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Universidad Autnoma del Estado de Mxico Centro Universitario UAEM Amecameca Medicina Veterinaria y Zootecnia

PRACTICA 1.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Y TCNICAS UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE VIROLOGA

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio


OBJETIVO: El alumno aplicar las medidas de bioseguridad necesarias para trabajar en el laboratorio. El alumno practicar las tcnicas asptica, de desinfeccin, antisepsia y de trabajo en rea estril. INTRODUCCIN Un laboratorio tiene elementos peligrosos para nuestra integridad personal, tal es el caso de las quemaduras por lquidos hirviendo, descargas elctricas debidas a enchufes o cables deteriorados, explosiones por prdidas de gas, cortaduras con instrumentos filosos, adems existen otros elementos potencialmente peligrosos como material biolgico proveniente de los pacientes, reactivos qumicos de diferente naturaleza como cidos, productos custicos, voltiles como el ter, altamente txicos y cancergenos como el fenol. El trabajo cotidiano de laboratorio puede resultar peligros, sin embargo la mejor defensa de nuestra integridad depende de nosotros mismos, de los buenos hbitos, del respeto por las normas de seguridad y del conocimiento de dnde reside el peligro, todas estas servirn para apreciar, valorar y disfrutar el enriquecedor trabajo de laboratorio. El riesgo de que se produzca un accidente, se puede disminuir a niveles muy bajos siempre que se tengan en cuenta las siguientes consideraciones. Tener conocimiento de los elementos de riesgo Conocer la forma de manejarlos Adoptar tcnicas apropiadas de contencin de riesgo. ELEMENTOS DE RIESGO, HBITOS DE HIGIENE MANOS: Las manos tocan la suciedad, las fuentes de infeccin y las llevamos a la boca o a los ojos que son a su vez las puertas de entrada de muchas infecciones. Por otro lado, las heridas, los pinchazos y abrasiones ocurren generalmente en las manos ya que el resto del cuerpo esta protegido por la ropa.
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En el laboratorio se deben lavar las manos con jabn cuantas veces sea necesario e incluso se puede utilizar algn antisptico y si la tarea lo requiere, utilizar guantes. La posibilidad de contaminarse o lastimarse se encuentra muy disminuida al usar guantes. Si bien el uso del guante protege al usuario, este debe abstenerse de tocar otros elementos de uso comn con la mano enguantada. CUERPO: El utilizar una bata de tela gruesa, de manga larga, con el largo a la rodilla, perfectamente cerrada, impide daos mayores a la hora de trabajar con reactivos qumicos, suspensiones de agentes patgenos o salpicaduras con algn material infeccioso o sangre. La bata debe quitarse antes de abandonar el laboratorio y guardarse evitando contacto con ropa de calle. Lo ideal es lavarla despus de cada sesin. OJOS: Se recomienda el uso de anteojos o mscaras cuando se trasvasan cantidades apreciables de lquidos corrosivos para evitar salpicaduras que pueden producir lesiones serias en la crnea, tambin cuando se generan vapores qumicos. En caso de salpicaduras o produccin de aerosoles con material infeccioso, los ojos son una va de entrada importante. Cuando este manejo se requiera hacer debemos ver la posibilidad de trabajar en una campana para manejar material biolgico peligroso y utilizar mscaras de proteccin. BOCA: Utilizar la boca para aspirar lquidos con una pipeta debe ser evitado, para ello existen en la actualidad dispositivos apropiados para hacerlo, como pipetas automticas, peras de goma, dispensadores, etc. El manejo de estos elementos es simple y no se producen errores de medicin. No deben introducirse a la boca lpices o plumas que se dejan en cualquier lugar, no fumar, no ingerir o beber sustancias txicas en vasos mal lavados o contaminados por accidente, debe considerarse que el laboratorio es un lugar de trabajo no apto para el consumo de alimentos slidos o lquidos, asimismo no maquillarse o acicalarse en el mismo. Hay que recordar que las reglas de BIOSEGURIDAD no son represivas sino que surgen como una forma de conservar nuestras vidas en plenitud MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Bata Guantes de ltex Cubre bocas Cofia Lentes de seguridad (uno por equipo)

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MTODO: 1. El instructor junto con los alumnos revisarn las medidas de bioseguridad que debern observar y aplicar durante el desarrollo de prcticas. RESULTADOS Reportar al instructor si tiene alguna duda u observacin acerca de las medidas de bioseguridad en el laboratorio. CUESTIONARIO: 1. Qu elementos de proteccin o de bioseguridad debe usted utilizar en forma obligatoria dentro del laboratorio de virologa. 2. Como debe conducirse dentro del laboratorio de virologa. TCNICAS UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE VIROLOGA. DESINFECCIN Y ANTISEPSIA: Tanto en el laboratorio de virologa como en la prctica rutinaria veterinaria es indispensable conocer y aplicar correctamente las tcnicas de desinfeccin y antisepsia. Desinfeccin: Consiste en la destruccin, inhibicin o eliminacin de microorganismos que pueden causar enfermedades (patgenos). Los desinfectantes son agentes generalmente qumicos y se utilizan en objetos inanimados. Un desinfectante no esteriliza necesariamente un objeto ya que pueden permanecer esporas y algunos microorganismos viables. Antisepsia (del Griego anti=contra; sepsis=putrefaccin) Es la prevencin de una infeccin o sepsis y se realiza con antispticos, los cuales son agentes qumicos que se aplican sobre los tejidos destruyendo o inhibiendo el crecimiento de los agentes patgenos. Las sustancias que destruyen los organismos, tienen el sufijo cida =destruir Un germicida destruye agentes patgenos (y no patgenos), pero no esporas. Algunas veces un desinfectante o antisptico es particularmente eficaz contra un grupo especfico de agentes y se denomina segn sea el caso: Viricida= destruye virus Bactericida= destruye bacterias Fungicida=destruye hongos Esporocida=destruye esporas
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Otras sustancias qumicas no destruyen sino que impiden el crecimiento del agente patgeno, estos terminan con el sufijo sttico (del Griego statikos = que causa detencin), por ejemplo: Bacteriosttico: detiene el crecimiento bacteriano Fungisttico: detiene el crecimiento de hongos MATERIAL QUE EL ALUMNO DEBE TRAER: 1 jabn de tocador 1 marcador indeleble 2 torundas de algodn secas MATERIAL POR EQUIPO: 4 cajas de Petri con agar biotriptosa 2 hisopos estriles envueltos en papel estraza. MATERIAL POR GRUPO: 1 frasco con alcohol 1 frasco con yodo al 2% 1 frasco con formol Estufa de incubacin a 37C. MTODO: Superficie inanimada: 1. Rotular con marcador indeleble las 4 cajas de Petri con agar biotriptosa del nmero 1 al 4, adems con el nmero de equipo 2. Tomar una muestra con un hisopo estril del rea que le indique el instructor sin limpiar ni desinfectar y sembrar por estra en la primera caja de Petri (CAJA 1). 3. Tomar una muestra con un hisopo estril de la misma rea una vez realizada la indicacin del instructor: 4. Limpiar 5. Desinfectar 6. Limpiar y desinfectar 7. Sembrar por estra en la segunda caja de Petri (CAJA 2) Manos: 8. Un integrante del equipo sin lavarse las manos apoyar su mano ligeramente sobre el agar biotriptosa de la tercera caja de Petri (CAJA 3) 9. El mismo integrante del equipo, realizar alguna de las siguientes acciones: 10. Lavado de manos 11. Lavado y antisepsia de manos 12. nicamente antisepsia de manos
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13. Utilizar el desinfectante indicado por el instructor 14. Deber tener cuidado de no tocar ningn objeto, por lo que otro integrante del equipo le ayudar a abrir y cerrar llaves del agua, esperara a que sequen sus manos y volver a colocar su mano en la cuarta caja de Petri (CAJA 4) 15. Colocar las cajas de Petri con medios de cultivo en la estufa bacteriolgica invertidos. 16. Incubar durante 24 horas a 37C. 17. Realizar la lectura: la presencia de colonias bacterianas en los medios slidos indicarn la presencia de bacterias. RESULTADOS: Esquematice los resultados que observa en cada una de sus cajas de Petri.

CAJA 1

CAJA 2

CAJA 3

CAJA 4

CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. El desinfectante que utiliz fue eficaz? Hubo reduccin en la carga bacteriana presente en la mesa de trabajo? El procedimiento de antisepsia que realiz fue eficaz? Se redujo la carga bacteriana de sus manos? Qu marca de jabn utiliz?, Cul es su ingrediente activo?
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TCNICA ASPTICA Y REA DE ESTERILIDAD: Cuando se requiere trabajar con material estril o bien con algn material infeccioso del que se requiere aislar al agente patgeno involucrado, se debe trabajar de manera asptica y en rea de esterilidad. El objetivo de ello es evitar la contaminacin por agentes presentes en el ambiente que pudieran interferir en la identificacin del agente o contaminar el material con que se esta trabajando en determinado momento y confundirnos en el diagnstico. Consiste en desinfectar el rea de trabajo, realizar la antisepsia de las manos o utilizar guantes estriles, utilizar cubre bocas y trabajar alrededor de un mechero con la seguridad de que en un dimetro de 20 cm alrededor de su flama podremos trabajar sin que el material con que se trabaje se contamine MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Jabn (detergente en polvo) Franela Maskin tape MATERIAL POR EQUIPO: 1 Tubo bacteriolgico de 3 ml con tapn de baquelita sin esterilizar 1 Tubo bacteriolgico de 10 m con tapn de baquelita sin esterilizar 1 asa bacteriolgica 1 caja de Petri sin esterilizar 1 frasco de 10 ml con tapn de plstico sin esterilizar 1 Mechero MTODO: 1. El instructor har la demostracin de la tcnica asptica y como debe trabajarse en rea de esterilidad. 2. Limpiar el rea de trabajo con jabn (detergente en polvo) 3. Desinfectar el rea utilizando una torunda con alcohol 4. Lavarse las manos con jabn 5. Realizar la antisepsia de las manos con una torunda con alcohol, esperar a que este se evapore. 6. Encender el mechero 7. Practicar el manejo del material en rea de esterilidad, de acuerdo a lo demostrado previamente (todos los integrantes del equipo). RESULTADOS: Reporte al instructor si concluyo satisfactoriamente sus ejercicios o si tuvo algn problema.

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CUESTIONARIO: 1. Explique la importancia de trabajar en rea estril, en el laboratorio de virologa 2. Qu rea de esterilidad le proporciona un mechero ELIMINACIN DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. Las cajas de Petri con los cultivos, despus de su lectura sern esterilizadas, el agar lquido se vaciar en una bolsa plstica para su disposicin final en la basura 2. El material de vidrio ser lavado y secado para su reutilizacin 3. Los hisopos y las torundas sern eliminados en la basura 4. El jabn, el marcador indeleble y los desinfectantes sern guardados para su posterior utilizacin BIBLIOGRAFA: Prescott, L. M.; Harley, J.P. and Klein, D.A.: Microbiologa. MaC Graw-Hill Interamericana. 4a Edicin, Espaa 1999. Davis, B. D.; Dulbecco., R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S. and Wood, W. B.: Microbiology, Harper & Row. 2a Edicin. USA. 1973 Carter, G. R.: Bacteriologa y Micologa Veterinarias. Manual Moderno. 1 . Mxico. 1985.

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PRACTICA 2.
ESTERILIZACIN DE MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO EN EL LABORATORIO DE VIROLOGA

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio


OBJETIVOS: El alumno conocer las bases tericas de las diferentes tcnicas de esterilizacin utilizadas en el laboratorio de Microbiologa. El alumno practicar la preparacin de material y emplear el autoclave para esterilizarlo. El alumno comprobar la efectividad del proceso de esterilizacin empleado. INTRODUCCIN: Aunque muchos microorganismos son beneficiosos para el bienestar humano y animal, otros pueden tener consecuencias indeseables como la putrefaccin de los alimentos y el desarrollo de las enfermedades, por lo que es fundamental poder destruir los microorganismos o inhibir su crecimiento para minimizar sus efectos destructivos. Conocer los agentes fsicos y qumicos que se pueden utilizar para llevar a cabo las tcnicas de esterilizacin, es de mucha utilidad ya que stas tcnicas son utilizadas rutinariamente tanto en el laboratorio de microbiologa como en la prctica veterinaria. Esterilizacin: (del Latn sterilis = incapaz de reproducirse): Es el proceso por el que todas las clulas vivas, esporas viables, virus y viroides son eliminados de un objeto o hbitat. Un objeto esterilizado esta totalmente libre de microorganismos viables: clulas vivas, esporas viables, virus y viroides. El criterio de esterilizacin se basa en la incapacidad de un microorganismo para crecer cuando se proporciona un medio adecuado. AGENTES FSICOS CALOR HMEDO: La aplicacin de calor es el mtodo ms simple para esterilizar material siempre y cuando este sea resistente al dao por calor. Las constantes de esterilizacin por este mtodo son: una temperatura de 121C a una presin de 15 libras por 15 minutos. Se piensa que el calor hmedo destruye eficazmente al degradar los cidos nucleicos y desnaturalizar las enzimas y otras protenas esenciales, tambin
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puede alterar las membranas celulares. El calor hmedo (vapor) mata las clulas vegetativas y endosporas con gran rapidez cuando se encuentran hmedas, entre 10 y 12 minutos, pero se contina durante 15 minutos para tener un margen de seguridad; adems el vapor proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente en todas las partes del esterilizador. La esterilizacin mata todas las formas bacterianas vegetativas y las esporas, hongos, virus y viroides. Los priones requieren de una temperatura superior a los 134C durante 18 minutos. Para esterilizar por calor hmedo se utilizan las autoclaves o las ollas de presin cuyo funcionamiento consiste en hervir agua para producir vapor, que pasa a travs de una camisa al interior de la cmara del autoclave. Se expulsa el aire que inicialmente se encuentra en la cmara hasta que sta queda llena de vapor saturado y se cierran las salidas (vlvula). El vapor saturado y caliente contina entrando a la cmara hasta alcanzar la temperatura y presin deseadas. Cuando se requiere esterilizar volmenes grandes hay que alargar el tiempo de esterilizacin para que el centro del volumen alcance la temperatura adecuada (5 litros requieren 70 minutos de esterilizacin). Para comprobar que la carga del autoclave ha quedado esterilizada se pueden utilizar varios mtodos: Indicador biolgico: este se incluye junto con el resto del material en la carga del autoclave; consiste generalmente en una ampolleta estril y una tira de papel cubierta de esporas de Bacillus stearothermophilus o Clostridium, despus de la esterilizacin, se rompe la ampolleta en forma asptica y se incuba durante varios das. Si la bacteria no crece en el medio, los materiales han quedado esterilizados. Cinta testigo: es una cinta especial o una tira de papel indicador que cambian de color despus del tratamiento, se supone que el material esta estril pero no es muy confiable. Prueba de control de esterilidad: generalmente se utiliza para lquidos, consiste en sembrar una muestra
del mismo en medios de cultivo para bacterias aerobias y para anaerobias, se incuba a 37C durante varios das; si no hay crecimiento bacteriano se considera efectivo el proceso.

EBULLICIN: El agua hirviendo o el vapor de agua (esterilizador comn) a 100C, es til para desinfectar jeringas, agujas y otros instrumentos utilizados en ciruga menor. Este procedimiento elimina a los virus, formas vegetativas de bacterias y algunas esporas en 10 minutos pero otras esporas son resistentes ( Bacillus y Clostridium ) as como el virus de la Hepatitis B. No es un proceso de esterilizacin de acuerdo a la definicin. CALOR SECO: Se utiliza para esterilizar materiales que deben permanecer secos. Se realiza en hornos elctricos (Horno Pasteur) o en una estufa por los que circula el aire
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caliente. En vista que el calor es menos eficaz en materiales secos se utilizan temperaturas de 160 a 170C durante dos o tres horas. La destruccin microbiana se produce aparentemente como consecuencia de la oxidacin de los constituyentes celulares y la desnaturalizacin de las protenas. Aunque el calor de aire seco es menos eficaz que el hmedo tiene la ventaja de que no corroe las vasijas ni los utensilios metlicos como lo hace el calor hmedo y puede emplearse para esterilizar medios deshidratados, aceite y materiales similares, material de cristalera pero no materiales termosensibles como objetos de plstico y goma. FILTRACIN: Se ha utilizado para reducir la poblacin microbiana en soluciones de componentes termosensibles y a veces puede emplearse incluso para esterilizarlas, por ejemplo: medios bacteriolgicos, suero, soluciones inyectables y otros productos. Ms que destruir directamente a los microorganismos contaminantes, el filtro los elimina. Actualmente los filtros ms usados son los filtros de membrana, los cuales son membranas porosas con un grosor algo superior a 0.1 mm, fabricadas de acetato de celulosa, nitrato de celulosa, policarbonato u otros materiales sintticos. Se encuentran disponibles en una amplia variedad de dimetros de poro, varan entre 0.22 y 10 m. Los filtros con poro de dimetro burdo se usan para clarificar las soluciones y eliminar el material grueso (prefiltrado) antes de filtrar con poros de menor tamao para eliminar bacterias (0.2 micrmetros de dimetro) pero no logran retener virus o micoplasmas. Las membranas se sujetan a soportes especiales (filtros) a travs de los cuales se pasa la solucin con vaco o a presin aplicndolos con una jeringa o una bomba de vaco y se recogen en recipientes esterilizados previamente. Por filtracin tambin puede esterilizarse el aire, por ejemplo: las mascarillas y los tapones de algodn de los tubos de cultivo que permiten el paso del aire pero no de los microorganismos. Tambin las cabinas de seguridad biolgica que utilizan filtros de alta eficacia de retencin de partculas de aire eliminando el 99% de partculas mayores a 0.3 micrmetros. Estas fuerzan el aire a pasar los filtros creando una cortina de aire estril que protege al operador de los microorganismos que esta trabajando y evita la contaminacin de la habitacin. RADIACIONES: Radiacin ultravioleta (UV): La exposicin directa a la luz solar (porcin ultravioleta del espectro de aproximadamente 260 nm puede ser letal, destruye con facilidad las formas vegetativas de los microorganismos pero las esporas son resistentes y no atraviesa muy eficazmente el cristal, pelculas de materia orgnica, ni el agua. En forma artificial se obtiene con lmparas de vapor de mercurio y se usan ampliamente en techos de cubculos de inoculacin,
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quirfanos, corraletas y otras reas con el fin de reducir infecciones por aerosoles ya que esteriliza el aire y otras superficies expuestas. Estas radiaciones actan causando errores en la replicacin del DNA. Son eficaces contra la mayora de bacterias, hongos y virus. La radiacin UV, quema la piel y lesiona los ojos, por lo que debe asegurarse que las lmparas estn apagadas cuando se trabaje en donde estas se encuentran. Radiaciones ionizantes: Esta forma contiene ms energa que la luz ultravioleta y posee un mayor poder desinfectante. Por lo que es un agente esterilizante excelente y penetra profundamente los objetos. Los rayos gamma procedentes de una fuente de cobalto 60 se utilizan para esterilizar en fro antibiticos, hormonas, suturas, jeringas, agujas, pipetas, material quirrgico, objetos de plsticos o susceptibles al calor. Se ha empleado tambin para esterilizar y pasteurizar carne y otros alimentos. Ondas snicas y ultrasnicas: estas destruyen la pared celular AGENTES QUMICOS: GASES ESTERILIZANTES: Oxido de etileno, mezclado con CO2 al 90% o con un fluorocarbono se vuelve no explosivo y se constituye como agente esterilizante muy confiable para superficies secas (gas que se deja actuar por 4 a 18 horas). Sirve para desinfectar sabanas, cojines, colchones, instrumental, cristal, plstico, libros, papeles; pero requiere equipo especial. Penetra materiales embalados e inclusive bolsas de plstico. La esterilizacin se lleva a cabo en un esterilizador especial de oxido de etileno en el que se controla la concentracin de este, la temperatura y la humedad. Es muy txico por lo que necesita airearse muy bien el material esterilizado. Betapropiolactona: se emplea a veces como gas esterilizante, En forma lquida esteriliza sueros e inactiva los virus en las vacunas, Destruye los microorganismos ms rpido que el oxido de etileno pero no penetra tan bien los materiales y puede ser cancergena. MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Frascos de diferente tamao, boca ancha (adecuados para toma de muestra), con o sin tapn 50 g de algodn 20 cm de cordel o hilaza 1 pliego de papel estraza Tijeras Masking tape
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Cuadrado de manta de cielo doble de 15 x 15 cm o 4 gasas grandes 2 Cuadrados de papel aluminio de 15 x 15 cm

MATERIAL POR EQUIPO: 2 tubos bacteriolgicos de 10 ml sin esterilizar 4 palitos de madera 1 Mechero Tubo con agar biotriptosa Tubo con caldo tioglicolato 1 gradilla

MATERIAL POR GRUPO:

Frasco de torundas con alcohol. Estufa bacteriolgica a 37C Cinta testigo para esterilizacin.

MTODO: 1. El instructor demostrar la forma en que se prepara el material para su esterilizacin 2. Preparar los frascos para su esterilizacin. 3. Preparar dos hisopos y colocar uno dentro de cada tubo bacteriolgico. 4. Preparar dos hisopos y envolverlos en papel estraza para su esterilizacin 5. Identificar el material con el nmero de equipo 6. Colocar una tira de cinta testigo para esterilizar, en algn material de la carga. 7. Acomodar el material dentro de la autoclave. 8. Llevar a cabo el proceso de esterilizacin. Cuando se registren las constantes de esterilizacin (121C/15lb), tomar el tiempo (15 minutos). 9. Apagar el autoclave cuando haya transcurrido el tiempo. 10. Esperar a que se enfre el autoclave. 11. Sacar el material de la autoclave. CUIDADO! 12. Desinfectar su superficie de trabajo con una torunda con alcohol 13. Prender el mechero. 14. Trabajar en rea de esterilidad. Dos integrantes del equipo previa antisepsia de sus manos realizaran la prueba de esterilidad del material esterilizado. Junto al mechero abrir un tubo bacteriolgico conteniendo un hisopo e introducirlo en el tubo con agar biotriptosa (medio para bacterias aerobias), cerrarlo al primer toque. 15. Repetir la maniobra utilizando el tubo de caldo tioglicolato (medio para bacterias anaerobias), cerrarlo hermticamente. 16. Identificar los tubos con el nmero de equipo
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17. Colocar los tubos en la gradilla que se indique 18. Incubar a 37C/24 horas 19. Leer la prueba de esterilidad. RESULTADOS: Reporte que cambios observ en la cinta testigo de esterilizacin. Reporte la lectura de la prueba de esterilidad que realiz. En base a los resultados obtenidos, concluya si el proceso de esterilizacin fue efectivo. CUESTIONARIO: 1. Escriba las constantes de esterilizacin para calor hmedo y seco? 2. La esterilizacin en autoclave, con qu mtodo fsico trabaja? 3. Si estuviera en un lugar en donde no tuviera al alcance ningn mtodo de laboratorio para esterilizar material quirrgico,qu mtodo utilizara?. ELIMINACIN DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. E material de cristalera ser guardado para su uso posterior. 2. Los medios de cultivo con los hisopos, s pasaron la prueba de esterilidad, los slidos sern calentados y el agar en forma lquida ser eliminado en una bolsa para su disposicin final en la basura. El lquido ser eliminado en la tarja. Si no pasaron la prueba sern esterilizados previamente, para despus disponerlos de la misma manera. 3. Las torundas con alcohol sern eliminadas en la basura. 4. Los hisopos estriles restantes sern guardados por los integrantes del equipo para su uso posterior en la prctica 3: Toma, conservacin y envo de muestras para diagnstico vital.

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PRACTICA 3.
TOMA, CONSERVACION Y ENVIO DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO VIRAL.

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio


OBJETIVO: El alumno conocer las bases tericas para una adecuada toma, conservacin y envo de muestras virolgicas. INTRODUCCION Para demostrar la existencia de un virus o para aislarlo, el primer paso es la toma muestras del husped infectado. La toma debe hacerse en el momento en que se suponga que la concentracin de virus es mxima, es decir en los primeros estadios de la enfermedad (al principio de la infeccin), y antes de que comience la produccin de anticuerpos; para su envo inmediato al laboratorio. En animales vivos pueden tomarse muestras de sangre, esputos, lavados nasales y oculares, lquido cefalorraqudeo, otros fluidos, secreciones y excretas de casos clnicos. En animales muertos o sometidos a necropsia las muestras deben tomarse de inmediato (2 hrs. despus de su muerte), ya que de lo contrario los virus pueden ser destruidos por desecacin, inactivacin trmica o descomposicin bacteriana. Se debe colectar el tejido por el que el virus presente mayor tropismo por ejemplo, deben procurarse muestras traquales, pulmonares y nasales, en enfermedades del aparato respiratorio, como Bronquitis Infecciosa, Laringotraquetis, etc. De cerebro y mdula espinal, en padecimientos del sistema nervioso como son los casos de Rabia, Aujezsky, Encefalitis, etc. De sangre, hgado y bazo en animales con enfermedades generalizadas como en Newcastle, Peste Porcina Clsica, Moquillo Canino y otras. La seleccin de las muestras que se deben colectar depende de que se sospeche de la patogenia de la enfermedad viral. De ser posible se debe procurar tomar la muestra en condiciones aspticas. Debido a que los virus son muy lbiles, las muestras deben mantenerse siempre fras e inmersas en un medio protector, por ejemplo: caldo triptosa, gelatina (0.25- 0.5%), albmina srica de bovina, glicerina con solucin salina fisiolgica (50%). Con frecuencia se agregan antibiticos a las muestras para impedir el crecimiento de bacterias, a menos que se hayan obtenido en condiciones
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estriles. Para conservar las muestras suele utilizarse una combinacin de Penicilina (1000-10000 UI) y Estreptomicina (1-10 mg) por ml o gr de muestra, usando concentraciones ms elevadas para muestras fecales. Conservacin de las muestras virolgicas durante su envo al laboratorio. Congelacin: para la transportacin y preservacin temporal de la muestra, un termo conteniendo hielo seco es suficiente para la mayora de los virus. Cuando se usa hielo seco, es necesario utilizar frascos con tapn de rosca o bolsas de plstico, ya que el hielo seco modifica el pH y puede inactivar algunos virus si los recipientes no se encuentran adecuadamente sellados, a pesar de proporcionar una temperatura de 70oC. El hielo seco debe constituir el 50% del paquete. Si en el momento de empacar se roca el hielo seco con alcohol la temperatura de congelacin se aumenta. Refrigeracin: es suficiente colocar la muestra en un recipiente hermticamente cerrado y ste dentro de otro conteniendo hielo, para evitar que al derretirse el hielo, la humedad dae la muestra o altere sus caractersticas. Tambin pude utilizarse un refrigerante. En cualquiera de los dos casos el hielo dbe constituir el 50% del paquete. Glicerina (50%): este mtodo se usa cuando es imposible enviar las muestras en las formas sealadas anteriormente, stas pueden ser depositadas en un frasco que contenga glicerina al 50% en solucin salina fisiolgica, previamente esterilizada en autoclave a 15 lb/121oC/15 min. La Glicerina debe cubrir totalmente la muestra. Con este mtodo no se necesita refrigerar. La muestra debe empacarse en una caja de cartn, de madera, de unicel o en bolsas etc. identificarse perfectamente y anexar una breve Historia Clnica; sta debe proporcionar datos fundamentales para realizar el diagnstico viral: fecha de envo, muestras que se envan, mtodo de conservacin, especie de que se trate, fecha de coleccin de la muestra, morbilidad, mortalidad, el diagnstico presuntivo y si se dio algn tratamiento. Adems el nombre del remitente, su direccin y telfono para enviar los resultados o localizarle en caso necesario. Si se sospecha que el material pudiera ser infeccioso para el hombre, es conveniente usar un doble frasco o una cubierta de plstico que pudiera sellarse. El material debe rodearse de aserrn de madera, papel, madera o cualquier material absorbente humedecido con formol. El material sirve de proteccin para evitar que los tubos o frascos de vidrio se rompan y el formol para inactivar al virus en caso de que se presente un accidente por rotura de los mismos.

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Conservacin de las muestras virolgicas en el laboratorio. El mejor mtodo para la conservacin de las muestras en laboratorio para aislamiento viral es la congelacin entre 40 a 70 C. Es importante sealar que se debe evitar en todo momento las fluctuaciones bruscas de temperatura, as como las congelaciones y descongelaciones sucesivas que van en detrimento de la concentracin viral. Si no se cuenta con el material biolgico para realizar las pruebas necesarias para el aislamiento viral al tiempo de la coleccin de las muestras, l inoculo puede ser preparado y almacenado en congelacin mientras se llevan a cabo las pruebas de esterilidad bacteriana del mismo. Debe tenerse cuidado de no mantener estas muestras congeladas durante perodos largos de tiempo, ya que la actividad enzimtica (antiviral) de los tejidos es mayor en este estado que en una muestra sin procesar. La temperatura del nitrgeno lquido (-196oC) puede conservar a los virus en las muestras sin procesar inclusive durante aos. MATERIAL: El alumno, previa consulta bibliogrfica, seleccionar una enfermedad de etiologa viral, realizar el ejercicio de tomar las muestras adecuadamente, seleccionar el mejor conservador de la misma y preparar su muestra (empaquetado) para enviarla a un laboratorio de diagnstico viral, simulando una ubicacin lejana al mismo. Investigar con que medio de transporte cuenta para hacer llegar su paquete al laboratorio, el costo, el tiempo y la disponibilidad del mismo. METODO: El ejercicio prctico consiste en revisar junto con el instructor cada paquete y hacer una evaluacin de cada uno, con la participacin de los alumnos para cuestionar si es correcta o no la forma en que se prepar. RESULTADOS: 1. Explique brevemente si la forma en que prepar su muestra fue correcta o no y porqu?

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ELIMINACIN DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. Todas las muestras slidas sern colocadas en una bolsa amarilla, para material biolgico infeccioso para su posterior incineracin. 2. Todas las muestras lquidas sern colocadas en una bolsa roja para material biolgico infeccioso para su posterior incineracin. 3. Las cajas de cartn, madera, unicel, etc., se regresaran a los alumnos para su reciclaje. 4. Todos los envases de vidrio sern lavados y secados para su reutilizacin. CUESTIONARIO: 1. Qu tipo de muestras enviara de un animal vivo y de uno muerto para aislamiento viral? 2. Se emplea formol como medio de conservacin para transportar una muestra para aislamiento viral? Porqu 3. Cul es la finalidad de agregar antibitico a las muestras para aislamiento viral? 4. Qu datos debe contener una Historia Clnica de una muestra destinada para aislamiento viral? 5. Qu pruebas serolgica se pueden realizar para el diagnstico. BIBLIOGRAFIA: Mohanty, S.B. and Dutta, S.K.: Virologa veterinaria. Interamericana. Mxico. 1985 Larski.: Virologa para veterinarios. La Prensa Mdica Mexicana. Mxico. 1980. Fenner, W.: Virologa Mdica. Acribia. 6 a. Ed. Espaa. 1971.

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PRACTICA 4.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA PARA AISLAMIENTO VIRAL PREPARACION DE UN INOCULO VIRAL

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno aprender a procesar una muestra viral para su diagnstico directo o indirecto. INTRODUCCION: Las muestras de tejidos y fluidos corporales para aislar o detectar virus usualmente deben de procesarse para poder ser inoculados en el sistema husped elegido o bien para detectarlo a travs de alguna prueba serolgica. El proceso consiste en hacer una suspensin de la muestra de tejido en alguna solucin estril como la solucin salina, alguna solucin amortiguadora. Generalmente se utiliza algn triturador elctrico, mortero Tenbrooeck o un simple mortero de porcelana. Los virus son agentes biolgicos intracelulares y al homogeneizar la muestra, se rompen las clulas y el virus es liberado. Se deben tomar precauciones para evitar aspirar los aerosoles producidos al operar estos aparatos. Los restos celulares y grandes bacterias pueden ser eliminadas utilizando la centrifugacin a baja velocidad (1000 a 2000 rpm / 10 a 15 minutos). Grandes velocidades de centrifugacin son utilizadas para sedimentar y empaquetar a los virus. Algunos virus que no son afectados por el ter o solventes de lpidos, pueden ser mezclados con fluorocarbn, homogeneizarlos y despus centrifugarlos; con ste tratamiento se sedimentan las bacterias, moco y restos celulares y el virus queda en el sobrenadante Si es posible filtrar el material antes o despus de la centrifugacin utilizando membranas de celulosa de 0.45 m de tamao de poro en el cual la mayora de las bacterias son retenidas y los virus pasan o de 0.22 m de tamao de poro si hay la seguridad de no tener presentes grandes virus como los poxvirus. Sin embargo las concentraciones de virus bajan dramticamente al usar la filtracin. Una mezcla de antibiticos es adicionado a ste inculo o a los fluidos corporales para reducir la contaminacin bacteriana: Penicilina 1000 a 2000 U.I. / ml, Estreptomicina 10 a 20 mg / ml, neomicina 5 mg / ml, Sulfato de polimixina B 5 mg / ml, y Fungizona ( .25 mg / ml; son comnmente utilizados.
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Cuando las muestras son lquidas, solo se centrifugan y se adicionan antibiticos. En caso de ser hisopos estos se sumergen en solucin salina fisiolgica y se procesan de la misma manera. MATERIAL POR EQUIPO: Pinzas y tijeras estriles (el alumno es responsable de prepararlas) Mortero con pistilo estril Tubo con arena o vidrio molido estril 2 tubos estriles con tapn Frasco con 10 ml de Solucin Salina Fisiolgica estril 1 pipeta 10 ml 1/10 1 tubo de caldo tioglicolato 1 tubo con agar biotriptosa inclinado 1 mechero 1 balanza granataria. 1 pipeta serolgica de 1 ml 1/100 1 gradilla. 1 propipeta

MATERIAL POR GRUPO: 1 estufa bacteriolgica Una muestra elegida en la prctica anterior. 1 centrfuga Antibitico ( mezcla penicilina estreptomicina) Torundas con alcohol

MTODO: 1. Preparar su rea para trabajar en forma estril, prender el mechero para generar su rea estril 2. Pesar 1 g de su muestra. 3. Colocar el tejido en un mortero estril y triturarlo, utilizando un abrasivo (arena estril) 4. Adicionar poco a poco 9 ml de diluente (SSF), para obtener una suspensin al 10%, lo que nos permite inclusive hacer una determinacin cuantitativa del virus 5. Transferir la suspensin a un tubo estril. 6. Centrifugar el macerado a 1000 rpm / 10 min. 7. Transferir el sobrenadante a un tubo estril. 8. Aadir antibiticos dejndolos actuar por 10 min. para eliminar a las bacterias presentes en el mismo. 9. Realizar la prueba de esterilidad bacteriana al inculo.
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Prueba de esterilidad bacteriana:

Es conveniente cultivar una muestra de los inculos, por si existiera contaminacin bacteriana, los medios ms adecuados para este fin son el caldo tioglicolato (anaerobios), el caldo o agar biotriptosa, el agar sangre (aerobios) los cuales son sembrados utilizando una pipeta estril. 10. Sembrar 0.1 ml en cada medio de cultivo proporcionado e incubar a 37 grados centgrados durante 24 a 48 horas. 11. Realizar la lectura de la prueba de esterilidad: si hay presencia de colonias bacterianas en los medio slidos o turbidez en los medios lquidos, el inculo no debe utilizarse en el sistema husped; ya que la presencia de signos, lesiones o efectos citopticos que pudieran observarse podran deberse a la presencia de bacterias y no del virus. 12. Cuando el inculo viral no pasa la prueba de esterilidad, podemos agregar una dosis mayor de antibiticos y repetir la prueba de esterilidad. 13. Si la prueba de esterilidad es negativa, el inculo esta listo para probarse en el sistema husped elegido o bien en una prueba serolgica. RESULTADOS: Esquematice el resultado obtenido en su prueba de esterilidad bacteriana ELIMINACION DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. Todos los inculos se eliminaran en la tarja. 2. Los restos de tejidos se colocaran en una bolsa amarilla para material biolgico infeccioso para su posterior incineracin. 3. Una vez concluida la lectura de la prueba de esterilidad, los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave para eliminarlos en la basura y posteriormente lavar y secar los recipientes. CUESTIONARIO: 1. Cul es la finalidad de preparar un inculo viral? 2. Para que agrega antibitico al inculo? 3. Explique para qu y como realiza la prueba de esterilidad bacteriana? BIBLIOGRAFIA: Cotiral, G.E.: Manual of Standardized Metthods for Veterinary Microbiology. Cornell Univ. Press. 1978. Rovozo, G.C.:A Manual of Basic Virological Techniques. Cornell Univ. Press. 1978

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PRACTICA 5.
DILUCIONES MS UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE VIROLOGIA.

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno comprender la metodologa para calcular, realizar y determinar las diluciones ms utilizadas en virologa as como su utilidad. INTRODUCCION: La disminucin de la concentracin de un reactivo en forma constante en una serie ordenada de tubos nos permite obtener diluciones seriadas. Las diluciones seriadas ms utilizadas en el laboratorio de virologa son las de factor de dilucin 2 (dobles) y las de factor de dilucin 10 (dcuples). La metodologa para preparar diluciones es utilizada para determinar la actividad o el contenido de un virus en una suspensin de concentracin desconocida lo que se conoce como titulacin. Cualquier procedimiento para preparar una dilucin seriada utiliza un diluente que no debe afectar al material que estamos diluyendo (soluto): virus, anticuerpos, molculas biolgicas, clulas. Un diluente muy utilizado es la solucin salina fisiolgica al 0.85 % de cloruro de sodio. Frecuentemente sta puede ser amortiguada con fosfatos a un pH de 7 a 7.4 adquiriendo el nombre de solucin tampn de fosfatos (PBS). Se puede elegir entre otras, solucin Ringer, caldo triptosa fosfatado, suero normal al 10%, solucin salina equilibrada con o sin rojo de fenol. DILUCIONES DOBLES SERIADAS: Un procedimiento rutinario de dilucin doble en serie implica preparar diluciones tales como: 1:2, 1:4, 1:8,1:16,1:32 e indica que bajamos la concentracin de nuestro soluto dos veces de un tubo a otro. Para preparar estas diluciones, se coloca un volumen constante de diluente (por ejemplo 1 ml) en una serie de tubos y un volumen igual del soluto (virus) se adiciona al primer tubo y se homogeniza 7 veces. El mismo volumen es transferido al siguiente tubo. Este procedimiento se repite hasta el ltimo tubo. El excedente de volumen en el ltimo tubo es desechado (Fig1).

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SUSPENSIN DE VIRUS

1 ml.

1 ml.

1 ml.

1 ml.

1 ml.

1 ml.

2
1/4

3
1/8

4
1/16

5
1/32

6
1/64

1 ml. de solucin salina tubos 1 - 6

Figura 1

DILUCIONES DECUPLES SERIADAS: Al hacer diluciones dcuples seriadas implica preparar diluciones como: 1:10 que corresponden a 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1:100 1:1000 1:10,000 1:100000

Para prepararlas se coloca un volumen constante de diluente en una serie de tubos, que corresponde a 9 dcimas partes del volumen que se necesite trabajar. Una dcima parte del virus (soluto) se coloca en el primer tubo y se homogeneiza. Una dcima parte del volumen del primer tubo se transfiere al segundo tubo. Este procedimiento se repite hasta el ltimo tubo. El exceso de volumen del ltimo tubo se desecha.

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De esta manera la concentracin del soluto se reduce 10 veces de un tubo a otro (Fig.2).

1:10 10-1

1:100 10-2

1:1000 10-3

1:10,000 10-4

1:100000 10-5

1 ml.

1 ml.

1 ml.

1 ml.

1 ml.

1 ml.

SUSPENSIN DE VIRUS

9 ml. de solucin salina tubos 1 - 6

Figura 2.

Ambas diluciones en serie puede utilizarse para realizar alguna prueba serolgica (la que mide una reaccin antgeno-anticuerpo), en la que el virus diluido es el antgeno, en una prueba de Hemoaglutinacin viral (HA), de Inhibicin de la Hemoaglutinacin viral (HI) o bien en una prueba de Medicin de la Infectividad viral. En todas ellas se busca el Punto Final visible de la reaccin que se lee en cada prueba. El Punto Final es el Ttulo de la prueba y representa la concentracin hipottica del virus en la solucin sin diluir. El Ttulo se expresa como el recproco de la dilucin ms alta en que se observa el punto final. Si el Punto final en una prueba se observa en la dilucin 1:64, el ttulo es 64 y las unidades corresponden a la prueba que se utiliza.

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DILUCIONES EN PASOS: Son diluciones que se realizan para obtener diluciones muy altas de soluto (muy diluido) o porque la cantidad de este es tan pequea que es imposible de medir. Para llegar a ella hay que utilizar diluciones intermedias. Ejemplo: preparar una dilucin en pasos para obtener una suspensin de virus 1: 100,000 en 10 ml (Fig.3). Tubo Dilucin obtenida Dilucin utilizada para llegar 1 1:10 1/100 2 1:1,000 1/100 3 1:100,000

X 1/100

x 1/100

SUSPENSIN DE VIRUS

1/10

1/1000

1/100,000

Figura 3

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En el ejercicio anterior se llega a la dilucin requerida en 3 pasos: se prepara una dilucin inicial 1:10, se diluye 100 veces y se obtiene una dilucin 1: 1000, se diluye 100 veces y se llega a la dilucin 1:100,000 Tambin se puede llegar de esta otra manera, en 2 pasos: se prepara una dilucin inicial 1:1000, se diluye 100 veces y se obtiene la dilucin 1:100,000 (Fig.4): Tubo Dilucin obtenida Dilucin utilizada para llegar 1 1:1000 1:100 2 1:10,000

x 100

SUSPENSIN DE VIRUS

1/1000

1/10,000

Figura 4

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Para preparar las diluciones en pasos, no existe un procedimiento establecido, se puede tomar la dilucin inicial y los pasos que se crean ms convenientes para llegar a la dilucin requerida. Una forma prctica de obtener el factor de dilucin que se necesita cuando solo se utiliza un paso es dividir el factor de dilucin que se requiere entre el factor de dilucin con que se quiere iniciar o bien el que se tiene. Ejemplo: Preparar una dilucin 1/ 600 en un volumen de 10 ml. Factor de dilucin X 100 X 75 X 30 Dilucin tubo 2 1:600 1:600 1:600 FD que se requiere FD que se tiene 600 6 = 100 600 8 = 75 600 20 = 30

Dilucin tubo 1 1:6 1:8 1:20

Si se elige por ejemplo la primera opcin se preparara de la siguiente manera (Fig.5): 10 6 = 1.66 10 1.66 = 8.34 El primer tubo llevara 8.34 ml de diluente y 1.66 ml de virus, quedando una dilucin inicial de 1:6. 10 100 = 0.1 10 0.1 = 9.9

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El segundo tubo llevara 9.9 ml de diluente y 0.1 ml de la dilucin 1:6 de virus obtenindose una dilucin en este tubo de 1: 600

1.66 ml

0.1 ml

9.9 ml 8.34 ml Cantidad de diluente

Figura 5.

MATERIAL POR ALUMNO Calculadora.

MATERIAL POR EQUIPO: 1 gradilla 7 tubos vacutainer de 10 ml sin esterilizar 1 tubo o frasco con 30 ml de agua destilada. 1 frasco con colorante vegetal. 7 pipetas serolgicas de 1 o 2 ml 1/100 1 pipeta serolgica estril de 5 ml 1/10 1 propipeta

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1/600

1/6

SUSPENSIN DE VIRUS

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METODO: 1. Calcular los siguientes ejercicios. Una dilucin dcuple seriada a partir de una dilucin inicial de 1:2 en un volumen inicial de 5 ml en 5 tubos. Calcular como preparar 5 ml. de una dilucin 1:20,000 en dos pasos

2. Preparar la dilucin en serie y en pasos siguiendo la metodologa ya establecida. RESULTADOS: Reporte si las diluciones de colorante coincidieron en su coloracin tanto en la dilucin en pasos como en la serie (lo que indica que midi y trabaj correctamente). CUESTIONARIO: 1. Para que se utilizan las diluciones en el laboratorio de virologa? 2. Cules son los diluentes ms utilizados al realizar las diluciones de las suspensiones virales? ELIMINACIN DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. El contenido de los tubos ser eliminado en las tarjas. 2. Los tubos y pipetas sern lavados y secados para su reutilizacin. BIBLIOGRAFIA: Del Castillo, E. y Gmez, F.: Prcticas de Virologa. Manual de Laboratorio. UNAM. Mxico. 2000. Myers, R.: Inmunology, a Laboratory Manual. Wm.C.Brown Publishers.Iowa. 1989

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PRACTICA 6.
HEMOAGLUTINACION VIRAL.

Mvz. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno aplicar las bases tericas para relizar e interpretar y aplicar en forma prctica una prueba de Hemoaglutinacin viral. INTRODUCCION: Ciertos virus tienen la capacidad de unirse a glbulos rojos de diferentes especies debido a la presencia de unas proyecciones presentes en su envoltura viral llamadas espculas o hemoaglutininas y a este fenmeno se le conoce como Hemoaglutinacin Viral. La unin de estas hemoaglutininas con sus receptores en los glbulos rojos provoca que las partculas virales acten como puentes entre los glbulos rojos formando una red de aglutinacin que puede apreciarse a simple vista. Este fenmeno fue descrito por Hirst y Mc Clelland en 1941, quienes observaron que cuando se mezclaban los lquidos amniticos y alantoideos con eritrocitos en el embrin de pollo , estos se aglutinaban con la presencia del virus de la influenza. Investigaciones posteriores a sta, han demostrado que muchos virus aglutinan los glbulos rojos de aves adultas y de ciertos mamferos (ver tabla): Glbulo rojo, Temperatura y Ph. Humano, cobayo. 4C cobayo 4C mono, rata 37C algunas aves 37C humanos humanos vacunos 4C aves, humano, cobayo. 4C aves, humano, cobayo, 4C Ganso 4C
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FAMILIA Parvoviridae Papoviridae Adenoviridae Poxviridae Picornaviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Rhabdoviridae

GENERO O ESPECIE virus adenoasociados tipo 4 virus polioma la mayora de los tipos viruela virus Coxackie Virus Echo Rinovirus Influenza tipo A y B Parainfluenza, Parotiditis Rabia
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Existen algunos factores por parte del virus que pueden influir en la prueba como son la cepa viral, el nmero de pases, sistema husped en que se replic; as como edad y sexo de la especie de la que se obtuvieron los glbulos rojos. La temperatura, pH y osmolaridad tambin pueden afectar la prueba. La prueba de hemoaglutinacin viral puede utilizarse para detectar virus por una prueba cualitativa rpida en placa: en una placa se coloca una gota de la muestra viral sospechosa y se le adiciona una gota de una suspensin de glbulos rojos lavados y a una concentracin del 3%. La mezcla se homogeneiza y se incuba a temperatura ambiente. La lectura se realiza en un perodo mximo de 3 minutos.

Glbulos rojos
Virus

HA (+)

La titulacin viral es otro de los usos de la Hemoaglutinacin viral . Es un mtodo cuantitativo, rpido y sencillo que consiste en hacer diluciones dobles seriadas de la suspensin viral en solucin salina fisiolgica en tubos y se mezcla con una suspensin normalizada de glbulos rojos (generalmente del 0.25 al 1%), de la especie afn al virus a titular. La prueba se incuba a temperatura ambiente y

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se lee en un perodo mximo de una hora. Deben hacerse lecturas cada 15 minutos y la lectura final se hace cuando los controles de la prueba ya trabajaron. Interpretacin de la prueba: en aquellos tubos donde los glbulos rojos se unen al virus, se forman puentes mltiples de gran tamao que sedimentan en el fondo del tubo y forman una capa delgada de aglutinacin caracterstica. En los tubos donde no hay virus suficiente para unirse a los glbulos rojos, estos tambin sedimentan en el fondo del tubo formando un botn de sedimentacin caracterstico.

HEMOAGLUTINACION

SEDIMENTACION

El Punto Final de la prueba es la mxima dilucin donde se observe 100% de Hemoaglutinacin. En el Punto Final hay una Unidad Hemoaglutinante (1 UHA) que es la mnima cantidad de virus capaz de hemoaglutinar al 100% de los glbulos rojos de la especie que adicionamos a una concentracin x. El ttulo de la prueba es el recproco del Punto Final y se expresa en Unidades Hemoaglutinantes (UHA) por ml.

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Ejemplo:

Dilucin del virus


1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160

1/320

1/640

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16

Unidades Hemoaglutinantes

El Ttulo del virus es de 160 UHA con glbulos rojos de X especie a una concentracin X / ml. Esquematizacin de la titulacin de un virus por la prueba de Hemoaglutinacin Viral Algunos virus como el de Newcastle, poseen una enzima llamada neuraminidasa, la cual acta ptimamente a 37 grados centgrados, su sustrato es el cido N acetil- neuroamnico que forma parte del receptor de los glbulos rojos. Esto ocasiona que despus de cierto tiempo se digiera el receptor del glbulo rojo, separando a stos del virus produciendo el fenmeno de Elucin viral. Este fenmeno se puede retardar a 4 grados centgrados. Los glbulos rojos eludos no podrn ser reaglutinados por el mismo virus, pues sus receptores han sido destruidos, sin embargo estos glbulos rojos pueden ser hemoaglutinados por otros virus siempre y cuando posean receptores afines a dicho virus. Con la ayuda de los fenmenos de Hemoaglutinacin y Elucin viral se pueden purificar
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suspensiones de virus contaminadas o si se desea concentrar alguna suspensin viral. MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Masking tape Cubre bocas Guantes de ltex (1 por equipo) Lentes de seguridad (1 por equipo) MATERIAL POR EQUIPO: 1 gradilla 10 tubos vacutainer de 10 ml. Sin esterilizar. Masking tape para rotular. Frasco con 8 ml. de Solucin Salina Fisiolgica Estril. Frasco con virus de Newcastle con ttulo desconocido. Frasco con 7 ml de una suspensin de glbulos rojos de ave al 0.75%. 1 portaobjetos. 1 palillo de madera. 2 pipetas serolgicas de 1 0 2 ml 1/100 estriles. 1 propipeta.

MATERIAL POR GRUPO: Frasco con 10 ml de glbulos rojos de ave lavados al 3% METODO: 1) Detectar la presencia de virus de Newcastle en la suspensin que le proporcionaron utilizando la prueba rpida en placa. Si su resultado es positivo proceda a titular su suspensin utilizando una prueba en tubo como se indica a continuacin. 2) Colocar los 10 tubos en la gradilla. 3) Identificar con Masking tape los tubos del 1 al 8 con la dilucin que le corresponda, el tubo 9 como control de virus y el tubo 10 como control de glbulos rojos. 4) Calcular una dilucin D O B L E seriada de virus en SSF, en 8 tubos a partir e una dilucin inicial 1/5 con un volumen final de 0.5 ml. 5) Adicionar con la primera pipeta la SSF a los tubos de la serie ( 1 a 8), 0.25 ml al tubo nueve y 0.5 ml al tubo 10. 6) Adicionar con la misma pipeta el virus al primer tubo y 0.25 ml al tubo 9. 7) Homogenizar con la misma pipeta y transferir al tubo dos y as hasta el tubo 8. Desechar el volumen sobrante en el recipiente que se le indique. 8) Homogenizar la suspensin de glbulos rojos al 0.75%
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9)

Adicionar con la segunda pipeta a todos los tubos de la prueba 0.5 ml de la suspensin de glbulos rojos de ave al 0.75%. 10) Homogenizar la prueba agitando suavemente la gradilla. 11) Incubar la prueba a temperatura ambiente durante 1 hora. 12) Realizar la lectura de la prueba a los 15, 30, 45 y 60 minutos, hacer la lectura final cuando los controles hayan trabajado. Si los controles no trabajan despus de una hora, la prueba no es vlida. En el tubo control de virus debe observarse hemoaglutinacin, en el tubo control de glbulos rojos, sedimentacin. El punto final de la prueba ser la mxima dilucin en la que se observe 100 % de hemoaglutinacin. TUBO Dilucin SSF Virus NC G.R. 1 1/5 0.8 0.2 0.5 0.5 0.5 0.5 2 1/10 0.5 3 1/20 0.5 4 1/40 0.5 5 1/80 0.5 6 1/160 0.5 7 1/320 0.5 8 1/640 0.5 9 Virus 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 10 GR 0.5 0.5

Transferir 0.5 0.5 0.5

HOMOGENEIZAR INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE R E A L I Z A R L A L E C T U R A C A D A 15 M I N U T O S

Lectura obtenida

PF: UHA TITULO

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RESULTADOS: Muestre al instructor su prueba y lea el ttulo de la misma. CUESTIONARIO: 1. Defina el fenmeno de HA. 2. Defina el fenmeno de Elucin viral. 3. Escriba los usos de la HA. ELIMINACION DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. Los tubos con su contenido, las pipetas, portaobjetos y palillos sern esterilizados. 2. Una vez esterilizados su contenido ser eliminado en la tarja. 3. El material de vidrio ser lavado y secado para su reutilizacin. 4. El palillo ser esterilizado en autoclave y eliminado en la basura. BIBLIOGRAFIA: Dulbecco, D. And Col..:Microbiology. Harper & Row. E:U. 1973. Mohanty,S and Dutta, S.: Veterinary Virology. Philadelphia. 1981.

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PRACTICA 7.
PRUEBA DE INHIBICION LA HEMOAGLUTINACION (IH) METODO BETA.

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno realizar una prueba de Inhibicin de la Hemoaglutinacin (IH), Mtodo Beta y la interpretar. INTRODUCCIN De las pruebas de Inhibicin de la Hemoaglutinacin, el mtodo Beta es el ms utilizado para medir los niveles anticuerpos contra virus que tienen la capacidad de hemoaglutinar. Recordemos que los virus que tienen la misma capacidad tambin tienen poseen la capacidad de estimular la produccin de anticuerpos ya sea por vacunacin o por infeccin. En el mtodo Beta el suero se diluye y se enfrenta a cantidades constantes del virus. El virus puede ser empleado con 2, 4, 8 y 16 UHA dependiendo del propsito de la prueba. El fundamento de la Inhibicin de la Hemoaglutinacin viral se basa en la unin previa de los anticuerpos a las espculas o hemoaglutininas del virus, antes de adicionar los glbulos rojos, resultando en la Inhibicin de la Hemoaglutinacin. Al igual que en el mtodo Alfa, los sueros a probar con este mtodo debern ser tratados para eliminar los inhibidores inespecficos de la hemoaglutinacin. MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Maskin tape Cubre bocas Guantes de ltex ( 1 par por equipo) Lentes de seguridad ( 1 por equipo)

MATERIAL POR EQUIPO: Gradilla 11 tubos vacutainer de 10 ml limpios no estriles Frasco con 6 ml de Solucin Salina Fisiolgica Frasco con 2.5 ml de Virus de Newcastle con 8 U. H. A.
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Tubo con 0.5 ml de suero de ave inmune a Newcastle con ttulo desconocido Frasco con 6 ml de una suspensin de glbulos rojos de ave al 0.75% 3 pipetas de 1 o 2 ml 1/100, estriles Propipeta

MTODO: 1) Colocar 11 tubos en la gradilla 2) Calcular una dilucin doble seriada del suero sospechoso en. 8 tubos, a partir de una dilucin inicial de 1/5, con un volumen inicial de 1 ml. 3) Identificar los tubos con la dilucin en serie del suero sospechoso (1-8), el 9 como control de virus, el 10 como control de suero y el 11 como control de glbulos rojos. 4) Con la primera pipeta colocar 0.8 ml del diluente (SSF) al tubo 1, 0.5 ml del tubo 2 al 8, 0.25 ml al 9 y 10 y 0.5 ml al 11. 5) Con la misma pipeta adicionar 0.2 ml de suero (soluto) al primer tubo y 0.25 ml al tubo control de suero. 6) Homogenizar y transferir con la misma pipeta 0.5 ml del tubo 1 al 2; del 2 al 3; etc. 7) Adicionar con la segunda pipeta 0.25 ml de la suspensin de virus de Newcastle con 8 UHA a cada tubo de la dilucin en serie (1 -8)y al tubo control de virus. Colocar esta pipeta en el recipiente indicado para la inactivacin qumica del virus 8) Homogenizar la prueba agitando suavemente la gradilla. 9) Incubar la prueba 15 minutos a temperatura ambiente para favorecer la reaccin virus- anticuerpo. 10) Homogenizar la suspensin de glbulos rojos de ave al 0.75% suavemente. 11) Adicionar con la tercera pipeta 0.5 ml de la suspensin de glbulos rojos a todos los tubos. 12) Homogenizar la prueba agitando la gradilla suavemente 13) Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora 14) Realizar la lectura a los 15, 30, 45 y 60 minutos. La lectura se hace cuando los controles han trabajado. Si los controles no trabajan la prueba no es vlida. En el control de virus debe observarse hemoaglutinacin, en los de suero y glbulos rojos sedimentacin. El punto final de la prueba ser la mxima dilucin en que se observe 100% de sedimentacin.

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Tubo Dilucin SSF Suero Virus 8 UH G.R.

1 1/5 0.8 0.2 0.25 0.5

2 1/10 0.5

3 1/20 0.5

4 1/40 0.5

5 1/80 0.5

6 1/160 0.5

7 1/320 0.5

8 1/640 0.5

9 Virus 0.25 -

10 Suero 0.25 0.25 0.5

11 G.R. 0.5 0.5

Transferir 0.5 ml 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5 0.25 0.5

0.25 0.5

Ejemplo: Mezcla suero virus y tubos controles

INTERPRETACIN: Para la titulacin de esta prueba se usa la siguiente frmula: Inverso del Punto Final del suero x No. de unidades hemoaglutinantes del virus Sustituyendo: 160 X 8 = 1280 UIHA RESULTADOS: Muestre al instructor su prueba e interplelo CUESTIONARIO: 1. Esquematizar los resultados de su prueba de la IH Mtodo Beta y calcular el ttulo de su prueba. 2. Que usos tienen las pruebas de Inhibicin de la Hemoaglutinacin Mtodo Beta. 3. En este mtodo qu reactivo es el que se diluye y cul se adiciona en forma constante?

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ELIMINACION DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. Los tubos con su contenido sern esterilizados para la posterior eliminacin de su contenido en la tarja. 2. Los tubos sern lavados y secados para su posterior reutilizacin. 3. Las pipetas sern esterilizadas para su posterior lavado, secado y reutilizacin. 4. Los sobrantes de SSF y de la suspensin de glbulos rojos sern eliminados en la tarja y los frascos sern lavados y secados para su reutilizacin. 5. Los frascos conteniendo virus sern esterilizados y posteriormente lavados para su reutilizacin. BIBLIOGRAFIA: Tizard,I.:Inmunologa Veterinaria. McGraw-Hill. 5 ed. Mxico. 2000. Del Castillo,E. y Gmez,F.:Prcticas de Virologa. UNAM. 2000.

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PRACTICA 8.
INOCULACIN DE DIFERENTES VIRUS EN EL EMBRION DE POLLO.

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno identificar diferentes virus, utilizando al embrin de pollo como sistema biolgico para replicar los virus de Newcastle, Viruela aviar, Bronquitis infecciosa, Laringotraquetis aviar, utilizando la va de inoculacin adecuada para cada uno. INTRODUCCION Los huevos de aves embrionados son un valioso medio para el cultivo de muchos virus, ya que son una fuente rica de clulas vivas adems de ofrecer una variedad de tejidos en los cuales el virus se puede replicar de acuerdo a su tropismo. Su bajo costo, la facilidad de su manejo sin necesidad de equipo especializado o costoso, adems de la presencia del cascarn que lo mantiene libre de contaminacin externa lo hacen un mtodo conveniente para mantener semillas virales, producir antgenos y vacunas. Para obtener buenos resultados al utilizar el embrin de pollo se debe ser muy cuidadoso al seleccionar los proveedores de los mismos. Las granjas productoras de huevo frtil deben poseer medidas de manejo y alimentacin adecuadas que garanticen la viabilidad y resistencia del embrin. De preferencia deben obtenerse embriones libres de patgenos especficos (SPF), en caso de no ser as entonces utilizar embriones de granjas libres de infecciones que puedan ser transmitidas en forma vertical, sobre todo cuando se requiere cultivar virus aviares. As mismo deben de proceder de granjas donde no vacunen contra antgenos iguales o relacionados con los virus en estudio, ya que los anticuerpos maternos encontrados en el saco vitelino pueden intervenir en la replica viral. Es conveniente tener un proveedor establecido ya que esto asegura la uniformidad en la produccin. Se pueden utilizar huevos embrionados de otras especies como pato, pavo y codorniz. Para utilizar el embrin de pollo como medio de cultivo viral es importante conocer su estructura anatmica (fig.1):

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Cmara de aire

Frfara Membrana corioalantoidea


Embrin Cavidad alantoidea

Cavidad amnitica Saco vitelino Cascarn Albmina

(Fig. 1) Estructura del embrin de pollo Vas de inoculacin en el embrin de pollo: MEMBRANA CORIOALANTOIDEA (MCA): Para esta va se utilizan embriones de 10 12 das de edad, el volumen de inoculacin es de 0.1 a 0.5 ml. La membrana corioalantoidea funciona como un rgano respiratorio y se encuentra muy vascularizado. Esta va es apropiada para el cultivo de virus varilicos, Laringotraquetis aviar y en general los epiteliotropos. En esta va se cosechan las membranas para la obtencin el virus. Las tcnicas para MCA son: Mtodo A (fig. 2): este mtodo es simple y consiste en inocular el material infeccioso a travs de la cmara de aire sobre la MCA para que difunda sobre toda la superficie de la misma.
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1) Ovoscopear al embrin, verificar viabilidad y marcar cmara de aire. 2) Colocar el huevo con la cmara de aire hacia arriba. 3) Desinfectar la superficie a inocular. 4) Perforar 6 a 7 mm arriba de la cmara de aire 5) Inocular con aguja del 22 x 1, depositar primero el inoculo en la frfara y despus introducir toda la aguja para rasgar la frfara y MCA. 6) Sellar con resistol o parafina 7) Incubar a 37 grados centgrados. 8) Ovoscopear los embriones cada 24 hrs para verificar viabilidad. Los embriones que mueran dentro de las primeras 24 hrs pueden atribuirse a otra causa. MtodoB (fig.3): con este mtodo se asegura que todo el inoculo es depositado en la MCA ya que se forma una cmara de aire falsa. 1) Ovoscopear al embrin, verificar viabilidad y marcar una zona contraria al embrin libre de vasos sanguneos. 2) Colocar al embrin en un plano horizontal. 3) Desinfectar la superficie de inoculacin. una en el polo superior. otra en la zona contraria al embrin, libre de irrigacin. 4) Perforar en los sitios sealados en el punto 3. 5) Con una bombilla succionar en la perforacin hecha en el polo superior frente al ovoscopio hasta observar que se forma una cmara de aire en el otro punto de perforacin. 6) Inocular con aguja del 27 x , depositar el inoculo en la MCA 7) Sellar los dos puntos de perforacin con resistol o parafina. 8) Incubar en posicin horizontal con la nueva cmara de aire hacia arriba a 37 grados centgrados.

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9) Ovoscopear cada 24 hrs para verificar viabilidad. Los embriones que mueren dentro de las primera 24 hrs pueden atribuirse a otra causa. CAVIDAD ALANTOIDEA (CA): Para inocular esta va se utilizan embriones de pollo de 9 a 12 das de edad, el volumen de inoculacin es de 0.1 a 0.2 ml. Los virus que se replican en la CA son los virus de Newcastle y Bronquitis infecciosa. Esta va tiene la ventaja de la simplicidad de su tcnica de inoculacin y de cosecha del lquido alantoideo, que resulta de gran utilidad cuando se necesitan preparar grandes cantidades de antgenos. (fig. 4) 1) Ovoscopear al embrin verificar viabilidad y marcar la cmara de aire. 2) Colocar el huevo con la cmara de aire hacia arriba 3) Desinfectar la superficie de inoculacin 3 mm debajo de la cmara de aire. 4) Perforar. 5) Inocular introduciendo una aguja del 27 x 6) Sellar con resistol o parafina 7) Ovoscopear cada 24 hr para verificar viabilidad. Las muertes del embrin dentro de la primeras 24 hr son por otra causa. CAVIDAD AMNIOTICA (Cam): Para esta va de inoculacin se pueden emplear embriones de 7 a 15 das de edad, el volumen de inoculacin es de 0.1 a 0.2 ml. La edad de los embriones depende del tipo de virus que se quiera aplicar. Los virus de replicacin lenta se benefician con la prolongacin del perodo de incubacin de los embriones. Estn expuestas a la infeccin la capa epitelial interna del amnios y la epidermis del embrin. Los movimientos de deglucin y respiracin de los embriones ms desarrollados llevan el agente infeccioso hacia las mucosas altas del aparato respiratorio y gastroentrico. (fig.5) 1) Ovoscopear al embrin, verificar viabilidad y marcar cmara de aire. 2) Colocar el huevo con la cmara de aire hacia arriba. 3) Desinfectar la superficie de inoculacin, 5 mm arriba de la cmara de aire, del lado donde se encuentre el embrin..

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4) Perforar. 5) Inocular con aguja del 22 x 1 , introducir toda la aguja. 6) Sellar con resistol o parafina. 7) Incubar a 37 grados centgrados 8) Ovoscopear cada 24 hr para verificar viabilidad. Las muertes del embrin durante las primeras 24 hr son por otra causa. SACO VITELINO (SV): Se emplean embriones de 5 a 8 das de edad, el volumen de inoculacin es de 0.1 a 1.0 ml. El saco vitelino est formado por una membrana de clulas en constante incremento. A partir del da 12, el vitelio se deseca progresivamente y aumenta al mismo tiempo la fragilidad de la membrana. Durante las ltimas 24 a 48 hr, el saco vitelino queda includo en la cavidad abdominal. El virus de la infeccin de la Bolsa de Fabricio, de la enfermedad de MareK, de la Encefalomielitis aviar y de la Artritis aviar son algunos de los que pueden replicarse por esta va. (fig 6) 1) Ovoscopear al embrin 2) Colocar el huevo con la cmara de aire hacia arriba. 3) Desinfectar la superficie de inoculacin: 5 mm arriba de la cmara de aire del lado contrario a donde se encuentra el embrin. 4) Perforar. 5) Inocular con aguja del 20 x 1 6) Sellar con resistol o parafina. 7) Incubar a 37 grados centgrados. 8) Ovoscopear cada 24 hr para verificar viabilidad. La muerte dentro de las primeras 24 hr es por otra causa. INTRAVENOSA (I.V): Esta tcnica es empleada en casos especficos para incrementar las oportunidades de aislamiento o deteccin de virus y en estudios hematolgicos.

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La edad del embrin es de 10 a 15 das y el volumen de inoculacin es de 0.02 a 0.05 ml. 1) Ovoscopear al embrin, verificar viabilidad y marcar el vaso sanguneo de mayor calibre. 2) Con un pequeo disco de carborundo seccionar el cascarn circularmente sin lesionar la frfara. 3) Desinfectar el surco marcado por el disco y dejar secar. 4) Con ayuda de unas pinzas estriles, desprender el cascarn y dejar al descubierto la frfara. 5) Aplicar unas gotas de aceite mineral estril o solucin salina fisiolgica estril para transparentar. 6) Inocular con una aguja del 27 x 7) Tapar el sitio de inoculacin pegando un disco papel grueso estril con parafina o resitol. 8) Incubar a 37 grados centgrados. 9) Ovoscopear cada 24 hr para verificar viabilidad. La muerte del embrin durante las primeras 24 hr es por otra causa. INTRACEREBRAL (I.C.): Esta va puede ser empleada es estudios de alteraciones patolgicas del cerebro despus de la infeccin. Se utilizan embriones de 8 a 14 das de edad y el volumen e inoculacin es de 0.01 a 0.02 ml. 1) Ovoscopear al embrin para verificar viabilidad, marcar cmara de aire y la posicin del embrin. 2) Realizar los pasos del nmero 2 al 5 de la tcnica I.V., pero en la cmara de aire en una zona lo ms cercana al embrin. 3) Con unas pinzas estriles, perforar la frfara, membrana corioalantoidea y extraer el embrin por el cuello. 4) Inocularlo IC con aguja 27 x . 5) Regresar al embrin.
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6) Realizar los pasos del nmero 7 al 9 de la tcnica anterior. Algunas veces es necesario hacer pases ciegos antes de detectar la replica viral. Los embriones que mueren por efecto de la rplica viral deben sacarse de la incubadora lo ms pronto posible para evitar cambios del tejido o inactivacin trmica del virus. Cuando los embriones no mueren pueden ser sacrificados por refrigeracin al menos por 24 hr, antes de realizar la cosecha de los lquidos embrionarios. MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Cubre bocas Guantes de ltex ( 1 por equipo) Lentes de proteccin ( 1 por equipo) 1 jeringa de insulina estril 1 jeringa de 3ml con aguja del 22 X 1 estril 1 recipiente pequeo con hielo o un refrigerante MATERIAL POR EQUIPO: 1 frasco con virus de Newcastle y un frasco con virus de Laringotraquetis o 1 frasco con virus de Bronqutis infecciosa y 1 frasco de virus de la Viruela aviar 1 mechero 1 perforador 1 frasco con resistol charola porta-huevos. 8 embriones de pollo de 9 das. MATERIAL POR GRUPO: 1 ovoscopio. 1 frasco con torundas con alcohol. cerillos Estufa de incubacin a 37 grados centgrados.

MTODO: 1. 2. 3. 4. 5. Realizar la tcnica asptica en el rea de trabajo. Prender el mechero para generar una rea de esterilidad Ovoscopear los embriones, para verificar viabilidad Desinfectar la superficie, dejar secar. Marcar cmara de aire, sitio o va de inoculacin, virus a inocular, nmero de equipo. 6. Colocar la suspensin viral en la palangana con refrigerantes.
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7. Perforar el punto de inoculacin ( desinfectar previamente el perforador con una torunda con alcohol 8. Proceder a la inoculacin en ambiente de esterilidad. 9. Sellar el sitio de inoculacin con una gota de resistol 10. Regresar a la incubadora los embriones y revisar diariamente. Las muertes ocurridas dentro de las primeras 24 horas son debidas a traumatismos durante la inoculacin. 11. Transcurrido el tiempo de incubacin los embriones se sacrifican por refrigeracin para su posterior revisin o bien para la cosecha viral. NOTA: es importante trabajar rpido ya que la viabilidad de los embriones depende de que no permanezcan demasiado tiempo fuera de la incubadora Virus de Newcastle: Paramixovirus (ARN) Va de inoculacin: CA. Volumen de inoculacin: 0.1 ml Tiempo de incubacin: Se clasifican por el tiempo que tarda en matar al embrin: Cepas velognicas: 36 a 48 hr (Quertaro) Cepas mesognicas: 48 a 72 hr. (Roaking) Cepas lentognicas: ms de 72 hrs. (B1, Lasota). Cepas vacunales, a veces no matan al embrin. Virus de Laringitraquetis aviar: Herpesvirus (ADN) Va de inoculacin: MCA: por cmara de aire o por cmara falsa. Volumen de inoculacin: 0.2 ml Tiempo de incubacin: 5 a 6 das Bronqutis infecciosa : Coronavirus (ARN) Va de inoculacin: CA Volumen de inoculacin: 0.1 ml. Tiempo de incubacin: 4 a 5 das. No siempre lo mata. Viruela aviar: Avipoxvirus (ARN) Va de inoculacin: MCA: cmara de aire o por cmara falsa. Volumen de inoculacin: 0.2 ml. Tiempo de incubacin 5 a 6 das

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RESULTADOS: Avise a su instructor, si concluy satisfactoriamente la inoculacin de los virus que le fueron proporcionados. Avise a la encargada del laboratorio, el horario en que revisar sus embriones diariamente. Terminado el tiempo de incubacin guarde sus embriones en refrigeracin para utilizarlos en la prxima prctica. ELIMINACIN DE RESIDUOS PELIGROSOS: 1. Los frascos con virus y las jeringas utilizadas sern esterilizadas para su posterior lavado y reutilizacin. 2. Los embriones de pollo se continuarn utilizando en la prxima prctica. 3. Las torundas con alcohol tambin sern esterilizadas para su eliminacin en la basura. BIBLIOGRAFIA: Cunningham, C.H.: Virologa Prctica. Acribia. 3 . Zaragoza Espaa. 1971. KurstaK, E.: Viral Inmunodiagnosis. Ed. E. Kurstak &Morissed. New York. 1974. George, S.C.: Manual of Standarized Methods for Veterinary Microbiology. Camstock Publishing Associates. Garnell University Press. USA. 1978. LarsKi.: Virologa para veterinarios. Prensa Mdica Mexicana. 2 .1989.

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Membrana corioalantoidea Mtodo A

Membrana corioalantoidea Mtodo b Cmara de aire artificial

Perforacin en polo superior

Figura 2

Figura 3

Cavidad alantoidea

Figura 4

Cavidad amnitica

Saco vitelino

Figura 5

Figura 6

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PRACTICA 9.
DETECCION DE LESIONES EN EL EMBRION DE POLLO Y COSECHA DE VIRUS

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno identificar la presencia de los virus inoculados en su prctica anterior por la presencia de lesiones en el embrin de pollo, en las estructuras extraembrionarias y a travs de la prueba de HA con los lquidos colectados. INTRODUCCIN La susceptibilidad de una clula a un virus ( tropismo) esta determinada por la presencia de receptores especficos sobre la membrana celular y una capacidad metablica de la misma para inducir la sntesis necesaria para la rplica viral Existen diferencias en los tropismos virales tanto in vitro como in vivo, que estn determinados por la cpside; mientras que los cidos nucleicos son pantotrpicos en el sentido de que pueden penetrar en una clula (que es refractaria al virus completo) e inducir la sntesis de una sola generacin de virus que despus de adquirir la cpside pierden su capacidad para penetrar en clulas refractarias. El uso del embrin de pollo como sistema biolgico para replicar virus, permite obtener una gran cantidad de partculas virales completas a un costo muy bajo, las cuales pueden utilizarse como: reactivos para diagnstico en pruebas serolgicas (antgeno). fuente de antgeno para la produccin de biolgicos. conservacin de cepas virales. identificacin de virus.

La identificacin de virus se hace a travs de la presencia de lesiones en el embrin de pollo y en los tejidos extraembrionarios. Cuando el virus replicado tiene la capacidad de hemoaglutinar; sta prueba, permite corroborar la presencia del virus en los lquidos extraembrionarios. Cuando un virus es replicado se debe estar seguro que el virus recuperado es el mismo que se inocul, ya que cualquier sistema biolgico utilizado pueden contener virus latentes que pueden ser activados por el material inoculado.

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MATERIAL QUE TRAE EL ALUMNO: Pinzas y tijeras estriles Palangana o bote para desechar estructuras del embrin Masking tape 1 jeringa de 5 mil con aguja del 18 X 1 , para colectar lquidos extaembrionarios Jeringa de 10 o 20 ml con aguja del 18 X 1 , para lavar las membranas corioalantoideas y buscar las lesiones. MATERIAL POR EQUIPO: Embriones inoculados en su prctica anterior sacrificados por refrigeracin. Mechero Frasco estril (para guardar los lquidos extraembrionarios conteniendo el virus) 3 cajas de petri estriles (para guardar la MCA conteniendo el virus) 1 pedazo de Masking tape para rotular. Frasco con 100 ml de Solucin salina fisiolgica estril. Si trabajo virus de Newcastle: 2 portaobjetos, 2 palillos de madera.

MATERIAL POR GRUPO: 1 frasco gotero con una suspensin de glbulos rojos de ave al 3%. Fuente de luz para buscar lesiones en MCA. Frasco con torundas con alcohol.

METODO: MEMBRANA CORIOALANTOIDEA: Las membranas se colectan con la ayuda de pinzas y tijeras. Este mtodo es aplicable para cuando la membrana ha sido inoculada por la cmara de aire o por la cmara falsa: 1) Trabajar en rea estril. 2) Desinfectar toda la superficie del cascarn donde se encuentra la cmara de aire. 3) Abrir cortando el cascarn por cmara de aire. 4) Desechar los fluidos, saco vitelino y el embrin. La MCA queda adherida al cascarn. 5) Con unas pinzas se separa y obtiene la MCA y se coloca en una caja de petri. 6) La MCA se extiende y se lava con solucin salina fisiolgica estril para su revisin.
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LIQUIDO ALANTOIDEO: Se utiliza jeringa de 10 ml con aguja del 20 x 1 1) Trabajar en rea estril. 2) Desinfectar la superficie del cascarn sobre la cmara de aire. 3) Abrir cortando el cascarn por la cmara de aire. 4) Insertar la aguja en cavidad alantoidea y aspirar el lquido. En caso de virus de Newcastle antes de colectar todo el lquido, probar la presencia del virus mediante una prueba de Hemoaglutinacin rpida en placa. La cantidad colectada por huevo vara con la edad del embrin. En embriones de 12 das se colecta un promedio de 5 ml por huevo. 5) Envasar el lquido colectado.

LIQUIDO AMNIOTICO: Se utiliza jeringa de 10 ml con aguja de 20 x 1 . Trabajar en rea estril. Desinfectar la superficie del cascarn sobre la cmara de aire. Abrir cortando el cascarn sobre cmara de aire. La frfara y la MCA se rasgan en la base de la cmara de aire para permitir mejor visibilidad del amnios. 5) Insertar la aguja en la cavidad amnitica y aspirar el lquido. 6) Envasar el lquido colectado. 1) 2) 3) 4) SACO VITELINO: Se utiliza una jeringa de 20 ml con aguja del 14 x 1 1) Trabajar en rea estril. 2) Desinfectar la superficie del cascarn sobre la cmara de aire 3) Abrir cortando el cascarn por cmara de aire 4) Introducir la aguja rasgando la frfara y MCA y llegar al saco vitelino.
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5) Aspirar el vitelio y envasarlo

PRUEBA DE HEMOAGLUTINACIN VIRAL: El lquido alantoideo de huevos embrionados inoculados con virus de Newcastle, antes de envasarlo probarlo con glbulos rojos de ave al 3% en una prueba rpida en placa. Solo envasar los que resulten positivos a la prueba.

LESIONES: VIRUS DE NEWCASTLE: El lquido alantoideo hemoaglutina. Embrin muerto con congestin generalizada, hemorragias drmicas generalizadas principalmente en la porcin cfalica y extremidades. Colectar Lquido alantoideo, membrana corioalantoidea y embriones.

VIRUS DE LARINGOTRAQUEITIS INFECCIOSA: muerte del embrin cuando son cepas muy virulentas. MCA presenta zonas pustulosas en forma de placas de color blanco grisceo o gris amarillento y edema. Produce cuerpos de inclusin intranucleares. Colectar membrana corioalantoidea y embriones. VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA: Enrollamiento y enanismo del embrin, desarrollo anormal del plumn, atrofia del dedo medio. Fibrosis del
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amnio. Depsito de uratos en rion, en ocasiones zonas necrticas en hgado. Despus de varios pases se puede provocar la muerte del embrin.

VIRUS DE VIRUELA AVIAR: Membrana corioalantoidea con lesiones pustulosas, placas de color blanco grisceo o gris amarillento. Engrosamiento y edema de la MCA y en ocasiones muerte embrionaria. Cuerpos de inclucin intracitoplasmticos. Colectar Lquido alantopideo, membrana corioalantoidea y embrin. RESULTADOS: Reporte los cambios observados en los embriones de pollo que usted inocul, y concluya si el virus se replic. CUESTIONARIO: 1. Escriba las vas de inoculacin que pueden realizarse en el embrin de pollo. 2. Cmo comprueba la rplica viral en el embrin de pollo? 3. Qu ventajas tiene el uso del embrin de pollo en comparacin con otros sistemas biolgicos? 4. Qu usos tiene el embrin de pollo en virologa?. ELIMINACIN DE RESIDUOS PELIGROSOS:

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1. Los lquidos cosechados conteniendo virus se congelarn para su uso posterior. 2. Las MCA con lesiones cosechadas, se congelarn para su posterior procesamiento y utilizacin. 3. Las dems estructuras embrionarias se desecharn colocndolas en una bolsa amarilla de desechos biolgicos para su incineracin. 4. Las jeringas y el material de vidrio utilizados se esterilizarn para su posterior lavado y reutilizacin. 5. Las torundas y palillos tambin sern esterilizados para su eliminacin en la basura. BIBLIOGRAFIA: Andrews,C.:Virus of Vertebrates. Baillere Tindal. 4 London. 1978. Davis, B.D. y Dulbecco,R.:Tratado de Microbiologa. Salvat Editores. 2 Barcelona, Espaa. 1978 George,S.C.: Manual of Standarized Methods for Veterinary Microbiology. Camstock Publishing Associates. Garnell University Press. USA. 1978. Mohanty y Sashi B. Virologia Veterinaria. Interamericana. Mxico. 1983. Larski.:Virologa para veterinarios. Prensa Mdica Mexicana. 2 . 1989.

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PRACTICA 10.
DIAGNOSTICO DE RABIA.

MVZ. Virginia Gpe. Garca Rubio.


OBJETIVO: El alumno conocer las pruebas diagnsticas para Rabia que se utilizan actualmente, sus bases tericas, prcticas y su interpretacin.

INTRODUCCION

La Rabia es una enfermedad del sistema nervioso central, generalmente aguda, que afecta a todos los animales de sangre caliente incluyendo al hombre. El agente causal es un virus de la familia Rabdoviridae, gnero lissavirus. Se trasmite a travs de la mordedura de los animales afectados y se manifiesta por signos clnicos nerviosos como son: furia, complejo de ataque y parlisis ascendente.

Las tcnicas de diagnstico para Rabia deben ser precisas, rpidas y econmicas. El diagnstico de Rabia se puede realizar por medio de tres tcnicas de laboratorio que son:

1) Tcnica de Inmunofluorescencia. 2) Tcnica Histopatolgica. 3) Prueba Biolgica.

INMUNOFLUORESCENCIA: La tcnica que se emplea es la de Inmunofluorescencia directa, esta es una prueba serolgica que detecta una reaccin antgeno-anticuerpo utilizando como sistema indicador un conjugado (fig.1) El conjugado es un anticuerpo especfico para el virus de la Rabia marcado con un fluorocromo. El fluorocromo ms utilizado es el isotiocianato de fluorescena (FITC).

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Figura 1. Prueba de Inmunofluorescencia Directa e Indirecta . Si se hace una impronta de un cerebro de un perro rabioso en un portaobjeto, por ejemplo y se coloca el conjugado sobre la muestra; se deja incubar para que se lleve a cabo la reaccin antgeno-anticuerpo, despus se lava y se observa al microscopio para Inmunofluorescencia, al ser irradiado el antgeno rbico unido al conjugado, el fluorocromo emitir una luz verde manzana o verde amarillento, lo que indicara un resultado positivo. Esta tcnica ofrece la ventaja de mostrar antgeno, sea infectante o no , en contraste con los mtodos histopatolgicos (tincin de Seller) , que revelan solamente las inclusiones intracelulares, adems es ms rpida que la prueba biolgica. Sin embargo se han encontrado casos en que la prueba de Inmunofluorescencia es positiva y la prueba biolgica es negativa, Esto sucede cuando los tejidos tienen lo que se llama sustancia inhibidora de la Rabia y que actualmente se sabe que son anticuerpos . Estos anticuerpos impiden la multiplicacin del virus en los cerebros de los ratones pero no la deteccin del antgeno por inmunofluorescencia.

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Tambin hay casos en que la tcnica de Inmunofluorescencia es negativa y la inoculacin es positiva. Esto sucede cuando la cantidad de virus presente en la muestra es muy pequea o la distribucin de la misma no es uniforme. Por ello es aconsejable utilizar ambos mtodos o hasta un tercero para el diagnstico de Rabia, sobre todo en aquellos casos en que la muestra resulta negativa a Rabia por la prueba de Inmunofluorescencia y hay exposicin humana a animales sospechosos de estar rabiosos. ltimamente se han descrito algunos mtodos empleando la prueba de Inmunofluorescencia para diagnosticar la Rabia antes de la muerte del individuo sospechosos, tomando improntas de cornea, biopsia de piel y de aislamiento de saliva. Debe tenerse en cuenta que si bien un resultado positivo obtenido con ellos confirma el diagnstico, un resultado negativo no descarta la enfermedad.

TECNICA HISTOPATOLOGICA: La tcnica histopatolgica sirve para buscar la presencia de los Corpsculos de Negri, los cuales son patognomnicos de la enfermedad. La tcnica consiste en aplicar el tejido enceflico a un portaobjetos y teirlo con el colorante de Sellers. La localizacin de los corpsculos de Negri es intracitoplsmica, pero cuando se realiza la tcnica de aplicacin directa del tejido enceflico al portaobjetos, la estructura histolgica se altera y con frecuencia pueden encontrarse fuera de la neurona. Se ha observado que los corpsculos de Negri son ms fciles de observar en el cuerno de Ammon del cerebro, clulas piramidales de la corteza cerebral y clulas de Purkinje del cerebelo. Mediante el empleo de cortes histolgicos, se ha demostrado que los crpusculos de Negri reaccionan en forma acidfila a la tincin de Sellers, suelen ser redondos pero pueden adoptar cualquier forma y en su interior aparecen pequeos grnulos basfilos. PRUEBA BIOLOGICA: Tambin conocida como prueba de inoculacin al ratn para el diagnstico de Rabia. Esta tcnica fue introducida por Hoyt y Jugenblut en 1930, y desde entonces se ha utilizado esta tcnica, pues se ha comprobado que el ratn lactante albino suizo es el animal ms susceptible al virus de la Rabia en la prueba de inoculacin y porque la concordancia de esta prueba con la de anticuerpos fluorescentes se aproxima al 100% lo cual permite controlar ambas tcnicas si estas se efectan simultneamente. La prueba biolgica consiste en la inoculacin intracerebral de material sospechoso a ratones blancos por va intracerebral para detectar la presencia del virus rbico en el mismo.
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1) La inoculacin se efecta a partir del material recibido que puede ser: tejido nervioso, glndulas salivales y saliva. 2) La muestra se procesa para elaborar un inculo. 3) Se emplean de 10 a 15 ratones por muestra, de 24 a 72 hrs de edad o ratones de 11 g de peso y 21 das de edad, clnicamente sanos. 4) Se inocula un volumen de 0.025 ml por va intracerebral en ratn lactante o con 0.03 ml en ratn adulto. 5) Los animales inoculados se colocan en una jaula previamente preparada e identificada. 6) Se someten a observacin durante un perodo mnimo de 21 das y mximo 30 das contados a partir del siguiente da de inoculacin. 7) Las muertes ocurridas dentro de las primeras 24 a 72 hrs post-inoculacin no se atribuyen al virus rbico. 8) Con el cerebro de los ratones que mueren se efecta la prueba de Inmunofluorescencia para detectar el antgeno viral. 9) Los signos observables son: hiperacusia, pelo hirsuto, astenia, lordosis, xifosis, hemiplejia temblor, parlisis postracin y muerte. Cuando se emplean ratones lactantes es posible un diagnstico precoz de Rabia, ya que se puede sacrificar un animal de estos por da a partir de las de72 horas post-inoculacin y someterlo a la prueba de anticuerpos fluorescentes MATERIAL: Camin Solicitud de visita aprobada al Centro Antirrbico de Valle de Chalco, Edo. De Mx.

METODO: Los alumnos observarn el desarrollo de las pruebas diagnsticas para Rabia montadas en dicho, centro.

RESULTADOS: No hay CUESTIONARIO: 1. Escriba cuales son las pruebas diagnsticas para Rabia que realizan en el Centro antirrbico? 2. Qu muestras se envan al Centro antirrbico para el diagnstico de Rabia?
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3. Hacen el diagnstico a partir de muestras de un animal vivo? cul? Y qu criterio establecen para determinar hacerlo? 4. Cunto tiempo tardan en emitir un diagnstico? 5. Cmo disponen de los cadveres? 6. Cuntos casos de Rabia se han diagnosticado en el Centro antirrbico? ELIMINACION DE RESIDUOS PELIGROSOS: No hay.

BIBLIOGRAFIA: Batalla, C.D. : La Rabia. INIP. SARH. Mxico. 1982 Blood and Henderson: Medicina Veterinaria. Ed. Interamericana.5ed. Mxico. 1983. Kapalan, M.N and KoprowsKi,H.:La Rabia, tcnicas de laboratorio. O.M.S. Ginebra Suiza. 1976 Brooks,G.F.,Butel,J.S. and Morse,S.A.: Microbiologa Mdica de Jawetz,Melnick y Adalberg. Manual Moderno. 16 .Mxico. 1999.

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