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Quim. Nova, Vol. 35, No.

10, 1985-1990, 2012 ESPECIAO DE COBRE E ZINCO EM URINA IMPORTNCIA DOS METAIS EM DOENAS NEURODEGENERATIVAS Maria Fernanda C. Leal*, Rita I. L. Catarino e Adriana M. Pimenta CEBIMED, Faculdade de Cincias da Sade, Universidade Fernando Pessoa, Rua Carlos da Maia, 296, 4200-150 Porto, Portugal / REQUIMTE, Departamento de Qumica-Fsica, Faculdade de Farmcia, Universidade do Porto, Rua Anbal Cunha, 164, 4099-030 Porto, Portugal Maria Renata S. Souto CEBIMED, Faculdade de Cincias da Sade, Universidade Fernando Pessoa, Rua Carlos da Maia, 296, 4200-150 Porto, Portugal / CBQF, Escola Superior de Biotecnologia, Universidade Catlica Portuguesa, Rua Dr. Antnio Bernardino de Almeida, 4200-072 Porto Portugal Tatiana S. N. Pinheiro Faculdade de Cincias da Sade, Universidade Fernando Pessoa, Rua Carlos da Maia, 296, 4200-150 Porto, Portugal Recebido em 5/3/12; aceito em 19/6/12; publicado na web em 31/8/12

SPECIATION OF COPPER AND ZINC IN URINE IMPORTANCE OF METALS IN NEURODEGENERATIVE DISEASES. Metals such as copper and zinc are essential for the development and maintenance of numerous enzymatic activities, mitochondrial functions, neurotransmission, and also for memorization and learning. However, disruption in their homeostasis can cause neurodegenerative disorders such as the Alzheimer and Parkinson diseases. In this work, the speciation of copper and zinc in urine samples was carried out. To this end, free and total metal concentrations were determined by square wave anodic stripping voltammetry using a glassy carbon electrode coated with bismuth film. The digestion of the samples was performed in a microwave with the addition of oxidant reagents. Keywords: metals; neurodegenerative diseases; stripping voltammetry.

INTRODUO Alteraes bioqumicas, fisiolgicas e neurolgicas em doenas neurodegenerativas As doenas neurodegenerativas, que se caracterizam pela progressiva perda da estrutura e funo neuronal, tm vindo a aumentar em todo o mundo, revelando-se na atualidade um grave problema humano, social e at econmico. Apesar de ainda no serem conhecidos todos os processos bioqumicos e/ou fisiolgicos que conduzem ao desenvolvimento destas desordens, sabe-se hoje que as principais doenas neurodegenerativas, tais como a doena de Alzheimer e a doena de Parkinson, apresentam algumas semelhanas, especialmente no que respeita deposio intra ou extracelular de emaranhados proteicos.1 A doena de Alzheimer uma doena progressiva e irreversvel, que comea por atingir a memria e com a evoluo acaba por afetar outras funes mentais. Um doente de Alzheimer, aps diagnosticada a doena, resiste em mdia 8 anos.2-4 A doena de Alzheimer pode surgir com uma causa gentica ou de forma espordica, apontando-se neste caso vrios fatores responsveis pelo seu aparecimento, tais como a alterao da transmisso colinrgica, a cascata amiloide, a isoforma 4 da apoliprotena E e a protena tau.5-10 Na doena de Alzheimer, do ponto de vista histopatolgico, verifica-se a deposio de placas senis extracelulares (agregados do pptido -amiloide (A)), bem como a deposio de fibrilas intracelulares de protena tau polimerizada (hiperfosforilada).9 O pptido A resulta da clivagem proteoltica da protena precursora -amiloide (PPA) por -, - e -secretases.11 As formas mais frequentes de A so constitudas por 40 e 42 aminocidos.9,12-14 Os A formados que assumem maior comprimento tm mais facilidade para uma rpida agregao,
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oligomerizao e formao de fibrilas.15 A forma de oligmero a mais neurotxica. O mecanismo ativo existente para remover oligmeros do A ocorre pela promoo da sua desagregao enzimtica em monmeros.9 Os axnios so constitudos em grande parte pela protena tau e microtbulos de baixo peso molecular. Os oligmeros formados do pptido A provocam instabilidade na protena tau, havendo uma rpida dissociao dos microtbulos e o rompimento da estrutura axonal, permitindo uma desordem no processamento das sinapses e posteriormente a morte de neurnios.6,9 A doena de Parkinson um distrbio neurolgico do movimento, progressivo e de evoluo prolongada, que leva incapacidade.16 uma doena multifactorial, cujo aparecimento se encontra associado a diferentes causas, nomeadamente, alteraes bioqumicas, fatores ambientais e genticos, incluindo aterosclerose, infees virais, traumatismo craniano e uso crnico de medicamentos antipsicticos.17,18 A doena de Parkinson caracteriza-se pela presena de disfuno monoaminorgica mltipla, incluindo o dfice de sistemas dopaminrgicos, colinrgicos, serotoninrgicos e noradernrgicos.16 uma desordem cerebral que caracterizada pela neurodegenerao especfica da substncia negra, acompanhada pela diminuio significativa de dopamina em todos os componentes dos gnglios basais, e pela presena de corpos de Lewy, incluses citoplasmticas compostas por uma variedade de protenas como a -sinuclena, a parkina e a ubiquitina.19 Importncia dos metais em doenas neurodegenerativas Estudos recentes tm revelado uma forte influncia da homeostase de determinados metais, particularmente os que possuem actividade redox, na evoluo de doenas neurodegenerativas, como as doenas de Alzheimer e de Parkinson.12,20 A nvel cerebral os referidos metais contribuem para um aumento do stress oxidativo, uma vez que podem conduzir produo de espcies reativas de oxignio, como o

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perxido de hidrognio, e radicais hidroxilo, bem como de espcies reativas de azoto, como o xido ntrico. Estes radicais livres so txicos e no caso de no serem removidos ou neutralizados reagem com lpidos, protenas e cidos nucleicos, danificando as funes celulares.21-23 No crebro de um doente de Alzheimer, para alm da acumulao de placas amiloides e de emaranhados neurofibrilares, ocorre alterao nas reaes redox, havendo registo de um aumento de danos oxidativos.24 Suspeita-se que a secreo e a deposio do A, bem como a agregao das placas senis ocorrem num segundo plano, funcionando como uma tentativa das clulas se protegerem contra os danos provocados pelo stress oxidativo.25 Biometais como o cobre (Cu) e o zinco (Zn) circulam no crebro de forma regulada, atravs da barreira hematoenceflica. O Cu encontra-se distribudo por todo o organismo preferencialmente na forma de complexo orgnico, normalmente associado a metaloprotenas com funo enzimtica. Estas enzimas encontram-se envolvidas na sntese de protenas constituintes do esqueleto e vasos sanguneos, e neurotransmissores essenciais funo nervosa.26 A absoro, distribuio e excreo do Cu so controladas por vrias protenas, prevenindo potenciais danos provocados pelas formas livres deste metal. Os nveis de Cu encontrados no plasma ao nascimento so baixos, aumentando mais tarde.23 No existe atualmente nenhum marcador especfico para Cu. So utilizados para o efeito os valores de referncia de Cu srico (0,64-1,56 g/mL), Cu urinrio (12-80 g/L) e Cu depositado no cabelo (10-20 g/g).27 Alteraes na homeostasia dos nveis de Cu no crebro levam a desordens neurolgicas.23 Elevadas concentraes de Cu foram encontradas nas placas amiloides de crebros de doentes de Alzheimer, tanto associados ao A como aos emaranhados neurofibrilares.28,29 O A liga-se ao Cu e este promove a agregao do A.30 O A reduz o Cu2+ a Cu+ e catalisa a formao de perxido de hidrognio atravs de processos que usam oxignio, colesterol, vitamina C e catecolaminas, originando radicais hidroxilo muito txicos, o que aumenta o stress oxidativo.22,31 Ao agregar o excesso de Cu livre intracelular, o A armazena temporariamente a sua toxicidade.28 Alm da produo de radicais livres, a caracterizao da interaco do Cu2+ com a -sinuclena demonstra a capacidade deste metal na acelerao da agregao de protenas em concentraes fisiologicamente relevantes, sem alterar as estruturas fibrilares resultantes.20 O Zn um oligoelemento que tem como funes bioqumicas a participao em processos enzimticos e estabilizao da estrutura molecular dos componentes subcelulares e da membrana. Encontra-se em todos os tecidos e fluidos corporais, sendo o crebro um dos rgos que contm nveis mais elevados deste metal. A sua eliminao feita atravs dos rins, da pele e do intestino. Num indivduo saudvel a excreo de Zn atravs da urina deve situar-se entre 300-600 g/L.32 A concentrao de Zn diminui com o avanar da idade, havendo acentuado decrscimo a partir dos 75 anos de idade. Esta diminuio em doentes de Alzheimer aumenta a patologia amiloide. A diminuio de Zn sistmico provoca aumento na reteno de Zn no crebro.23,33 A enzima degradante da insulina e a neprilisina so proteases da famlia das metalopeptidases de Zn. Estas proteases so responsveis pela degradao do A. A formao da placa senil pode ser reduzida, ou mesmo evitada, ao se aumentar os nveis da enzima degradante da insulina e da neprilisina.23 Quando conjugados Cu e Zn, facilmente provocada a precipitao de oligmeros A.21 Vrios estudos revelam que o Cu e o Zn tm afinidade para o pptido A e que ambos se ligam aos mesmos resduos do A, logo competem pelo mesmo local, tendo o Zn maior relevncia na rpida agregao do pptido do que o Cu, que por sua vez induz principalmente mudanas conformacionais do A.34,35 O processamento da PPA pode tambm ser influenciado por Cu e Zn uma vez que as -, - e -secretases, que so essenciais para o processamento da PPA, tm interaes com estes metais.23

Importncia da determinao de metais em amostras biolgicas vantagem da voltametria de redissoluo com eltrodo de filme de bismuto na especiao de metais O Cu e o Zn so fatores de mediao em doenas neurodegenerativas, como as de Alzheimer e de Parkinson.36,37 Para alm disso, a doena de Wilson e, tambm, certos carcinomas caracterizam-se por um aumento dos nveis de Cu.38 Sendo assim, o controlo dos nveis destes metais e o uso de terapias quelantes tambm uma forma de controlar a evoluo destas patologias.39 Surge assim, na atualidade, a necessidade de desenvolver mtodos que sejam eficazes na determinao das concentraes de Cu e Zn, principalmente a nvel dos fluidos biolgicos. Os fluidos biolgicos so reconhecidos como meios teis para a determinao de metais no diagnstico e monitorizao de determinados estados nutricionais e patologias. No entanto, a anlise da concentrao total do metal numa amostra no d informao suficiente para prever a respetiva toxicidade. A forma qumica (i.e. espcie) pode influenciar a toxicocintica e toxicodinmica do mesmo e deve ser considerada para melhorar a avaliao do risco na sade humana.40 Tem sido difcil encontrar tcnicas analticas que sejam suficientemente sensveis e seletivas para medir a especiao de metais vestigiais. Os mtodos eletroqumicos apresentam uma vantagem sobre a maioria das outras tcnicas analticas, uma vez que provocam uma perturbao mnima do sistema durante a medio. A voltametria de redissoluo, que combina uma etapa de pr-concentrao com uma etapa de medio eletroqumica dos analitos acumulados, uma ferramenta poderosa para a monitorizao de metais vestigiais em diversas amostras.41-43 Nas 2 ltimas dcadas os eltrodos de filme de mercrio (Hg) (MFEs), preparados pelo revestimento de um material apropriado com um filme de Hg metlico, tm sido usados como suporte s tcnicas de voltametria de redissoluo devido sua elevada reprodutibilidade e sensibilidade.41,43,44 O eltrodo de filme de bismuto (Bi) (BFE) foi proposto pela primeira vez em 2000, como uma alternativa aos MFEs.45 Estudos realizados comprovam que os BFE apresentam elevada sensibilidade, um sinal bem definido e altamente reprodutvel, um grande intervalo de potencial catdico, uma boa resoluo de picos vizinhos, e ainda so menos sensveis do que os MFE ao oxignio dissolvido.43,44,46-48 No entanto, a vantagem mais significativa dos BFEs que a toxicidade do Bi negligencivel, ao contrrio da extrema toxicidade do Hg usado na preparao dos MFEs.41,44,45,47,49,50 Recentemente, encontram-se alguns trabalhos visando a determinao de metais por voltametria de redissoluo em BFEs,51-53 sendo no entanto escassos os trabalhos desenvolvidos tendo em vista a especiao dos mesmos em BFEs.54 Neste trabalho, realizou-se a especiao de Cu e Zn em amostras de urina. Para tal, determinou-se a concentrao livre e total dos metais por voltametria de redissoluo andica de onda quadrada, usando um eltrodo de carbono vtreo revestido com filme de bismuto. Para a determinao do metal total, a digesto prvia das amostras foi efetuada em micro-ondas com adio de reagentes oxidantes. PARTE EXPERIMENTAL Reagentes e solues Na preparao de todas as solues foram utilizados reagentes de qualidade p.a. ou semelhante e gua purificada por sistema Milli Q (resistividade 18 M cm). Todo o material usado foi previamente descontaminado por imerso num banho de cido ntrico 2 M e lavado abundantemente com gua desionizada. As solues de cido ntrico 2 e 6 M foram preparadas por diluio apropriada de uma soluo de cido ntrico concentrado (Panreac).

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O tampo acetato 0,10 M (pH 4,5) foi preparado pela adio de 9 mL de cido actico concentrado (Sigma Aldrich), 8,203 g de acetato de sdio (Fluka) e gua ultrapura, de modo a perfazer o volume de 1 L. O tampo fosfato 0,25M (pH 7,4) foi preparado misturando 400 mL de uma soluo de Na2HPO4.7H2O 0,25 M (Sigma Aldrich) e 200 mL de uma soluo de NaH2PO4.H2O 0,25M (Fluka). As solues de Bi foram preparadas por diluio apropriada de uma soluo 1000 mg/L (Fluka) em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5). As solues de Cu e Zn foram preparadas por diluio de solues 1000 mg/L (Fluka) em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4). As amostras de urina utilizadas na anlise foram recolhidas de pessoas saudveis, ou seja, pessoas que no apresentavam nenhuma patologia nem tomavam qualquer frmaco. Instrumentao

processo combinado, micro-ondas e oxidao por compostos qumicos. A 4 mL de amostra foram adicionados 4 mL de cido ntrico concentrado e 2 mL de perxido de hidrognio (Panreac).57 O aparelho de irradiao com micro-ondas foi programado para uma potncia de 600 W durante 16 min, atingido a temperatura mxima de 140 C. A uma das amostras foi adicionada uma sonda para possibilitar o controlo da temperatura mxima atingida durante a digesto. As amostras foram refrigeradas at posterior anlise.57 Depois do processo de digesto, e antes da diluio, foi necessrio proceder neutralizao da urina com hidrxido de sdio concentrado (Panreac). Esta mistura foi ainda diluda 10 vezes com gua desionizada. RESULTADOS E DISCUSSO Optimizao das condies de deposio de Cu e Zn

As determinaes voltamtricas foram efetuadas num potencistato Ecochimie/Autolab modelo Autolab Type III, ao qual foi acoplado um stand da Metrohm 663 VA. O potencistato foi controlado por um computador com um software GPES 4.9. O eltrodo de trabalho, onde foi depositado o filme de Bi, era de carbono vtreo com um dimetro de disco de 2 mm. Como eltrodo de referncia utilizou-se um eltrodo de AgCl/Ag (KCl, 3,0 M) e o eltrodo auxiliar foi de carbono vtreo. Durante as etapas de deposio as solues foram agitadas com uma haste rotativa de politetrafluoretileno (PTFE) a 2500 rpm. A purga das solues foi realizada por um tubo que libertava azoto livre de oxignio. O aparelho de irradiao com micro-ondas utilizado foi um High Performance Microwave Digestion Unit Mls 1200 Mega da Milestone. Determinao voltamtrica de Cu e Zn No incio de cada dia o eltrodo de trabalho foi polido manualmente por frico da sua superfcie com xido de alumnio (Buehler 40-6603-030-016), tendo o material residual sido removido por passagem abundante de gua desionizada. Realizou-se uma limpeza eletroqumica com tampo acetato 0,10 M (pH 4,5) por meio da aplicao de um potencial de condicionamento (Ec) de 1,8 V durante 600 s (tc) (para que todos os resduos adsorvidos e/ou depositados na superfcie do eltrodo fossem removidos atravs da sua oxidao). As determinaes voltamtricas foram efetuadas pipetando 40 mL de soluo numa clula voltamtrica. A formao do filme de Bi foi realizada ex situ com Bi em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5), aplicando um potencial de deposio (Ed) de -1,4 V durante 90 s (td), sendo a soluo purgada durante 180 s com azoto livre de oxignio (parmetros previamente optimizados).55 Para a remoo do filme de Bi fez-se um varrimento andico entre -1 e 1 V em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5), aps um te de 10 s. Os parmetros de deposio do Cu e Zn foram optimizados em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4). As determinaes de Cu e Zn foram efetuadas em triplicado por voltametria de redissoluo andica, fazendo um varrimento de potencial aps um tempo de equilbrio (te) de 10 s. Os parmetros de varrimento utilizados (previamente optimizados) foram voltametria de onda quadrada, frequncia de 10 Hz, amplitude 0,05 V e degrau de variao de potencial de 0,005 V.55 No final de cada dia procedeu-se limpeza qumica por imerso do eltrodo de trabalho numa soluo de cido ntrico 6 M durante 120 s.56 Digesto da amostra A anlise das amostras de urina foi efetuada antes e aps destruio da matria orgnica. Para digerir as amostras utilizou-se um

Optimizao do Ed e do td Para a primeira fase de optimizao das condies de deposio dos metais utilizou-se uma soluo de Bi 1 mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5) e uma soluo padro de Zn 100 g/L preparada em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4). Estes parmetros foram optimizados s para o Zn, visto este ser o metal que se apresenta a um potencial mais negativo aps o varrimento de potencial. O primeiro parmetro avaliado foi o Ed. Para um td de 90 s variou-se o Ed entre -1,3 e -1,7 V, verificando-se que a intensidade de corrente (i) obtida para o Zn aumentava at -1,6 V, diminuindo para -1,7 V (Figura 1a). O segundo

Figura 1. Influncia do Ed (a) e do td (b) na intensidade de corrente (i) (valor mdio desvio padro, n = 3) obtida para uma soluo de Zn 100 g/L em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4), aps deposio de Bi 1 mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5)

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parmetro avaliado foi o td. Para um Ed de -1,6 V avaliaram-se td diferentes: 60, 90 e 180 s, obtendo-se um valor mximo de i produzida pelo Zn aos 90 s de deposio (Figura 1b). Optimizao da concentrao de Bi Usando um Ed de -1,6 V e um td de 90 s, optimizou-se a concentrao de Bi a utilizar para as determinaes de Cu e Zn. Variou-se a concentrao de Cu e Zn entre 100 e 500 g/L para concentraes de Bi 0,5 e 1 mg/L. Os resultados obtidos demonstraram que, para uma concentrao de Bi 0,5 mg/L, a intensidade de corrente obtida para o Zn era superior obtida para Bi 1 mg/L. No entanto, para o Cu obteve-se uma intensidade de corrente superior para Bi 1 mg/L (Figura 2). Como a intensidade de corrente obtida para as solues de Zn muito inferior (cerca de 10 vezes) obtida para as solues de Cu de igual concentrao, e a determinao de Cu e Zn nas amostras efetuada em simultneo, a concentrao de Bi a usar nas determinaes de Cu e Zn foi optimizada em 0,5 mg/L.

soluo de tampo acetato 0,10 M (pH 4,5) e Bi 0,5 mg/L e a posterior deposio do Cu e Zn numa soluo tampo de fosfato 0,25M (pH 7,4) contendo Cu e Zn 100 g/L, utilizando as condies de deposio j optimizadas. Nos voltamogramas obtidos, dos quais o voltamograma da Figura 3 um exemplo, pode-se verificar a existncia de dois picos de corrente correspondendo ao Zn (a~-0,96 V) e ao Cu (a ~ -0,10 V), no sendo o Bi detetado. Assim, a tcnica de deposio ex situ do filme de Bi revela-se como a mais vantajosa, para as determinaes a pH fisiolgico. O mtodo in situ foi ento abandonado e o mtodo utilizado para o estudo das amostras de urina foi o mtodo ex situ.

Figura 3. Voltamograma obtido pelo mtodo ex situ para uma soluo de Cu e Zn 100 g/L em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4), aps deposio de Bi 0,5mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5)

Curvas de calibrao para Cu e Zn em tampo fosfato Aps optimizao das condies de deposio foram realizadas calibraes para Cu e Zn, utilizando as condies optimizadas, Ed -1,6 V, td 90 s e Bi 0,5 mg/L. As solues padro de Cu e Zn foram preparadas em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4) entre 50 e 200 g/L (Figura 4). Aplicao em fluidos biolgicos (urina) Aps optimizao do mtodo procedeu-se sua aplicao a amostras de fluidos biolgicos, concretamente urina. As amostras de urina foram diludas 2 e 10 vezes em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4) consoante a anlise para metal livre e total, respetivamente. A anlise foi efetuada em triplicado, no prprio dia da colheita, tanto para a determinao de metal livre, como para a determinao de metal total. A concentrao de metal total foi tambm determinada, usando os mesmos procedimentos, em urina de referncia (NIES CRM No. 18 Human Urine) e os valores experimentais no foram estatisticamente diferentes dos valores certificados (teste t, P > 0,05). Para a determinao da concentrao de Cu e Zn, as amostras diludas foram analisadas aps deposio de Bi 0,5 mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5). As retas de regresso linear foram construdas por adies sucessivas de padro de Cu e Zn s amostras. Para a determinao de metal livre foi obtida linearidade para concentraes entre 100 e 500 g/L, tanto para Cu como para Zn. Para a determinao de metal total foi obtida linearidade para concentraes entre

Figura 2. Intensidade de corrente (i) (valor mdio desvio padro, n = 3) obtida para solues de Cu (a) e Zn (b) em tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4), aps deposio de Bi 0,5 e 1 mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5)

Deposio do Bi, Cu e Zn in situ vs ex situ Durante os estudos de optimizao foram tambm testados dois mtodos diferentes: deposio do Bi, Cu e Zn in situ e ex situ. Para os estudos in situ utilizou-se uma soluo de tampo fosfato 0,25 M (pH 7,4) contendo Cu e Zn 100 g/L e Bi 0,5 mg/L. A deposio tanto dos metais como do Bi foi feita simultaneamente, utilizando as condies de deposio j optimizadas. Foram realizadas vrias determinaes voltamtricas e nos voltamogramas obtidos o Zn no era detetado e o pico de intensidade do Cu era mascarado pelo do Bi. Para os estudos ex situ, fez-se a deposio prvia de Bi numa

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Figura 5. Curva de adio de padro para a determinao de Zn total (valor mdio desvio padro, n = 3) numa amostra de urina diluda 10 vezes em tampo fosfato 0,25 M (pH = 7,4), aps deposio de Bi 0,5 mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5)

Figura 4. Curva de calibrao para Cu (a) e Zn (b) (valor mdio desvio padro, n = 3) em tampo fosfato 0,25 M (pH = 7,4), aps deposio de Bi 0,5 mg/L em tampo acetato 0,10 M (pH 4,5)

50 e 250 g/L, tanto para Cu como para Zn. Um exemplo de curva de adio de padro obtida representado na Figura 5. As concentraes de Cu e Zn livre e total para 5 amostras de urina encontram-se na Tabela 1. Para Cu, a mdia das concentraes de metal total obtida para as 5 amostras (140,8 9,4 g/L) elevada quando comparada com os valores existentes na literatura (12-80 g/L). No entanto, a mdia das concentraes de Cu livre, ou seja, o mais biodisponvel, obtida para as 5 amostras (53,8 1,7 g/L) fica dentro do intervalo desses valores. Para Zn, a mdia das concentraes de metal total obtida para as 5 amostras (486 101 g/L) encontra-se dentro do intervalo de valores referenciados como normais na literatura (300-600 g/L). No existem na literatura valores de referncia para as concentraes de metal livre. Sendo assim, este trabalho inovador em relao a esse aspeto. Comparando as concentraes de metal livre e total, verifica-se que se obtiveram valores superiores quando se analisou a amostra

digerida. Para ambos os metais, procedeu-se posteriormente ao clculo da percentagem de metal livre em relao ao total (Tabela1). Para Cu e para as 5 amostras, a mdia das percentagens de metal livre em relao ao metal total foi de 38,3 1,3%. Para Zn e para as 5 amostras, a mdia das percentagens de metal livre em relao ao total foi de 41,9 1,9%. Verifica-se ento que a percentagem de metal livre em relao ao metal total muito idntica para ambos os metais (~ 40%). Estes resultados revelam a importncia da especiao de metais em fluidos biolgicos, concretamente na urina, pois a informao isolada do metal total pode levar concluso precipitada de certa patologia. Neste caso em concreto, do Cu e Zn total excretado na urina s ~ 40% se encontram livres, ou seja, biodisponveis, e 60% complexados com diversos ligandos, sendo menos biodisponvel. CONCLUSES Estudos recentes tm revelado uma forte influncia da homeostase de determinados metais, como Cu e Zn, na evoluo de doenas neurodegenerativas, como as doenas de Alzheimer e de Parkinson. O controlo dos nveis destes metais e o uso de terapias quelantes uma forma de controlar a evoluo destas patologias. Surge assim a necessidade de desenvolver mtodos que sejam eficazes na determinao das concentraes de Cu e Zn, principalmente a nvel dos fluidos biolgicos. No entanto, a anlise da concentrao total do metal numa amostra no d informao suficiente para prever a respetiva toxicidade. A forma qumica (i.e. espcie) pode influenciar a toxicocintica e toxicodinmica do mesmo e deve ser considerada para melhorar a avaliao do risco na sade humana.

Tabela 1. Concentraoa (g/L) de Cu e Zn livre e total em diferentes amostras de urina Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Mdia desvio padro a Valor mdio (n = 3) Cu livre (g/L) 55,1 56,0 51,2 52,7 54,2 53,8 1,7 Cu total (g/L) 149 150 129 133 143 140,8 9,4 Cu livre / Cu total (%) 37,0 37,3 39,7 39,6 37,9 38,3 1,3 Zn livre (g/L) 171 156 276 243 179 205 46 Zn total (g/L) 425 378 623 559 447 486 101 Zn livre / Zn total (%) 40,2 41,3 44,3 43,5 40,0 41,9 1,9

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Neste trabalho, um elctrodo de carbono vtreo revestido com filme de bismuto foi preparado e utilizado para a especiao de Cu e Zn em amostras de urina. As concentraes livre e total dos metais foram determinadas utilizando a voltametria de redissoluo andica de onda quadrada. Para a determinao do metal total, a digesto prvia das amostras foi efetuada em micro-ondas, com adio de reagentes oxidantes. Comparando os valores obtidos para o metal total nas amostras de urina com os existentes na literatura, concluiu-se que a concentrao mdia de Cu total obtida para as 5 amostras (140,8 9,4 g/L) se encontra ligeiramente aumentada, enquanto a de Zn (486 101 g/L) se encontra no intervalo considerado normal (300-600 g/L). No entanto, a concentrao mdia de Cu livre obtida para as 5 amostras (53,8 1,7 g/L) encontra-se no intervalo de valores de Cu total existentes na literatura (12-80 g/L). Como os estudos de especiao em fluidos biolgicos no se encontram muito desenvolvidos, no existem valores de referncia para as concentraes de metal livre em urina. Este fato mostra a importncia de se continuarem a realizar estudos de especiao em fluidos biolgicos, j que como se pode verificar pelos resultados obtidos s ~ 40% do metal (Cu e Zn) excretado se encontra no seu estado livre. AGRADECIMENTOS Este trabalho foi financiado pela Fundao para a Cincia e a Tecnologia atravs da bolsa n. PEst-C/EQB/LA0006/2011. REFERNCIAS
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