Universidad de Panam Facultad de Ciencias Naturales Exactas y Tecnolgicas Escuela de Biologa Trabajo de Gentica Microbiana

Integrantes: Jenifer Bentez Azalea Gordon Sean Romaa Sidney Polanco Grupo : 3-4

Mtodos de Extraccin y Purificacin de ADN

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados. Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: cido nucleico diana. Organismo fuente. Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.). Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin). Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADNc, etc.).

A continuacin se recogen los principios de algunos de los mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos que ms se emplean en la actualidad.

Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
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 Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.). Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.). Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo.

Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes: Extraccin/precipitacin Cromatografa Centrifugacin Separacin por afinidad.

Extraccin/precipitacin: A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante cambios del pH. Cromatografa: Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin: permeacin sobre gel, intercambio inico, adsorcin selectiva o unin por afinidad. La permeacin sobre gel aprovecha las propiedades de las partculas porosas del gel para tamizar molculas. Se emplea una matriz con poros de tamao definido, que dejan pasar las molculas ms pequeas por difusin, pero no las ms grandes, que quedan eluidas en el volumen vaco. La cromatogrfica de intercambio inico es otra tcnica, que se basa en la interaccin electrosttica de la molcula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los cidos nucleicos pueden eluirse de las columnas de intercambio inico con simples Tampones salinos. En la cromatografa de adsorcin, los cidos nucleicos se fijan selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas sales, mientras que otras molculas biolgicas no se fijan. A continuacin, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampn hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores. Centrifugacin: La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin eficaz. As, por ejemplo, la ultracentrifugacin en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plsmidos. La centrifugacin suele asociarse a otros mtodos, como la cromatografa de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeacin sobre gel y la centrifugacin para separar el ADN o ARN
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de contaminantes ms pequeos (sales, nucletidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar segn el tamao. Algunos procedimientos combinan la adsorcin selectiva en matriz cromatogrfica (vase el apartado anterior Cromatografa) y la elucin por centrifugacin para purificar de forma selectiva un tipo de cido nucleico. Separacin por afinidad: En los ltimos aos, cada vez son ms los mtodos de purificacin que combinan la inmovilizacin por afinidad de cidos nucleicos y la separacin magntica. Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partculas magnticas revestidas deestreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partculas puede eliminarse de la solucin (y de los contaminantes libres) con un imn. Esta tcnica en fase slida simplifica la purificacin de los cidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de centrifugacin, extraccin orgnica y separacin de fases por una operacin de separacin magntica, nica y rpida.

Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB

El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en gentica molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validacin para detectar OGM.

Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin

Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetil- trimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol. En esta seccin se describirn los principios de las tres etapas principales: la lisis de la membrana celular, la extraccin del ADN genmico y su precipitacin. Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no covalentes. Extraccin: En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones
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enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Precipitacin: En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual.

Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra

El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan idneos. La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco.

Principios de la cuantificacin de ADN por espectrofotometra

El espectrofotmetro se funda en la transmisin de la luz a travs de una solucin para determinar la concentracin de un soluto presente en la misma. El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiacin luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energa luminosa transmitida con una clula fotoelctrica situada detrs de la muestra. El espectrofotmetro de haz nico consta de una fuente luminosa, un prisma, un recipiente con la muestra y una clula fotoelctrica. Los distintos elementos estn conectados a los sistemas elctricos o mecnicos adecuados para controlar la intensidad luminosa y la longitud de onda y para convertir en variaciones de tensin la energa recibida en la clula fotoelctrica.

Determinacin de la concentracin de cidos nucleicos

Eleccin de la cubeta: La cantidad de solucin de cidos nucleicos necesaria para medir la absorbancia A depende de la capacidad de la cubeta. Debe elegirse una cubeta apropiada atendiendo al intervalo de concentracin de la muestra, el factor de dilucin y el volumen de la muestra. En la mayor parte de los procedimientos empleados para detectar OGM, el
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volumen de ADN genmico disponible vara entre 50 y 100 l. Para la cuantificacin espectroscpica de pequeos volmenes de cidos nucleicos se emplean diversos tipos de cubetas de microvolumen, cuya capacidad oscila entre 5 y 70 l. Preparacin: Para calibrar el espectrofotmetro es importante: Establecer el paso de luz correcto; Establecer el factor correcto (ADN bicatenario, ADN monocatenario o ARN); Medir la solucin en blanco (establecer la referencia), que ser agua o solucin tampn (A260 = 0); Cerciorarse de que la referencia establecida se renueva peridicamente; Medir una cantidad conocida de cidos nucleicos puros para comprobar la fiabilidad de la referencia establecida. Medicin en una muestra desconocida: Para medir la concentracin, se utilizan cantidades determinadas de solucin de ADN en funcin de la capacidad de la cubeta empleada (por ejemplo, 5 l de ADN diluidos en 195 l de agua si la capacidad de la cubeta es inferior a 0,2 ml). Despus de calibrar el espectrofotmetro y de aadir la solucin de cidos nucleicos, se tapa la cubeta, se mezcla la solucin y se mide la absorbancia. Con objeto de reducir los errores de pipeteado, debe efectuarse la medicin al menos dos veces y siempre con 5 l de solucin de ADN, como mnimo. Se desaconsejan los valores de A260 inferiores a 0,02 o comprendidos entre 1 y 1,5 (segn el instrumental empleado) por el elevado margen de error que entraan. La concentracin c de un cido nucleico determinado presente en una solucin