Aprovechamiento del bagazo de caa en la produccin biotecnolgica de Xilitol por Candida parapsilosis

Nadia Adelina Rodrguez Durn , Jos Alberto Ramrez De Len , Manuel Vzquez Vzquez , 2 2 Gonzalo Velzquez De La Cruz , Simn Josas Tllez Luis Unidad Acadmica Multidisciplinaria Mante -UAT Cd. Mante, Tam. 2 Unidad Acadmica Multidisciplinaria Reynosa-Aztln UAT Reynosa, Tamaulipas. narodriguez@uat.edu.mx, nadiaard@hotmail.com
1 1* 2 2

Palabras clave: Xilitol, xilosa, bagazo, caa, Candida parapsilosis. Key words: Xylitol, xylose, bagasse, cane, Candida parapsilosis.

RESUMEN En Mxico, la caa de azcar es uno de los principales cultivos agrcolas. Su industrializacin produce el azcar de mesa (sacarosa). El bagazo es un subproducto del proceso de extraccin del azcar. Este material puede ser utilizado para la obtencin de xilitol, el cual es un edulcorante que puede competir con los endulzantes artificiales y los jarabes de maz ricos en fructosa que desplazan del mercado a la sacarosa. Un proceso biotecnolgico optimizado permite producir xilitol de origen natural y con menos costo que el obtenido por sntesis qumica. En esta investigacin se realizaron diversos estudios con la finalidad de emplear el bagazo de caa como fuente de carbono para la levadura Candida parapsilosis (NRRL Y-2315) en la produccin de xilitol. Se determinaron las condiciones ptimas de detoxificacin de los hidrolizados de bagazo de caa concentrados para la eliminacin de la mayor cantidad de inhibidores del crecimiento microbiano sin afectar la concentracin de azcares. Se realiz un diseo multifactorial fraccionado con tendencia central para determinar el efecto de la concentracin de carbn activado, pH inicial y duracin del tratamiento a 45C y 150 rpm, sobre el Porcentaje de Eliminacin de Furfural (PEF). Este diseo fue aplicado en hidrolizados obtenidos con 2% de cido fosfrico a 121C durante 60 min y concentrados hasta 53.5 g de xilosa/L. Como resultado se obtuvo que el modelo estadstico predice adecuadamente el PEF y que las condiciones ptimas para la detoxificacin son pH 3.8, 58.4 min y carbn activado 1/30 obtenindose un valor de PEF de 99.95%, conservndose concentraciones de 48.3, 3.6, 6.9 y 3.9 g/L de xilosa, glucosa, arabinosa y cido actico, respectivamente, lo cual significa una baja concentracin de furfural (0.0033 g/L) con un elevado porcentaje de recuperacin de azcares (90.38 %). Esto hace que

la aplicacin de estos licores como medio de fermentacin sea adecuada. El estudio de las condiciones de pH, concentracin inicial de xilosa y temperatura en las cuales se favorece la produccin de xilitol y biomasa, empleando medios de xilosa comercial inoculados con Candida parapsilosis, permiti establecer que la mayor produccin de xilitol se obtuvo con 60 g/L, pH 6 y 26C, y la mayor formacin de biomasa con 15 g/L, pH 5 y 26C. Los factores que tuvieron un efecto estadsticamente significativo sobre el rendimiento en xilitol fueron concentracin inicial de xilosa, temperatura, interaccin entre xilosa inicial-pH y pH-temperatura.

ABSTRACT In Mexico, sugar cane is one of main agricultural cultures. Its industrialization produce table sugar (sucrose). The bagasse is a by-product of the sugar extraction process. This material can be used for the obtaining of xylitol which is a sweetener that can compete with the artificial sweeteners and the high fructose corn syrup that are moving from the market the sucrose. An optimized biotechnological process allows producing xylitol of natural origin and with less cost than the obtained by chemical synthesis. In this research, several studies were made with the purpose of using the cane bagasse as carbon source for the yeast Candida parapsilosis (NRRL Y-2315) in the production of xylitol. The optimal conditions of detoxification of concentrated hydrolysates of cane bagasse were determined for the removing of inhibitors for the microbial growth without affecting the concentration of sugars. A fractional multifactorial experimental design with central tendency was made to determine the effect of the activated charcoal concentration, initial pH and duration of the treatment at 45C and 150 rpm on the Percentage of Elimination of Furfural (PEF). This design was applied to hydrolyzates obtained with 2% of phosphoric acid at 121C during 60 min and concentrated up to 53.5 g of xylose/L. As result were obtained that the statistical model predicts suitably the PEF and that the optimal conditions for the detoxificacin are pH 3.8, 58.4 min and activated charcoal 1/30, obtaining a value of PEF of 99.95% and remaining concentrations of 48.3, 3.6, 6.9 and 3.9 g/L of xylose, glucose, arabinose and acetic acid, respectively. Which means a low concentration of furfural (0.0033 g/L) with a high percentage of recovery of sugars (90.38 %). This made that the application of these liquors as fermentation media are adequate. The study of the conditions of pH, initial concentration of xylose and temperature that are adequate for the production of xylitol and biomass using medias of commercial xylose allowed to establish that the higher production of xylitol was obtained at 60 g/L, pH 6 and 26C, and the higher formation of biomass was at 15 g/L, pH 5 and 26C. The factors that had a statistically significant effect on the yield in xylitol were

initial concentration of xylose, temperature, interaction between initial xylose-pH and pHtemperature. ANTECEDENTES La caa de azcar (Saccharum officinarum) es uno de los principales productos agrcolas de Mxico. 1 Este producto agrcola es industrializado en los ingenios azucareros, girando su economa alrededor de la produccin de sacarosa cuya demanda decrece debido al surgimiento de tendencias nutricionales en las que lo cotizado son los alimentos bajos en caloras. Adems de la aparicin en el mercado de edulcorantes naturales de menor costo y ligeramente mayor poder edulcorante como los jarabes de maz ricos en fructosa.2, 3 En la actualidad, la industria azucarera debe enfrentarse a la competencia con otros edulcorantes, a la falta de eficiencia energtica y a la contaminacin que produce. Desarrollar alternativas para utilizar al mximo cada uno de los productos y subproductos derivados de la caa de azcar contribuir a mejorar las condiciones econmicas de sta industria. Es decir, la crisis en la que se encuentra la industria azucarera se puede resolver, entre otras medidas, si se disea y lleva a cabo un aprovechamiento integral del cultivo de caa con el menor impacto ecolgico, industrializndose los subproductos que se obtienen durante la produccin de sacarosa tales como el bagazo de caa, las melazas o mieles, la cachaza de los filtros, las cenizas de los hornos y los gases de combustin. De esta manera, la industria azucarera se transformara en una industria del cultivo de caa con capacidad de responder a las demandas comerciales. 4, 5 Un edulcorante que puede competir con los endulzantes artificiales bajos en caloras y con los jarabes de maz ricos en fructosa es el xilitol, ya que tiene un bajo valor calrico, un sabor fresco caracterstico, no participa en la reaccin de Maillard, puede ser consumido por los diabticos sin causar dao a su salud, no produce caries y tiene un poder edulcorante similar al de la sacarosa, entre otras propiedades, que lo convierten en un edulcorante cotizado en el mercado. 4, 6, 7, 8, 9 El xilitol es un endulzante que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, pudindose obtener a partir de ciertas frutas, hortalizas y cereales pero en muy pequeas cantidades por lo que su extraccin de estas fuentes resulta poco rentable. Tambin puede obtenerse por sntesis qumica y por fermentacin. La sntesis qumica es un proceso caro que se refleja en el costo de este producto. La produccin biotecnolgica de xilitol es una alternativa con mucha viabilidad de ser un proceso ms rentable si se optimizan todas las etapas de este proceso y se obtiene a partir de materia prima abundante y econmica como lo son los materiales lignocelulsicos. 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12

Se ha demostrado que las levaduras son las mejores productoras de xilitol, especialmente aquellas del gnero Candida. Estas reducen la xilosa a xilitol bajo la accin de una enzima denominada xilosa reductasa, la cual es NADP-dependiente. La cantidad de xilitol y la productividad del mismo dependern de las condiciones de cultivo y del tipo de cepa que se utilice. 6, 9, 13
3

Este edulcorante se puede producir a partir del bagazo de caa, el cual tiene diversas aplicaciones, pero de muy bajo valor y que, incluso, puede llegar a ser considerado un desecho agroindustrial. 4, 9, 14 Si se efecta un proceso biotecnolgico optimizado se obtendra un producto de origen natural con ventajas sobre el obtenido por sntesis qumica, ya que los consumidores prefieren lo natural por considerarlo ms sano aunque, realmente, la toxicidad de una sustancia no depende de su origen natural o artificial sino de su composicin qumica y de las condiciones de su consumo. Otra ventaja es que se obtendra con un menor costo. 3, 15, 16 La produccin de xilitol, junto con la de la sacarosa a partir del cultivo de caa, servira para abarcar el mercado de los que prefieren lo natural dando opcin al consumidor de elegir lo tradicional o lo bajo en caloras. Para que el bagazo de caa pueda ser aprovechado como fuente de carbono en la produccin de xilitol, empleando microorganismos, ste debe recibir un tratamiento llamado hidrlisis cida con el cual se fracciona la hemicelulosa y se obtienen los licores ricos en xilosa. Tambin se debe de aplicar un tratamiento de eliminacin de agua para tener una mayor cantidad de xilosa y aumentar los rendimientos en xilitol; presenta como inconveniente el que tambin se concentran el furfural y el cido actico, los cuales actan como inhibidores del crecimiento microbiano. Tambin ocasiona el incremento de la concentracin del cido empleado para llevar a cabo la hidrlisis, por lo que desciende mucho el pH del licor y disminuye la rentabilidad del proceso ya que en la etapa de neutralizacin, la cual es indispensable para que estos hidrolizados puedan emplearse como medios de cultivo, aumenta el gasto de lcali y de sal formada. 9, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22 Se ha empleado el carbn activado para eliminar los inhibidores de crecimiento microbiano formados durante la hidrlisis cida de materiales lignocelulsicos. Un ejemplo de su uso es en hidrolizados de olote de maz, en los cuales el rendimiento en xilitol se vio mejorado cuando fue tratado con carbn activado. Se ha estudiado el efecto de la temperatura, pH y proporcin de hidrolizado: carbn activado sobre el proceso de adsorcin de cido actico, cido levulnico, hidroximetilfurfural y furfural, en licores obtenidos por hidrlisis cida de madera de eucalipto, probando la efectividad del proceso sembrando en ellos Debaryomyces hansenii, levadura productora de xilitol. Tambin se han comparado tratamientos con carbn activado con otros procesos, como por ejemplo, produccin de xilitol por Candida guilliermondii en hidrolizados de eucalipto tratados con carbn activado en combinacin con pH, en comparacin con el tratamiento en el que se utilizan resinas de intercambio inico, de los cuales el segundo tuvo mejores resultados.13, 23, 24

OBJETIVOS El objetivo general de esta investigacin es optimizar las etapas de detoxificacin y neutralizacin del proceso de produccin de xilitol por Candida parapsilosis, a partir de estudios realizados en hidrolizados de bagazo de caa de azcar y en medios de xilosa comercial.

MATERIALES Y MTODOS Hidrolizado de Bagazo de Caa (HBC) El bagazo se obtuvo de la molienda de caa de azcar de diferentes variedades y fue proporcionado por el Ingenio Mante, localizado en Cd. Mante, Tamaulipas, Mxico. Dicho material fue deshidratado, molido y tamizado, posteriormente se le aplic un tratamiento de hidrlisis cida con relacin slido-lquido de 1/10, 2% de cido fosfrico, 121 C y 60 min21 La etapa de concentracin se realiz hasta obtener un 25% del lquido inicial. Detoxificacin del hidrolizado de bagazo de caa} Tres niveles de pH (1, 3 y 5), tiempo (20, 40 y 60min) y carga (1 g de carbn activado/ 50, 40 y 30 g de hidrolizado) fueron probados en HBC conteniendo 53 g de xilosa/L. El pH correspondiente fue ajustado con la adicin de CaCO3 al HBC, seguido por una filtracin al vaco. Se colocaron 100 g de HBC en matraces de 250 ml de capacidad, se agitaron a 150 rpm a una temperatura de 45C. Neutralizacin de HBC con CaCO3, NH4OH y ambos lcalis Tres condiciones de neutralizacin, aplicadas a HBC 50 g de xilosa/L con pH 1.23, fueron probadas: 200 g de CaCO3/L; NH4OH 5 M, hasta alcanzar un pH de 7; 100 g de CaCO3/L y solucin NH4OH 5 M, hasta alcanzar un pH de 7.12. El volumen gastado de lcali y volumen final de HBC fueron medidos. Reactivacin y mantenimiento de la cepa Se emple una cepa liofilizada de Candida parapsilosis NRRL Y-2315 proporcionada por United States Departament of Agricultura Northern, Nacional Research Laboratory en Peoria, IL., USA. Este microorganismo fue inoculado en un medio con un contenido de 10 g de xilosa comercial/L, 5 g de peptona/L y 3 g de extracto de levadura/L y fue mantenido en agar, en tubo inclinado conteniendo un medio con los mismos componentes y concentraciones descritas previamente, ms 20 g de agar/L. Preparacin del inculo El inculo empleado fue preparado a partir del medio congelado antes mencionado, sembrado en 250 ml de medio con pH 5 y una composicin de 60 g de xilosa comercial/L, 5 g de peptona/L, 6 g de extracto de levadura/L y 6 g de extracto de malta/L, incubado a 126 rpm y 26C durante 144 h26. Otro inculo fue preparado en 250 ml de medio con pH 5 y un contenido de 15 g de xilosa comercial/L, 5g de peptona/L, 6 g de extracto de levadura/L, 6 g de extracto de malta/L, 5 g de KH2PO4/L, 2 g de NH4HSO4/L, incubado a 126 rpm y 26C durante 144 h. La adicin de KH2PO4 y NH4HSO4 se hizo en base a nutrientes empleados por Furlan y de Castro (2001).

Preparacin de medios de cultivo Se emplearon medios de cultivo con una composicin de 5 g de peptona/L, 6 g de extracto de levadura, 6 g de extracto de malta/L, variando la concentracin de xilosa a 15, 30, 45 y 60 g/L, pH 5 y 6, y temperaturas de 26 y 36C. Cada tratamiento probado se realiz por duplicado en 100ml de medio colocado en matraz de 250ml de capacidad con agitacin de 126 rpm y duracin de 144 h. Otros medios fueron preparados a partir de soluciones al 0, 2, 4 y 6 % de H3PO4, las cuales fueron neutralizadas con una solucin de KOH 5M hasta un pH de 5.0. Fueron medidos el volumen gastado de lcali y el volumen final de la solucin. Todos los tratamientos se realizaron por duplicado y tenan un mismo contenido de los siguientes nutrientes: 45 g de xilosa comercial/L, 5 g de peptona/L, 6 g de extracto de malta/L, 6 g de extracto de levadura/L. Las condiciones de incubacin fueron 26C, 126 rpm durante 144 horas. Mtodos analticos La biomasa fue determinada por peso seco, tomando alcuotas de 3 ml, centrifugacin a 4000 rpm durante 15 min y secado en una estufa a 105C. La determinacin de monosacridos, cidos orgnicos y productos (xilosa, glucosa, arabinosa, cido actico, xilitol y etanol) fue realizada en un Cromatgrafo de Lquidos de Alta Eficacia (CLAE) marca Hewlett Packard, serie 1100, con una columna de intercambio inico para separacin de polisacridos y cidos orgnicos Transgenomic ICSepICE-ION-300 y detector de ndice de Refraccin (IR). La determinacin de furfural fue realizada por espectrofotometra UV-Visible a una longitud de onda de 280 nm. Anlisis estadstico Los programas empleados fueron Excel y Statgraphics versin 4.0. En el estudio de la eliminacin de inhibidores del crecimiento microbiano en HBC ricos en xilosa se realiz un anlisis multifactorial fraccionado con tendencia centrada. En el estudio del efecto de la concentracin inicial de xilosa comercial, pH y temperatura sobre el rendimiento en producto, rendimiento en biomasa y productividad en medios de xilosa comercial, se realiz un anlisis de varianza multifactorial completo. En el estudio del efecto de la presencia de sales de fosfato sobre el rendimiento en producto, rendimiento en biomasa y productividad en medios de xilosa comercial, se realiz un anlisis de varianza unifactorial.

RESULTADOS Y DISCUSIN Optimizacin del proceso de detoxificacin de hidrolizados de bagazo de caa de azcar ricos en xilosa empleando un modelo estadstico

Diversos factores influyen sobre la efectividad de un tratamiento con carbn activado por lo cual se probaron combinaciones de pH, tiempo y carga de carbn activado (Cuadro 1) para conocer su efecto sobre los azcares que interesan como fuente de carbono en fermentaciones y sobre la eliminacin de sustancias inhibidoras del crecimiento microbiano que se encontraban presentes en el Hidrolizado de Bagazo de Caa Concentrado (HBCC). Las condiciones de temperatura y agitacin (45C y 150 rpm), que en este estudio estn constantes, ya han sido empleadas en tratamientos de detoxificacin con carbn activado, en hidrolizados de paja de arroz concentrados, dando resultados favorables.11
Cuadro 1. Diseo de experimentos y resultados obtenidos en el estudio de optimizacin del proceso de detoxificacin de hidrolizados de bagazo de caa de azcar ricos en xilosa. Experimento pH 1 2 3 4 5 6 7a 7b 7c 8 9 10 11 12 13 14 3 1 5 3 1 5 3 3 3 1 5 3 1 5 3 3 Variable independiente Dimensionales t 20 20 20 20 40 40 40 40 40 40 40 60 60 60 60 40 C 1/50 1/40 1/40 1/30 1/50 1/50 1/40 1/40 1/40 1/30 1/30 1/50 1/40 1/40 1/30 1/30 Adimensionales X1 0 -1 1 0 -1 1 0 0 0 -1 1 0 -1 1 0 0 X2 -1 -1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 X3 -1 0 0 1 -1 -1 0 0 0 1 1 -1 0 0 1 1 Y1 52.9 46.8 50.8 47.9 47.6 50.0 51.3 50.8 51.8 46.5 50.6 49.3 47.6 48.3 50.2 52.0 Y2 4.4 4.3 4.1 3.9 4.4 4.1 4.3 4.2 4.3 4.3 4.0 4.0 4.4 3.9 3.4 3.8 Y3 6.8 6.1 6.4 6.1 6.2 6.7 6.8 6.6 6.9 6.2 6.8 6.5 6.3 6.6 6.6 6.9 Y4 15.70 1.71 2.42 26.62 4.62 3.32 7.07 19.46 9.27 11.27 7.61 14.18 6.03 4.86 30.64 19.36 Y5 90.3 91.9 95.6 98.6 88.3 92.4 95.4 95.2 95.0 96.6 99.9 91.4 91.9 97.3 99.2 98.9 Variable dependiente

Para relacionar los resultados con las variables operacionales) se utiliz el siguiente modelo estadstico:

independientes

(variables

Y = a + bX1 + cX2 + dX3 + eX1X2 + fX2X3 + gX1X3 + h X1X1 + iX2X2 + jX3X3 Donde: X1=pH; X2=tiempo; X3=carga; Y1=concentracin de xilosa despus del tratamiento, g/L. Y2=concentracin de glucosa despus del tratamiento, g/L. Y3=concentracin de arabinosa despus del tratamiento, g/L. Y4=porcentaje de eliminacin de cido actico despus del tratamiento (PEAA). Y5=porcentaje de eliminacin de furfural despus del tratamiento (PEA).

Los coeficientes de determinacin entre lo estimado con el modelo estadstico y lo obtenido experimentalmente nos indican que el modelo es adecuado para las variables dependientes Y1 y Y5 (Cuadro 2).

Cuadro 2. Parmetros estadsticos de correlacin entre los modelos matemticos y los valores experimentales obtenidos. R2 0.9237 0.8091 0.8583 0.8821 0.9977 R2 ajustada 0.8093 0.5227 0.6458 0.7053 0.9943

Variable dependiente Y1 (Xilosa) Y2 (Glucosa) Y3 (Arabinosa) Y4 (PEAA) Y5 (PEF)

Este tipo de diseo experimental es un anlisis multifactorial fraccionado con tendencia centrada, el cual permite obtener grficos de superficie de respuesta como resultado del anlisis estadstico. Este tipo de anlisis es de gran utilidad para estimar los valores de las variables dependientes (concentraciones de xilosa, glucosa, arabinosa y porcentajes de eliminacin de cido actico y de furfural) que se obtendran con una cierta combinacin de variables operacionales, en el rango de valores experimentados, aunque estas no se hayan llevado a cabo. Esto permite predecir las condiciones ptimas del proceso, considerando que estas seran aquellas en las que se recupere el mximo de los azucares o en las que el porcentaje de eliminacin de inhibidores del crecimiento microbiano (cido actico y furfural) sea el mximo. En el Cuadro 3 se muestran diversas predicciones de las variables operacionales en las que se obtienen los mximos valores de las variables dependientes. En dicho cuadro tambin se incluy el porcentaje de recuperacin, ya que ste pudo ser calculado debido a que se tomaron muestras, antes y despus, de la etapa de detoxificacin.
Cuadro 3. Valores estimados de las variables dependientes y las variables operacionales, codificadas y no codificadas, en las que se obtendran dichos valores, empleando el modelo estadstico obtenido de un diseo experimental de anlisis multifactorial fraccionado con tendencia centrada. Variables dependientes Y1 (Xilosa) Y2 (Glucosa) Y3 (Arabinosa) Y4 (PEAA) Y5 (PEF) Y5 (PEF) *g/L; **% Punto estacionario Mximo Mximo Mximo Mximo Mximo Mantenido en 100 Codificadas X1 X2 X3 0.38 -0.99 -0.99 -1.00 -0.10 -0.45 0.42 0.27 0.25 -0.07 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.40 0.92 0.99 No codificadas pH t C 3.7 20.2 1/49.9 1.0 38.0 1/44.5 3.8 45.4 1/37.5 2.8 60.0 1/30.0 5.0 59.8 1/30.1 3.8 58.4 1/30.1 Valor % Recuperado estimado * 52.88 98.78 * 4.59 98.20 * 6.93 98.00 ** 28.53 71.47 **100.70 -0.70 **99.95 0.05

Como el objetivo principal de este estudio fue el de eliminar furfural y este modelo es adecuado para calcular el porcentaje de eliminacin de furfural (PEF), el Cuadro 4 muestra los valores que se obtendran de las diversas variables dependientes, si se realizaran las condiciones operacionales en las que se tiene un mximo PEF.
Cuadro 4. Valores de las variables dependientes estimados por el modelo estadstico en las condiciones de mximo porcentaje de eliminacin de furfural (PEF). Variables dependientes Y1 (Xilosa) Y2 (Glucosa) Y3 (Arabinosa) Y4 (PEAA) *g/L Codificadas X1 X2 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 0.99 No codificadas t C 59.9 1/30 59.9 1/30 59.9 1/30 59.9 1/30 Valor estimado *49.63 *3.48 *6.80 4.33% %Recuperado 92.72 74.49 96.30 95.66 Concentracin (g/L) 49.63 3.48 6.80 4.97

X3 0.99 0.99 0.99 0.99

pH 5 5 5 5

En este estudio, de acuerdo a lo estimado por el modelo estadstico y que se muestra en los cuadros, las concentraciones de furfural estuvieron por debajo de lo considerado txico para los microorganismos, lo cual es de 0.3 a 0.5 g/L.25

Estimacin de los porcentajes de prdida de hidrolizado o de la concentracin de sal formada durante la neutralizacin de HBCA con CaCO3, NH4OH y una combinacin de ambos lcalis La rentabilidad de un proceso de produccin va a depender de la optimizacin de la eficiencia del proceso en todas sus etapas. No conviene un proceso en el que la materia prima es muy econmica pero el costo de los reactivos y de las condiciones empleadas para llevarlo a cabo, es muy elevado. La estimacin de las prdidas de hidrolizado y de la concentracin de sal formada durante la neutralizacin se realizaron en hidrolizado de bagazo de caa concentrado obtenido con cido fosfrico. El carbonato de calcio (CaCO3) fue el lcali utilizado en el estudio de optimizacin del proceso de detoxificacin y ha sido empleado para la neutralizacin de hidrolizados de diferentes materiales lignocelulsicos formando sales insolubles que pueden retirarse del licor por medio de filtracin al vaco, 23, 26, 27, 28, 29 pero en el caso del HBC concentrado, su empleo result con prdidas que no fueron cuantificadas. Pensando en que los hidrolizados se obtengan utilizando cido fosfrico, se decidi probar con el hidrxido de amonio (NH4OH) ya que la sal formada durante la neutralizacin sera una sal fosfato de amonio, y se han reportado sales de amonio como nutriente de medios de cultivo para la produccin de xilitol en concentraciones de 2 a 3 g/L. 9, 11, 13, 30, 31 En este estudio, la neutralizacin con CaCO3 a una concentracin de 200 g/L fue suficiente para alcanzar un pH considerado como adecuado para el crecimiento de microorganismos, pero la prdida de HBC fue muy elevada (52%); el ajuste de pH con
9

NH4OH 5 M fue realizado pero dio como resultado un medio con elevada concentracin de sales, lo cual puede perjudicar a la produccin de biomasa y a la formacin de producto, adems se diluyeron los azcares, ya que aument su volumen en un 35.5%; una combinacin de ambos lcalis para la neutralizacin del HBC se estudi, encontrndose que con 100 g/L de CaCO3, ms la adicin de NH4OH 5 M, slo hubo una prdida del 33% de HBC, la cual fue menor pero no dej de ser elevada; tambin se formaron 44.89 g de sal/L (el 30.7% de la sal formada en la neutralizacin con solamente NH4OH 5M) y el aumento de volumen fue de 8.75%. Determinacin del efecto de la concentracin inicial de xilosa, el pH y la temperatura sobre la produccin de xilitol en medios de xilosa comercial inoculados con Candida parapsilosis Se ha mencionado que una mayor concentracin de xilosa al inicio de la fermentacin mejora la bioconversin de este monosacrido en xilitol11, 32 pero la concentracin inicial de xilosa en un hidrolizado va a depender del material lignocelulsico, de las condiciones de obtencin del licor y de la aplicacin de operaciones de concentracin. Por otra parte, la produccin de xilitol va a depender de la capacidad del microorganismo para la bioconversin de xilosa a xilitol, de la concentracin inicial de xilosa as como de otros factores como pH, temperatura y disponibilidad de oxgeno entre otros.11 Para conocer el efecto de la concentracin inicial de xilosa, el pH y la temperatura sobre la produccin de xilitol inoculado con Candida parapsilosis, se experiment con cuatro concentraciones iniciales de xilosa comercial, dos pH y dos temperaturas, permaneciendo igual para todos los tratamientos la agitacin, el inculo y el tiempo de incubacin. Las combinaciones realizadas y los resultados obtenidos en rendimiento en producto (YP/S), rendimiento en biomasa (YX/S) y productividad (QP) se muestran en el Cuadro 5.
Cuadro 5. Variables empleadas y promedios de los resultados obtenidos (+/- desviacin estndar). XILOSA INICIAL 15 15 15 15 30 30 30 30 45 45 45 45 60 60 60 60 pH 5 6 5 6 5 6 5 6 5 6 5 6 5 6 5 6 C 26 26 36 36 26 26 36 36 26 26 36 36 26 26 36 36 YP/S 0.32+/-0.06 0.30+/-0.07 0.29+/-0.01 0.26+/-0.01 0.50+/-0.08 0.53+/-0.05 0.49+/-0.06 0.39+/-0.03 0.44+/-0.06 0.61+/-0.09 0.44+/-0.07 0.47+/-0.08 0.54+/-0.09 0.52+/-0.05 0.52+/-0.04 0.39+/-0.11 YX/S 0.34+/-0.03 0.31+/-0.05 0.30+/-0.02 0.27+/-0.03 0.24+/-0.05 0.22+/-0.03 0.23+/-0.02 0.22+/-0.05 0.20+/-0.01 0.22+/-0.04 0.14+/-0.03 0.22+/-0.03 0.18+/-0.01 0.17+/-0.01 0.17+/-0.02 0.16+/-0.03 QP 0.04+/-0.00 0.03+/-0.00 0.04+/-0.00 0.03+/-0.00 0.07+/-0.01 0.06+/-0.01 0.07+/-0.00 0.05+/-0.01 0.07+/-0.03 0.08+/-0.01 0.06+/-0.01 0.05+/-0.00 0.08+/-0.02 0.09+/-0.01 0.07+/-0.00 0.05+/-0.01

10

El mayor rendimiento en biomasa que se obtuvo fue utilizando 15 g/L pH 5, 26C (Yx/s=0.34 +/- 0.03 g/g), la mayor productividad a 60 g/L, pH 6 y 26C (0.09 +/- 0.01), y el mayor rendimiento en producto a 45g/L, pH 5 y 26C (0.61 +/- 0.09) (Figura 1). Este rendimiento en producto est en el rango de los reportados en otros estudios, en los cuales se emplearon diversas condiciones y microorganismos para llevar a cabo la produccin de xilitol: 0.31 a 0.63 por Candida parapsilosis; 0.73 por C. shehatae; 0.49 a 0.75 por C. guilliermondii; 0.61 por 1EC5; 0.6 y 0.5 por Phaffia rhodozyma; 0.31 a 0.62 por Debaryomyces hansenii. 9, 11, 12, 24, 30, 32

YP/S (g/g)
0.8

YX/S (g/g)

QP (g/L h)

(a) pH 5 - 26 C
0.6

(b) pH 6 - 26 C

0.4

0.2

0 0.8

(c) pH 5 - 36 C
0.6

(d) pH 6 - 36 C

0.4

0.2

0 15 30 45 60 15 30 45 60

Xilosa inicial (g/L)

Xilosa inicial (g/L)

Fig.1. Diagramas de barras en las que se compara los valores promedio con error estndar del rendimiento en producto, el rendimiento en biomasa y la productividad obtenidos a concentraciones iniciales de xilosa comercial de 15, 30, 45 y 60g/L a (a) pH 5-26C, (b) pH 6-26C, (c) pH 536C y (d) pH 636C.

Determinacin del efecto de sales de fosfato sobre el YP/S, YX/S y QP en medios de xilosa comercial inoculados con Candida parapsilosis Las sales de fosfato de potasio (KH2PO4) han sido reportadas como un nutriente para microorganismos productores de xilitol, en concentraciones de 2 a 5g/L. 9, 30, 31 Resulta interesante investigar si la Candida parapsilosis puede crecer en altas concentraciones de esta sal, ya que de esta manera sera posible emplear al hidrxido de potasio como lcali en la etapa de neutralizacin del HBC obtenido con cido fosfrico. Se prefiri realizar la neutralizacin en lugar de agregar la sal, puesto que son tres las sales (KH2PO3, K2HPO3 y K3PO3) que posiblemente se formen durante esa etapa y no sabemos con certeza cules de ellas, y en qu proporcin, se generan durante la neutralizacin. Para determinar si el efecto es estadsticamente significativo se realiz un anlisis de varianza unifactorial (ANOVA, por sus siglas en ingls) con el que se demostr que s
11

fue significativo el efecto de la concentracin de sales para todas las mediciones antes mencionadas, ya que el valor P fue menor a 0.05 en todos los casos.
Cuadro 6. Tratamientos realizados para la determinacin del efecto de las sales de fosfato el YP/S, YX/S, QP en medios de xilosa comercial inoculados con Candida parapsilosis. TRATAMIENTO %H3PO4 INICIAL VOLUMEN (ml) 100 100 100 100 ml KOH 5M pH 5.02 1.49 1.13 1.00 0.00 8.25 15.85 23.55 FINAL VOLUMEN (ml) 100.00 108.25 115.85 123.55 g DE KH2PO4/L ESTIMADO 0.0 51.8 93.0 129.6

pH 5.02 5.01 5.02 5.07

CONTROL T1 T2 T3

0 2 4 6

Cuadro 7. Promedios de los resultados obtenidos en cada tratamiento (+/- desviacin estndar). TRATAMIENTO CONTROL T1 T2 T3 YP/S 0.26+/-0.01 0.21+/-0.01 0.06+/-0.02 0.02+/-0.00 YX/S 0.23+/-0.02 0.19+/-0.03 0.17+/-0.05 0.14+/-0.04 QP 0.067+/-0.002 0.040+/-0.010 0.010+/-0.001 0.005+/-0.000

YP/X 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 CONTROL T1

YX/S

QP

T2

T3

Fig. 2. Diagramas de barras en las que se compara los valores promedio con error estndar del rendimiento en producto (g/g), rendimiento en biomasa (g/g) y productividad (g/L h).

De los medios que contenan sal fosfato de potasio, el T1 fue el que tuvo un mayor porcentaje de rendimiento en producto, rendimiento en biomasa y productividad, considerando lo obtenido en el control (testigo) como un 100% (Cuadro 8). A pesar de que la concentracin de sal cuantificada como fosfato de potasio dicido era de 51.3 g/L en el T1 sta slo redujo su rendimiento en xilitol a 83.13% del obtenido en el control lo que lo convierte en una posible opcin de neutralizacin, slo que esta concentracin corresponde a lo formado a partir de una concentracin de 2% de cido

12

fosfrico, lo que hace pensar que sera necesario realizar un estudio ms en el cual primero se neutralice con otro lcali, formando una sal insoluble y retirarla del medio y despus con el hidrxido de potasio, procurando no exceder de la cantidad utilizada en el T1.
Cuadro 8. Porcentajes obtenidos en los T1, T2 y T3 considerando a lo obtenido en el control como 100%. TRATAMIENTO CONTROL T1 T2 T3 YP/S 100.00 83.13 25.75 8.98 YX/S 100.00 80.78 71.73 59.55 QP 100.00 60.38 16.04 8.52

CONCLUSIONES Se logr optimizar las condiciones de detoxificacin para el Hidrolizado de Bagazo de Caa concentrado (HBC) logrando una eliminacin del furfural desde el 88 hasta el 99%, obtenindose concentraciones inferiores de las conocidas como txicas para los microorganismos. En cuanto al clculo de las prdidas de HBC rico en xilosa durante la neutralizacin con diferentes lcalis, de las opciones estudiadas, las que podran afectar ms a la rentabilidad del proceso es emplear solamente CaCO3 NH4OH siendo lo ms recomendable aplicar una combinacin de ambos. Por otra parte, puede utilizarse el HBC sin tratamiento de concentracin cuando se desea producir biomasa y ste debe concentrarse en un rango de 30 a 60g de xilosa/L cuando se utilice para producir xilitol. Debe, asimismo, buscarse condiciones de neutralizacin en las que las sales formadas sean lo mnimo posible, ya que se observ un efecto negativo de las mismas.

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