MARCO TEORICO

Electroforesis La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asign a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este trmino se limit originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscopicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular.

Fundamento

Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las

molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La

energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Electroforesis en Papel: El manejo del aparato ideado por TISELIUS era complicado y lento, lo que, unido al considerable coste del mismo, hizo que el uso de este mtodo electrofortico se reservara para clnicas centrales e institutos cientficos exclusivamente. No obstante, siendo conocido y estimado cada vez ms el valor cientfico de la frmula proteica y el servicio que a ella podan prestar los mtodos electroforticos, surgi una sana fiebre (valga el contrasentido) de encontrar tcnicas electroforticas ms sencillas, que estuvieran al alcance, si no de la totalidad de los clnicos, al menos s de la mayora. Asi pues comenz la bsqueda por nuevos materiales a utilizar entre los cuales es el papel la sustancia que ha adquirido mayor importancia. El empleo del mismo en las tcnicas electroforticas, como soporte del medio: la electroforesis sobre tiras de papel, embebidas en una disolucin electroltica Electroforesis en papel, se emplea en la separacin de sustancias de bajo peso molecular como aminocidos y pptidos. Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su rpido desarrollo. Hoy da, las tcnicas electroforticas en papel, tanto en escala analtica como en escala preparativa (lo que se puede hacer corresponder, en un sentido amplio, con las modalidades de electroforesis discontinua y continua, respectivamente) han alcanzado una importancia tal, que han llegado a hacerse insustituibles para una amplsima gama de cuestiones, desde las que tienen un inters puramente cientfico, hasta las de

importancia eminentemente prctica ya sea desde un punto de vista clnico, ya por un fin tcnico, como antes se ha apuntado, especialmente, en el fraccionamiento industrial de materiales biolgicos. En principio, la importancia se manifiesta ms claramente en el tratamiento de sustancias de carcter macromolecular, pero ello no excluye a las de pequeo tamao, puesto que lo que ocurre realmente es que, para estas ltimas, los mtodos electroforticos se presentan, ms que como esenciales, como mejorantes de otras tcnicas con las que quizs se logra ya el efecto deseado. Este es, por ejemplo, el caso de los aminocidos; su tratamiento constituy un problema difcil hasta el advenimiento de la cromatografa, pero, realmente, el uso combinado de aqulla con la electroforesis, o incluso una adecuada aplicacin de esta ltima, suponen un ahorro de tiempo extraordinario para lograr los mismos efectos, cuando no una mejora de resultados. Cuando se utiliza el papel de filtro como soporte slido del medio en que se produce la migracin electrofortica, y a la vista de su especial poder adsorbente, es de suponer que pueda ejercer acciones sobre las partculas mviles, secundarias con respecto al fin fundamental, y que producirn, en definitiva, un retardo en la electromigracin. No hay duda de que este efecto es previsible; parte de nuestros experimentos han servido para confirmarlo plenamente. Lo mismo podemos decir de otros factores, que, modificando, por ejemplo, ese poder de adsorcin ineludible del soporte, afectan igualmente al proceso. Por ello, tambin han sido objeto de nuestra atencin, con resultados que se expondrn ms adelante. A su vez, estos factores pueden ser de dos clases: a) de tipo puramente fsico, como los que se refieren al grado de porosidad, activacin termodinmica, etc., o b) eminentemente qumicos, como aquellos que dependen del nmero y clase de grupos modificados de la celulosa (grupos

metoxilos, urnicos, reductores, etc.) o incluso los que, si bien no son inherentes a la celulosa per se, en ocasiones pueden determinar el que sta vaya acompaada de grupos de iones activos, extraos a la misma, que han sido retenidos, fsicas o qumicamente, durante el tratamiento seguido en sil preparacin. Estos y otros factores han de tenerse en cuenta para el estudio terico de la electromigracin en la celulosa, considerada como sistema capilar C-52 Mara del Carmen Bonmati Limarte (electroforesis en papel o capilar), si bien es preciso despreciar aquellos otros que influyen en menor cuanta, al objeto de simplificar la discusin matemtica. La clase de papel soporte del medio, tendr una gran importancia con vistas a conseguir una buena separacin. Su influencia radica en su estructura misma, tanto fsica como qumica, y en las propiedades que de ella se derivan. La estructura fsica del papel de filtro puede representarse como un entrecruzado tridimensional de fibras de celulosa que dejan, entre s, espacios intersticiales (poros) de dimensiones ampliamente variables. De aqu que el papel de filtro sea un medio poroso, de accin capilar, e hidroflico, por el carcter propio de las fibras de celulosa, pero insoluble en agua. Sus poros, como se deduce de las consideraciones hechas anteriormente sobre la migracin de partculas en el papel, resultan bastante grandes, aun para las molculas mayores. Entre las fibras existe una afinidad qumica que comunica al papel una fuerza considerable cuando seco, a pesar de que dicha fibras son slo moderadamente largas. Desde el punto de vista qumico, el papel de filtro est constituido por celulosa bastante pura (en el caso ideal, por macromolculas no degradadas de celulosa), a cuyos numerosos grupos oxhidrilos debe sus propiedades hidroflicas y su mojabilidad por disolventes polares en general. No puede considerarse, sin embargo, el papel de filtro como una sustancia lipfoba, puesto que las cadenas de glucosa, constituyentes de la celulosa, presentan

tambin afinidad para otras cadenas y anillos carbonados, siendo, por lo tanto, mojable igualmente por disolventes no polares y por lpidos y lipoides. Sin embargo, en la prctica, no es posible considerar a ningn papel de filtro como celulosa absolutamente pura. Hay que tener en cuenta que es frecuente encontrar, en el mismo, trazas de otras sustancias, como hemicelulosas y ligninas, que provienen del proceso de elaboracin. Por esto, aunque la celulosa pura se considera como no ionizable, el papel de filtro puede poseer grupos inicos en alguna proporcin. As, es corriente encontrar, sobre el mismo esqueleto de la celulosa, algunos grupos carboxilo. En cuanto a los resultados prcticos obtenidos en la electroforesis con este soporte, se deduce de las consideraciones hechas por algunos autores sobre el papel cromatogrfico que dichos resultados sern tanto mejores cuantas menos condiciones cumpla el papel de las requeridas para la cromatografa capilar (tambin llamada por adsorcin o retencin), aunque siempre es inevitable que se produzca una pequea adsorcin fsica de las macromolculas. Suele darse como norma el utilizar aquellos tipos de papel de propiedades adsorbentes menores, es decir, los menos porosos. Proceso para llevar a cabo la electroforesis en papel: 1) Se toma una tira de acetato de celulosa y se seca entre dos papeles tipo tissue, luego se coloca en un recipiente que contenga buffer, se deja durante unos 10 minutos, transcurridos, se saca y se absorbe el exceso con papel tissue, se monta sobre el puente de la cuba con la cara opaca hacia arriba. 2) La siembra se hace a 1,5 cm del ctodo. Conviene ser rpido en todo esto para evitar que se evapore el lquido del acetato y se reseque 3) En la cuba se coloca en ambos compartimentos una buena cantidad de buffer. Y se pone el puente con la tira.

4) Se enciende la fuente, si es regulable se le da unos 150v y la corriente andar mas o menos a 1 mA por cada cm de ancho de la tira, en mi caso uso tiras de 2 cm. 5) Se deja 50 minutos. Si se quiere visualizar por dnde anda la corrida, se le agrega al suero una tintura (azl de bromofenol en alcohol al 1%) 6) Transcurrido el tiempo se desconecta la fuente de la red y se saca la tira, si se manipula, las manos deben estar bien limpias y desengrasadas. 7) Se traslada la tira cortndole los extremos (dejamos solo la parte donde se encuentra el suero ya fraccionado) a un recipiente con el lquido colorante por unos 4 minutos. 8) Luego se trasvasa el lquido a su frasco y la tira puede lavarse con agua, se pasa luego a un recipiente con liquido decolorante, agitndola y haciendo sucesivos lavados hasta que quede el fondo completamente blanco, en este momento ya se visualizan perfectamente las fracciones, pero falta transparentizar.

Antes de pasar al lquido trasparentizador conviene por 1 minuto colocar en metanol puro, luego se pasa al lquido trasparentizador por 2 minutos, una vez hecho esto, se saca con precaucin la tira y se la coloca sobre un vidrio cuidando que no queden burbujas de aire, se pone sobre alguna superficie caliente, puede ser el calor de una lmpara elctrica. Una vez que se le aplica calor la tira se pone transparente se la deja secar y ya tenemos nuestra corrida electrofortica. Electroforesis en Gel: La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico.

Permite separar especies qumicas (cidos nucleicos o protenas) a lo largo de un campo elctrico en funcin de su tamao y de su carga elctrica. Adems esta se halla entre los mtodos mas poderosos y convenientes para la separacin de macromolculas, suplanto en gran medida a la electroforesis en papel. Los geles mas usados, poliacrilamida y agarosa tienen poros de dimensiones moleculares cuyos tamaos pueden especificarse. Por ello, las separaciones moleculares se basan en la filtracin de geles y en las movilidades electroforticas de las molculas que se intentan separar. Los geles utilizados retardan las molculas grandes en comparacin con las de menor tamao, al revs de lo que ocurre en la cromatografa de filtracin por geles, dado que en el caso de la electroforesis en gel no hay espacio de solvente como en el que se ubica entre las microesferas de la cromatografa de filtracin por geles (los geles mas usados en electroforesis se generan en forma directa en el aparato electrofortico. Dado que las molculas de una muestra no pueden abandonar el gel, el movimiento electrofortico de las mas grandes se ve impedido en comparacin con el de las mas pequeas. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE). Los geles de poliacrilamida (PAGE) se forman por polimerizacin de la acrilamida y la N,N-metileno bisacrilamida inducida por radicales libres en un buffer. Es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Por lo general el gel se arma como una plancha rectangular delgada en la que pueden analizarse varias muestras en calles paralelas en forma

simultanea, lo que permite comparar muestras similares. El buffer, que es el mismo en amnbos reservorios y en el gel, tiene un pH tal (en general alrededor de 9 para las protenas) que las macromolculas tienen carga negativa, por lo que migran hacia el anodo ubicado en el reservorio inferior. Cada muestra puede contener no mas de 10microgramos de material macromolecular, se disuelve en una cantidad minima de una solucin relativamente densa de glicerol o sacarosa que previene la mezcla con el buffer del reservorio superior. La muestra se coloca en fosas preformadas en la parte superior del gel. Como alternativa, puede estar contenida en un tramo corto de gel para muestra, cuyos poros son demasiados grandes como para impedir la migracin de las molculas. A continuacin se aplica al gel una corriente directa de alrededor 300 V por un tiempo suficiente (30-90 min) para separar a los componentes macromoleculares en una serie de bandas discretas. El gel se retira de su compartimiento y se aplica un mtodo adecuado para visualizar las bandas de macromolculas. Mediante esta tcnica, una mezcla proteica de 0,1 a 0,2 mg puede resolverse en hasta 20 bandas discretas. Lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. Electroforesis en Geles de Agarosa. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

Enfoque Isoelctrico: (Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra y, en consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce el gradiente de pH del gel. Electroforesis Bidimensional: La electroforesis bidimensional es una tcnica de alta resolucin cuyo objetivo es realizar las separaciones del mismo espcimen de protenas altamente complejas en dos direcciones distintas. La base de su elevado poder de resolucin est precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las protenas son separadas secuencialmente por dos criterios fsicos. En primer lugar las protenas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoelctrico por medio de isoelectroenfoque. Tras esta separacin por carga las protenas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tincin del gel las protenas aparecen formando manchas circulares. En un solo electroforetograma bidimensional pueden observarse hasta 5.000 protenas, por lo tanto la electroforesis bidimensional es una herramienta valiosa y la mas empleada para el anlisis global en

protemica que se refiere al estudio del Proteoma el cual fue usado por primera vez por Wilkins et al. (1996) para describir el conjunto de protenas que se expresan por una clula o un organismo, pero con acento en su cuantificacin, localizacin, modificaciones interacciones y actividades y por ultimo en su identificacin. A partir de un genoma en un momento dado. El Proteoma es un elemento altamente dinmico, cuyos componentes varan en un organismo, tejido, clula o compartimento subcelular, como consecuencia de cambios en su entorno, situaciones de estrs,

administracin de drogas, seales Bioqumicas o su estado fisiolgico o patolgico. Dicha tcnica permite la separacin de cientos o miles de protenas en un nico gel, mostrando un patrn caracterstico. La principal aplicacin de esta tcnica es determinar la composicin de especmenes biolgicos complejos. El protocolo de electroforesis bidimensional consiste en: 1) Se toma la muestra de protenas: especmenes biolgicos complejos. 2) Preparacin de la muestra: el paso ms crtico y clave en el xito del experimento. En l se Emplean agentes caotrpicos, surfactantes y agentes reductores. Los Agentes caotrpicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalizacin de las protenas por ruptura de puentes de hidrgeno, dejando expuestos los residuos hidrofbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT (aunque tambin se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalizacin proteica por ruptura de puentes disulfuro. 3) Separacin en la 1 Dimensin (Isoelectroenfoque): En primer lugar las protenas se separan en base a su punto Isoelctrico en gradientes de pH inmovilizados. Equipo de Isoelectroenfoque: Protean IEF cell (BioRad). 4) Separacin en la 2 Dimensin (SDS-PAGE): Una vez que las protenas han sido separadas en funcin de sus propiedades elctricas,

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pasamos a separarlas en funcin de su tamao o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sdico (SDS). Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar prcticamente todas las protenas de un proteoma en una matriz bidimensional (electroforesis bidimensional). Equipo de Electroforesis Bidimensional: Mini Protean System (BioRad). Equipo de Electroforesis Bidimensional: Protean Plus Dodeca Cell (BioRad) 5) Tincin: Para visualizar las protenas en el gel, stas deben ser teidas de alguna manera. La eleccin del mtodo de tincin viene determinado por diferentes factores, como la sensibilidad deseada, rango lineal, facilidad de uso, precio y tipo de equipo de adquisicin de imagen disponible. Los mtodos ms usados son la tincin con Coomassie Blue, la tincin fluorescente con Sypro Ruby y la tincin con Plata, aunque esta ltima no es del todo compatible con el anlisis posterior de las protenas por espectrometra de masas. Gel Bidimensional: Tincin Coomassie Blue 6) Adquisicin y Anlisis de Imagen: La habilidad para adquirir datos en formato digital es uno de los principales factores que hace a los geles bidimensionales ser un prctico medio para recoger informacin sobre un proteoma. Antes de que los geles donde hemos separado las protenas puedan ser analizados con un sistema de evaluacin de imgenes, stos deben ser digitalizados. Los instrumentos de adquisicin de imgenes ms comnmente usados son los densitmetros (GS800) y los escneres de fluorescencia (FX ProPlus). Todos ellos funcionan con softwares de anlisis diseados para detectar y cuantificar spots en las imgenes digitales as como para comparar y analizar estadsticamente los geles de inters. El software de anlisis usado en el Servicio es el PDQuest de Bio-Rad. Se ofrece la opcin de usar el software Decyder de GE para anlisis de imgenes DIGE.

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La interpretacin de los resultados se realiza mediante numerosos programas especiales de anlisis de la imagen que permiten cuantificar protenas, calcular puntos isoelctricos, masas molares y correlacionar distintos patrones electroforticos para anlisis de fenotipos, taxonomas (identificacin de gneros y especies). La electroforesis bidimensional, debido a su elevada resolucin, ha sido una tcnica ampliamente utilizada en la confeccin de mapas de referencia, es decir, en la diseccin de la composicin proteica de un determinado orgnulo o tipo celular. Cuando estos mapas se utilizan para comparar distintas situaciones experimentales, como pueden ser distintas condiciones de cultivo, tratamientos con frmacos o compuestos txicos, tejidos sanos o enfermos, lneas celulares normales y tumorales, es cuando la electroforesis bidimensional adquiere toda su funcionalidad

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