio, que o passo mais importante da via comum. Plasma colhido em citrato de sdio Adio de trombina e recalcificao da amostra Cronometrar at a formao do cogulo de fibrina Encontra-se aumentado em hipofibrinogenemias (< 100 mg/dl), na funo deficiente do fibrinognio (desfibrinogenemia) e na presena de inibidores da induo de formao do cogulo pela trombina (heparina). Obs.: na intoxicao por antagonistas da vitamina K, devido a curta vida mdia do Fator VII, o TP pode apresentar-se inicialmente prolongado enquanto o TTPA est normal. Fibrinognio O fibrinognio pode ser mensurado por duas tcnicas. Mtodo do refratmetro: Preencher dois capilares de microhematcrito com sangue com anticoagulante EDTA a 10% Ved-los e centrifug-los a 5000 rpm por cerca de 3-5 minutos Quebrar o primeiro capilar e ler a protena plasmtica total (PPT) no refratmetro Levar o segundo capilar ao banho-naria a 56 oC por 3 minutos, onde ocorrer a coagulao do fibrinognio (o plasma fica turvo) Centrifugar novamente para a precipitao do fibrinognio Ler a protena plasmtica restante (PPT - fibrinognio) Calcular a diferena entre a primeira e a segunda leitura (fibrinognio) Mtodo colorimtrico:

FIBRINLISE PDFs - Produtos de Degradao da Fibrina A amostra deve ser colhida com antifibrinoltico para evitar a degradao da fibrina in vitro e formao de mais PDFs. Existem kits comerciais que avaliam semi-quantitativamente os PDFs por meio de reao de aglutinao em ltex.

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Os PDFs encontram-se aumentados em condies de estmulo da fibrinlise ou na CID. Dmeros-D Especfico para as condies de trombose e/ou CID, pois no aumentam em estados de fibrinogenlise. Lise da Euglobulina Mtodo de Bckell Preparar tubos de vidro cnicos devidamente identificados e colocar: 9,0 mL de gua destilada 0,1 mL de cido actico 1% 0,5 mL de plasma citratado Arrolhar o tubo e homogeneizar por inverso. Levar geladeira (4C) por 30 minutos. Centrifugar por 5 minutos a 2.000 rpm. Desprezar o sobrenadante e secar as paredes do tubo com papel de filtro (tomar cuidado para no retirar o precipitado do fundo do tubo). Levar os tubos com o precipitado ao banho-maria 37C e colocar 0,5 mL de tampo Borato de Sdio (pH 9,0) que j deve estar aquecido. Ressuspender com basto de vidro para dissolver o precipitado. Colocar 0,5 mL de CaCl 2 M/40. Marcar o tempo a partir da formao do cogulo. Inspecionar a cada 20 minutos at ocorrer a lise, ou seja, dissoluo do cogulo. Inspecionar a cada 20 minutos at ocorrer a lise, ou seja, dissoluo do cogulo. Normal: 2 horas aconselhvel fazer sempre o teste usando tambm um plasma normal para controle. Este um dos melhores exames para diferenciar a fibrinlise primria (fisiolgica) da CID (coagulao intravascular disseminada). O exame tambm pode ser utilizado para controlar terapias com estreptocinase ou urocinase em pacientes com IM agudo. O exame de lise da euglobulina avalia a fibrinlise (isto , a dissoluo de um cogulo sangneo). O sistema fibrinoltico normalmente dissolve os pequenos depsitos de fibrina. Quando este sistema est anormalmente hiperativo, qualquer cogulo de fibrina que se forme ser rapidamente dissolvido, resultando, desse modo, em uma tendncia ao sangramento