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UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA SEDE TALCAHUANO "REY BALDUINO DE BELGICA"

Gua de laboratorio de biologa

Gua de laboratorio de biologa UTFSM - Area Quimica

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO 1 1 INTRODUCCION. El progreso de la ciencia depende de la formulacin de ideas y del desarrollo de las herramientas de trabajo. Este trabajo prctico ha sido diseado para familiarizar al alumno con una de las importantes herramientas del campo de la biologa y demostrar como ha sido usada para explorar ideas 1 responder viejas preguntas y al mismo tiempo generar ideas e interrogantes. Nos referimos al microscopio ptico que por ms de dos siglos ha sido la principal herramienta del bilogo. Objetivos: 1. Conocer el microscopio ptico y aprender la funcin de cada una de sus piezas. Se supone que el alumno debe conocer previamente los conceptos elementales de la naturaleza y propiedades de la luz y de ptica. 2. Entrenamiento en el uso y cuidado del microscopio y algunas tcnicas relacionadas.

II

PRESENTACION DEL MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO. Bsicamente est constituido por dos lentes pticos: el ocular y el

objetivo cuya combinacin permite obtener una imagen virtual, de mayor tamao e invertida, del objeto que se observa. El microscopio compuesto est formado por los siguientes sistemas: 1. 2. 3. Sistema mecnico o esttico. Sistema de iluminacin. Sistema ptico.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica 1. Sistema Mecnico o Esttico : Es la armazn metlica que sostiene el sistema ptico y el sistema de iluminacin dndoles la posicin adecuada y permitiendo los movimientos necesarios para una correcta coordinacin entre ambos. Est formado por: a) Base o pi: Que da la base de sustentacin al microscopio. Generalmente es en forma de herradura y pesada. A veces sostiene al espejo y/o a la lmpara de iluminacin. Columna: Es el pilar que sostiene al tubo, platina, condensador y sobre el cual estn montado tornillos focalizadores macro micromtrico. La columna puede ser articulada al pie para permitir inclinar el instrumento, puede ser curva hacia adelante dndole de esta manera una inclinacin estable al tubo y dejando la platina en posicin horizontal permanente. Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos sobre el cual se coloca el objeto a observar montado sobre un portaobjetos (delgada lmina rectangular de vidrio) en algunas ocasiones protegido con una lmina ms delgada de vidrio llamada cubreobietos. Posee dos pinzas destinadas a sujetar la preparacin o bien un sistema de tornillos (el carro), que permite desplazarla con movimientos horizontales y verticales y que generalmente est graduada con un vernier. d) Tubo: Cilindro metlico hueco con su superficie interna completamente para evitar la reflexin de la luz. En su extremo superior va el ocular y en su extremo inferior el revolver e) Revolver o tambor: Mecanismo situados en el extremo inferior del tubo, que lleva los diferentes objetivos que posee el microscopio. Por simple rotacin del revolver se coloca en posicin el objetivo deseado.

b)

c)

En el revolver los objetivos estn construidos de manera tal, que estando en foco uno de ellos, todos los dems quedan en foco al rotar el revolver Esto se conoce con el nombre de sistema parafocal. e) Tornillos para la focalizacin : La platina junto con parte del sistema de iluminacin, (el tubo en los microscopio ms antiguos) se deslizan verticalmente por medio de dos tornillos Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica adaptados sobre una cremallera, uno para movimientos rpidos o de enfoque aproximado llamado Macromtrico y el otro para movimientos lentos destinados al enfoque de precisin llamado Micromtrico. 2. Sistema de iluminacin: Se encuentra ubicado bajo la platina y consta de: 2) b) c) d) a) Espejo. Diafragma. Condensador. Anillo portafiltro. Espejo: El espejo del microscopio es circular y presenta dos caras, una cncava y otra plana. Est montado sobre una horcadura mvil que permite girarlo en cualquier direccin. El espejo cncavo se usa cuando se trabaja con luz artificiai, ya que, con la proximidad de la fuente luminosa es necesario hacer converger los rayos luminosos sobre la abertura de la platina. El espejo plano se usa para luz natural ya que la fuente luminosa (el sol) se supone infinitamente lejos y el plano del espejo resulta curvo al considerar como centro al sol. b) Condensador: Sistema de lentes ideados por Abb, colocado bajo la platina y que puede moverse verticalmente mediante un tomillo. Este sistema de lentes concentra los rayos luminosos, por lo cual el trmino condensador es impropio ya que no se produce una condensacin de rayos luminosos. sino un aumento de la seccin del cono luminoso de donde resulta una imagen ms ntida. Diafragma: Est formado por una serie de lminas de acero imbrincadas que se cruzan y que pueden moverse libre y simultneamente por un extremo, estando.fijas por el otro. El

movimiento se ejecuta por medio de una pequea palanca. El diafragma est adosado al condensador y se mueve verticalmente junto con ste. Tiene por funcin regular el haz luminoso ensanchndolo o disminuyndolo por lo cual es complemento indispensable del condensador Anillo portafiltro: Es un anillo ubicado bajo el diafragma que puede moverse lateralmente mediante una palanca y sobre el Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica cual se colocan el o los filtros que se deben usar. Los filtros son discos de vidrio. 3. Sistema Optico: Est montado en el tubo y est formado por el sistema de lentes que forman la imagen. El ocular est montado en el extremo superior del tubo y el objetivo en el extremo inferior a) Objetivo: Est formado por asociaciones de lentes positivas o convergentes que van montadas en el revlver Generalmente el revlver lleva tres o cuatro objetivos. Estas asociaciones de lentes que constituyen un objetivo forman un sistema centrado que acta en su conjunto como si fuera una sola lente con determinada distancia focal y dems propiedades equivalentes a la de una lente. Estos objetivos pueden ser acromticos o apocromticos, propiedades de las cuales depende su condicin ptica. Los acromticos dan focos distintos para los diversos colores apareciendo las imgenes irisadas dando la llamada aberracin cromtica. Los objetivos apocromticos logran corregir casi completamente la aberracin cromtica. En la prctica se distinguen dos tipos de objetivos segn sea el medio que separa la lente del objetivo y la preparacin. 1. Cuando este medio es el aire, cuyo ndice de refraccin es uno (n=1) diferente al de portaobjeto de vidrio (n=1.5), el objetivo es a seco. d)

1. Si el medio es un lquido que tenga un ndice de refraccin semejante o igual al del vidrio, generalmente aceite de cedro, el objetivo es a inmersin. En este ltimo se suprime1 en parte, la refraccin de los rayos perifricos y se aprovechan aquellos, que de otra manera, se perderan por reflexin total, como ocurre en los objetivos a seco a! pasar los rayos luminosos de un medio ms denso a uno menos denso (del aire al vidrio). En consecuencia una mayor cantidad de luz entra al objetivo aumentando su poder de resolucin. Esto se conoce con el nombre de "inmersin

homognea". Cuando el lquido que separa la lente frontal y el objeto tiene un ndice de refraccin distinto al del vidrio (agua por ej.), se conoce como "inmersin ordinaria". Ocular: Son sistemas pticos centrados colocados en el extremo superior del tubo al cual el observador aplica el ojo. Estn formados por dos lentes planas convexas: i. lente ocular propiamente tal. ii. lente colectora o de campo. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Entre ambas lentes hay discos perforados que suprimen los rayos marginales. La lente inferior colectora de campo: recibe la imagen mal dada por el objetivo, la refracta y origina en el plano focal de la lente ocular la imagen libre de aberraciones. Ejercicio N01 Ahora que Ud. conoce las diferentes partes del microscopio ptico compuesto y su funcin rotule el esquema de las pginas anexas.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Quimica. III CUIDADOS QUE DEBE TENER CON EL MICROSCOPIO. 1. 2. 3. Cuando tenga que trasladar el instrumento sujtelo siempre por la columna. Llvelo en posicin vertical, puesto que si se inclina se pueden caer los oculares. Mantenga las lentes limpias usando solamente el pao de lino previamente hervido que Ud. tiene para este efecto. Nunca use los dedos. No deje el microscopio en el borde de su mesn puesto que lo puede botar Una vez ubicado el microscopio en su lugar no lo mueva ms. No saque los oculares, en primer lugar porque se pueden caer y quebrar y en segundo lugar porque entra polvo en el interior del tubo. No mueva ninguna pieza si no conoce exactamente su uso. No coloque el mechero a gas encendido cerca del microscopio. Trate de no mojar el microscopio con ningn lquido. Si ello llegara a ocurrir, squelo inmediatamente. Los movimientos de enfoque deben ser suaves, especialmente si est moviendo el macromtnco. Las preparaciones deben colocarse sobre la platina en el portaobjeto, usando cubreobjeto solo cuando se le indique.

4. 5. 6.

7. 8. 9. 10. 11. lv

MANEJO DEL MICROSCOPIO.

Ahora que Ud. est en conocimiento de la mecnica del microscopio y de los cuidados generales que debe tener para manipularlo, le presentamos a continuacin la metdica que debe seguir para su uso. Es fundamental que en la manipulacin de ste delicado instrumento, se proceda con el mximo cuidado. Por consiguiente, recomendamos a los alumnos que se ajusten estrictamente a las recomendaciones dadas. Gua de Laboratorio de biologa 6 UTFSM - Area Qumica. Elercicio N02 1. Ubicacin del microscopio. Retire el microscopio de su caja y colquelo en posicin sobre el mesn de trabajo. 2. Acomode en posicin correcta el aparato. a) El tubo ptico dirigindolo hacia Ud. b) El revlver, dejando en el sistema ptico el objetivo de menor aumento. Generalmente es el ms corto. El revlver se mueve siempre en sentido contrario a los punteros del reloj. c) d) e) El condensador, colocndolo en su posicin ms alta a fondo en el soporte. El diafragma, dejndolo completamente abierto. La platina ubicndola horizontalmente cuando se van a observar preparaciones en fresco, sin embargo con preparaciones fijadas puede inclinarse el tubo. (Esto es vlido para los microscopios con columna articulada al pi.). La fuente luminosa artificial ubicndola a 20 o a 30 cm. del espejo y frente al mismo. El espejo usando la superficie plana cuando se trabaja con luz natural

f) g)

3. Ubicacin del observador. El observador debe sentarse cmodamente frente al microscopio, el cuerpo erguido y la cabeza inclinada sobre el ocular. Mientras observa, una mano maneja el tornillo micromtrico y la otra el portaobjeto con los tornillos de movimiento de la platina. Debe observarse con ambos ojos abiertos. 4. Iluminacin del campo microscpico.

Utilice la luz natural por esta vez. Mueva el macromtrico hasta que la lente frontal del objetivo quede a uno o dos centmetros del plano de la platina. Observe por el ocular, cambie de posicin el espejo hasta lograr que los rayos por l reflejados, se dirijan al eje ptico. Contine movindolo hasta conseguir una intensidad luminosa uniforme en el campo. Gua de Laboratorio de biologa 7 UTFSM - Area Quimica. Ejercicio N03 5. Enfoque de una preparacin. Recibir un portaobjetos, ponga una gota de agua y sobre ella con una pinza coloque una pequea letra de peridico. La letra debe estar en posicin normal de lectura. Coloque el porta objeto en la platina, bajo el objetivo de menor aumento y enfoque. a) b) c) d) Describa la imagen y la orientacin de la letra. Aleje de s el portaobjeto. En qu sentido parece moverse la letra ? Mueva el porta objetos a la izquierda. En qu sentido parece moverse la letra? Cambie a los otros objetivos. Describa las diferencias.

6. Examen de su preparacin. Para el examen topogrfico que da una visin de conjunto del objeto a observar utilice aumento menor y recorra la preparacin movindola con la mano o por medio de los tornillos del carro. Para un examen citolgico o de detalles, utilice aumento mayor y los movimientos del porta objeto que ejecute deben ser muy suaves. Ejercicio N0 4 Su profesor o instructor se encargarn de desacomodar su microscopio y Ud., lo iluminar y enfocar en forma correcta.

V. DEFECTOS FRECUENTES EN EL MANEJO. a 1. En la iluminacin:

a) b) c) d)

Espejo en posicin incorrecta (desviado lateralmente) Condensador bajo o descendido en la montura. Diafragma muy cerrado, lateralizado Filtros inadecuados o en exceso.

Por imgenes extraas: a)Corpsculos de polvo u otros elementos extraos. En el ocular. Se reconoce al hacer girar el ocular. En el objetivo.Se reconocen porque persisten en el campo aunque se observe sin la preparacin. Con el cubreobjeto. Se reconocen porque se desplazan al mover la preparacin y estn en un plano focal diferente. b) Burbujas de aire: Se reconocen porque tienen forma de crculo con bordes negros y cambian de aspecto segn el foco. Gotas de grasa: Se reconocen porque son muy refringentes, brillante y de contornos oscuros.

C) Ejercicio N0 5

Compruebe cada una de estas indicaciones. VI. RECOMENDACIONES 1. Enfoque: En las preparaciones de muy poco contraste sucede a veces que no se encuentra fcilmente el plano de nitidez; para facilitar esta labor, se desplaza muy lentamente la preparacin sobre la platina a la vez que se gira el tornillo de enfoque aproximado. Tambin puede facilitarse esta operacin cerrando el diafragma del condensador Tan pronto como la zona a examinar con ms detalles queda en el centro del campo visual, puede aislarse con el siguiente objetivo ms potente, cuyo enfoque requiere solamente accionar el tornillo de precisin o micromtrico. 2. No diafragmar demasiado : Durante la regulacin de un condensador, suelen haber bastantes errores. El condensador puede considerarse como debidamente regulado cuando se encuentra en la posicin alta o un poco por debajo de la misma y su diafragma se cierra lo estrictamente necesario para producir el contraste justo. Los principiantes acostumbran a trabajar con diafragma de condensador demasiado cerrado. Por favor, no utilice Ud. este diafragma para disminuir la claridad. Recurra para ello a otro medio (empleo de filtros grises, etc.). El tan socorrido descenso del condensador "para aumentar el contraste" no tiene otro efecto que el de seguir cerrando el diafragma, y por lo tanto es inadecuado.Si en los objetivos de poco aumento no fuera suficiente la magnitud del campo iluminador, girar completamente la lente frontal del condensador y abrir totalmente su diafragma. Gua de Laboratorio de biologa

UTFSM - Area Qumica. 3. .Siempre con una mano en el tornillo de enfoque fino o micromtrico: La nitidez obtenida en la preparacin para una determinada graduacin del mecanismo de enfoque fino, es reducida, (Con los objetivos potentes 1 menor que con los dbiles). Por esta razn en los trabajos de Microscopa hay que mover constantemente hacia arriba y abajo el botn de enfoque fino, a fin de poder examinar sucesivamente toda la profundidad de la preparacin. 9 4. Dos puntos importantes : Siempre que se utilicen instrumentos pticos , hay que tener en cuenta dos cosas extraordinariamente importantes. 1. Mirar por el ocular con la vista descansada 2. Que haya cierta distancia entre el ojo y el ocular VII PROPIEDADES DEL MICROSCOPIO. Ud. ya conoce el instrumento en cuanto a su construccin y a la forma correcta de usarlo, pero es necesario que tambin conozca sus propiedades caractersticas que permitan entregarle una imagen de calidad. 1. Poder de aumento: Es la capacidad del microscopio que expresa la razn entre el tamao de la imagen que produce el microscopio y el tamao del objeto observado. Como el microscopio compuesto tiene dos sistemas pticos, cada uno de ellos capaz de agrandar la imagen, el aumento total es igual al producto de los aumentos dados por el ocular y el objetivo respectivamente. Tamao aparente Aumento = -----------------------------tamao real Aumento del instrumento = aumento del ocular x aumento del objetivo. 2. Poder de resolucin: Es la capacidad del instrumento de dar imgenes bien definidas de puntos situados muy prximos entre s. 3. Lmite de resolucin: Es la distancia mnima que puede existir entre dos puntos para que puedan ser definidas como tales. Es importante recordar que el lmite de resolucin (mnima distancia) es el inverso del poder de resolucin (mxima capacidad) de manera que cuanto mayor es el poder de resolucin, menor es el lmite de resolucin. Esto ltimo es el resultado de deducciones matemticas que no es el caso tratar aqu y Ud. lo estudiar en sus cursos de fsica.

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lo

4. Poder de definicin: consiste en la capacidad del microscopio de dar imgenes claras de contornos precisos. Reside en la correccin de las aberraciones propias de las lentes. 5. Poder de penetracin : As como el poder de resolucin permite averiguar detalles colocados a la misma altura, el poder de penetracin permita averiguar hasta que lmite, detalles de estructuras situadas en diferentes planos, realmente estn a niveles distintos con un mismo enfoque. VII METODICA PARA GUARDAR EL MICROSCOPIO. Terminada la observacin hay que cuidar de: a) b) c) Dejar limpio los objetivos y oculares por medio del pao de lino. Dejar limpia la platina. Dejar el microscopio en posicin de reposo que consiste en:

i. Objetivo de menor aumento en posicin de enfoque. ii. Espejo en posicin horizontal con la cara plana hacia arriba. iii Diafragma abierto y condensador en el tope inferior d) Una vez efectuado lo anterior guardar el microscopio en su correspondiente caja dejndolo a una distancia prudente del corte del mesn de trabajo.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Quimica. MICROSCOPIA ELECTRONICA Objetivos: Que el alumno conozca el funcionamiento del M.E. y las tcnicas empleadas para la preparacin de los tejidos a observar Al mismo tiempo, se hace un paralelismo entre este instrumento y el microscopio ptico. Introduccin: Los hombres han intentado siempre hacer evidentes de una manera o de otra los fenmenos que estudian, sea por medio de diagramas, grficos o escritos. La Microscopa ptica haba permitido ver los microorganismos y probar definitivamente su existencia. El microscopio electrnico permitira poner de manifiesto la organizacin celular interna de los organismos, y ms recientemente observar la organizacin molecular de los procesos vivos.En su fundamento, el M.E. es semejante al M.O., pero en lugar de estar compuesto de fotones, los rayos utilizados estn compuestos de electrones y su longitud de ondas es del orden del angstrom (lA = 10 -8 cm.). Asimismo, los aumentos obtenidos con un microscopio ptico son como mximo de 2.000 dimetros, mientras que los microscopio electrnico ms recientes permiten un aumento de 500.000 dimetros. Continuando con el paralelismo, si un observador con el microscopio ptico puede ver detalles del orden de 1/10 de micra, un observador con microscopio electrnico puede advertir sin dificultad del orden de 50 A (0,005 micras). El microscopio electrnico es el nico instrumento que permite conocer directamente la ultraestructura biolgica, puesto que posee un poder de resolucin mucho mayor que el del microscopio ptico. Utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electrosttico o electromagntico, en la misma forma que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente. Si se coloca un filamento en un tubo al vaco y luego es calentado, ese filamento emite electrones que pueden ser acelerados por medio de una diferencia de potencial elctrico. En estas condiciones el haz de electrones tiende a seguir una trayectoria rectilnea y posee propiedades similares a las de la luz. Al igual que sta, manifiesta un carcter vibratorio y corpuscular, pero la longitud de onda es mucho menor = 0,05 A para los electrones, en oposicin a los 5500 A de la luz. En el microscopio electrnico, el filamento o ctodo emite el haz de electrones. Por medio de una bobina electromagntica, que hace las funciones de condensador, los electrones se concentran en el plano donde se coloca el objeto. La segunda bobina funciona como una lente objetivo y da una imagen agrandada del objeto. Esta es recibida por una tercera "lente" magntica que acta como ocular o lente de proyeccin, la cual aumenta la imagen que proviene del objetivo. La imagen final se ve sobre la pantalla fluorescente o con una placa fotogrfica. A pesar de las aparentes semejanzas mostradas existen grandes diferencias entre el microscopio ptico y el electrnico,

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Alguna de las cuales se refiere al mecanismo de formacin de las imgenes. Mientras que en el microscopio ptico, sta depende principalmente de la desigual absorcin de la luz en diferentes zonas del objeto, en el microscopio electrnico la formacin de la imagen se debe principalmente a la dispersin de electrones. A menudo, los electrones que chocan con los ncleos de los tomos del objeto son dispersados en forma elstica de manera tal que caen fuera de la apertura de la lente objetivo, y la imagen observada en la pantalla fluorescente resulta, as, de la ausencia de estos electrones que han sido detenidos por la apertura. La dispersin puede, tambin, ser consecuencia de colisiones mltiples que disminuyen la energa de los electrones que pasan. En este caso se producen efectos cromticos. La dispersin de electrones est en funcin del espesor y densidad molecular del objeto, y en especial, del nmero atmico de los tomos que entran en su composicin. A mayor nmero atmico, mayor dispersin. Gran parte de los tomos que componen la estructura biolgica, como C, H, O, N, son de bajo nmero atmico y contribuyen poco a la formacin de la imagen. Por esta razn, como veremos ms adelante, se deben agregar tomos pesados a la estructura molecular. El aumento en el microscopio ptico se debe principalmente al objetivo, que llega a un mximo de 100 a 120 X. El ocular aumenta esta imagen entre 5 a 15 veces. De este modo se llega a un incremento til de orden de 500 a 1500 X. En el microscopio electrnico, el poder de resolucin es tan alto que la imagen obtenida del objetivo aumenta en proporcin mucho mayor. As, con un aumento inicial del objetivo de 100 x puede ampliarse la imagen 200 veces con la bobina proyectora, lo que equivale a un aumento total de 20,000 X. En los instrumentos ms recientes se obtiene un amplio grado de aumento mediante la introduccin de una lente intermedia, con la cual se logran aumentos directos de 160,000 X, mientras que los negativos pueden aumentarse fotogrficamente hasta 1,000,000 y ms, segn la resolucin alcanzada PREPARACION DEL MATERIAL BIOLOGICO PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA Por su extraordinario poder de resolucin, el microscopio electrnico es un instrumento ideal para el estudio de la estructura submicroscpica de la clula. Sin embargo, su uso est reducido por una serie de dificultades tcnicas y de limitaciones. Una de ellas se debe al escaso poder de penetracin que tienen los electrones. Si el espesor del material excede de 5000 A (0.5 u), la opacidad es casi total. El objeto debe depositarse sobre una pelcula extremadamente fina (de 75 a 150 A de espesor) de celodin, carbn, etc., que acta como material de sostn y que a su vez est apoyada sobre una fina grilla de metal. Otra limitacin proviene del hecho de que el espcimen debo deshidratarse para ser colocado en el vaco. Ello hace casi imposible el estudio de clulas vivas.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Todas estas dificultades se han podido resolver parcialmente permitiendo, aunque en casos limitados, la observacin de especmenes vivientes mediante el microscopio electrnico. Las tcnicas de preparacin de los especmenes varan considerablemente. En biologa existen dos clases principales de preparacin: suspensiones de pequeas partculas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partculas, como virus y macromolculas, una de las dificultades es la tendencia que tienen las partculas a amontonarse entre s durante la desecacin sobre la pelcula de sostn. Pueden obtenerse pequeas gotas por medio de cierto tipo de atomizador Tambin pueden producirse gotas submicroscpica transformando la suspensin en un aerosol (coloide de lquido en aire) y luego depositando las partculas cargadas por medio electrostticos sobre las grillas. Un mtodo importante para el estudio de macromolculas es la denominada tcnica de monocapas de Kleinschmidt, en la cual las macromolculas se extienden sobre una~interfase aire-agua antes de ser recogidas sobre una pelcula. Este procedimiento ha dado excelentes resultados en la demostracin de molculas de ADN y ARN de distintos orgenes y tipos.Los especmenes gruesos son susceptibles de ser desintegrados por medios mecnicos, como la homogeneizacin, ondas sonoras, o supersnicas, etc. El material es dividido por estos medios a lo largo de sus planos de clivaje en fragmentos, suficientemente finos como para que sean en parte transparente a los haces de electrones. Ultramicrotomia: El estudio de clulas y tejidos se logra tambin con el uso de cortes fino. La tcnica es esencialmente similar a la que se emplea en preparaciones para el microscopio ptico, pero sus requisitos son mucho ms crticos. Para cortar el tejido, sta debe previamente fijarse o incluirse. La necesidad de realizar cortes ultrafinos ha conducido al uso de medios de inclusin de considerable dureza. Los ms usados son los monmeros acrlicos o las resinas de epoxi, que impregnan los tejidos y luego se polimerizan por medio de catalizadores apropiados. Un medio hidrosoluble de glico-metcrilato ha sido desarrollado para estudios citoquimicos, permitiendo la extraccin selectiva de sustancias y la accin de diferentes enzimas. En los ltimos aos se han perfeccionado considerablemente los mtodos de corte, construyendo diversos micrtomos que tienen un avance tcnico o mecnico. Con ambos tipos, los cortes ms finos que pueden realizarse estn en el orden de los 200 A. Los factores que influyen aparentemente en la limitacin son la inclusin apropiada y el filo de la cuchilla, En la actualidad se emplean generalmente las cuchillas de vidrio o diamante. Es posible asimismo realizar cortes ultrafinos a baja temperatura en material incluido simplemente en gelatina.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Mtodos para intensificar el contraste : Ciertos materiales biolgicos como finas membranas, filamentos o macromolculas (de 100 A o menos de dimetro), tienen un poder muy pequeo de dispersin electrnica debido a que son uniformemente delgados y estn compuesto por tomos livianos. Se han utilizado mtodos que tienden a corregir esta dificultad aumentando el contraste y demostrando detalles ms finos de la superficie de los objetos. Una tcnica de stas, denominada de sombreado, consiste en colocar el espcimen dentro de una cmara de vaco y en evaporar metales pesados como cromo, paladio, platino o uranio, depositndola en un ngulo determinado, a partir de un filamento incandescente. De esta manera, el material se deposita sobre un lado de la superficie de las partculas del espcimen, mientras que del otro lado se produce un sombra cuyo longitud permite calcular el espesor de dichas partculas. Las fotomicrografas de esos especmenes presentan un aspecto tridimensional que normalmente no se produce. Una de las tcnicas ms recientes e importantes en el estudio de los virus y macromolculas es el de la "coloracin negativa", en el cual el espcimen es embebido en una gota de material denso como el fosfotungstato. Este penetra en todos los espacios vacos existentes entre las macromolculas, que aparecen muy bien limitados en contraste negativo. Con dicha tcnica se determin el nmero de molculas proteicas (capsmeras) de diferentes virus y se realizaron observaciones interesantes en algunas estructuras celulares. 14

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IDENTIFICACION DE VIDA MICROSCOPICA INTRODUCCION: La prctica anterior y las observaciones que har a continuacin le permitirn complementar sus conocimientos sobre el uso del microscopio, dominar el enfoque de cualquier tipo de preparacin que se le presente y lo introducir a un mundo insospechado de organismos invisibles al ojo desnudo. . El microscopio revela no slo que las plantas y animales estn constituidos por clulas o por productos celulares si no que existe todo un mundo de pequeas plantas y animales invisibles a simple vista. Muchos de estos organismos estn constituidos por una sola clula y pertenecen al reino protista que no tienen parecido tpico ni a plantas ni a animales. Objetivo: 1. Describa las clulas vivas de un vegetal 2. Analizar las ventajas del uso de colorantes en Microscopa ptica.. 3. Obtener conocimientos de la variedad de animales y plantas que existen en el agua estancada Ejercicio N0 1 Extraiga de un catfilo de cebolla un trocito de epitelio usando una hoja de afeitar. Colquela en un porta objetos con una gota de agua y cbrala con un cubre objeto. Observe y dibuje con objetivo de 10x y 40x la disposicin, agrupacin y forma celular. Anote sus observaciones. Ejercicio N02

Observe y dibuje un epitelio de cebolla teido con lugol: Qu visualiz? Qu diferencia presenta con el epitelio sin colorear? Gua de Laboratorio de biologa 17 UTFSM - Area Quimica. Ejercicio N0 3 En un portaobjetos coloque una gota de agua de charco, cbrala con un cubreobjetos. Observe la preparacin con el objetivo de 40x y trate de encontrar algunos organismos ayudado por la lmina anexa. Vea si son mviles o inmviles, unicelulares o pluricelulares. Cuando haya examinado una gota lave y seque cuidadosamente los portaobjetos y coloque otra gota de agua de charco . Encuentra los mismos microorganismos? Cuntas especies diferentes vio usted? Ejercicio N0 4 Hoja de lirio. De la hoja de lirio interesa un trozo de epidermis con algo de parenquima cloroflico. La epidermis es una capa finsima que cubre a la hoja y que se puede separar de ella haciendo uso de una hoja de afeitar En esta epidermis se observa entre las clulas epidrmicas, unas clulas arrionadas agrupadas por parejas, que forman los estomas, en estas clulas hay cloroplastos, son como esferitas color verde. Tratada la epidermis con lugol se ven los ncleos, algo mayor que los cloroplastos. Dibujar lo observado. EjercicioN05 Clulas de la pulpa de tomate. Del tomate interesa la pulpa gelatinosa que tiene clulas muy grandes con muchos cloroplastos. Dibujar lo observado Para su mejor observacin utilice Lugol. Ejercicio N06 Granos de almidn de patata. De la patata interesa ver los granos de almidn, estn incluidos en leucoplastos. Raspar un poco de patata y observar entre porta y cubre, primero

con una gota de agua, y luego , despus aadir una gota de lugol. Dibujar Gua Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica

MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA CELULAR. Introduccin. La vida se desarrolla en un marco de organizacin muy similar por diferente que parezca a simple vista la infinita variedad de seres vivos. Este desarrollo tiene como base una misma estructura fsica y qumica fundamental, como as mismo cumple funciones idnticas y estn sometidas a las mismas fuerzas que han generado su organizacin actual y que seguirn modificando sus estructuras y funciones en lo futuro. Dado el avance de las investigaciones actuales en el campo de la biologa es obvio que el fundamento de las organizaciones biolgicas descansa en la clula. En esta unidad estructural es donde deben interpretarse en ltima instancia, los fenmenos vivientes. El tamao de las clulas es variable sin embargo, la mayoria de las clulas presentan tamao comprendido entre 1 y 100 micrones lo que permite realizar la siguiente clasificacin. a) b) c) d) Clulas pequeas Clulas medianas Clulas grandes Clulas gigantes = = = = por debajo de 10 micrones. hasta 40 micrones. por sobre 40 micrones. por sobre los 100 micrones.

Para facilitar una observacin metdica y completa Ud. deber seguir el siguiente esquema en la descripcin: a) Relaciones b) Forma c) Tamao d) Lmite e) Citoplasma f) Ncleo : : : : : : Observe si se trata de libres o asociadas formando tejidos. Observe si se trata de clulas cbicas, prismticas, especificas, planas, etc. Se puede calcular dividiendo la longitud del dimetro del campo visual por el n de clulas que podran caber alineados sobre l. Fije su atencin en el lmite y observe el espesor de ste y si cubre total o parcialmente a la clula. Describe las caractersticas del citoplasma si este es estructurado, si se destacan elementos en l, distribucin, tamao aproximado y forma de ellos. Forma, posicin, tamao relativo, nucleolo(s).

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Objetivo: 1. Identificar los dos compartimientos de una clula. 2. Distinguir o interpretar distintas formas celulares a partir de la observacin de un corte o frotis.

Ejercicio N 1 A. Observacin de clulas sanguneas: A.1 1.1 Obtencin de sangre por puncin en el dedo meique. 1.2 Colocar una gota de sangre sobre el portaobjetos y extender cuidadosamente para obtener una pelcula delgada extendida. 1.3 Secar el aire el extendido o flamear suavemente a la llama del gas. 1.4 Fijar con gotas de alcohol metlico. 1.5 Secar el aire. 1.6 Observar al microscopio y dibujar con su aumento mayor, poniendo nfasis en los distintos tipos de ncleos que se aprecian en glbulos blancos. A.2 Realice el mismo esquema de trabajo hasta el paso 1,5 posterior a esto. 2.1 Agregue gotas de solucin wright (azul de metileno y eosina al 0,05%, en etanol; pH = 6,4 - 6,8 ) hasta cubrir el portaobjetos y mantener por un minuto. 2.2 Agregue agua destilada y dejar durante 5 minutos. 2.3 Secar con papel filtro. 2.4 Observar al microscopio y dibujar con aumento mayor poniendo especial

atencin a las diferencias con la experiencia A.1.

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Ejercicio N 2 B. Observacin de raspado de mucosa bucal. B.1 1.1 Introduzca en su boca un monda dientes o la yema del dedo pulgar y deslice de atrs hacia delante haciendo una ligera presin sobre la cara interna de la mejilla con lo cual lograr recoger algunas clulas corteliales descamadas. 1.2 Deposite el material as obtenido en una gota de solucin salina (NaCl 0.9%) sobre un portaobjetos. Agite suavemente para que se produzca una mezcla homognea. 1.3 Tome la laminilla cubre objetos por sus bordes acrquelo al portaobjetos de modo que uno de sus bordes libre toque la gota formando un ngulo de 45 bjelo lentamente permitiendo una distribucin homognea del lquido a examinar. 1.4 Seque los bordes con papel filtro y lleve su preparacin a la platina del microscopio. Dibuje y describa los observado.

B.2 2.1 Repita la misma operacin, pero fije el extendido calentndolo suavemente al mechero o colocndolo en alcohol. Para este material es recomendable la combinacin de secado y fijacin por alcohol. 2.2 Agregue a la superficie del extendido unas gotas de solucin de colorantes y djelo actuar durante dos minutos. 2.3 Deje escurrir el colorante y lave el exceso con agua. Cubra la preparacin en la forma antes indicada. 2.4 Dibuje y describa lo observado estableciendo adems, diferencias en la utilizacin de los colorantes. Nota : Utilizar los siguientes colorantes lugol, eosina y azul de metileno.

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TINCION DE GRAM Es una de las tinciones diferenciales ms importantes en bacteriologa. Las bacterias teidas por este mtodo se diferencian en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Consiste en teir bacterias con un colorante, violeta de genciana, luego aplicar una solucin de lugol como mordiente y decolorar con alcohol-acetona. Las bacterias gram positivas retienen el colorante mientras que las gram negativas se decoloran y deben ser teidas con un colorante de contraste (safranina). La diferente reactividad de las bacterias ante la tincin de gram se debe a la diferencia en la composicin qumica de las estructuras externas de ambos grupos. Tcnica: . 1. Limpie un portaobjeto y en uno de sus extremos trace una lnea con lpiz graso. 2. Haga un frotis. Si la muestra est suspendida en un medio lquido, tome una gota con una asa o con una pipeta Pasteur y extindala en el porta objeto. Si la muestra proviene de un medio slido, coloque una pequea gota de agua sobre el portaobjeto y haga una emulsin delgada, apenas lechosa, con los grmenes y extindala. 3. Fijacin por calor; Pase el portaobjeto varias veces por la llama hasta que se seque. De esta forma, las bacterias quedan fijas al vidrio y muertas. 4. Fijacin con alcohol - eter; Una vez enfriado el portaobjeto cubra la preparacin con unas gotas de alcohol~ter, pselo por la llama e inflmelo para fijar bien la preparacin.

5. Enfre. Cubra el frotis con solucin de cristal violeta (violeta de genciana) y deje actuar por un minuto. 6. Bote el exceso de colorante y lave con agua de la llave,

Gua de Laboratorio de biologia UTFSM - Area Qumica. 7. Cubra el frotis con solucin odo-lodurada (solucin de Gram o lugol). Deje actuar por un minuto. (Accin del mordiente). 8. Bote el exceso de solucin y lave con agua.

9. Decoloracin con alcohol-acetona: Haga escurrir por el frotis la solucin decolorante. Debe ser rpido. Lave con agua de la llave hasta que no se desprenda ms colorante violeta. 10. Coloracin de contraste: Cubra el frotis con fuccina diluida o solucin de safranina por un minuto. 11. Lave con agua. 12. Seque con papel filtro sin restregar 13. Observe al microscopio con objetivo de inmersin, sin cubreobjeto.

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FENOMENOS FISICOS Y QUIMICOS DE IMPORTANCIA BIOLOGICA Introduccin. El carcter qumico de los organismos parece haber sido determinado por la disponibilidad de materias primas en el medio ambiente y en parte por la adaptacin de la vida. Por lo tanto la composicin elemental de la materia viva presenta semejanzas y diferencias claras a la composicin de la biosfera. Se tratar de realizar un paralelismo en la composicin del medio en que se desarrollan. Analizando adems, la importancia del agua como medio de solvente que posibilita las reacciones qumicas en las estructuras biolgicas.

Objetivo. 1. 2. 3. Conocer mediante experiencias modelo, algunas caractersticas del estado fsico y qumico celular Reconocer los elementos qumicos que forman parte de la clula y sus importancia biolgica. Conocer reacciones especficas para el reconocimiento de sustancias qumicas.

A. Fenmenos Fisicos. 1 Grado de divisin de la materia. 1.1 Suspensin grosera: Agite una probeta llena de agua turbia ( con restos vegetales) djela reposar. Las partculas sedimentarn ya que slo se mantienen en suspensin por la accin mecnica de la agitacin .

Interprete y dibuje los estados que se presentan en este fenmeno. 1.2 Cristaloides: Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica a) Coloque una gota de k2Cr2O7 sobre un portaobjetos. Observe al microscopio con aumento mediano y mayor dibujando lo observado. Caliente suavemente el portaobjetos sobre un mechero evaporando lentamente el solvente. Vuelva a observar con los mismos aumentos y dibuje. b) Repita la experiencia anterior utilizando KMnO 4 y NaCl. 1.3 Coloide. En un tubo de ensayo coloque trozos de la gelatina, que se le proporcionar. Aadale 1 ml de agua, flame el tubo en el mechero y hierva hasta que se obtenga una suspensin homognea. 2. Lpidos.

Pruebe el poder disolvente que sobre el aceite tienen las siguientes sustancias agua, alcohol, ter, tetracloruro de carbono. Complete el siguiente cuadro. AGUA ACEITE (1 ml) ALCOHOL ETER CCl 4 (ml)

Anote e interprete los resultados en su cuaderno. 3. Reconocimiento de Protena. 3.1 Reaccin Xantoproteca. El ensayo es positivo para las protenas con aminocidos que llevan el anillo bencnico como tirosina, triptfano y fenilalanina.

a) En un tubo de ensayo agregue 2 ml de solucin de albmina al 5%. Luego agregue 1 ml de HNO3, caliente el tubo suavemente hasta ebullicin. Anote sus resultados. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica b) Realice la experiencia anterior utilizando gelatina en vez de albmina. Anote sus resultados. 3.2 Reaccin de Biuret. Es positivo para todos los componentes que contengan dos o ms uniones peptdicas. a. En un tubo de ensayo coloque 3 ml de albmina al 5%, luego agregue 1 ml de reactivo de Biuret. (CuSO 4 en solucin + NaOH 2 N). Caliente el tubo a 35C por 2 minutos observe la coloracin prpura formada. b. Realice la experiencia anterior utilizando gelatina en vez de albmina. Anote sus resultados. 4. Reconocimiento de Hidratos de Carbono. 4.1 Raspado del almidn de papas para microscopio. Haga un corte a una torreja de papa, agregue a la superficie solucin de lugol. Observe la coloracin que toma el tejido. 4.2 Reaccin de Molish. En un tubo coloque 2 ml de sacarosa al 5% y en otro 2 ml de glucosa el 5%. Luego agregue a cada tubo dos gotas de una solucin alcohlica de naftal al 5% (5gr. De naftol en 100 ml. de alcohol 95%). Agregar con cuidado 2 ml. de H 2SO4 concentrado por las paredes del tubo inclinado de modo que el cido forme una capa sin mezclarse con la solucin de carbohidratos. En unos pocos segundos aparecer un anillo de color violeta indicando reaccin positiva. 4.3 Reaccin de Fehling. Agregue a un tubo 1 ml. de glucosa al 5%; 1 ml. de solucin Fehling A y 1 ml. de solucin Fehling B. Prepare otro tubo con sacarosa al 5% y los reactivos de fehling A y B.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Agite cada uno de los tubos, caliente durante 10 minutos a Bao Mara. La reaccin positivo se observa con la aparicin de un color rojo ladrillo intenso. Anote sus observaciones e interprete los resultados obtenidos. 5. Reconocimiento de sustancias qumicas en leche. Haga hervir la leche en un vaso y coloque sobre los vapores que se desprenden una cpsula de vidrio reloj Qu sustancias se hace presente en las paredes fras? Deje enfriar la leche y constate en la superficie del lquido la formacin de una delgada pelcula llamada "nata". Separe esta membrana. 6. Reconocimiento del ion Cloruro. Reactivos NaCl Suero de leche H2O destilada AgNO3 1 3 ml. 3 gotas Tubos 2 3 ml. 3 gotas 3 3 ml. 3 gotas

Anote en su cuaderno los resultados obtenidos e interprete desde el punto de vista qumico. A unos ml. de leche agregue cido, filtre por filtro grueso se obtiene un lquido semi-transparente que constituye el suero de la leche y un cogulo espeso. A una porcin del cogulo agregue HNO 3 (gotas). Qu revela el color producido?. Coloque en un tubo de ensayo la otra porcin de cogulo agregue ter y agite con fuerza. Vierta el contenido del tubo en un vidrio reloj y cuando se haya evaporado el ter limpie con un papel el residuo que queda sobre el vidrio extindalo y examnelo a la luz Qu observa?. Vierta en un tubo de ensayo un poco de suero agregue Fehling A y B, caliente. Qu ocurre?. A otro poco de suero agrguelo AgNO3 Qu obtiene? Nota:

La leche presenta en su composicin protenas. Investigue cuales son las caractersticas que estas presentan. Gua de Iaboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica

METABOLISMO CELULAR Hemos conocido hasta el momento la gran complejidad de estructura y funcin de las diferentes clulas que componen los organismos. Para poder llevar a cabo todas estas funciones y mantener la integridad de los complejos celulares y de la clula misma es necesario la participacin de energa. Los organismos vivos no pueden consumir o crear energa, solamente puede "transformar una forma de energa en otra", por esto, absorven una forma de energa que es til en las condiciones especiales de temperatura y presin, la cual les permite realizar trabajo, devolviendo al ambiente otra forma menos utilizable (color o luz). Los mecanismos que las clulas vivas utilizan para extraer la energa son de dos clases y dividen a las clulas en auttrofas y hetertrofas. Ambos tipos celulares han desarrollado a travs de la evolucin complejos mecanismos, capaces de reaccionar coordinadas y cooperativamente en la conversin de energa. Los organismos auttrogos utilizan la energa atrapada en extraer protones y electrones del agua, en los vegetales estos se combinan con el CO 2 para formar molculas orgnicas como la glucosa, proceso llamado fotosinttico. Los organismos hetertrofos para obtener su mecanismos, la gluclisis y fosforilacin oxidativa. energa realizan dos

La gluclisis se caracteriza por una serie de transformaciones graduales con la produccin de dos molculas de cido pirvico, esto ocurre en el citoplasma con la participacin de aproximadamente 11 enzimas. En los organismos anaerbicos el cido pirvico puede transformarse en etanol, cido ctrico, cido butlico, proceso conocido como fermentacin alcohlica. La fosforilacin oxidativa corresponde al momento en que las clulas convierten la energa obtenida en molculas de ATP (adenosn trifosfato). La obtencin del ATP requiere de dos fenmenos, ciclo de Krebs y cadena respitoria, que se realizan en la mitocondria, siendo muy similar a los plastos.

La cantidad de energa necesaria para formar un ATP requiere de un ambiente qumico adecuado, as, cada molcula de glucosa oxidada proporcionara suficiente energa para la sntesis de cerca de 46 moles de ATP, pero los anlisis indican que slo se producen 36 moles de ATP al considerar las condiciones bioqumicas de la mitocondria. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica ADP + Pi + H+ ATP + H2O G=7,3 Kcal G=686 Kcal

Glucosa + 602 6 CO2 + H2O -------------------------------------------------------36 ATP 263 Kcal

Con un 38% de eficacia. Objetivos. 1. Identificar los organoides que participan en el proceso energtico. 2. Entender conceptos fundamentales tales como actividad enzimtica y respiracin celular. I Actividad Enzimtica.

Las enzimas aumentan, considerablemente la rpidez de casi todas las reacciones qumicas que se efectan en los organismos vivos, ya sean endergnicas o exergnicas. La actividad de una enzima esta influenciada por los siguientes factores, temperatura, concentracin de la enzima, pH, tiempo de exposicin en una sustancia, etc.

1. Deteccin de la Catalasa. La catalasa es una enzima que acelera la descomposicin del perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, segn la siguiente reaccin: catalasa -------------2H2O2 2H2O + O2 Se sabe que el perxido de hidrgeno es un compuesto utilizado como antisptico y como blanqueador.

El rol metablico de la enzima es evitar la acumulacin de perxido de hidrgeno en las clulas formado durante el proceso respiratorio en tejido vegetal y animal. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica. El perxido de hidrgeno tiene propiedades txicas, y si no es eliminado, puede llegar a causar la muerte de la clula. Ejercicio N 1 Comprobar la presencia de catalasa en tejido animal y vegetal. A dos tubos de ensayo agregue 2 ml. de perxido de hidrgeno al 3%, a uno de ellos agregue alrededor de 0,1 gr. de arena fina y al otro 0,1 gr. de MnO2, cierre el extremo abierto del tubo de ensayo con el dedo pulgar y agtelo fuertemente. Observe la reaccin. Coloque una astilla incandescente, en la boca del tubo, (de cada tubo) y anote sus observaciones. Ejercicio N 2 Vierta 2 ml. de perxido de hidrgeno recin preparado en varios tubos de ensayo (5). Agregue un trozo de hgado, un trozo de rin, un trozo de manzanas y sangre a cada tubo. Agite fuertemente los tubos y coloque una astilla incandescente. Anote sus observaciones. Ejercicio N 3 Tome un trozo de hgado, colquelo en un mortero agregue poco de arena fina, muela el hgado con el mortero. Coloque el material molido en dos tubos de ensayo, y uno de ellos calintelo a bao mara por dos minutos. Agite fuertemente ambos tubos y agregue 2 ml. de H 2O2. Haga la prueba con la astilla incandescente. Anote sus observaciones y resuma sus resultados en la siguiente tabla:

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica.

Material Actividad Enzimtica ---------------------------------------------------------------------------Arena Mn O2 Trozo de Hgado Trozo de rin Trozo de papa Sangre Hgado molido Hgado hervido -----------------------------------------------------------------------------2. Deteccin de la Amilasa. La amilasa es una enzima que acta sobre el almidn transformndolo en glucosa. Ejercicio N 4 Use dos placas de Petri que contienen 5 ml. de almidn, deje una de control, y la otra sela siguiendo las instrucciones: a) Colque en esta ltima saliva. b) Mantenga esta placa a una temperatura de 37C. c) Controle la degradacin del almidn a intervalos de 2 minutos, para ello saque muestras de la superficie y colquelas en una baldosa blanca, agregando de inmediato solucin de lugol. d) Saque muestras por espacio de varios minutos hasta llegar a incoloro.

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La siguiente pauta le permitir controlar el proceso de degradacin Lugol ---------------Almidn amilasa Lugol ---------------Amilodextrina amilasa lugol --------------Entrodextrina amilasa rojo - violado azul negro

lugol --------------Acrodextrina amilasa lugol --------------Maltosa amilasa lugol --------------Glucosa incoloro incoloro rojo - suave

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Ejercicio N 5 Recoja ms o menos 1/4 del tubo de ensayo con saliva. Separe la saliva en tres partes en iguales en tubos de ensayo y agregue 2 ml. de almidn. Caliente suavemente un tubo de ensayo a ebullicin, el otro a 60 grados Celsius y el tercer tubo mantngalo a 37 grados Celsius. Compruebe la actividad enzimtica siguiendo el mismo procedimiento que el ejercicio N3, pero a tiempo cero, cinco y treinta minutos. Anote los resultados obtenidos e interprtelos. Ejercicio N6 Divida una cantidad adecuada de semilla de maz en tres lotes los cuales sern sometidos a un tratamiento diferente: Lote 1 = Semillas remojadas durante 24 horas Lote 2 = Semillas remojadas durante 24 horas y despus hervidas por 15 min. Lote 3= Semillas secas Prepare tres placas de Petri colocando en cada una de ellas 15 ml. de una mezcla de Agar-Almidn recientemente preparada, espere que se solidifique el agar y tpelas. Corte por la mitad cada una de las semillas de los tres lotes. Coloque 5 mitades de cada una de ellas en las placas de Petri, las semillas debern quedar con la superficie plana en contacto con el agar. Anote en la tapa de la placa todos los datos necesarios. Deje la placa durante 24 horas a la temperatura ambiente. Pasado este tiempo separe las semillas del agar y coloque unas gotas de solucin de lugol sobre el medio moviendo las placas de tal modo que el reactivo cubra completamente el agar. Lave con agua en forma abundante y en seguida coloque una glucocinta o reactivo de Fehling A y B caliente. Anote los resultados obtenidos e interprtelos.

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Respiracin Celular Para liberar la energa, la clula realiza la respiracin aerobia y la anaerobia o fermentacin. En la respiracin aerobia es necesario el oxgeno para efectuar la combustin de los azcares y liberar la energa, en la anaeroba la energa se libera sin la presencia de oxigeno. La energa obtenida en ambos tipos de respiracin se utiliza para obtener ATP y liberar CO2 y energa calorfica. 1. Se medir la rapidez de la respiracin anaerbica (levadura) utilizando un manmetro que le presentar el profesor. Experiencia N 1 Agregue 3 ml. de agua a uno de los dos tubos de ensayo del manmetro.

Ajuste el tapn de ensayo. Coloque una gota de aceite mineral en la bocqa de la parte horizontal. Mueva la gota de aceite mineral, que servir de indicador, hacia el codo de la parte horizontal. Cierre el tubo de escape con pinzas. A otro manmetro coloque un trozo de levadura disgragado. Agreguele unas 20 gotas de glucosa al 10%. Con rpidez ponga la gota de aceite mineral y ajuste el manmetro. Observe las gotas indicadoras en ambos tubos y anote las lecturas de los movimientos (medidos con regla), despus de un minuto de empezar por primera vez el movimiento de la gota de aceite. Tome la lectura cada minuto y siga anotando hasta que se detenga el movimiento.

Experiencia N 2 Coloque semillas de guisantes en uno de los tubos de ensayos del manmetro (ms o menos hasta la mitad). Coloque sobre la semilla un poco de algodn con un poco de carbonato de sodio. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Introduzca el tapn con el tubo doblado que tiene la gota indicadora cerca de la boca. Es necesario colocar la gota indicadora a cierta distancia de la boca para que se derrame al exterior. Sern necesarios 4 5 minutos para iniciar las lecturas. Tome las lecturas cada cinco minutos y reste las lecturas obtenidas en el control. Se observar la respiracin en animales y vegetales superiores. Experiencia N 3 Con una pipeta insufle aire en un tubo que contiene una solucin de hidrxido de sodio, que tiene como indicador rojo fenol. Obvserve a que se debe el cambio de coloracin. represente ste fenmeno. Experiencia N 4 Las semilklas poseen reservas de carbohidratos que en condiciones especiales de temperatura y hmedad son degradados. Anote la ecuacin que

Demostracin: El esquema que se presenta en la anexa describe un aparato para demostrar repiracin aerbica en vegetales. Coloque en el matraz semillas remojadas de porotos. Cierre y deje en reposo. Sople por el extremo de la manguera para remover el aire contenido en el frasco B y hacerlo burbujear en el tubo C. 1. La membrana como barrera selectiva. Lleve unas gotas de suspensin de levadura (Saccharomyces cerviasiae) a un portaobjetos y agregue una gota de azul de tripn al 0.1%. Cubra con un cubreobjetos y elimine el exceso de colorante con papel filtro. Observe el microscopio. Describa e interprete los resultados. 2. Repita el experimento anterior utilizando una suspensin de levadura previamente hervida por 1 2 minutos. Compar los resultados. Esquematice el experimento en su hoja de informe. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica

Dibujos pag. 41

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METABOLISMO CELULAR II LA FOTOSINTESIS Introduccin. Las reacciones de la clula que mantienen el nivel de ATP requerido para realizar actividades tales como el crecimiento motilidad, respuesta a cambios en el ambiente, etc, requieren de una incorporacin continua de substratos oxidables (fuentes de enrga) para funcionar. A menos que sean renovados constantemente, el nivel de estos substratos seran agotados rpidamente por la masa de organismos vivos de la tierra (hetertrofos). El suministro est asegurado por la fotosntesis, proceso en que las plantas y algunos microorganismos captan la energa de la luz solar aprovechndola para reducir el dixido de carbono (CCO 2) hasta unidades de carbohidrato (CH2O), es decir, se transforman en una fabrica de compuestos ricos en energa, por lo que, la fotosntesis se constituye en uno de los procesos qumicos ms importantes del mundo viviente. Las investigaciones sobre la fotosntesis se inicaron hace unos 300 aos, pero

an, hoy da existe etapas no conocidas totalmente. La informacin acumulada en esta larga etapa de investigacin es abrumadora, mencionaremos slo algunos de los conocimientos logrados: 1. A partir de precursores simples como CO 2, H2O (H2S) y sales minerales, los organismos fotosintetizadores son capaces de fabricar todas las sustancias complejas requeridas para estructurar un ser vivo. 2. En algas y plantas verde, los electrones requeridos para reducir el CO 2 provienen del agua, formando como producto terminal, oxgeno molecular (O2). 3. Las bacterias fotosintetizadores de color prpura, utilizan H 2S (en vez de H2O) para reducir el CO2, formando azufre como producto terminal. Guja de Iaboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica 4. La fuente ltima de energa es la luz solar, absorbida y convertida en energa qumica por medio de pigmentos que forman parte de compartimentos membranosos del citoplasma celular. 5. De la cantidad de luz que llega a la tierra, slo se absorbe el 0,1% para realizar la fotosintesis, con esta cantidad de energa atrapada se pueden fijar unas 1010 toneladas de materia orgnica por ao. 6. Las rutas bioqumicas de la fotosntesis difieren para distintos organismos fotosintetizadores. 7. El proceso de fotosintesis (estudiado principalmente en los cloroplastos), puede ser dividido en una etapa CLARA LUMINOSA realizada en las membranas cloroplasmticas y una etapa OSCURA de reduccin del CO 2 realizada en la fraccin soluble del cloroplasto. I CUANTIFICACION DE LA FOTOSINTESIS. Es posible cuantificar la intensidad o actividad del proceso fotosinttico si se considera la ecuacin qumica general involucrada:

nCO2 + 2n H2O

E radiante -------------- (CH2O)n + nO2(gas) + nH2O Clorofila

En este caso se observa la cantidad de O 2 (gas) desprendido. Para este enunciado tenga validez, se deben mantener constantes factores externos como la temperatura del sistema , la calidad y/o intensidad de la luz que llega a la planta, la concentracin de CO2 disponible. No debe olvidar que el sistema utilizado, evala la actividad de clulas vivas, con sus sistemas enzimticos como actores principales de la catlisis de reacciones qumico-biolgicas por lo que, se obtendrn respuestas lineales slo dentro de ciertos rangos de variacin de los factores externos mencionados. Cuando se estudia el efecto de un factor externo sobre el proceso fotosinttico, los otros factores deben mantenerse constantes, para ello, cada dos determinaciones remueve la solucin hecha en 1.1., preocpese que la temperatura del sistema no vare mayormente (a excepcin del exp. 4), finalmente ubique el foco de luz a una distancia de 30 cms. (a excepcin del exp. 1). Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica En el trabajo prctico se medir la actividad fotosinttica de una planta acutica: ELODEA.

OBJETIVOS. 1. Demostrar las actividades qumicas que ocurren cuando una planta realiza la fotosntesis. 2. Incentivar la habilidad de los alumnos para disear experimentos y el posterior anlisis crtico de los resultados obtenidos.

Experiencia N 1 1. Efecto de la intensidad Luminosa. Tcnica: 1.1 1.2 1.3 1.4 Mezcle la solucin de Hogland (25%) y el NaHCO 3 (0.5%) en una proporcin 1:1. Sumerja la planta en un tubo de ensayo. Efecte 3 determinaciones variando la intensidad de la fuente luminosa. Anote sus resultados

Experiencia N 2 2. Efecto de la calidad de la luz. En las estructuras celulares que realizan la fotosntesis, se encuentra ms de un pigmento (clorofila a, b, carotenoides, xantofilas) que absorven con mayor o menor eficiencia las distintas longitudes de onda de la luz visible. Con el objeto de evaluar su efecto sobre el proceso fotosinttico se montar el siguiente sitema experimental: Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica Tcnica: 2.1 2.2 2.3 Mezcle la solucin de Hoagland (25%) y el NaHCO 3 (0,5%) en una proporcin 1:1. Sumerja la planta en un tubo de ensayo. Haga observaciones del desprendimiento de O 2, manteniendo constantes restantes factores externos (concentracin de CO 2m temperatura, intensidad de la luz. Anote los resultados obtenidos. Envuelva el tubo de ensayo con papel celofn de color verde (luego amarillo, azul), repita el paso 2.4.

2.4

Experiencia N3 3. Efecto de la Concentracin de CO2. Tcnica: 3.1 Mezcle la solucin de Hoagland (25%) y el NaHCO3 (variable entre 0.0%, 0,25% y 0,5%) en una proporcin 1:1. (trabaje en duplicado) en tubos de ensayo de 20ml. Haga observaciones del desprendimiento de =2, manteniendo constantes los restantes factores externos (temperatura, calidad e intensidad de la luz. Anote los resultados obtenidos.

3.2

3.3

Experiencia N4

4.Efecto de la Temperatura. Los sistemas enzimticos funcionan ms o menos eficientemente dentro de los rangos de temperatura compatibles con la vida. En general, al bajar la temperatura, la actividad enzimtica disminuye. Al subir la temperatura, se alcanza un mximo de actividad que luego decae al perderse la funcin enzimtica; por lo tanto, la fotosintesis, donde participan enzimas, es un proceso que funciona con mayor o menor eficiencia dependiendo de la temperatura en que se encuentre el sistema. Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica

4.1 Mezcle la solucin de Hoagland (25%) y en NaHCO 3 (0.5%) en una proporcin 1:1. 4.2 Sumerja la planta en tubo de ensayo que contiene la solucin anterior. 4.3 Asegrese que la temperatura de la solucin 4.1 sea la correcta (10, 20, 30 y 40C). 4.4 Haga observaciones, trabaje en duplicado del desprendimiento de O 2, manteniendo constantes los restantes factores externo (concentracin de CO2, calidad e intensidad de la luz). 4.5 Anote sus resultados obtenidos. III ALGUNAS CONSIDERACIONES GENERALES. Para la realizacin de la parte experimental, el curso ser dividido en tres o cuatro, cada uno de los cuales ser responsable de realizar al menos uno de los experimentos descritos. Antes de comenzar el trabajo experimental, el grupo debe planificar su rea.izacin (por ejemplo, no debe olvidar la inclusin de un sistema (CONTROL O TESTIGO). Al finalizar, habr una reunin en la cual los grupos analizarn y comentarn los resultados obtenidos. Pregunte sus dudas respecto del tema tratado.

Gua de Laboratorio de biologa UTFSM - Area Qumica. A fines del siglo XIX el conocimiento sobre la fotosintesis era muy limitado. Se conocian bien las materias primas, los productos y la importancia de la luz, pero lo que sucedia dentro de la clula vegetal (representada aqu como una caja) que permita la fotosintesis, era un gran enigma.

Anexos

Recursos web : http://www-micro.msb.le.ac.uk/MBChB/bloodmap/Blood.html