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Ingeniera bioqumica UGR 2012-2013 Javier Fuertes Martn Jos Antonio Olivares Pea Miguel Ruiz Bailn

INDICE
1. INTRODUCCION A LA BIOTECNOLOGIA 1.1. 1.2. Historia. Principales compaas y productos de la industria biotecnolgica.

2. PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES CON E.coli. 2.1. E.coli; fisiologa y metabolismo. 2.1.1. Oxidacin de la glucosa. 2.1.2. Fermentacin de la glucosa. 2.1.3. Oxidacin del acido actico. 2.2. 2.3. Aspectos genticos E.coli; tcnicas rADN. Interfern: clasificacin y accin.

3. DISEO DEL PROCESO 3.1. 3.2. modos de cultivo. Aspectos generales del proceso. 3.2.1. Medio de cultivo. 3.2.2. Alimentacin. 3.3. 3.4. Condiciones de operacin y control. Proceso de purificacin 3.4.1. Formacin, aislamiento y caracterizacin de IB. 3.4.2. Purificacin de protenas desnaturalizadas. 3.4.3. Renaturalizacin de protenas a conformacin bioactiva. 3.4.4. Mejora de las molculas bioactivas. 3.4.5. Tcnica purificacin seleccionada para IFN-. 4. SIMULACION DINAMICA: 4.1.
4.2.

Modelo complejo. Modelo simplificado

5. ANEXO 1: diagrama proceso.

6. BIBLIOGRAFA 2

1. INTRODUCCION A LA BIOTECNOLOGIA

1.1. Historia.

Se puede definir la biotecnologa como el uso de un organismo vivo para producir un producto o ejecutar un proceso. Aunque popularmente se crea que la biotecnologa es un sector nuevo, sus races las encontramos hace ms de 6000 aos con la fermentacin de la cerveza. La palabra biotecnologa en s, se remonta a 1917 cuando se comienza a cultivar a gran escala microbios y microorganismos. Algunas definiciones ms estrictas se refieren a la biotecnologa slo como la ingeniera gentica y la tecnologa de ADN recombinante. La ingeniera gentica se convirti en una realidad cuando por primera vez se utiliz para fabricar una protena humana en una bacteria. En 1978, en el laboratorio de Herbert Boyer en la Universidad de California en San Francisco, se descubri una versin sinttica del gen de la insulina humana y se insert en una bacteria Escheria coli. A partir de este momento la biotecnologa se ha ido desarrollando de tal forma que se ha convertido en una herramienta clave para diagnsticos y terapias clnicas. El trmino de biotecnologa fue ideado por Karl Ereky, un ingeniero hngaro, en 1919. Lo defina como el proceso en el cual los productos son producidos a partir de materias primas con la ayuda de organismos vivos. Ereky prev una edad bioqumica similar a la edad de piedra y hierro.

El hombre desde siempre ha estado manipulando seres vivos para solucionar problemas y mejorar su forma de vida. Las plantas y los animales se fueron criando selectivamente y los microorganismos se usaron para hacer alimentos tales como bebidas, queso y pan. A finales del siglo XVIII y principios del XIX llegaron las vacunas pero fue a finales de este siglo cuando se descubrieron los microorganismos, se llev a cabo el trabajo de Mendel sobre gentica y se investigaron sobre el proceso de fermentacin y otros procesos microbianos de la mano de Koch, Pasteur y Lister. A comienzos del siglo XX se empezaron a unir la industria con la agricultura. Durante la Primera Guerra Mundial, se desarrollaron procesos de fermentacin para producir acetona a partir de almidn de disolventes y pinturas para la industria automotriz de rpido crecimiento. En1930 se orient hacia el uso de 3

excedentes de productos agrcolas para abastecer a la industria en lugar de importaciones. La llegada de la Segunda Guerra Mundial trajo la fabricacin de la penicilina. El foco biotecnolgico se traslad a los productos farmacuticos. Los aos de la guerra fra estuvieron dominados por el trabajo con microorganismos para la preparacin de una posible guerra biolgica, as como la investigacin en antibiticos y en procesos de fermentacin. La biotecnologa moderna o la biotecnologa de segunda generacin surgieron a partir de la biologa molecular y la ingeniera gentica, la cual surgi despus de la Segunda Guerra Mundial. Se trataba de la integracin de la microbiologa a la bioqumica y a la ingeniera qumica de fermentacin a gran escala, al tratamiento de aguas residuales, as como para aplicaciones en la industria qumica y farmacutica. Actualmente la biotecnologa se utiliza en muchas reas tales como la agricultura, biorremediacin, procesamiento de alimentos y la produccin de energa. La produccin de insulina y otros medicamentos se lleva a cabo a travs de clonacin de vectores que llevan el gen escogido. Los inmunoensayos se estn utilizando no slo en la medicina para el nivel de drogas y pruebas de embarazo, sino tambin por los agricultores para ayudar en deteccin de niveles peligrosos de pesticidas, herbicidas y toxinas en los cultivos y en los productos de origen animal. Estos ensayos tambin proporcionan pruebas de diagnstico de campo de productos qumicos industriales en las aguas subterrneas, sedimentos y el suelo. En la agricultura, la ingeniera gentica se est utilizando para producir plantas que son resistentes a los insectos, malezas y enfermedades de las plantas. Las nuevas tcnicas biotecnolgicas han permitido a los cientficos manipular las caractersticas deseadas. Antes de la promocin de los mtodos de ADN recombinante, los cientficos se limitaban a las tcnicas de su poca (polinizacin cruzada, crianza selectiva, pesticidas y herbicidas). La biotecnologa actual tiene sus "races" en la qumica, la fsica y la biologa. El avance de las tcnicas bioqumicas han dado lugar a tres grandes ramas: ingeniera gentica, tcnicas de diagnstico, y tcnicas de clulas-tejidos. Ahora los cientficos pueden manipular el ADN, el bloque de construccin fundamental de la vida. Los primeros resultados van desde la fabricacin de medicamentos de ingeniera gentica hasta la clonacin de la oveja Dolly. Con la finalizacin del proyecto del genoma humano, el siguiente paso ser ser la identificacin de nuevos tipos de medicamentos. Se espera que el nmero de frmacos identificados, probados y comercializados aumenten seis veces en los prximos 20 aos.

1.2. Principales compaas y productos de la industria biotecnolgica.

Existen cerca de 500 productos biotecnolgicos desarrollados o en desarrollo a nivel mundial. Mediante la ingeniera gentica, los vegetales se pueden utilizar para producir farmacolgicamente protenas activas, incluyendo los anticuerpos de mamferos, sustitutos de productos sanguneos, vacunas, hormonas, citocinas, y otros agentes teraputicos. La eficiente produccin biofarmacutica en vegetales implica la seleccin apropiada de la propia planta y del sistema de expresin gnica. Las cuestiones de seguridad y salud del producto es uno de los temas ms importantes para pacientes, trabajadores y el pblico en general. Por ello deben ser abordados, y debe existir una adecuada regulacin y supervisin del producto antes de comercializarlo. Las compaas de productos farmacuticos tienen un gran potencial, y pueden ser la base de produccin una importante variedad de productos biofarmacutica nuevos. Centrndonos en el tema fundamental de este estudio, los interferones, algunos de los productos ms comercializados son: Acctimmune (gamma interfern) por Genentech, Inc. Intron A (alpha-interferon) por Schering-Plough Corp. Procrit (epoetin alfa) por Ortho Biotech. Roferon-A (recombinante alfa-interfern) por Hoffman-La Roche. De los 187 fabricantes biofarmacuticos y las organizaciones de fabricacin por contrato (CMOs) que respondieron a la encuesta llevada a cabo por BioPlan Associates Inc en 2005, el 53% se dedicaron a la gran produccin de cultivo de clulas, el 42% estuvieron involucrados en la fermentacin microbiana a gran escala para fines teraputicos, el 30% a la fabricacin por contrato, y el 27% a la fabricacin por contrato de otros productos biofarmacuticos.

Figura 1. reas de trabajo de las industrias bioqumicas que se sometieron a la encuesta de BioPlan Associates, Inc en 2005 Cerca del 60% de los encuestados eran de los Estados Unidos, el 29% Europa representa de encuestados. Otros pases representados en la encuesta incluyen: Cuba, Espaa, Finlandia, Francia, Irlanda, Israel, Italia, Portugal, Eslovenia, Suecia y Suiza.

Figura 2. Localizacin de las empresas biofarmacuticas encuestadas.

2. PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES

Once we understand the biology of Escherichia coli, we will understand the biology of an elephant. Jaques Monod A finales de 1960 el desarrollo de tcnicas para la manipulacin gentica in vitro permiti la expresin de genes en clulas microbianas, establecindose las bases de la produccin, para E.coli, de protenas bioactivas que hasta el momento no se haban podido aislar. La comercializacin de estas protenas requiere desde el punto de vista de la produccin industrial de: Un cultivo recombinante genticamente estable. Un proceso fermentativo de alta productividad. Bajo coste en su aislamiento y purificacin.

La eleccin de la bacteria E.coli como biofabrica, esto es, para la expresin de genes heterlogos, se debe principalmente (Blight and Holland) a: Facilidad de manipulacin gentica. Rpido crecimiento. Secuencia genmica completa. Rutas metablicas conocidas.

Aunque la E.coli no se puede usar para producir protenas largas o complejas, si es posible para otras protenas de alto valor como el interferones o hormonas. La produccin de protenas con esta bacteria requiere de un control exhaustivo en las condiciones del proceso fermentativo para lograr un buen rendimiento y obtener altas concentraciones del producto.

2.1. E.coli; fisiologa y metabolismo.


La E.coli fue descubierta en 1885 por un bacterilogo alemn llamado Theodore Escherich. Es una bacteria Gram negativa, lo que significa que posee una pared celular intermedia o periplasma entre las dos membranas; interna y externa. La acumulacin de protenas recombinantes en esta bacteria se produce en el citoplasma aunque tambin puede darse en el periplasma o ser secretadas al medio extracelular.

Los principales inconvenientes en la obtencin de altos rendimientos para la acumulacin de protenas recombinantes en el citoplasma son (Blight and Holland): Degradacin proteica. Dificultades en la purificacin. Y sobre todo la formacin de orgnulos de inclusin (IB).

Los IB son agregados intracelulares de polipptidos, que se producen debido al mal plegamiento de protenas ocasionado a su vez por la existencia de reas hidrofobicas y de interacciones intermoleculares tipo unin sulfuro (Villaverde A. et al.). Suelen presentar nula actividad biolgica (excepto algunos IB enzimticos), son partculas densas e insolubles que necesitan de un tratamiento especial para su conversin a la forma activa por desnaturalizacin y desdoblamiento.

Micrografa de clulas E.coli produciendo protena betagalinsulina (x17,500). Las flechas indican los IB. De William et al.extraido de Asok M.et al.

La E.coli es una bacteria facultativa anaerbica, corta y con forma de bacilo. Como mesfila puede crecer en un rango de temperaturas de 8-48C con una

velocidad de crecimiento mximo a 39C y con una actividad acuosa de 0.95, tolera bien ambientes cidos y puede crecer a valores de pH desde 4 a 10. La E.coli puede desarrollarse en diferentes substratos en presencia o no de oxgeno. La glucosa es el sustrato ms comn ya que se metaboliza fcilmente, proporcionando la fuente de carbono y la energa para la biosntesis. Para una mejor comprensin del comportamiento del microorganismo se describen a continuacin algunos aspectos relacionados con su metabolismo.

2.1.1. Oxidacin de la glucosa.


Se produce la glucolisis en condiciones aerbicas en las que parte de la glucosa se oxida a dixido de carbono con oxgeno como aceptor terminal de electrones. Este proceso es exergtico y permite la formacin de ATP, el cual es requerido en la biosntesis de los constituyentes celulares. La reaccin global para la oxidacin de la glucosa es:

Hay que tener en cuenta que en esta ecuacin qumica no se incluye la utilizacin de la glucosa para la ruta de biosntesis. 9

2.1.2. Fermentacin de la glucosa.


Cuando se produce un exceso de glucosa o hay condiciones anaerbicas, la glucosa puede reaccionar va fermentativa despus de la etapa de glucolisis, se convierte en metabolitos cidos como: succinato, formico, acetato, lactato, etanol e hidrogeno gas. De entre todos los productos de la fermentacin el cido actico es el ms abundante. Ignorando la utilizacin anablica de la glucosa la reaccin general para la fermentacin de la glucosa es:

Se ha demostrados que un elevado flujo de glucosa a la clula y la alta velocidad de crecimiento consecuente, inducen la produccin de cido actico. El valor crtico para el consumo de glucosa depende de: la cepa bacteriana, las condiciones y composicin del medio de cultivo. (Isabel C.A.) La produccin de cido actico en fermentaciones aerbicas de la E.coli constituye uno de los mayores problemas impidiendo alcanzar un alto rendimiento y productividad. La acumulacin de cido actico en el medio provoca, entre otras, la reduccin en la produccin de protenas recombinantes.

2.1.3. Oxidacin del cido actico.


Si la concentracin de cido actico no se encuentra en niveles de inhibicin y la capacidad del ciclo TCA (ciclo cido tricarboxilico) no est cubierta con glucosa, el actico se usa como fuente de carbn secundaria prolongando la vida de la clula. 10

En sistemas fed-batch se produce consumo de cido actico por las clulas, no est catablicamente reprimido de manera que las clulas pueden crecer en medio compuesto de una mezcla de glucosa y cido actico siempre que no se sobrepase la capacidad oxidativa de las clulas. En sistemas discontinuos la glucosa limita el uso celular del cido actico exgeno que se consume solo cuando se ha agotado la glucosa.

2.2. Aspectos genticos E.coli.


De acuerdo con el Instituto Americano de Salud las tcnicas de recombinacin gentica (rADN) comprenden; generalmente, la formacin de molculas recombinantes de ADN uniendo fragmentos de ADN naturales o sintticos a molculas de ADN originales, con la capacidad de replicarse. Los procesos de recombinacin in vitro hacen posible separar genes especficos de la cadena de ADN mediante el uso de encimas de restriccin y unirlas o parearlas de forma controlada. A continuacin se muestra un esquema del proceso.

Una de las tcnicas empleadas para llevar a cabo la clonacin de genes consiste en moverlos de un genoma complejo a otro ms simple, para ello una vez aislada la secuencia de inters, se incorpora esta a un vector de clonado. Resultando una molcula con ADN propio y capacidad de reproducirse, que 11

introduce ADN extrao producto de la recombinacin (rADN) en una clula hospedadora. El tipo de vectores de clonado ms habitual para E.coli son los plsmidos. Son organismos con ADN (extracromosmico) que se encuentran normalmente en las bacterias y que pueden reproducirse fuera de la clula hospedadora. El vector plsmido se fabrica con plsmidos naturales eliminando los segmentos innecesarios y aadiendo las secuencias deseadas. Posee de esta manera las secuencias genticas que expresan, en este caso, la produccin de protenas y tambin secuencias de genes que actan como activadores o fenotipos, regulando la expresin gentica. Los factores que afectan negativamente a la fisiologa de la clula durante la produccin de protena recombinante en cultivos densos de E.coli son: [Ref.3] Intracelulares: o Presencia de vectores de expresin multicopia. o Toxicidad de los productos genticos. o Alta expresin gentica. o Desdoblado de protenas. Extracelulares: o Acumulacin de desechos metablicos txicos. o Limitacin de nutrientes. o Limitacin de oxgeno. o Presencia de otros comensales.

De entre todos estos factores cabe destacar la estabilidad del plsmido, ya que un microorganismo que contenga un plsmido recombinante debe de asignar parte de sus recursos al mantenimiento y reproduccin del plsmido, por lo que se producirn diferencias en las velocidades de crecimiento de clulas con plsmido y clulas libres de plsmidos. En ingeniera gentica se utilizan de plsmidos que suelen tener uno o dos genes resistentes a un antibitico, esto es; contienen un marcador gentico que le confiere un fenotipo por el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. Otra tcnica muy habitual consiste en introducir un control va gen activador que permita separar las fases de crecimiento y produccin. Esto se realiza introduciendo un gen que acta como interruptor qumico (sustancia) o fsico (temperatura) de la expresin del plsmido. Una vez se ha optimizado la eleccin de un antibitico e interruptor adecuado hay que tener en cuenta la formacin de cuerpos u orgnulos de inclusin (IB) durante el proceso de produccin, seleccionado las tcnicas necesarias para su aislamiento y purificacin. 12

Aunque se ha avanzado mucho en las tcnicas de produccin por rADN con la E.coli, todava se hace necesaria mucha investigacin complementaria para poder simplificar y mejorar el proceso en su conjunto.

2.3. Interferones: clasificacin y accin.


Los interferones son una familia de pequeas protenas con pesos moleculares de entre 15 a 276 kDa que pertenecen al grupo de las citoquinas. Tienen una alta actividad antiviral e inhiben la proliferacin de clulas cancerosas. Se describieron por primera vez en 1957 por Isaacs y Lindermann del National Medical Research (UK). Se producen de forma natural por clulas del cuerpo (en mamferos) como: leucocitos o fibroblastos y su funcin principal es regular la respuesta inmune y antiinflamatoria.

Se han estudiado principalmente tres tipos de interferones (IFNs), que se pueden clasificar segn su actividad biolgica: [Ref. 6,7]

Tipo I: incluye subtipos y (humanos), (ratn) , (gatos), (rumiantes), (cerdo). o IFN (interfern leucocitario) incluye a su vez mas de 15 tipos de molculas diferentes, siendo IFN a , IFN b las ms estudiadas. o IFN (proveniente de fibroblastos), es la variedad comercializada en mayor medida actualmente cuya procedencia puede ser: De fibroblastos diploides creciendo en anclados una superficie adecuada, tcnica ms segura. De bacterias a las que se les ha insertado un plsmido que por tcnicas de recombinacin genticas ha sido asociado con el gen humano correspondiente. Tipo II: subtipo (IFN inmune). Tipo III: subtipo se une especficamente a receptor IL10R2.

Los interferones tipo 1 se producen principalmente en respuesta a los productos antgenos como glucoprotenas virales, ARN viral, endotoxinas virales Su metabolismo y produccin tiene lugar principalmente en los riones. De su unin a receptores especficos en la clula antgena objetivo 13

resulta la produccin de una protena que alerta a las clulas T y B (constituyentes de los linfocitos) sobre el posible ataque. De esta manera las clulas T atacan y provocan la eliminacin de las clulas antgenas. Tambin inhiben reproduccin de los virus mediante enzimas que a su vez inhiben la sntesis proteica de los virus en su multiplicacin.

Los interferones presentan actividad frente a clulas tumorales, las detectan de forma que las clulas T (linfocitos), las atacan y destruyen. El IFN-gamma est involucrado en la regulacin de las respuestas antiinflamatorias, normalmente tienen baja actividad contra antgenos y agentes cancerosos pero si potencia los efectos de los IFN-alfa y IFN-beta. Los IFNs estn tambin relacionados con los desrdenes autoinmunes, la alteracin de la membrana celular, la estimulacin en la diferenciacin celular, la regulacin del factor de crecimiento, la alteracin del sueo

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3. DISEO DEL PROCESO


El empleo de procesos basados en obtencin de productos a partir de E.Coli recombinada es cada vez ms frecuente, ya que han permitido obtener rendimientos muy superiores respecto otras tcnicas, y ahora mismo hay un creciente inters sobre mtodos de alta densidad celular frente a conseguir una alta expresin de la protena, y ms an desde que hay indicios de disminucin de la fidelidad de la recombinacin en sistemas de alto nivel de expresin, por lo que puede interesar producir con menor expresin pero en las condiciones adecuadas para conseguir un producto de mayor calidad. 3.1. Modos de cultivo Un error tpico a la hora de producir protenas por recombinacin gentica es centrarse slo en alcanzar una alta expresin de las protenas o bien en conseguir una alta densidad celular. Ambos aspectos son importantes y no podemos considerar tan slo uno de ellos si queremos que nuestro proceso sea econmicamente viable. Con frecuencia lo que se busca es la alta expresin de las protenas sin ser consciente de que una alta densidad celular aporta grandes ventajas frente a un cultivo de baja densidad: Altas concentraciones de producto. Aumento de la productividad. Disminucin de los costes de produccin. Reduce el volumen de cultivo. Facilita las operaciones aguas abajo, es decir, la extraccin y purificacin de la protena. Reduce la cantidad de efluentes residuales. Reduce el coste de produccin y de inversin en equipos. (Lee et al, 1996)

El problema est en que conseguir altas densidades celulares no es tan sencillo. Con E.Coli no recombinada se consiguen cultivos de alta densidad celular, por encima de 125 g/l con relativa sencillez, sin embargo para E.Coli recombinada normalmente son mucho menores, pocos autores confirman haber alcanzado concentraciones superiores a los 50 g/l. Con frecuencia para estos casos se ha empleado el reactor semicontinuo que nos permite obtener densidades celulares superiores cuando es necesario controlar el crecimiento debido a limitaciones en la transferencia de oxgeno, de calor o incluso problemas con el sustrato y subproductos. Los problemas de limitacin de oxgeno conducen a subproductos de fermentacin que actuarn como inhibidores del crecimiento del microorganismo y disminuirn el rendimiento del 15

proceso como se ha comentado anteriormente. Adems es tambin necesario evitar restricciones en el crecimiento debido a concentraciones iniciales de sustrato demasiado altas o demasiado bajas. Por tanto si queremos una alta densidad celular deberemos evitar tanto las limitaciones de oxgeno como el exceso de glucosa. A la hora de operar tenemos tres alternativas para la configuracin del reactor: continuo, discontinuo y semicontinuo. Estos mtodos difieren en la forma de aportar los nutrientes al cultivo. En los discontinuos todos los nutrientes excepto el oxgeno estn en el reactor de fermentacin en el momento de inoculacin. En el continuo el medio de cultivo es constantemente aadido al cultivo y la misma cantidad de caldo de cultivo es retirada de forma que se trabaja en estado estacionario. Y por ltimo en el semicontinuo hay una adicin de nutrientes a lo largo de la fermentacin pero no se elimina caldo de cultivo.

Isabel Cristina de Almeida Pereira da Rocha (2003) El proceso en continuo presenta la ventaja de una gran versatilidad a la hora de imponer una velocidad especfica de crecimiento, pero tiene el inconveniente de que se consume mucho tiempo para estabilizarlo en el estado estacionario. Otro aspecto a considerar es la inestabilidad del plsmido que es muy alta y que la probabilidad de contaminacin en estos reactores es mucho mayor que en el resto. No obstante, aunque a nivel industrial no es empleado se sigue utilizando para experimentos de laboratorio en los que se quieren velocidades de crecimiento especficas. En caso de tener un proceso continuo con induccin deberemos realizarlo en dos etapas, una de crecimiento bacteriano y otra de produccin de la protena, lo que aumenta an ms el riesgo de contaminacin y no todas las clulas que dejan el primer reactor tendrn el mismo tiempo de residencia dando lugar a clulas de diferentes edades en la

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etapa de induccin. A pesar de esto existen ejemplos de aplicacin de cultivos continuos en dos etapas Fu et al. (1993) o Kim et al. (1992). Para trabajar de esta forma un ejemplo lo podemos encontrar en Park et al. (1990) que realizan una induccin por temperatura, en la primera etapa se opera a temperatura inferior a 37C en la que se produce el crecimiento y en la segunda etapa se sobrepasan los 38C favoreciendo la biosntesis y acumulacin del producto del gen clonado. Respecto a la operacin en discontinuo es sin duda el mtodo ms usado en procesos industriales de biotecnologa debido a su simplicidad de operacin y al menor riesgo de contaminacin. Segn esto podramos pensar que es el reactor ideal para nuestro caso pero hay que tener en cuenta que tradicionalmente en estos reactores se han conseguido densidades celulares mucho ms bajas que en las otras configuraciones, normalmente de 1-2 g/l y con un mximo de 12 g/l debido a las restricciones por limitacin de nutrientes o aparicin de inhibidores del crecimiento. Obviamente con estas concentraciones de microorganismo no se conseguir un proceso rentable, por lo que habr que recurrir al reactor semicontinuo que aunque desde el punto de vista operacional es ms complejo permite obtener mejores rendimientos. En las siguientes figuras aparece un ejemplo de comportamiento de diferentes parmetros a lo largo del tiempo para el reactor discontinuo y semicontinuo.

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Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors (1991) En el semicontinuo la velocidad especfica de formacin de la protena es mxima durante las primeras horas tras de la induccin y despus disminuye. Esta disminucin puede ser debida al incremento en la concentracin de amoniaco y acetato, as como a la falta de glucosa 4.2 horas despus de la induccin. Tras la induccin se ve un aumento en la velocidad de generacin de acetato que conduce a un aumento de su concentracin. Esto a su vez lleva a un aumento del amoniaco ya que ste es usado para regular el pH. Existen otras sustancias como KOH o NaOH vlidas para sustituir al amoniaco en esta funcin aunque del mismo modo altas concentraciones de sales tendrn accin inhibidora por lo que no son una solucin real. Por otro lado con el semicontinuo se pretende alcanzar densidades celulares superiores con tiempos de cultivo relativamente cortos y siendo ms fcil mantener la esterilidad que en los sistemas continuos. Adems la inhibicin por nutrientes o subproductos se puede evitar gracias a la posibilidad de controlar la velocidad de crecimiento, evitar limitaciones en la transferencia de oxgeno o calor, y controlando la alimentacin de sustrato. En el ejemplo de Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors (1991) la alimentacin comienza cuando tenemos un peso seco celular de 11.6 g/l, que es cuando la glucosa inicial est casi consumida. La corriente de alimentacin de glucosa va aumentando exponencialmente durante tres horas a partir de ese momento se mantiene constante con lo que se pretenda conseguir una velocidad de crecimiento constante en 0.3 h-1 sin embargo primero fue de 0.35 h-1 y luego baj hasta 0.25 h-1. El acetato inicialmente formado va a ser consumido al principio del periodo de alimentacin. 18

Al igual que en el reactor continuo se produce un incremento transitorio de la concentracin de oxgeno y de dixido de carbono durante la primera hora tras la induccin aunque no tan pronunciado. Para evitar la limitacin de oxgeno se aumenta la presin en la alimentacin. En ambos mtodos los plsmidos se mantienen estables, sin embargo una cantidad significativa se redujo a partir de la temperatura de induccin en el reactor semicontinuo y algo parecido ocurre en el discontinuo tambin, y ha sido asumido como una consecuencia de excesiva sntesis de ARN o de acumulacin de subproductos. La disminucin en el semicontinuo probablemente no es causada por la alta concentracin intracelular de protena como en el discontinuo que fue un 50% mayor, si no que puede ser consecuencia de una falta de carbono para los procesos que no generan energa, ya que al principio del carbono alimentado el 33% pasa a CO 2 y al final pasa el 66%.

Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors 1991 En definitiva el empleo del sistema semicontinuo garantiza un incremento en la productividad y una disminucin de los costes de produccin respecto al discontinuo. Adems el reactor semicontinuo nos abre un amplio abanico de opciones para realizar el control que podr ser tanto por realimentacin como anticipativo. Incluso dentro del control por realimentacin existen varias opciones, el sistema indirecto en el que se usan parmetros como el oxgeno disuelto, pH y presin parcial de CO2 en gas de salida para regular la alimentacin de nutrientes. O el sistema directo en el que directamente la concentracin de sustrato en el medio de cultivo es usada como parmetro para el control.

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3.2. Aspectos generales del proceso


Para formar el cultivo se tienen las cepas bacterianas a -196C en nitrgeno lquido, primero formaremos el inculo en un matraz o tanque de menor tamao y posteriormente lo aadiremos al caldo de cultivo que introduciremos en el reactor. Una vez se da por completo el proceso se inactivan los microorganismos aadiendo cido sulfrico, se concentra mediante centrifugacin y directamente tras la centrifugacin se procede a la purificacin que va a ser una etapa de gran importancia. Se puede apreciar que tenemos dos reactores. Esta configuracin va a ser la ms frecuente ya que como se ha comentado lo recomendable es realizar el proceso en dos etapas, una primera etapa en la que se favorece el crecimiento del microorganismo y una segunda etapa en la que se corta el crecimiento y se fomenta mediante una induccin la generacin de la protena, adems este sistema nos permite trabajar a diferentes condiciones en los dos tanques, lo que puede ser muy ventajoso si las condiciones ptimas de crecimiento no son las mismas que para la produccin . La mejor manera de realizar la induccin es algo sobre lo que no se ha conseguido llegar a un acuerdo, hay varias formas de llevarla a cabo. En general la induccin conlleva un cambio que puede ser provocado tanto por un agente qumico como por un agente fsico. A da de hoy la preferida por la mayora es la induccin trmica, en la que con una variacin de la temperatura se impulsa el cambio en la bacteria. Los defensores de la induccin trmica critican las inducciones por agentes qumicos como pueden ser el isopropil--D-1-tiogalactopiransido (IPTG) o antibiticos basndose en su elevado coste y toxicidad. El empleo de estas sustancias implica su presencia en el producto final y en los efluentes residuales del proceso representando un peligro por lo que tendrn que ser eliminados. Esto requiere controles adicionales y operaciones aguas abajo para eliminar los inductores, especialmente en el caso de protenas de calidad farmacutica y productos para consumo humano, de forma que se encarece y complica el proceso. Una posible solucin es el reciclado de los agentes qumicos aunque todava no se ha avanzado lo suficiente en este campo. Otro tipo de induccin se basa en el agotamiento de algn tipo de nutriente como puede ser algn aminocido concreto, pero esta falta puede afectar al metabolismo de la clula o a la sntesis de la protena recombinante, adems de la dificultad que tiene una correcta sincronizacin de la induccin, es decir, aadir dicho nutriente en la cantidad justa para que se consuma por completo en el momento oportuno. Otro caso tpico es la induccin por pH, que pretende con un cambio en el pH conseguir el cambio en el comportamiento de la clula, pero no se ha 20

desarrollado demasiado todava. El cambio del pH puede provocar una salida del intervalo de pH ptimo de condiciones fisiolgicas para el correcto desarrollo del cultivo. Por tanto la tcnica ms exitosa hasta el momento es la induccin trmica que tiene probada su eficacia y evita el empleo de medios de cultivo especiales, o caros y txicos agentes qumicos. Consiste en mantener la temperatura por debajo de 37C (normalmente entre 28 - 32 C) para la primera etapa en la que se produce el crecimiento del cultivo ya que a esta temperatura la expresin del gen estar inhibida y para la segunda etapa se incrementa la temperatura por encima de 37C. Unos valores factibles segn Lars Strandberg et al. (1991) pueden ser 30C para la etapa de crecimiento y 40C para la etapa de produccin, y se proceder a la induccin cuando el peso seco celular sea de 4 g/l. Habr que tener cuidado de que el golpe de calor no afecte a la cantidad y calidad del producto. Las bacterias que hayan sufrido una induccin no son reutilizables.

Bsicamente este mtodo se basa en el empleo del promotor pL/pR del fago lambda (virus que se incrusta en su genoma afectando a su comportamiento). Este promotor est regulado por la protena cI857, que impide efectivamente la transcripcin de los genes bajo control de pL/pR a temperaturas por debajo de los 37 C. Dada la naturaleza termolbil de la protena cI857, cuando la temperatura se incrementa, la expresin es muy potente. El empleo del promotor permite obtener altas densidades celulares, manteniendo el nivel de expresin del gen a un nivel despreciable cuando las temperaturas del cultivo estn entre 28 y 32 C. Hay que tener en cuenta que el incremento de temperatura es ms lento a medida que aumenta la escala del biorreactor. La induccin no ser instantnea, no obstante un calentamiento progresivo puede incluso favorecer la produccin. lvaro R. Lara (2009). En las siguientes grficas podemos seguir el comportamiento de algunos parmetros con el tiempo:

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K. R. Babu et al. (2000)

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La primera parte corresponde a la fase discontinua cuando an queda glucosa en exceso y no es necesario iniciar la adicin de ms sustrato. En la segunda fase ya si tenemos la glucosa como sustancia limitante y por tanto se inicia la alimentacin con ms sustrato para que siga creciendo la E.Coli. Estas dos fases forman lo que se conoce como etapa de crecimiento y en ellas se debe alcanzar la densidad celular suficiente para conseguir la produccin esperada. La segunda fase del funcionamiento semicontinuo es la conocida como etapa de produccin, entre estas dos fases de funcionamiento semicontinuo se llevar a cabo la induccin para pasar de favorecer el crecimiento del cultivo a favorecer la produccin de protena. Se observa como la mayor parte del interfern generado se produce en las tres primeras horas tras la induccin. A partir de este momento la cantidad de producto obtenida no aumenta significativamente a pesar de continuar con la alimentacin de sustrato al medio. Tambin llama la atencin como durante la etapa semicontinua la generacin de acetato es muy lenta, gracias a que se realiza la alimentacin de forma que se minimice su aparicin. Esto no concuerda con los resultados observados anteriormente segn Lars Strafberg et al. (1991) donde probablemente no se consigui realizar la alimentacin de la mejor forma.

Medio de cultivo La fabricacin de un medio de cultivo adecuado va a ser base fundamental para que el proceso tenga xito, pues si no conseguimos las condiciones adecuadas para el cultivo no obtendremos el correcto desarrollo de la E.Coli. El medio va ser fundamentalmente una disolucin de glucosa enriquecida en sales minerales. Y conforme tenga lugar el proceso iremos adicionando ms glucosa. Es recomendable adems aadir trazas de algunos metales y vitaminas al medio. En las siguientes tablas observaremos las cantidades que se deben aadir al medio de cultivo tanto para el medio inicial que corresponde a la parte discontinua como a la alimentacin, adems del tipo de esterilizacin recomendada, para las 1 y 2 se esteriliza en un autoclave (30 min a 121C) los componentes por separado y los que tengan el nmero 3 son esterilizados mediante una filtracin esterilizante. Estas no son las nicas vas de esterilizacin, existen maneras alternativas como pueden ser la esterilizacin por sobrepresin de aire pero son es menos comn.

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Segn Isabel Cristina de Almeida Pereira da Rocha (2003):

Segn Xiao-Ming Yang et al. (1992):

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Alimentacin A continuacin haremos un repaso de las diferentes formas que hay de controlar la alimentacin del reactor semicontinuo: Alimentacin exponencial El realizar una alimentacin que aumente de forma exponencial es una tcnica muy utilizada para conseguir una velocidad de crecimiento constante y en un valor que minimice la formacin de acetato. Este procedimiento tiene algunos inconvenientes a la hora de aplicar los clculos necesarios para predecir cmo debe realizarse la alimentacin. Se recomienda que el caudal volumtrico permanezca constante y lo que aumente sea la concentracin del sustrato en la corriente. Mtodo del pH Como ya se coment, los cambios de pH en el medio pueden reflejar el nivel de concentracin de glucosa. Un exceso en la alimentacin de glucosa puede dar lugar a cambios metablicos de las clulas que excretarn acetato y otros cidos orgnicos reduciendo el pH. Por el contrario la falta de glucosa hace que las clulas catabolicen cidos orgnicos o aminocidos como fuente de carbono aumentando el pH. Por eso existe un mtodo para regular la alimentacin basado en el control del pH, de forma que si el pH disminuye se reduce la alimentacin y viceversa. Mtodo del oxgeno disuelto Con mucha frecuencia el oxgeno disuelto (DO) ha sido utilizado como parmetro de control por realimentacin, entre otras cosas por ser un sistema sencillo, barato y fiable. Bsicamente si el DO aumenta debido a una disminucin del sustrato el controlador inicia la adicin de glucosa provocando la disminucin del DO. Cuando se alcanza un mnimo prefijado se detiene la adicin de glucosa. Algunos autores encontraron inconvenientes a este sistema porque se sigue generando una cantidad significativa de acetato, para evitarlo hay que complicar el lazo de control aadiendo un control sobre la velocidad de agitacin y no siempre merece la pena. Mtodo directo Otra opcin es medir directamente la concentracin de glucosa en el caldo de cultivo y en funcin de esto regular la alimentacin. La concentracin de glucosa se puede determinar por el mtodo de la glucosa oxidasa, que consiste en que la glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando cido glucnico y H2O2. El perxido de hidrgeno liberado reacciona con un cromgeno (fenol/4aminoantipirina) por la reaccin de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente 25

proporcional a la concentracin de glucosa y se podr determinar con un espectrofotmetro.

Para realizar este anlisis existen kits comerciales que facilitan el trabajo y de una manera similar se pueden realizar las medidas de la concentracin de acetato. Mtodo de consumo de glucosa Este mtodo se basa en regular la alimentacin de glucosa en funcin del consumo. Y para conocer el consumo de glucosa se realiza un anlisis del gas expulsado del fermentador, que se har mediante un analizador de gases con un detector de infrarrojos para el CO2 y un detector paramagntico para el O2.

3.3. Condiciones de operacin y control.


Se instalarn una serie de lazos de control para los principales parmetros que influyen en el proceso como la temperatura, volumen, desarrollo celular, formacin de espumas, presin, velocidad de agitacin, flujo de aire y oxgeno, pH y alimentacin de glucosa. Para regular el pH usaremos amoniaco y cido sulfrico en caso de que sea necesario. El pH debe mantenerse lo ms constante posible alrededor de 6,8-7 que ser un pH ptimo para el desarrollo de la E.Coli. La formacin de espumas puede ser otro inconveniente que con frecuencia aparece en nuestro sistema, para evitarlo se instala un sistema con un detector de espumas que automticamente aada un antiespumante que podra ser polipropilenglicol. La medida de la turbidez se relaciona con la densidad ptica, se emplear un espectrofmetro y la medida ser realizada a 600 nm, con esta medida se controlar el crecimiento de las clulas. La estabilidad de los plsmidos ser estudiada en funcin de la cantidad de unidades formadoras de colonias en una placa con y sin antibiticos (ampicilina 105 mg/l y kanamicina 30 mg/l), siendo las placas incubadas a 30C durante 24 h (Lars Strandberg et al. 1991). Esto es as ya que normalmente el plsmido contiene un gen que proporciona resistencia a los antibiticos, y de esta forma comparando la cantidad de UFC en ambas placas se puede saber la cantidad de clulas que contienen dicho plsmido. Aspecto de gran importancia pues debido a efectos de segregacin el plsmido podra perderse y las clulas 26

libres al carecer de la carga metablica impuesta por el plsmido creceran ms rpido desplazando al resto, con la consecuente prdida de productividad ( lvaro R. Lara 2009). El volumen del tanque se controla con un sensor de presin diferencial por membranas, aunque se pueden instalar otros sistemas. El caudal de alimentacin de glucosa se mide con un caudalmetro msico por induccin. La velocidad de agitacin se regula con un variador de frecuencia y debe mantenerse entre unas 200-450 rpm segn Lars Strandberg et al. (1991) aunque hay otros autores como B. Wipf et al. (1994) que recomiendan se controle entre 0-350 rpm y K. R. Babu et al. (2000) en 500 rpm. La elevada demanda de oxgeno en los cultivos de alta densidad celular hace necesario alimentar con una corriente de aire enriquecida con oxgeno puro. La proporcin entre ambos ser controlada mediante unas vlvulas accionas por un controlador y se mide con un caudalmetro msico trmico. Se procurar mantener el oxgeno disuelto entre el 50- 80% de la concentracin de saturacin segn B. Wipf et al. (1994) y para medirlo se emplear un electrodo polarogrfico. Otros autores como Lars Strandberg et al. (1991) y K. R. Babu et al. (2000) sitan este valor en un 25% del valor de saturacin. Los parmetros que afectan al oxgeno disuelto son la velocidad de agitacin, los flujos de aire y oxgeno, y la temperatura. Para un reactor de unos 1000 litros el flujo mximo de aire ser de aproximadamente 600 l/min, que previamente pasar por un filtro de unas 0.2 m para esterilizar y retirar partculas en suspensin. En ese caudal ir incluido el flujo de oxgeno puro que rondar los 100-170 l/min. El caudal de aire, la alimentacin de glucosa y el volumen del fermentador se medirn en intervalos de 1 minuto. Mientras que el anlisis del gas expulsado oscilar entre 4-10 minutos. Una vez visto todo esto el esquema del reactor resultante puede observarse en la siguiente figura:

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B. Wipf et al. (1994)

Otra imagen correspondiente al dispositivo experimental utilizado a escala de laboratorio

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3.4. Purificacin del producto.


La produccin de protenas recombinantes (R-prot.) con E.coli requiere la colaboracin interdisciplinar en aspectos como: biologa molecular, procesos de fermentacin, purificacin de productos Para la comercializacin rentable del este tipo de productos se hace imprescindible una alta productividad volumtrica de R-prot. purificada y bioactiva para lo cual es necesario: Un proceso fermentativo de alta productividad; dens.celulares>200gr/L Un proceso de purificacin adecuado y eficiente.

Dentro del proceso de produccin de protena bioactiva, las etapas de plegamiento y purificacin son de vital importancia debido a la las particularidades de la clula hospedadora (E.coli), aunque es extensible a procesos con otros organismos como: levaduras, bacilos, eucariotas superiores... Aunque normalmente la acumulacin de protenas en E.coli se produce en el periplasma, la formacin de IB facilita el aislamiento de la protena en el citoplasma acosta de modificar su estructura primigenia. Es de destacar por tanto, que la viabilidad econmica de todo el proceso depende en gran medida de la eficiencia en la recuperacin de la protena bioactiva de los IB. [Ref.4] Protena recombinante como orgnulos de inclusin (IB) La formacin de IB dentro del citoplasma celular no est del todo justificada actualmente a pesar de la multitud de estudios realizados sobre la materia. Cada protena tiende por causas especficas y no del todo dilucidadas a formar IB, siendo la causa compartida a todas la sobreexpresin de R-prot. en circunstancias adversas para su plegamiento de manera natural. No hay relacin directa entre la tendencia a la formacin de IB de una protena determinada y sus propiedades intrnsecas como: peso molecular, hidrofobia, rutas de plegamiento, etc... En el caso de que la R-prot. tenga puentes de disulfuro, la formacin de IB esta inhibida por el ambiente reductor/oxidante del citoplasma. A grandes rasgos y de una manera generalista los procesos de recuperacin de protena bioactiva de IB comprenden las siguientes etapas: [Ref.5] Aislamiento de IB. Purificacin de la protena desnaturalizada. Plegamiento de la protena a la conformacin bioactiva. Mejora de la actividad biolgica. Purificacin. 29

3.4.1. Formacin, aislamiento y caracterizacin de IB. Como se han descrito anteriormente los IB son agregados proteicos que se encuentran en el citoplasma y periplasma. Se distinguen del resto de orgnulos por ser refractarios, suelen tener un tamao entre 017-13m y pueden presentar estructura amorfa o paracristalina. En muchos casos representan entre el 20-50% del contenido proteico total de la clula, facilitando el aislamiento y recuperacin de R-prot en la forma desnaturalizada. Como se ha mencionado anteriormente la razn exacta de la agregacin de protenas formando IB no est del todo clara y puede deberse a: La alta concentracin de R-prot. en el citoplasma. Falta de compartimentacin en la clula adems de un ambiente oxidante/reductor en el citoplasma que provoca la no interaccin de los puentes disulfuro.

Esta primera etapa en el proceso de purificacin consta de dos fases fundamentales: 1. Aislamiento de IB. 2. Solubilizacin de la protena contenida en IB. La E.coli presenta elevada rigidez en la membrana multicapa por lo que la su ruptura no es posible mediante tcnicas como: Ultrasonidos (depende de frecuencia y ciclos). Shock osmtico. Permeabilizacin qumica (solo periplasma). Ruptura enzimtica (solo periplasma).

La tcnica ms adecuada para ocasionar un alto grado de lisis celular (>95%), consiste en la homogeneizacin a alta presin (2500 kg/cm^2 aprox.), aunque con el inconveniente de la posible contaminacin de la R-prot. por sustancias celulares. Como parmetros de funcionamiento para un equipo de homogeneizacin a alta presin hay que destacar: Presin de trabajo. Diseo de la vlvula. Numero de pasos a travs de la vlvula. Velocidad de flujo. Temperatura de la suspensin.

Una vez rota la membrana celular, dado que los IB presentan una alta densidad (13mg/mL aprox.), es posible su separacin del resto de componentes celulares por centrifugacin a alta velocidad. Como parmetros de funcionamiento para una centrifugadora industrial continua se destacan: 30

Flujo de la corriente procesada. Velocidad de centrifugacin. Propiedades fsicas de los sedimentables. Densidad y viscosidad de la solucin.

En la centrifugacin los IB se compactan en agregados o pellets que posteriormente son clarificados por sucesivas ciclos de lavado y centrifugacin. La mayor parte de los contaminantes se elimina en 3-4 ciclos de lavado. La estructura densa de los IB es solubilizada minimizando las interacciones hidrofobicas y la formacin de enlaces S-S no deseados. Para llevar a cabo la solubilizacin los (disolventes/detergentes/agentes caotrpicos) a emplear se deben escoger en base a criterios como: No crear dificultades en etapas posteriores. Buena solubilizacin de IB. Inhibicin de actividad proteica. No modificar los enlaces de aminocidos en la R-prot.

A baja concentracin de detergente la cadena C-C de este reacciona con el lado hidrfobo del aminocido, extendindose el grupo polar al agua. De esta manera los detergentes tapan o cubren las zonas hidrfugas de la superficie proteica y la solubilizan. El inconveniente de esta tcnica radica en la dificultad de eliminar totalmente el detergente de la R-prot. aunque como ventajas tenemos su bajo precio y la baja influencia que ejerce sobre la actividad biolgica de la R-prot. Considerando que la formacin de IB es muy selectiva, se puede esperar que usando tcnicas de lavado adecuadas se obtenga un 90% aprox. de pureza para la obtencin de R-prot. solubilizadas. Los agentes caotrpicos habituales son: urea, GdHCl, sales de tiocianato, y detergentes como; SDS, cloruro de N-cetiltrimetilamonio, Sarkosyl La concentracin habitual (6-8M) aumenta con la hidrofobia de la R-prot a solubilizar. El grado de solubilizacin de los IB depende de: Concentracin de la protena y del agente desnaturalizante. Pureza de la protena. pH. Presencia de grupos tioles libres.

En ocasiones es difcil solubilizar IB incluso a altas concentraciones de agente caotrpicos debido fundamentalmente a la formacin de enlaces S-S intermoleculares. 31

Una tcnica empleada para medir el grado de solubilizacin consiste en cuantificar la accin de disolventes o buffers de pH por mediciones en fluorescencia y dispersin de la luz al atravesar la muestra. Mediante esta tcnica es posible la determinacin del mximo de solubilidad. La eleccin de uno u otro agente de solubilizacin afecta en gran medida al plegamiento de la molcula, de forma que una etapa de solubilizacin adecuadamente seleccionada repercute en la economa proceso.

3.4.2. Purificacin de la protena desnaturalizada. La tcnica de purificacin que se debe llevar a cabo antes de la etapa de plegamiento, se elige en funcin de la influencia que las impurezas de la mezcla (IB+protenas+DNA+lipidos) tengan sobre la etapa de plegamiento Se decide a proceder con la purificacin de las R-prot. antes del plegamiento segn: La cantidad y pureza de R-prot. en los IB. o Si la cantidad en <15% de las protenas celulares totales. o Si la pureza de la R-prot en IB no alcanza 40-50%. Si hay elevado nmero de protenas con grupos tioles. La presencia de protenas de esta clase puede provocar la formacin de enlaces intermoleculares con las R-prot.

Tcnicas de cromatografa habituales en la purificacin de protenas: Cromatografa de fase inversa (RP-HPLC). Cromatografa de filtracin en gel (por exclusin de tamaos). Cromatografa de intercambio inico: es la tcnica ms til en purificacin. Ambas matrices, catinica y aninica, pueden llevarse al pH isoelctrico y correspondiente al pH de estabilidad de la protena. Las ms habituales son la Q y S-sepharose. Ofrecen escalabilidad y la concentracin y purificacin se puede alcanzar en un solo paso.

Tambin o conjuntamente la purificacin se puede llevar a cabo mediante: Centrifugacin a alta velocidad. Ultrafiltracin: se aplica a operaciones a escala industrial. Como la mayora de las protenas de inters se encuentran entre 14-22kDa, ajustando el corte por pesos moleculares de la membrana es posible separar la mayora de los contaminantes macromoleculares.

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3.4.3. Renaturalizacin de las R-prot. a la conformacin bioactiva. Para obtener la conformacin original, la cadena de polipptidos debe ser replegada en las estructuras secundarias o terciarias correctas, de forma que puedan ser posteriormente estabilizadas por enlaces de disulfuro. Las estrategias de replegado de desarrollan de acuerdo a condiciones como: Reducir la concentracin de detergente a niveles en los que no afecten a las fuerza de estabilizacin intramolecular; enlace H-H, hidrofobia El proceso de plegamiento se lleva a cabo en una medio buffer que contiene un agente oxidante. La concentracin de protena desnaturalizada en la disolucin amortiguadora se mantiene baja para evitar la agregacin intermolecular.

Entre las tcnicas de plegamiento destacamos: A. Plegamiento por dilisis, tecnologa de membrana y filtracin en gel: son las tcnicas ms frecuentes utilizadas en el intercambio del buffer. En las dos primeras se utiliza un tamao de poro inferior al de la protena aunque suficiente para la disolucin buffer pase y lleve a cabo el plegamiento. la filtracin con gel es ms rpida. B. Plegamiento por dilucin: a. Plegamiento en una nica etapa de dilucin: este mtodo es ms rpido que el anterior. La protena desnaturalizada se disuelve en la disolucin buffer repetidamente de modo que la concentracin de desnaturalizante se va eliminado restablecindose as las fuerzas intramoleculares. El buffer se compone normalmente de 50mM tris-HCL conteniendo diferentes sistemas redox. La dilucin se lleva a cabo: i. Aadiendo lentamente la protena desnaturalizada a la disolucin buffer. ii. Vertiendo rpidamente la disolucin buffer en protena desnaturalizada. b. Plegado por etapas de dilucin: esta tcnica es ms adecuada cuando los intermedios de plegado de la protena son insolubles en el medio. Los inconvenientes en mtodo de disolucin a la hora de pasar de una escala pequea de laboratorio a una escala de produccin industrial son: i. Grandes tanques de reaccin (plegamiento). ii. Elevado volumen de disolucin amortiguadora. iii. Requiere sucesivas etapas de concentracin.

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C. Plegamiento asistido por aditivos: incorporando aditivos al buffer se puede mejorar la eficiencia del plegado, ya que los aditivos se unen a los intermedios de plegado inhibiendo su agregacin o porque estabilizan la conformacin plegada de la protena. Como aditivos de uso habitual encontramos: azucares, aminocidos, tensioactivos neutros, polmeros, los cuales se pueden separar fcilmente de la R -prot. Especficamente para los IFN es posible utilizar polietilglicol. D. Modificacin qumica: no es habitual en procesos de obtencin de protenas aunque si tiene ms aplicaciones en diagnostico in vitro.

E. Plegamiento de micelas inversas: en este caso cada protena desnaturalizada se encapsula en una gota de agua mediante un tensioactivo y las micelas se dispersan en un disolvente orgnico. Por un proceso de intercambio selectivo la concentracin de desnaturalizante en las micelas se reduce y la protena se pliega en presencia del buffer.

3.4.4. Mejora de las molculas bioactivas. La purificacin de protenas hasta el grado requerido en aplicaciones teraputicas requiere de una serie de etapas de cromatografa. La seleccin de estas etapas depende de: La concentracin y pureza de la protena. La estabilidad y propiedades fsico qumicas. Nivel de pureza final requerido para la protena. Carga de contaminantes y sus lmites en producto final.

Normalmente la pureza de la protena antes de la etapa de mejoramiento es mayor al 90%, suele estar acompaada de contaminantes. Es importante seleccionar una secuencia adecuada para los tratamientos por cromatografa.

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Una eleccin correcta de la secuencia conlleva; reduccin del nmero de etapas de intercambio buffer, mejora del rendimiento, menor tiempo en el proceso y menor coste. La siguiente tabla resume las posibles tcnicas cromatogrficas aplicadas en la mejora:

3.4.5. Tcnica purificacin seleccionada para IFN-. Hasta aqu se ha hecho mencin de las etapas generales que se han de seguir para la purificacin de protenas recombinantes contenidas en clulas hospedadoras. Segn las referencias consultadas, estas tcnicas varan continuamente introduciendo mejoras considerables, de manera que en lo siguiente se describe el proceso de purificacin ms reciente al que se ha podido tener acceso dados los recursos limitados con que se trabaja. En seleccin de tcnicas de purificacin adecuadas para IFN se ha de proceder teniendo en cuenta criterios como (Paul P.Trotta et al.):

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Evitar tcnicas que involucren altas concentraciones de agentes desnaturalizantes/plegadores como la urea o la GdHCl ya que dificultan la renaturalizacin eficaz. Esta consideracin es especialmente relevante en IFN humanos debido a que se deben formar dos enlaces disulfuro, que con altas concentraciones de agentes caotrpicos suele resultar incorrecta. El mtodo de extraccin y purificacin utilizado debe evitar la contaminacin de la protena con pirgenos bacterianos (liposacridos de bacterias Gram-negativas que causan fiebre). La protena resultante debe estar libre de cidos nucleicos y protenas de su clula hospedadora. El IFN producido debe ser homogneo, libre de agregados y restos proteolticos. Esto es de especial importancia debido a que si se inyectan en humanos pueden provocar reaccin antgena. Para ser comercialmente viable, en la purificacin se debe alcanzar por lo menos un 20% en actividad antiviral.

Ya desde 1957 sus descubridores plantean un mtodo de purificacin del IFN limitado a una precipitacin con sulfato amnico seguido de una dilisis [Ref.23]. A lo largo de los sesenta se publicaron estudios sobre la purificacin de IFN (leucocitario o fibroblastos) como el correspondiente a la adsorcin en aluminosilicatos [Ref.21]. Pero es a partir de los aos 80 cuando se ha avanzado ms en la purificacin de IFN- producido en E.coli. Friesen et al. de la compaa Hoffman-la Roche [Ref.22] plantean en 1981 un mtodo para la purificacin de IFN- mediante dos etapas principales: una primera etapa de cromatografa por afinidad, seguida de cromatografa liquida a alta presin. Leibowitz et al. de la Schering Corporation [Ref.24] plantean en 1982 un mtodo para la extraccin de IFN de un cultivo bacteriano, que requiere acidificar el medio bacteriano varias veces para despus neutralizarlo, separando el IFN disuelto del resto. David R. et al. describen en 1986 unos de los mtodos para la purificacin de IFN-2 recombinante que ms citaciones recibe a nivel general. Este consiste eliminar los componentes celulares solubles (que incluyen la mayor parte de contaminantes) mediante sucesivas etapas de lavado, suspensin y centrifugado. Una vez separado los IFNs atendiendo a su nula solubilidad por el estado agregado (IB) en que se encuentran, se procede al tratamiento con agentes caotrpicos de forma que se vuelven solubles y forman una disolucin homognea que puede purificarse mediante sucesivas etapas de: cromatografa, quelatos metlicos, cromatografa de gel y recristalizacin.

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En la siguiente tabla se resumen las etapas del proceso y diferentes parmetros para cada etapa que determinan la eficacia y rendimiento global: [Ref.25].

Se observa como a medida que progresa el proceso de purificacin: El volumen disminuye. La actividad (unidades/mL) disminuye. Las unidades totales disminuyen. El % en la recuperacin de actividad antiviral va disminuyendo. La actividad especfica aumenta hasta 32.10^8 ud/mg

Un estudio ms reciente de Paul P.T et al. [Ref.20] en el ao 2000 plantea un procedimiento a escala industrial para la purificacin de IFN-2 expresado por el vector plsmido PBR322 based, que consta de las siguientes etapas: 1) Se somete al extracto de E.coli a lisis celular mediante acidificacin a pH=2 con posterior neutralizacin. Esto evita las altas concentraciones de desnaturalizantes y mejora la estabilidad de IFN tipo I. 2) Acidificacin a pH=4.5. elimina cidos nucleicos de las protenas 3) Centrifugacin; separa el sobrenadante concentrando el material insoluble en agregados compactos. 4) Como los IFNs son estables en disolventes orgnicos, se extraen con etanol y despus se precipitan con tricloroactico. 37

5) Cromatografa de afinidad; Matrex gel Blue A (cibracron blue F3 GA) Sepharose. La elucin de la columna se lleva a cabo con una solucin NaCl 2M. 6) La ltima etapa de purificacin se puede llevar a cabo de dos maneras: a. Ciclos repetidos de precipitacin por dilisis y redisolucin en disolucin NaCl 2M b. Precipitacin selectiva seguida de cromatografa de intercambio inico DEAE Sepharose. En ANEXO 1 se adjunta el documento donde se especifica los detalles de su operacin. Con este procedimiento la actividad del producto final es de 7.10^7 IU/mg.+ Este es el procedimiento que se propone por los autores de este estudio, ya que es el ms adecuado segn criterios de produccin comercial como: Economa: Bajo precio de reactantes empleados. Sencillez: El nmero de etapas necesarias es reducido y no complicadas. Tiempo: Requiere un menor tiempo por lo que se obtiene una mayor produccin. Adems cumple con todos los criterios expuestos anteriormente (Paul P.Trotta et al. [Ref.20])

Otra posible alternativa consiste en usar cromatografa de inmunoadsorcin con anticuerpos monoclonales inmovilizados. La siguiente tabla muestra un resumen de las etapas y de los principales parmetros en este procedimiento: [Ref.20]

Segn K.R. Babu et al. (2000) es posible otro procedimiento para la purificacin de IFN- activo en una sola etapa (columna Q-sepharose) previo tratamiento de purificacin, solubilizacin y plegado. Con este procedimiento se logran valores de actividad biolgica ms elevados (25.10^8 IU/mg). Aunque los 38

autores sostienen la versatilidad en su aplicacin a escala industrial, la cantidad y precio de los solventes utilizados puede indicar lo contrario, se requiere un estudio ms detallado sobre este tema. El proceso puede resumirse en las siguientes etapas: 1) Preparacin y purificacin de IBs a. Buffer A (trisHCL 10mM,pH=8 + EDTA 10mM + NaCl 100mM). b. Centrifuga (10000rpm,10min). c. Lavado Buffer A + PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride). d. Sonoporacion (p30s, pausa15s, 15min). e. Urea + Buffer A + PMSF en Tanque Agitado (1h,4C) f. Centrifuga (10000rpm,45min). Se retira el sobrenadante. g. Buffer B (trisHCL 10mM,pH=8 + EDTA 1mM+ NaCl 1M) en TA h. Centrifuga (lavado agua destilada). Se retira el sobrenadante quedando unos pellets IBs con 70-80%pureza IFN-. 2) Solubilizacin y plegado a. Buffer C (trisHCl 100mM,pH=8 + EDTA 02mM + GuHCl 8M) TA(2h,Tamb). b. Centrifuga (17000rpm, 1h,4C) se recoge el sobrenadante con IBs solubilizados c. Buffer D (trisHCl 100mM,pH=8 + L-arginina 05M + EDTA 02mM), aadir IB solubilizados lentamente sobre buffer TA d. Incubacin 24-36h. 3) Purificacin en columna Q-sepharose a. Dilisis (elimina argina) con trisHCl 50mM + urea 100mM + EDTA 1mM. b. Centrifuga (10000rpm, 30min, 4C). c. Ultrafiltracin (0.45m). d. Columna Q-sepharose. Se selecciona la fraccin de inters. e. Dilisis con PBS. f. Congelado (-70C).

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4. SIMULACION DINAMICA

Un proceso de produccin de protena de alto valor aadido como es el caso del IFN, requiere de un conocimiento detallado de los parmetros que lo rigen. La produccin va fermentativa es un proceso complejo que engloba reacciones bioqumicas y fenmenos de transporte, de forma que, para lograr una produccin en condiciones ptimas se requiere de un modelo que permita predecir y describir el comportamiento del proceso. Adems, a la escala de produccin con la que se trabaja, no se puede optimizar el proceso por simple prueba y error, sino que es necesario desarrollar un modelo matemtico representativo.

1. Modelo complejo
La descripcin del proceso requiere tener en cuenta la estequiometria, anlisis de flujo, cintica microbiana, fluidodinamica y transferencia de masa. Brevemente, se van a exponer los fundamentos tericos necesarios para el desarrollo del modelo dinmico, siendo necesario un anlisis ms detallado para una mejor comprensin. (Isabel C. [Ref.11]) De forma general para un reactor fed-batch, se puede expresar el balance a cada componente:

Siendo D la velocidad de dilucin:

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Se ha considerado:

Ecuaciones cinticas:

Dado que la E.coli presenta tres vas metablicas, se han propuesto tres ecuaciones cinticas, correspondientes cada una a: la oxidacin de la glucosa, la fermentacin de la glucosa y la oxidacin del actico.

Dinmica de gases disueltos: En el proceso de fermentacin aerobio de la E.coli es necesario considerar la dinmica en las concentraciones de gases, en particular de: oxgeno y dixido de carbono. La velocidad de transferencia de oxigeno (OTR): factor limitante.

Al incrementar la velocidad de transferencia de oxigeno es posible alcanzar una mayor productividad celular. Se puede incrementar OTR si se incrementa KL.a o Oeq. 41

Como el producto KL.a varia principalmente con el flujo de la aireacin y la velocidad de agitacin y la viscosidad, para determinar OTR de una manera mas precisa, se usa la ley de gases ideales a presin y temperatura constante.

Usando el mismo balance para el nitrgeno y considerndolo como inerte; no reacciona y su acumulacin en despreciable:

Cuando las velocidades de reaccin no cambian significativamente, se puede asumir un estado estacionario para la fase gas de modo que los trminos de acumulacin pueden obviarse.

El balance al oxigeno disuelto en la fase liquida queda:

El termino Oin puede despreciarse ya que la alimentacin al introducirse en el reactor se esteriliza, causando que la concentracin de los gases disueltos se reduzca a cero Velocidad de transferencia de dixido de carbono(CTR): el CO2 presenta una situacin ms compleja que el oxgeno (es 5 veces ms soluble ), ya que su solubilidad en agua aumenta debido al carcter inico del bicarbonato. 42

Se debe tener en cuenta por tanto el equilibrio acido base para las distintas especies del CO2:

La constante para el equilibrio entre CO2 y bicarbonato

Donde B es la concentracin de bicarbonato, H la de protones y C la de CO2. El balance a CO2 en fase liquida:

La transferencia de CO2 en la interfase gas lquido:

Considerando la fase gas-lquido bien mezclada, la concentracin de equilibrio puede calcularse de: 43

Los valores de la constante de Henry se pueden consultar en bibliografa, aunque diferentes estudios proponen una dependencia de esta constante con la temperatura. La solubilidad del CO2 en el medio se puede ver influenciada por la presencia de compuestos no polares y de especies inicas. De la consideracin de equilibrio entre gas y lquido se puede obtener una estimacin para la concentracin de bicarbonato. La concentracin de CO2 y bicarbonato se estiman mediante medidas en pH y anlisis de gases:

De forma que la concentracin de CO2 y carbonato se puede expresar:

En condiciones de no equilibrio las concentraciones de CO2 y bicarbonato pueden calcularse:

El coeficiente de transferencia de masa para el CO2 puede expresarse en trminos de la transferencia de oxgeno. La correlacin entre ambos coeficientes de masa se puede expresar:

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Balance al sustrato: Al tratarse de un reactor fed-batch, al realizar los balances se debe tener en cuenta que la masa del reactor no permanece constante. Adems en concreto para el sustrato debemos considerar que entrar en la alimentacin y se consume tanto en la va oxidativa como en la fermentativa.

Dnde: MS, gramos de sustrato en el medio de reaccin. Fins, son los kg/h de alimentacin. Sin concentracin de glucosa en la alimentacin. K1 y K2, son los coeficientes estequiomtricos que relacionan la cantidad de sustrato consumido con la cantidad de biomasa generada. Sus inversas son ms conocidas como Yx/s.

Fintot, ser la variacin total de la masa dentro del reactor, teniendo en cuenta: la alimentacin, la base y cido aadido; el flujo de gas residual; el lquido evaporado y el volumen de muestras tomadas. Si despejamos :

Quedando finalmente:

Balance al microorganismo: Habr que tener en cuenta que el crecimiento del microorganismo se produce por las tres vas metablicas y no se introduce nada por la alimentacin.

Donde MX es la masa de microorganismo en el interior del reactor 45

Despejando

Balance al acetato: En este caso el acetato es producto de la va fermentativa pero a la vez es oxidado, por lo que tendremos un trmino que lo aumente y otro que lo disminuya.

Dnde: MA es la masa de acetato en el reactor K3 y K4, son los coeficientes estequiomtricos que relacionan la cantidad de acetato generado o consumido respectivamente con la cantidad de biomasa generada

Despejando

Balance al oxgeno: El oxgeno se consume en las tres vas y es alimentado como aire enriquecido.

Dnde: MO es la masa de oxgeno disuelta en el reactor K5, k6 y k7, son los coeficientes estequiomtricos que relacionan la cantidad de oxgeno consumido en cada va con la cantidad de biomasa generada. 46

OTR es el caudal de oxigeno alimentado por unidad de masa.

Despejando

Balance al CO2: Al contrario que el oxgeno el dixido de carbono se produce en las tres vas metablicas, adems se perder en la corriente de gases residuales.

Dnde: MCt es la masa de CO2 dentro del reactor. K8, k9 y k10, son los coeficientes estequiomtricos que relacionan la cantidad de CO2 generado en cada va con la cantidad de biomasa generada. CTR es el flujo de CO2 perdido en los gases de salida por unidad de masa.

Seleccin de la cintica adecuada: Para la seleccin de la ecuacin cintica que mejor se ajuste a cada una de las vas metablicas se han propuesto varias alternativas. Mediante programacin con MATLAB se comparan los valores tericos obtenidos para cada ecuacin cintica con los valores experimentales y se minimiza la diferencia. En base a esto se selecciona la opcin que al final del proceso tenga menor diferencia entre los valores tericos y los experimentales. 47

Las ecuaciones cinticas propuestas para la va oxidativa-fermentativa de la glucosa son:

Y para la va oxidativa del acetato son:

Despus de la optimizacin se obtiene que las ecuaciones cinticas que mejor se ajustan a los datos son: Va oxidativa-fermentativa de la glucosa:

Va oxidativa del acetato:

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Simulacin del modelo con Berkeley Madonna. El modelo anteriormente visto ha sido transcrito en el programa para proceder a su ejecucin y obtener la simulacin del proceso: METHOD RK4 STARTTIME = 0 STOPTIME=30 DT = 0.001 {MODELO=17} X'=(U1+U2+U3)*X - D*X S'=(-K1*U1-K2*U2)*X + (FIN/W)*SI - D*S A'=(K3*U2-K4*U3)*X-D*A O'=(-K5*U1 - K6*U2 - K7*U3)*X + OTR-D*O CT'=(K8*U1 + K9*U2 + K10*U3)*X - CTR - D*CT W'= FIN + FB + FA - FEVAP - FGAS - FSMP FIN=0.0102*EXP(0.1019*TIME) {ALIMENTACIN EXPONENCIAL FEDBATCH, SACADA DE LOS DATOS EXPERIMENTALES MEDIANTE AJUSTE EXPONENCIAL, R2=0.9934} D=FIN/W {VELOCIDAD DE DILUCIN, VARIABLE YA QUE LA ALIMENTACIN NO ES CTE} FA= CA*U3*X*W FB= CB*U2*X*W FEVAP= CE FGAS=(CTR-OTR)*W {FLUJO DE CIDO AADIDO} {FLUJO DE BASE AADIDO} {FLUJO DE LQUIDO EVAPORADO} {FLUJO NETO DE GAS}

CTR= 0.0084* TIME^2+0.0227*TIME+0.2155 { ECUACIN AJUSTE POLINMICO DATOS EXPERIMENTALES, R2=0.9979} OTR=0.009*TIME^2-0.08*TIME+0.5973 { ECUACIN AJUSTE POLINMICO DATOS EXPERIMENTALES, R2=0.9857} U1=QSMAX*S/(KS+S) U2=QSMAX*S/(KS+S) U3=QACMAX*A/(A+KA)*KIA/(KIA+A) { VARIABLES=39 K1, K2, K3, K4, K5, K6, K7, K8, K9, K10 QSMAX, KS, KOS, QOMAX, KIO, QACMAX, KA KOA , KIA, CB, CA, CE, SI X, S, A, O, CT U1, U2, U3 D, FIN, W OTR, CTR 49

FA, FB, FEVAP, FGAS } { PARMETROS=22 } K1=3.164 K2=25.22 K3=10.90 K4=6.382 K5=1.074 K6=11.89 K7=6.098 K8=1.283 K9=19.01 K10=6.576 QSMAX=1.832 KS=0.1428 KOS=2.02 QOMAX=0.7218 KIO=6.952 QACMAX=0.0967 KA=0.5236 KOA=1.996 KIA=5.85 CB=0.1034 CA=0.095 CE=0.0444 SI=250 {CONDICIONES INICIALES=6} INIT X=10; INIT S=5; INIT A=0; INIT O=0.0021; APROX. 30% Osaturacin INIT CT= 0; INIT W=3 ; Para poder construir el modelo se han tenido que realizar una serie de consideraciones: -se asume una alimentacin de forma exponencial ya que no se conoce al detalle cmo se lleva a cabo. Se ha realizado un ajuste exponencial a los datos experimentales y se ha introducido en el modelo una exponencial en funcin del tiempo.

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Alimentacin-tiempo
0.25 Alimentacin, kg/h 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 Tiempo, h 25.00 30.00 35.00 y = 0.0102e0.1019x R = 0.9934

-Los parmetros OTR y CTR se calculan en funcin de la transferencia de materia de forma que hay que determinar los coeficientes de transferencia de materia para ambos componentes en este medio. Debido a la complejidad de estos clculos se procede realizando un ajuste polinmico para los datos experimentales, obteniendo una funcin polinmica que representa la variacin de estos parmetros en funcin del tiempo.

Ajuste CTR
10 9 8 7 CTR, g/kgh 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo, h y = 0.0084x2 + 0.0227x + 0.2155 R = 0.9979

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Ajuste OTR
8 7 6 OTR, g/kgh 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 y = 0.009x2 - 0.08x + 0.5973 R = 0.9857

Tiempo, h

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2. modelo simple
Con la intencin de obtener una aproximacin en los valores de los parmetros cinticos caractersticos, se ha procedido a realizar una estimacin sobre datos del estudio (K. R. Babu et al.[Ref.18]).

Para la obtencin de los parmetros cinticos se han propuesto dos modelos; uno para la etapa discontinua y otro para la semicontinua.

Modelo discontinuo {MTODO NUMRICO} STOPTIME = 10 ;h DT = 0.01;h

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{ECUACIONES = 7} X' = rX S' = rS A' = rA rX = U*X U = UM*S/(KS+S+A/KA) rS = -rX/Y rA = (k1+k2*U)*X {VARIABLES = 12 X, S, P, KS: g/L rX, rS, rP: g/(Lh) U, UM, k1: 1/h Y, k2: ad} {GRADOS DE LIBERTAD = 5} UM =0.9 KS = 0.14 k1 = 0 k2 = 0.1 KA=0.1 Y = 0.41 {CONDICIONES INICIALES = 3} INIT X = 0.01 INIT S = 30 INIT A = 0 Se obtiene:

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Los valores de S, A, X obtenidos en la simulacin se asemejan a los obtenidos experimentalmente, por lo que se puede considerar que el modelo propuesto con los siguientes valores para los parmetros cinticos es adecuado para esta etapa. Los parametros obtenidos son: KS=0.14, K1=0, K2=0.1, KA=0.1, Y=0.41 Modelo fed-batch {MTODO NUMRICO} STOPTIME = 15 ;h DT = 0.01;h {ECUACIONES =12} V'=F VS'=F*S0+rS*V VX'=rX*V VA'=rA*V rX=U*X rS=-rX/Y U=UM*S/(KS+S+A/KA) rA=(K1+K2*U)*X X=VX/V S=VS/V A=VA/V F = F0 {VARIABLES = 21 X, S, A, S0, KS, KA, Y, K1, K2 : g/L VX, VS, VA: g rX, rS, rA: g/(Lh) F, F0: L/h V: L U, UM: 1/h Y: ad} {GRADOS DE LIBERTAD = 8} F0=0.2 {F0= k0*EXP(K00*TIME) K0=0.0102 K00=0.1019 } S0=250 UM=1.75 KS=1.75 K1=0 K2=0.1 55

KA=0.22 Y=0.65 {CONDICIONES INICIALES = 3 (valores finales de la fase de reactor discontinuo)} INIT V=3 INIT VX=3*12.5 INIT VS=0.01*3 INIT VA= 0.6*3 Obtenindose:

Solo los valores para la concentracin de microorganismos obtenidos por la simulacin se aproximan a los datos experimentales, adems los valores en los parmetros cinticos resultan diferentes a los obtenidos en la etapa discontinua. Por tanto, dada la incoherencia en estos resultados se hace necesario un estudio ms detallado para la obtencin de parmetros adecuados. Parmetros obtenidos: UM=1.75, KS=1.75, K1=0, K2=0.1, KA=0.22, Y=0.65

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5. ANEXO 1: DIAGRAMA PROCESO

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6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA 1. Blight, M. A. and Holland, I. B. Heterologous protein secretion and the versatile Escherichia coli haemolysin translocator. Trends in Biotechnology. 12, 450-455. 1994. 2. Villaverde A, Carri MM, Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol Lett. 2003, 25(17):1385-95. 3. C. Perry Chou. Engineering cell physiology to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:521532. 4. Amulya K. Panda. Bioprocessing of Therapeutic Proteins from the Inclusion Bodies of Escherichia coli. Adv Biochem Engin/Biotechnol (2003) 85: 4393. 5. Asok Mukhopadhyay. Inclusion Bodies and Purification of Proteins in Biologically Active Forms. (1997) Adv Biochem Eng Biotechnol 56:61. 6. Grace, Eric S., La biotecnologa al desnudo: promesas y realidades / Eric S. Grace, Anagrama, 1998. 7. Smith, John E., Biotecnologa / John E. Smith, Acribia, 2006 8. B. Wipf, E. K. Weibel, S. Vogel . Computer controlled large scale production of oc-interferon by E. coli. Bioprocess Engineering (1994), 145-153. 9. Lee, S. Y. High cell-density culture of Escherichia coli. Trends in Biotechnology. 14, 98-105.1996. 10. Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors. Batch and Fed-Batch cultivations for the temperature induced production of a recombinant protein in Escherichia Coli. Biotechnology Letters Vol No 8, 609-614. (1991). 11. Isabel Cristina de Almeida Pereira da Rocha. Model-Based strategies for computer-aided operation of recombinant E. Coli Fermentation (2003) 12. Kim, E., Fu, J, Wilson, D. B., and Shuler, M. L. Expression of human epidermal growthfactor by Escherichia coli in continuous culture. Biotechnology Letters. 14, 339-344. 1992 13. Fu, J., Wilson, D. B., and Shuler, M. L. Continuous, high level production and excretion of a plasmid-encoded protein by Escherichia coli in a twostage chemostat. Biotechnology and Bioengineering. 41, 937-946. 1993. 14. Park, S. H., Ryu, D. D. Y., and Kim, J. Y. Effect of cell growth rate on the performance of a two-stage continuous culture system in a recombinant Escherichia coli fermentation. Biotechnology and Bioengineering. 36, 493-505. 1990. 15. Yang, X.-M. Optimization of a cultivation process for recombinant protein production by Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 23, 271-289. 1992. 16. Lars Strandberg, Kristina Kiihler & Sven-Olof Enfors. Large-Scale Fermentation and Purification of a Recombinant Protein from Escherichia coli. Process Biochemistry 26 (1991) 225-234. 58

17. Xiao-Ming Yang , Lun Xu and Lee Eppstein . Production of recombinant human interferon-a 1 by Escherichia coli using a computer-controlled cultivation process. Journal of Biotechnology, 23 (1992) 291-301 18. K. R. Babu, S. Swaminathan, S. Marten N. Khanna, U. Rinas. Production of interferon-a in high cell density cultures of recombinant Escherichia coli and its single step purification from refolded inclusion body proteins. Appl Microbiol Biotechnol (2000) 53: 655-660. 19. http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/18 (ltima consulta 5 enero 2013. 20. Paul P.Trotta, Tattanahalli L. Interferons. Ullmanns encyclopedia of industrial chemistry. 21. Karl H. et al., Glaxo Labs, US 3265581, 1968, process of purifying IFN with alumino-silicate adsorbents. 22. Friesen et al., Hoffmann-la Roche, US4289689, Preparation of homogeneous human fibroblast IFN. 23. Isaacs et al., National Research Development Corp. US3699222, 1972, production of viral interfering substances. 24. Leibowitz et al., Schering Corp. US4364863, 1982. Extraction of Interferon from bacteria. 25. Thatcher DR, Panayotatos N. (1986). Purification of recombinant human IFN-a2. Methods Enzymol 119: 166-177. 26. lvaro R. Lara. Produccin de protenas recombinantes en Escherichia Coli. Revista mejicana de Ingeniera Qumica. Volumen 8, nmero 3, 2009. 27. Gnter Jagschies, Process-Scale Chromatography (2012), Ullmanns encyclopedia of industrial chemistry.

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