CANCER DE MAMA, ANATOMIA PATOLOGICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Carmen Arriagada1, Mara Jos Valenzuela1 y Nancy Rivera F2.

Alumnos 4 Ao de Tecnologa Mdica, Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico

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. Profesora Seminarios de Biologa Molecular. Facultad de Medicina Universidad de RESUMEN

Concepcin

El cncer de mama representa la segunda causa ms importante de muerte por enfermedades de tipo maligno en las mujeres de edad media en Chile, caracterizndose por su agresividad y rpido progreso; aumentando en un 20% la tasa de incidencia en los ltimos 25 aos. Las razones que explican el aumento en la tasa de incidencia nacional y mundial son, el envejecimiento de la poblacin, adems de una mayor exposicin a los factores de riesgo, como la obesidad; el consumo de alcohol y los antecedentes familiares de presencia de cncer de mama. El objetivo del presente seminario es hacer una revisin actualizada de las tcnicas diagnsticas de cncer de mama que se usan en el sistema de salud y, las investigaciones cientficas en base a tcnicas de biologa molecular, las cuales buscan caracterizar diferentes genes implicados en la predisposicin gentica al desarrollo de la patologa, destacando el protoncogen Her-2, BRCA-1, BRCA-2 y el gen P-53. Entre las tcnicas se encuentran la aplicacin de diversos tipos de PCR, entre las cuales destaca la mismatch PCR, Methylation Specific PCR y PCR cuantitativa en tiempo real. Todas ellas utilizadas para determinar la presencia o sobre-expresin de diversos tipos de genes, de forma mucho ms rpida, econmica y de resultados tan confiables como las tcnicas de uso rutinario en los Hospitales Clnicos del pas. Adems, la amplificacin de ciertos genes como Herp 2 se relaciona con una mayor resistencia a los tratamientos convencionales y, a una menor tasa de supervivencia, el cual si es detectado, puede conducir a un tratamiento dirigido, con anticuerpos monoclonales, aumentando la supervivencia de los pacientes. La PCR se presenta como una nueva opcin clara y realista de exmenes de rutina alternativos, para la determinacin de lesiones mamarias en etapas tempranas y tardas de la enfermedad. Palabras claves, Cncer de mama, factores de riesgo, Protooncogen Her-2, Tcnicas de Biologa Molecular

INTRODUCCIN El cncer de mama representa en Chile la segunda causa ms importante de muerte por enfermedades de tipo maligno en las mujeres mayores de 50 aos (1), caracterizndose por su agresividad y rpido progreso; aumentando en un 20% la tasa de incidencia en los ltimos 25 aos y dando como resultado alrededor de 1000 muertes anuales. Adems este tipo de patologa no afecta tan solo a las mujeres sino que tambin a los hombres, aunque en un porcentaje muchsimo menor, con un total de menos de un 1% de los casos totales, apareciendo tambin en edades ms avanzadas de alrededor de los 70 aos. (2) Entre las razones que explican el aumento en la tasa de incidencia nacional y mundial se encuentran el continuo envejecimiento de la poblacin, adems de una mayor exposicin a factores de riesgo. Entre estos factores de riesgo se encuentran una dieta con alta ingesta de grasas saturadas y elevada en caloras, lo que conduce a la presencia de obesidad (uno de los principales factores de riesgo) aumentando en un 67% el porcentaje de riesgo de desarrollar el carcinoma, por el contrario se ha demostrado que una dieta que contenga altos porcentajes de frutas, verduras, hidratos de carbono y aceite de oliva, disminuyen la probabilidad de desarrollar el cncer de mama ( ayudan a bajar los ndices de obesidad); otros factores protectores son la actividad fsica y la multiparidad. (2) Entre otros factores de riesgo podemos encontrar tambin el consumo de alcohol (aumenta en un 61% las probabilidades de desarrollar la patologa) y los antecedentes familiares de presencia del cncer de mama, lo que se explica por su alto carcter hereditario (2). Es a causa de este ltimo factor que hoy en da se encuentran en desarrollo un gran nmero de investigaciones cientficas en base a tcnicas de la biologa molecular en la cual se buscan y caracterizan diferentes genes implicados en la predisposicin gentica al desarrollo de la patologa, destacando el protoncogen Her-2, BRCA-1, BRCA-2 y el gen P53.

DESARROLLO GLNDULA MAMARIA ANATOMA E HISTOLOGA NORMAL La glndula mamaria se caracteriza por ser un cuerpo glandular par, de gran tamao y ubicado en la zona pectoral, entre abundante tejido adiposo y conectivo, siendo de mayor tamao en la mujer. Su histogenesis corresponde a una glndula cutnea modificada, derivada del ectodermo cutneo, el cual involuciona durante la vida uterina, a excepcin de las zonas de las lneas mamarias localizadas en la zona pectoral, desarrollndose lo que se conoce como Botn Epitelial Epidrmico Profundo, uno en cada lado del dorso. Al momento del nacimiento ambos sexos presentan un amplio desarrollo glandular mamario por la accin hormonal de la placenta, pero luego esta involuciona; para volver a desarrollarse en el caso de la mujer durante la pubertad, alcanzando un desarrollo total durante el embarazo. Histolgicamente la mama se compone de unos 20 lbulos independientes, separados por tejido interlobulillar denso y tejido adiposo. Cada lbulo se compone de numerosos lobulillos, que corresponden a pequeas ramificaciones glandulares rodeadas de tejido conectivo laxo, adems cada lobulillo recibe un nico conducto terminal que corresponde a un rama dicotoma del conducto galactoforo, este conducto terminal a su vez se vuelve a dividir en el interior del lobulillo formando los conductillos intralobulillares. Este conjunto de lobulillos con sus respectivos conductos terminales son de gran importancia, pues forman la unidad funcional de la mama, denominada Unidad Ductololobulillar Terminal (TDLU) (3). Esta zona se caracteriza tambin porque en ella se lleva a cabo el proceso de recambio celular o turn over, razn por la cual presenta un alto ndice de actividad mittica, lo que la convierte en una zona muy sensible a todo tipo de injurias que potencialmente podran alterar la regulacin del ciclo celular, originndose en esta zona la mayora de las proliferaciones epiteliales benignas, los carcinomas ductales y lobulillares de la mama. (4)

ANATOMA PATOLGICA DEL CNCER DE MAMA En anatoma patolgica a la hora de determinar la clasificacin de un carcinoma mamario no se hace en base a su histogenesis, sino a su tipo histolgico, ya que todos tienen el mismo origen en la TDLU. Otro problema que se presenta en la clasificacin de este tipo de cncer, es el que son todos muy similares en su aspecto macroscpico, existiendo como nicas excepciones el carcinoma mucinoso y papilar. Es as como se pueden distinguir ms de 14 tipos diferentes de cncer de mama, diferencindose tanto por su tipo histolgico como por su grado de invasin de tejidos vecinos y distantes. Sin embargo dentro de esta gran variedad, es un tipo el que predomina, el cncer invasivo ductal de la mama, que representa cerca del 75% de todos los casos de carcinoma invasor de mama registrados en el pas. Este tipo de carcinoma corresponde a una alteracin ductal sin grandes caractersticas propias, que lo diferencien de los dems carcinomas; macroscpicamente lo podemos observar como un tumor blanquecino grisceo, de consistencia firme a dura, pudindose mostrar bien o mal delimitado. Histolgicamente se reconoce por poseer un estroma colagenizado hialino denso denominndose carcinoma tipo escirro. En este tipo de casos se recomienda la mastectoma, la cual dependiendo de cada caso ser acompaada de radioterapia o quimioterapia (4). MTODOS DE DIAGNOSTICO RUTINARIOS PARA DETECCIN DE CNCER DE MAMA Existen dos grupos principales de mtodos de deteccin del cncer de mama, los llamados mtodos de deteccin temprana y los de confirmacin de diagnostico. Entre los mtodos de deteccin temprana se encuentran el examen fsico y la mamografa, los cuales tiene como finalidad poder detectar cualquier posible lesin durante sus etapas iniciales, tratndolas oportunamente, lo que previene las probables metstasis en tejidos cercanos o a distancia. El examen fsico corresponde a una palpacin de la glndula mamaria, que puede ser realizada tanto por los profesionales del rea de la salud, como por

la propia mujer, se recomienda que esto ultimo se realice de forma frecuente, a partir de los 20 aos y una ves pasada la menstruacin, ya que durante ella se presentan ndulos y pequeos quistes propios de la etapa del ciclo. La finalidad de realizar este examen de forma peridica, es el poder reconocer las caractersticas propias de cada mama y posteriormente distinguir las posibles anomalas. Entre los posibles hallazgos que deben ser estudiados se encuentran la asimetra del tamao de las mamas, desviacin de la direccin de alguno de los pezones, retraccin del pezn o de alguna otra porcin de la piel, edema de la piel, traducido por un aumento de tamao de los poros cutneos, ulceraciones o excoriaciones de la piel (incluyendo arola y pezn), salida espontnea de secrecin (serosa, sangunea) por alguno de los pezones, aumento de la vascularidad de la piel (asimetra), enrojecimiento y cambios en relacin con el examen previo (5). La mamografa corresponde al estudio de las glndulas mamarias por rayos x, para esto se utiliza una maquina denominada mamgrafo, la cual consta de dos placas que presionan suavemente las mamas, para poder obtener una mejor imagen y detectar as pequeos y sutiles detalles que indiquen alguna patologa. Mediante este procedimiento se puede detectar el cncer en sus inicios, aun antes de que cualquier medico experimentado pueda sentir algn ndulo o lesin, como microcalcificaciones (5; 6). Entre los exmenes de rutina, que son utilizados para determinar el tipo y estadio del cncer de mama, se encuentran las pruebas de histoqumica e inmunohistoqumica, las cuales se realizan en cortes finos en parafina, obtenidos de las biopsias mamarias. Entre las pruebas histoqumicas se encuentran tinciones simples de H-E, en las cuales es avaluada la morfologa caracterstica de cada tipo de carcinoma. Entre las pruebas de Inmunohistoqumica se destacan las realizadas para determinar la presencia de ciertas protenas de membrana, expresadas por los genes alterados de las clulas afectadas; como lo son la presencia de receptores estrogenitos, las glicoproteinas de membrana producto del oncogn Her-2 y la pS2, que corresponde a una protena secretada por clulas de la lnea de clulas tumorales MCF-7 bajo estimulacin estrognica. La presencia de esta protena en conjunto con la de receptores estrognicos se asocia a un factor pronstico positivo en el cncer de mama (7).

CNCER DE MAMA Y BIOLOGA MOLECULAR La biologa molecular ha dado un gran golpe en la anatoma patolgica, en todo lo referente al estudio de la patogenia de diversos tipos de enfermedades que afectan a los seres humanos, adems de entregar diagnsticos ms efectivos, rpidos y especficos. Se ha logrado estudiar ADN, ARN y protenas mediante muestras citolgicas, o de tejidos obtenidos de biopsias o autopsias, a las cuales se les aplica el tratamiento de rutina de los laboratorios de patologa. (8) La biologa molecular en el rea patolgica ha sido principalmente utilizada en investigaciones relacionadas con estudios de alteraciones genticas o mutaciones encontradas en las distintas enfermedades que atacan a la poblacin mundial, pero principalmente en los diversos tipos de neoplasias. Gracias a investigaciones actuales se conoce que las neoplasias son causadas por lesiones precursoras, las cuales son acumulaciones de muchas alteraciones genticas que afectan al control normal de diferenciacin y crecimiento celular, presentan caractersticas histolgicas, genticas y morfolgicas especficas, y el cncer de mama no es la excepcin y debido a su gran incidencia en la poblacin femenina mundial es que se presenta el inters de ser estudiado utilizando tcnicas moleculares, las cuales facilitan y entregan resultados sensibles y especficos, en lo que se refiere a la presencia de determinados genes y sus manifestaciones encontradas en las diversas poblaciones celulares de las mujeres afectadas con los distintos tipos de canceres de mama y sus diferentes estados histolgicos. En investigaciones en donde se ha utilizado citometra de flujo y citogentica se pudo saber que el cncer de mama presenta un elevado porcentaje de aneuploida y adems de grandes alteraciones en diversos cromosomas (9). Se han encontrado poblaciones genticas caractersticas, que se encuentran alteradas en un alto porcentaje de neoplasias, sin ser la excepcin el cncer de mama, este es el caso del gen p53 localizado en el brazo corto del cromosoma 17, banda 17p 13.15, que tiene entre sus funciones detener el crecimiento de clulas tumorales, reparar y regular los daos que se producen en el ADN mediante el fenmeno conocido como apoptosis. Este gen se ha encontrado mutado en todos los tipos de canceres conocidos actuando en este caso como un oncogen el cual tiene una funcin

contraria a su estado normal, ayudando al crecimiento de la poblacin de clulas neoplsicas. En el cncer de mama por medio de tcnicas de PCR aplicadas al ADN obtenido de muestras de sangre de pacientes afectadas con la neoplasia o de familiares directos de mujeres enfermas, se ha encontrado el gen p53 mutado entre un 17% y 40% del total de casos investigados, tambin se sabe que existe una leve diferencia de porcentajes entre los distintos estudios realizados para estudiar la mutacin del p53, pero estas pueden deberse al tipo de tcnica utilizada para la deteccin de la mutacin, la raza de la mujer, el tipo de cncer de mama y el estadio en el cual esta se encuentre. (9). Adems del p53, que se podra decir es un gen cuya mutacin se presenta comnmente en todas las neoplasias conocidas; en el cncer de mama hereditario se han identificado la presencia mutada de otros dos genes, conocidos como los genes supresores de tumores BRCA1 y BRCA2, localizado en el cromosoma 17q21 y en el cromosoma 13q12 respectivamente, los cuales se encuentran alterados en aproximadamente el 90% de los casos de cncer de mama hereditario. En nuestro pas solo se han publicado 2 trabajos relacionados con el estudio de 3 tipos de mutaciones en estos genes en poblaciones femeninas especficas, los cuales no han podido ser detectados en estudios previos (10). Hasta el momento ya hay conocidas 1.070 alteraciones diferentes del gen BRCA1 y BRCA2 con la utilizacin de tcnicas moleculares como el PCR, en donde es sabido que 664 se encuentran asociados a efectos deletreos. Estas alteraciones son en el marco de la lectura, con un 49% y 35% de incidencia para los genes BRCA1 y BRCA2 respectivamente, en donde se destaca que el 66% de las mutaciones del gen BRCA1 son cancerigenas y en el caso del gen BRCA2 un 43%. (11). Las mujeres que presentan este tipo de mutaciones al momento de desarrollar la neoplasia manifiestan algunas caractersticas fenotpicas comunes, como por ejemplo; la neoplasia se desarrolla preferentemente en mujeres jvenes, las que poseen la mutacin en el BRCA1 tienen mas riesgo de presentar una neoplasia de alto grado con una alta tasa de mitosis y las que presentan la mutacin en el gen BRCA2 tienen tumores con una tasa mittica menor (10). Entre todas las numerosas alteraciones que afectan al gen BRCA1, la con ms prevalencia es la deleccin de AG en el codn 185 del exn 2, razn por la cual se ha

seleccionado para realizar estudios en pacientes sanos, que presenten al menos 2 parientes con cncer de mama. JARA L. y cols. (2002), utilizando los siguientes procedimientos, que se detallan a continuacin, detectaron las deleciones del codn 185 del exn 2, para el gen BRCA1: Extraccin de ADN desde sangre perifrica. Anlisis de la mutacin 185 del AG, por medio de la tcnica mismatch PCR, la que consiste en cambiar una base en uno de los partidores de modo de generar un fragmento que difiere en una base respecto del DNA templado. Como mtodos de confirmacin de los resultados obtenidos de la PCR, para la deleccin en estudio; se emplearon las siguientes tcnicas: Amplificacin por PCR del exn 2 del gen BRCA1 y separacin de los productos por electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida al 5% utilizando como marcador de peso molecular un Ladder de 25pb. Hibridaciones Alelo Especfica (ASO). Secuenciacin directa del producto de PCR.

Es as, como de 382 casos estudiados, se obtuvieron un total de 381 de ellos, con un patrn de bandas de 170pb en la muestra no digerida y dos bandas de 150pb y 20pb en las muestras digeridas con la endonucleasa de restriccin HinfI, patrn que fue considerado como normal. Solo se detecto un caso que difera de este patrn, observndose una banda de 170pb en la banda sin digerir y dos opciones diferentes despus de la digestin enzimtica, una banda de 170pb (mutada, sin sitio de restriccin) y la otra de 150pb (normal); lo que se clasifico como ADN portador de la deleccin 185AG. Detectndose as por primera vez en el pas este tipo de alteracin gentica en la poblacin. De este modo el procedimiento descrito se puede clasificar como rpido, de fcil interpretacin, de alta sensibilidad y de bajo costo por lo que cumplira con los requisitos para ser aplicado a gran escala como un tipo de estudio clnico (11).

Estudios mas recientes mediante la utilizacin de tcnicas moleculares tambin han mostrado procesos de modificacin en la funcin de algunos genes, pero estas no implican alteraciones en la secuencia de ADN, estas modificaciones son conocidas como alteraciones epigenticas, que se producen por agentes externos como la exposicin prolongada de una persona a fuertes carcingenos, repercutiendo en la salud con la produccin de neoplasias. La alteracin epignica mas comn es la metilacin del ADN, la cual se ha estudiado por tcnicas como Southern, pero teniendo la desventaja de requerir gran cantidad de ADN metilado, por lo que se ha cambiado por la tcnica de amplificacin de PCR comn, pero esta tambin presenta problemas al requerir ADN de alta pureza para as eliminar los errores producidos en la interpretacin, por esto se ha desarrollado una nueva tcnica de PCR, especial para estudiar ADN metilado denominada Methylation Specific PCR (MPS). Esta ltima ha entregado gran cantidad de informacin en relacin al estado en el cual se encuentra el ADN en las neoplasias. La amplificacin puede ser verificada por la tcnica de Bisufite Sequencing la cual asegura que los alelos amplificados posean ADN metilado (8). En la investigacin realizada a diversos genes se ha encontrado que el gen FHIT localizado en el cromosoma 3p14.2, el cual tiene la funcin de ser un supresor de tumores se encuentra fuertemente metilado en los distintos tipos de canceres bronquiales y de mama estudiados, perdiendo totalmente la efectividad de su funcin. Se vio que en los canceres de mama que no tienen receptores para estrgeno ni para progesterona, la metilacin del gen FHIT no tiene mayor importancia en el desarrollo ni en el comportamiento de la neoplasia (8). El protooncogen Her2/neu (tambin conocido como c-erb2) localizado en el cromosoma 17q21, codifica la glicoprotena transmembrana conocida con el mismo nombre, pertenece al factor de crecimiento epidrmico regulando el crecimiento, sobrevida y diferenciacin celular (14). El gen Her2 es expresado por muchas protenas epiteliales, en donde una sobre-expresin en el cncer de mama, es reconocido como un factor de malignidad y de un aumento del crecimiento de la neoplasia, adems de asociarse directamente con una pobre sobrevida de las pacientes (12). En el cncer invasor de mama se ha encontrado aumentada su expresin en alrededor de un 20-30% por sobre los valores normales (15). Numerosos estudios han

relacionado que las pacientes con cncer de mama que presentan la sobre- expresin del Her2/neu, pueden presentar algn tipo de resistencia a algunos tratamientos convencionales, como los hormonales y las quimioterapias (15). Es por esta razn que el estudio de sobre-expresin de este gen en una paciente con cncer de mama es de vital importancia; para as poder determinar el tratamiento adecuado a seguir y no perder tiempo en tratamientos que no causaran efectos positivos en las pacientes y que finalmente pueden llevar a la muerte de la mujer afectada. El estudio y determinacin de la sobre-expresin del gen Her2/neu en las pacientes con cncer de mama puede realizarse con Inmunohistoqumica y con la tcnica de biologa molecular FISH (14), la cual se caracteriza por su complejidad, larga duracin y alto costo, razn por la que se realizo una investigacin en donde se evalu una tcnica alternativa como es la PCR cuantitativa en tiempo real (12). Como material de Estudio se seleccionaron 40 tumores de mama, de los cuales 21 fueron FISH positivos y 19 FISH negativos. Para la tcnica FISH se utilizaron cortes en parafina de 3 m de grosor, las cuales fueron tratadas con la sonda PathVysion, la que corresponde a una mezcla de dos sondas, una centromrica y otra que reconoce el gen Her2. Para la PCR se utilizaron fragmentos de 112pb del gen Her2, ms un gen de referencia de 113pb. Como resultado de este estudio se observo que existe una concordancia de un 80.95% entre los tumores FISH positivos y los resultados obtenidos por la PCR y un 100% de concordancia entre los FISH negativos. En base a los resultados obtenidos se puede afirmar que la tcnica de PCR es una muy buena alternativa de estudio para la deteccin de la sobre-expresin del gen Her2/neu, tanto por la precisin y alta sensibilidad de la prueba, como por su bajo costo (en relacin al FISH) y rpida entrega de resultados, obtenindose en un solo da (12). Adems de estas dos tcnicas anteriormente nombradas para la determinacin del aumento en la expresin del Her2, se encuentra el conocido mtodo Herceptest. El cual consiste en un Inmunotincin semicuantitativa de tejidos mamarios con cncer avanzados, los cuales fueron tratados para procesos histolgicos de rutina (15). Como en toda Inmunohistoqumica se establecen controles positivos y controles negativos. Los cuales son

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muestras de tejidos de casos de cncer de mama en donde la sobre-expresin del gen es conocida y muestras en donde se reemplaza en anticuerpo primario por suero normal, respectivamente. Estos controles son tan importantes como la tcnica misma, ya que, son la nica forma de certificacin de que la tcnica esta siendo aplicada y realizada correctamente (15). Los resultados son analizados con manuales preestablecidos, que regulan con cdigos definidos los resultados de sobre-expresin encontrada en cada muestra de tejido estudiada (15). Tabla 1 Tabla 1: Valores preestablecidos para resultados obtenidos con tcnica Herceptest (12).

La importancia de este examen radica en ver la posibilidad de aplicar una terapia alternativa a pacientes que presentan una cierta resistencia a tratamientos convencionales contra el cncer, estas terapias nuevas consisten en una quimioterapia ms Herceptin. Este ltimo, es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el dominio extracelular de los receptores Her2. Al unirse al dominio provoca una inhibicin de la proliferacin de las clulas tumorales, logrando as aumentar la tasa de sobrevivencia de las pacientes (12). .

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CONCLUSION En vista de lo estudiado, se pudo concluir que las tcnicas de Biologa Molecular, especficamente FISH y los distintos tipos de PCR son efectivas en el propsito de diagnostico temprano para mujeres con antecedentes de familiares cercanos que desarrollaron cncer de mama. Este tipo de pruebas en general, presentaron grandes ventajas en relacin a las tcnicas de rutina como es su gran sensibilidad, especificidad y rpida obtencin de resultados, lo que las convierte en buenas candidatas para su inclusin futura dentro de las tcnicas de diagnostico hoy utilizadas por los departamentos de anatoma patolgica. En nuestro pas se ha desarrollado el inters de muchas de las pacientes y de sus familiares de realizarse este tipo de exmenes, para detectar la presencia de una mutacin familiar y poder brindar algn tipo de consejo gentico, desarrollando estrategias de prevencin a las mujeres sanas portadoras de la mutacin con planes especiales de alimentacin y hbitos como por ejemplo dejar de beber alcohol y realizar mayor actividad fsica. Tambin es posible mediante las mismas tcnicas diagnosticar en una etapa presintomtica un posible tipo de cncer de mama invasor que se manifestara en los prximos aos. Por ltimo, las tcnicas de biologa molecular cumplen un rol importante en mujeres con cncer de mama invasor en donde los tratamientos de rutina no son efectivos, por lo tanto ellas permiten evaluar otros tratamientos alternativos de acuerdo a las caractersticas genticas especficas que presenta la neoplasia.

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