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APLICAO DAS TCNICAS DE PCR E SUAS TCNICAS DERIVADAS EM DIAGNSTICO MOLECULAR

Cleyton Florencio de Camargo1 Paulo Roberto Queiroz da Silva2


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Qumico. Aluno da Ps-Graduao em Farmcia e Qumica Forense, pela Universidade Catlica de Gois/IFAR. 2 Bilogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Braslia UnB Professor do IFAR/PUC-GO. Endereo: IFAR Instituto de Estudos Farmacuticos. SHCGN 716 Bl B Lj 05 Brasilia DF CEP: 70770732. E-mail: pqsilva@uol.com.br

RESUMO Contexto: A prtica das aplicaes das tcnicas de PCR e suas tcnicas derivadas em diagnsticos moleculares tem se mostrado de grande efetividade, especialmente no diagnstico de doenas cujo diagnstico precoce crucial no sucesso do tratamento. Objetivo: Apresentar reviso da literatura quanto s principais tcnicas moleculares nos diagnsticos da doena de chagas, da tuberculose, da hepatite C, do cncer de mama e do HPV. Mtodo: Reviso da Literatura e discusso do material utilizado. Resultados: Apresentao das principais tcnicas moleculares derivadas do PCR. Concluso: as utilizaes das tcnicas carecem de uma padronizao. Palavras-chave: Cncer de mama, HPV, Hepatite C; Mycobacterium

ABSTRACT Background: The practical applications of PCR and its derived techniques in molecular diagnostics has proved highly effective, especially in diseases where early detection is crucial for a successful treatment. Objective: To review the literature on the basic molecular techniques in diagnosis of Chagas disease, tuberculosis, hepatitis C, breast cancer and HPV. Method: Literature Review and discussion ofmaterial. Results: Presentation of the main molecular techniques derived from the PCR. Conclusion: the uses of the techniques require a standardization. Keywords: Breast cancer, HPV, Hepatitis C, Mycobacterium

INTRODUO

Considerada uma tcnica de biologia molecular revolucionria, a reao em cadeia da polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction ) permitiu o rpido desenvolvimento do estudo de sequncias de cidos nuclicos (MOLINA et tal, 2004). Desenvolvida por Kary Banks Mullis (prmio Nobel de qumica de 1993 pelo desenvolvimento dessa tcnica) em abril de 1983, essa tcnica de biologia molecular consiste na sntese enzimtica de cpias de cidos nuclicos (COSTA, 2010). A tcnica de PCR promove, por meio de etapas de variao de temperatura, a duplicao de cadeias de DNA in vitro. A reao de amplificao de DNA por PCR envolve o emprego dos quatro nucleotdeos (dNTPs) do DNA, sequncias iniciadoras (primers) e uma DNA polimerase termoestvel. Assim, possvel a obteno de muitas cpias de uma sequncia especfica de cido nuclico, a partir de uma fita molde. O princpio da PCR envolve trs etapas bsicas de variao de temperatura por ciclo, ou seja: a) Desnaturao da fita molde de DNA - etapa com durao entre 30 s a 1 min a temperatura entre 92 C a 96 C; b) Pareamento de dois iniciadores sintticos de composies distintas, que funcionam como os iniciadores da reao de polimerizao, ligando-se regio complementar da fita de DNA alvo que sofrer a duplicao. Etapa com durao de 30 s a 1 min a temperatura entre 58 C e 65 C; c) Amplificao por meio da enzima Taq DNA polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando os quatro dNTPs como substrato da reao de polimerizao. Etapa com durao entre 45 s e 1 min a 72 C (COSTA, 2009). Cada ciclo repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificao da regio alvo determinada conforme o anelamento dos iniciadores sintticos de DNA. Ou seja, o iniciador reconhece, por complementaridade de bases, o local de incio da regio do DNA a ser amplificada e fornece uma extremidade 3-OH livre para a sntese da nova cadeia pela DNA polimerase. O grande problema inicial foi a desnaturao seguida da catlise pela enzima DNA polimerase que, obtida de Escherichia coli, no suportava a temperatura para abertura das fitas de cidos nuclicos, reduzindo a sua atividade a cada ciclo do processo. Assim, a cada ciclo, uma nova quantidade de enzima deveria ser adicionada (COSTA, 2010). Contudo, em 1988, Saiki e colaboradores substituram a polimerase de E. coli pela j conhecida Taq DNA polimerase, uma enzima obtida da bactria Thermus

aquaticus, encontrada em guas quentes de giseres e vulces submersos, e possui uma atividade tima de crescimento entre 70 C a 75 C. Assim, essa substituio promoveu maior independncia ao processo alm de aumentar a confiabilidade por reduo de riscos de contaminao (COSTA, 2010). Desde a introduo da tcnica de PCR, rpidos avanos nas tcnicas de gentica molecular tem revolucionado a prtica da patologia, anatomia e anlises clnicas. As tcnicas moleculares so agora aplicveis a todas as reas do laboratrio clnico. Na anatomia patolgica, apesar das anlises morfolgicas ainda serem a principal ferramenta de trabalho, resultados dos estudos de gentica molecular tm integrado, cada vez mais, os diagnsticos nas anlises cirrgicas (MOLINA; TOBO, 2004). Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi descrever o emprego da tcnica de PCR e suas derivadas no diagnstico molecular de doenas.

METODOLOGIA

Trata-se de uma reviso da literatura, sendo desenvolvida sob uma metodologia terica e conceitual, tendo como base livros especializados na rea, tais como, microbiologia, bioqumica, imunologia celular e molecular e biologia molecular, entre outros, bem como o acesso a artigos publicados em peridicos indexados e disponibilizados em bases de dados como, por exemplo, SciELO, PubMed, MEDLINE e Science Direct. Foram priorizados os artigos publicados ao longo dos ltimos dez anos. Entretanto, artigos com data de publicao anterior e que foram julgados relevantes para a pesquisa tambm foram considerados para a construo do manuscrito.

DESENVOLVIMENTO

DIAGNSTICO DO PROTOZORIO Trypanosoma cruzi

O diagnstico da doena de Chagas pode ser realizado por meio de diferentes estratgias, dependendo da fase em que a doena se encontra. No estgio inicial da infeco pelo Trypanosoma cruzi um grande nmero de parasitos circula na corrente

sangunea e o diagnstico pode ser obtido por meio de exame microscpico direto no sangue perifrico. Em contraste, na fase crnica os nveis de parasitas se encontram abaixo dos limites de deteco por microscopia e, assim, o diagnstico se baseia, sobretudo, na deteco da resposta sorolgica do hospedeiro ou na amplificao in vitro da populao de parasitos por meio dos mtodos de xenodiagnstico ou hemocultivo. Embora altamente especfico, o xenodiagnstico possui uma sensibilidade limitada, detectando o parasito em apenas 20% a 60% dos pacientes crnicos soropositivos, dependendo da rea endmica em estudo e, conseqentemente, gerando um nmero significativo de resultados falsonegativos (BRITO, 2005). A hemocultura no tem sido usada com freqncia no diagnstico, devido tambm a sua baixa positividade na fase crnica da infeco. Alm disso, ambos os ensaios de amplificao biolgica podem selecionar sub-populaes de parasitos, levando a uma distoro dos resultados de tipagem do agente etiolgico envolvido e dos dados epidemiolgicos gerados (MARCON, 2001). As limitaes na sensibilidade e especificidade dos testes laboratoriais parasitolgicos e sorolgicos, especialmente quando se trata do diagnstico de fase crnica, explicam o interesse e a necessidade de implantao de um mtodo direto e mais sensvel que permita monitorar a presena do parasito e confirmar a etiologia da doena. Neste sentido, a principal tcnica que tem sido testada para a pesquisa do parasita, T. cruzi, diretamente no sangue de pacientes crnicos o ensaio molecular por PCR, baseado no emprego de oligonucleotdeos sintticos que amplificam seqncias de DNA especficas de T. cruzi (MARCON, 2001). Os estudos de biologia molecular esto sendo empregados tanto em testes confirmatrios para doena de Chagas, bem como, para o acompanhamento do paciente chagsico crnico. So vrios os iniciadores registrados no GenBank que poderiam ser utilizados como base para as reaes de PCR (GILBER, 2007). Baseando-se na tcnica de PCR, feita a amplificao de fragmentos oriundos do DNA genmico de T. cruzi ou do DNA de minicrculos do cinetoplasto do parasito (kDNA). Este um procedimento a ser empregado em amostras de sangue de pacientes chagsicos e/ou fezes de triatomneos, ou em outros materiais biolgicos, detectando-se o DNA de um nico parasita ou fraes do mesmo, com ausncia de reaes cruzadas. Em estudos de monitoramento teraputico com testes peridicos e sistemticos dos indivduos, recomenda-se a utilizao de tcnica molecular associada sorologia (GILBER, 2007).

A reao de PCR constitui-se em um instrumento diagnstico valioso, notadamente no caso de doenas infecciosas graves, devido sua capacidade em detectar agentes infecciosos com maior sensibilidade e especificidade (BRAZ, 2006), sem necessidade de se encontrarem parasitas viveis na amostra biolgica. Para os recm-natos o diagnstico rpido essencial para a introduo precoce do tratamento antiparasitrio. Para os pacientes rejeitados pelo Banco de Sangue, tambm fundamental o diagnstico de certeza no intuito de diminuir a ansiedade nesses indivduos em se confirmar ou no a doena de Chagas, uma vez que, essas pessoas podem no apresentar quaisquer sintomas de doena (forma indeterminada). Os mtodos moleculares teriam uma maior rapidez e melhor sensibilidade em comparao com os testes considerados padro-ouro como os parasitolgicos (GILBER, 2007). Segundo a Fundao Osvaldo Cruz (FIOCRUZ), a reao de PCR pode ser considerada como tcnica padro-ouro para a deteco de parasitos circulantes na doena de Chagas e esforos tem sido concentrados para a realizao de um estudo multinacional de padronizao da tcnica, com o intuito de se estabelecer um protocolo consenso para ser empregado por todos os grupos que praticam o teste molecular na sua rotina diagnstica. Essa preocupao decorre da extrema variabilidade nos nveis de sensibilidade gerada pelos diferentes protocolos, variabilidade que depende no apenas das caractersticas epidemiolgicas das populaes estudadas, mas tambm do volume de sangue coletado, do mtodo para extrao de DNA, da escolha das seqncias de DNA-alvo e iniciadores, dos reagentes e condies de ciclagem trmica. No entanto, ainda no existe nenhum teste de PCR padronizado e para validar um ensaio de PCR como ferramenta molecular de diagnstico da infeco chagsica, a sensibilidade e especificidade do mtodo devem ser testadas com um elevado nmero de amostras procedentes de diferentes reas geogrficas, visto que a doena apresenta uma grande variedade de manifestaes clnicas, alm de diferentes nveis de parasitemia (FIOCRUZ). Conforme orientao do ultimo Consenso Brasileiro em Doena de Chagas, organizado pelo Ministrio da Sade, realizado em 2005, onde recomendava-se um estudo multicntrico para a validao da PCR como metodologia confirmatria, utilizando o mesmo protocolo experimental em distintos laboratrios, conforme recomendao da OMS.

DIAGNSTICO DE Mycobacterium tuberculosis

O Mycobacterium tuberculosis ou bacilo-de-koch, a bactria que provoca a maioria dos casos de tuberculose. Foi descrita pela primeira vez em 24 de maro de 1882 por Robert Koch, que subsequentemente recebeu o Prmio Nobel de Fisiologia/Medicina por esta descoberta em 1905. Ela uma micobactria BAAR (bactria lcool cido resistente), parasita intracelular (wikipedia). Segundo o Programa Nacional de Controle da Tuberculose, organizado pelo Ministrio da Sade em 2004, a Organizao Mundial da Sade (OMS) declarou a tuberculose em estado de emergncia no mundo, onde ainda a maior causa de morte por doena infecciosa em adultos. Segundo estimativas da OMS, dois bilhes de pessoas correspondendo a um tero da populao mundial est infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Destes, 8 milhes desenvolvero a doena e 2 milhes morrero a cada ano. No diagnostico a microscopia direta aps colorao de Ziehl-Neelsen em busca de bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) um mtodo rpido e barato. No entanto, tem baixas sensibilidade e especificidade. So necessrios, no mnimo, 5.000 bacilos para que o teste seja positivo. Apesar de ser o padro para a confirmao diagnstica da tuberculose, a cultura requer mais de trs semanas para um diagnstico definitivo, pela prpria caracterstica de replicao do M. tuberculosis podendo, ainda, no informar qual membro do complexo M. tuberculosis foi o causador da doena, o que pode confundir o diagnstico e a epidemiologia (BOLLELA; SATO; FONSECA, 1999, KONEMAN et al, 2000; YZQUIERDO et al, 2007). Avanos no campo da biologia molecular tm gerado novas tcnicas para o diagnstico de infeces por meio da deteco de sequncias nucleotdicas especficas dos microrganismos. Tcnicas de amplificao de cidos nuclicos atraram interesse considervel desde que ofereceram a oportunidade de encurtar o tempo requerido para detectar e identificar organismos do complexo M. tuberculosis em amostra respiratria e extrapulmonar. Porm, a maioria dos laboratrios que usam estas tecnologias desenvolveram os prprios testes com uma grande variedade de iniciadores, sondas, extrao de DNA, reaes de amplificao e tcnicas de deteco. Isto conduziu a uma inesperada variao de sensibilidade e especificidade. Para superar estas dificuldades, a tcnica de PCR tem sido introduzida e testada. A aplicao clnica de deteco e amplificao de sequncias nucleotdicas especficas do M. tuberculosis para diagnstico

de rotina importante e precisa ser discutida quanto s formas de padronizao (MACENTE, 2009). A tcnica de PCR possibilita uma nova estratgia na anlise dos genes, dispensando todas as trabalhosas etapas de clonagem gnica. Ainda, h a possibilidade de adaptaes da tcnica de PCR a fim de melhorar a especificidade e a eficincia da reao. Muitas micobactrias no-tuberculosas so de importncia mdica, pois ocorrem mais frequentemente em pases desenvolvidos, nos quais a incidncia de tuberculose baixa. A deteco e diferenciao rpida de infeces causadas por micobactrias no-tuberculosas de micobactrias tuberculosas mostra-se uma estratgia precoce para o tratamento, haja vista que muitas micobactrias no-tuberculosas so resistentes aos antibiticos usados para tuberculose (MACENTE, 2009). Pela sua alta sensibilidade e por utilizar iniciadores que so especficos para micobactrias do complexo tuberculosis, a reao de PCR capaz de, em poucas horas, determinar a presena do patgeno na amostra e ajudar na deciso da melhor teraputica para o caso. Em condies extremas, esta tcnica pode ser refinada para torn-la capaz de determinar no s a presena, mas tambm as estirpes resistentes aos tuberculostticos disponveis para o tratamento da tuberculose, alm de estudos de epidemiologia molecular e tipagem de estirpes em cultura; ou seja, esta tcnica pode ser utilizada como alternativa para os mtodos tradicionais de deteco do patgeno. Pelo descrito, a escolha do DNA alvo e a definio dos iniciadores dentro da sequncia do DNA so fatores determinantes para sua acuidade. A escolha dos diversos iniciadores utilizados na PCR para a identificao do M. tuberculosis tem apresentado resultados variveis, principalmente em relao sensibilidade do teste. Por esta razo, vrios autores pesquisaram a utilizao e avaliao de diferentes iniciadores no teste. Os iniciadores mais estudados so o IS6110, GroEL (65 kDa), PhoS, CIE Ag78 ou Pab (38 kDa) e MPB64 (23 kDa) (MACENTE, 2009). Entre os iniciadores estudados, o IS6110 (Tb 294: 5 -GGA CAA CGC CGA ATT GCG AAG GGC-3 e Tb 850: 5-TAG GCG TCG GTG ACA AAG GCC ACG-3, e/ou Tb 505: 5 -ACG ACC ACA TCA ACC-3 e Tb 670: 5-AGT TTG GTC ATC AGC C-3 ) (WILSON et al., 1993) o mais usado por ser uma sequncia repetitiva no genoma do M. tuberculosis (de 1 a 20 cpias por clula) enquanto as outras sequncias esto sempre em um nico local no material gentico da micobactria. A existncia da sequncia repetitiva IS6110 no genoma prev uma alta sensibilidade e especificidade na prova de PCR, pois

quando mltiplas cpias de DNA alvo esto presentes, a sensibilidade de deteco de M. tuberculosis aumentar em proporo ao nmero de cpias. Isto uma grande vantagem em amostras clnicas com pequeno nmero de micobactrias, como pode acontecer em determinados casos de tuberculose (MACENTE, 2009). O segundo iniciador de opo o fragmento genmico MPB64, que foi demonstrado ser altamente especfico para M. tuberculosis. Comparativamente ao IS6110, gerou menos resultados falso-positivos, porm com a necessidade de realizar adaptaes na reao de PCR. Alm disso, a qualidade da amostra pode influenciar diretamente na positividade da PCR. Quanto mais representativa for a amostra, melhor ser o rendimento da deteco molecular. Quando ocorre uma baixa sensibilidade da PCR, esta pode ser justificada pela introduo de substncias inibidoras durante o procedimento de extrao (ASSIS et al, 2007). Para evitar esta inibio, alguns autores defendem a lavagem exaustiva do DNA obtido para eliminao de substncias inibidoras da enzima Taq DNA polimerase (MACENTE, 2009). Quando comparado o custo-benefcio da PCR em relao s tcnicas padro utilizadas hoje no diagnstico da tuberculose, observa-se que o tempo necessrio para a realizao da PCR , em mdia, um dia, enquanto as tcnicas normalmente utilizadas variam entre 4 a 8 semanas reduzindo, assim, o tempo para o diagnstico final. Considerando apenas os reagentes usados em ambos os mtodos de identificao, a PCR 50% mais barata do que a identificao bioqumica. Alm disso, uma nica pessoa pode executar a tcnica de PCR. A identificao bioqumica usualmente envolve diferentes pessoas para esterilizao, preparao dos meios e manejo das culturas. A manipulao de bactrias mnima com PCR, pois no h necessidade de cultivo e crescimento de microrganismos, proporcionando otimizao da segurana no laboratrio (SILVA et al, 2001).

DIAGNSTICO DA HEPATITE C

O VHC (vrus da hepatite C) transmitido pelo contato com sangue contaminado. Essa patologia ocorre na maioria das pessoas que adquirem o vrus e, dependendo da intensidade e tempo de durao, pode levar a cirrose e cncer do fgado. Ao contrrio dos demais vrus que causam hepatite, o vrus da hepatite C no gera uma resposta

imunolgica adequada no organismo, o que faz com que a infeco aguda seja menos sintomtica. Alm disso, a maioria das pessoas que se infectam se tornam portadores de hepatite crnica, tendo consequncias a longo prazo. O VHC circula no sangue em baixa concentrao. A deteco de anticorpos contra antgenos especficos do VHC a maneira mais freqentemente empregada para identificar a infeco, presente ou passada. Para isso, so utilizados testes de rastreamento, que apresentam alta sensibilidade e testes suplementares, tambm denominados confirmatrios, com maior especificidade. Os testes comercializados para deteco do anti-VHC baseiam-se nos testes de ELISA, que apresenta vantagens, tais como, rapidez no processamento, facilidade de automao, alta confiabilidade e custo relativamente baixo. As trs geraes de ELISA desenvolvidas at o momento utilizam protenas recombinantes ou peptdeos sintticos para a captao do antiVHC (BRANDO et al, 2001). No entanto, em pacientes com hepatite crnica que so negativos para a presena de anti-VHC (como os pacientes em hemodilise ou submetidos a transplante de rgos), ou em pacientes anti-VHC positivos e com aminotransferases normais, por exemplo, necessrio utilizar o teste de PCR qualitativo. Nestes ltimos, os resultados do teste podem indicar duas possibilidades: infeco curada (RNA do VHC negativos) ou em atividade (RNA do VHC positivos), a despeito da normalidade das enzimas. O padro-ouro para o diagnstico de infeco pelo VHC a determinao do RNA do VHC por meio da PCR. O mtodo utiliza oligonucleotdios de DNA ou RNA com estrutura complementar a uma seqncia do cido nuclico a ser detectado. Os testes qualitativos informam a presena ou no do RNA viral (resultado positivo ou negativo). Um teste sensvel para a identificao do RNA do VHC a reao em cadeia de polimerase com a enzima transcriptase reversa (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), que catalisa a sntese do DNA complementar (cDNA) a partir da regio 5'RNC do RNA viral. A seguir, a PCR utilizada para amplificar o cDNA, produzindo quantidades suficientes para serem detectadas em gel de agarose. O limite terico de deteco, por PCR, em condies timas, de aproximadamente 1000 cpias do genoma/mL, mas existem variaes da tcnica, e uma das mais sensveis capaz de detectar at 100 cpias do genoma/mL de soro (BRANDO et al, 2001). Os mtodos que adotam tcnica de biologia molecular para genotipagem, utilizando pores do genoma, incluem a PCR aninhada (Nested PCR), a tcnica de RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphism), a hibridao reversa (INNO-LiPA, Innogenetics, Blgica; Gen.Eti DEIA HCV, Sorin Biomedica, Itlia) e o sequenciamento direto da regio no codificante 5' (TruGene, Visible Genetics, Canad) (BRANDO et al, 2001). Suas principais vantagens so a informao direta a respeito de seqncia de nucleotdeos do genoma viral, a alta sensibilidade, por se basearem na PCR, e a possibilidade de identificar o subtipo viral. Os mtodos para determinao do gentipo que utilizam sorotipagem baseiam-se na deteco de anticorpos gentipo-especficos contra epitopos do VHC (por exemplo, protenas da regio do cerne). Os testes comercializados utilizam diferentes tcnicas, tais como, ELISA competitivos ou immunoblot (Murex-HC16, Murex Diagnostics Ltd, Reino Unido; RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics, Estados Unidos) (BRANDO et al, 2001). As principais vantagens da tcnica de sorotipagem so o baixo custo e a maior facilidade de realizao, em comparao com os testes de biologia molecular.

DIAGNSTICO DO CNCER DE MAMA

O papel da predisposio hereditria a cnceres em geral veio para ocupar um lugar importante aos olhos do pblico. Ele j largamente discutido pelos meios de comunicao popular e cada vez mais mulheres preocupadas com a sua histria familiar de cncer de mama esto procurando ajuda mdica. Poucos centros tm suficiente experincia nessa rea para provar a validade de qualquer protocolo em particular, mas os eventos esto acontecendo to rapidamente na rea da gentica molecular que novas abordagens de manejo devem surgir (KAREN et al, 2001). A avaliao para cncer gentico um procedimento demorado e complexo que requer experincia para sua aplicao, interpretao e planejamento estratgico de acompanhamento. Existem estimativas de risco emprico para cncer de mama, por meio de tabelas desenvolvidas pelo Cancer and Steroid Hormone Study (CASH), com modelos genticos para derivar o risco estimado de cncer para cada idade em mulheres com, no mnimo, um parente com a doena (KAREN et al, 2001).

Nas ltimas dcadas, tem ocorrido um aumento significativo da incidncia e mortalidade de pessoas com cncer de mama no mundo. Dentre os fatores de risco identificados, ressalta-se a predisposio gentica, alm do estilo de vida e meio ambiente. Neste contexto, os principais genes associados com cncer de mama so BRCA1 e BRCA2. Mulheres que possuem mutaes no gene BRCA1 tm 80% de chance de desenvolver cncer de mama e 60% para cncer de ovrio. Foram identificadas trs mutaes especficas mais relevantes para auxiliar o prognstico para cncer de mama: as mutaes 185delAG e 5382insC, no gene BRCA1 e a mutao 6174delT, no gene BRCA2 . O gene BRCA1 localiza-se no cromossomo 17 (17q21) e composto por 24 xons e o gene BRCA2 localiza-se no cromossomo 13 (13q12) e possui 27 xons. Estes genes pertencem a uma classe conhecida como supressores de tumor que, em clulas normais, ajudam a impedir o seu crescimento descontrolado (BERNARDI, 2008). Para fazer um levantamento das principais ferramentas laboratoriais usadas para identificao das trs principais mutaes nos genes BRCA1 e BRCA2 so coletados 10 mL de sangue total em tubo contendo EDTA. O DNA extrado das clulas brancas e regies especficas dos genes BRCA1 e BRCA2 so amplificados por PCR. Estes amplicons so sequenciados para a identificao das mutaes descritas acima (KAREN et al, 2001). Outras tcnicas especficas para deteco de variaes no DNA realizadas em laboratrios devem incluir mtodos para deteco de mutaes, tais como,

oligonucleotdeo alelo-especfico (ASO), protena truncada (PTT), eletroforese em gel com gradiente de desnaturao (DGGE), polimorfismo unifilamentar conformacional (SSCP), seqenciamento completo de DNA, anlise por Southern blot, Anlise Heteroduplex (HA), ou uma combinao dessas e/ou outras tcnicas (KAREN et al., 2001). Existem problemas tcnicos em relao ao teste gentico. A correta avaliao s possvel caso uma mutao seja identificada dentro de uma dada famlia. BRCA1 e BRCA2 so genes grandes e o rastreamento de mutaes usando a tecnologia atual lento e caro, com aproximadamente 20% das mutaes sendo perdidas (KAREN et al, 2001). Para a interpretao dos resultados necessrio analisar as trs principais mutaes que ocorreram em locais especficos do gene. Como so mutaes dominantes, pessoas que possuam pelo menos uma cpia do gene com mutao apresentam um risco

elevado de desenvolver cncer de mama, alm de poder transmitir a mutao para os seus descendentes (KAREN et al, 2001).

DIAGNSTICO DO PAPILOMAVRUS HUMANO HPV

O HPV um vrus com mais de 200 tipos diferentes, sendo que 40 tipos podem infectar o trato genital (SOUZA, 2009). Muitas vezes no causa sintomas, mas pode ser transmitido devido presena na pele e mucosas. O vrus pode permanecer em estado latente em uma pessoa por anos a dcadas. Estes tipos virais so comumente classificados de acordo com o tipo de leso celular que promovem, portanto, podendo ser denominados de: a) Alto risco (possuem alta correlao com as leses intra-epiteliais de alto grau e carcinomas do colo uterino, da vulva, do nus e do pnis mais raro). So representados pelos subtipos 16, 18, 31, 33 e 35. Contudo, as estirpes 16 e 18 so as responsveis por 70% a 75% dos casos de cancro do colo do tero; b) Baixo risco (esto associados s infeces benignas do trato genital, como condiloma acuminado ou plano e leses intra-epiteliais de baixo grau). So os subtipos 6, 11, 42, 43 e 44. Por sua vez, as estirpes 6 e 11 so as mais comuns (MONTE et al, 2010); O diagnstico da infeco por HPV leva em conta os dados da histria, exame fsico e exames complementares como, por exemplo, pela pesquisa direta do vrus ou, indiretamente, por meio de alteraes provocadas pela infeco nas clulas e nos tecidos (ROSENBLATT, 2009). O estudo da histria natural da infeco pelo HPV pode ser avaliado visualmente (colposcopia e tcnicas relacionadas), microscopicamente (citologia e histologia) e por via molecular (testes de deteco do DNA do HPV). H trs fases necessrias na carcinognese cervical que podem ser distintas, estudadas e usadas em programas de preveno, que incluem infeco pelo HPV, progresso da infeco ao estgio de pr-cncer e invaso (PEREIRA, 2006). O mtodo mais simples para deteco do HPV a observao das verrugas genitais a olho nu, mas como a maioria das infeces subclnica, lana-se mo de

mtodos de diagnstico complementares, como a colpocitologia, a colposcopia, bipsia dirigida e os mtodos de biologia molecular. Estudos mostram que a infeco pelo HPV melhor estudada em nvel molecular, pois a maior parte das infeces no so evidentes clinicamente nem microscopicamente. A sorologia para HPV no sensvel, mostrando-se negativa em muitas mulheres infectadas, mas a sorologia especfica, ou seja, o resultado negativo em mulheres no infectadas (PEREIRA, 2006). Os mtodos atualmente disponveis em biologia molecular para HPV so a captura hbrida e o PCR. Estes mtodos so indicados para pacientes com leses colposcpicas incomuns, citologia crvico-vaginal sugestiva de ASCUS (Clulas Escamosas Atpicas de Significado Indeterminado) (BARCELOS, 2008) e AGUS (Clulas Glandulares Atpicas de Significado Indeterminado) (BARCELOS, 2008), leses de baixo grau de colo, vagina e vulva diagnosticadas pela citologia e/ou histopatologia, discordncia cito-histopatolgica, controle de cura teraputica (PEREIRA, 2006). O princpio das tcnicas de hibridao (captura hbrida) baseado na propriedade que os cidos nuclicos tm de parear suas fitas complementares por meio das ligaes de hidrognio entre as bases nitrogenadas. De um modo geral, as reaes se fundamentam na tendncia das cadeias de DNA de se associarem (anelamento), formando uma dupla hlice e se separarem (desnaturao) mediante alta temperatura ou tratamento com lcalis. No processo de hibridao, o DNA das sondas (um pequeno fragmento de DNA do microrganismo que se deseja pesquisar), e o DNA alvo so desnaturados e o anelamento feito entre as fitas simples da sonda e do DNA teste, resultando um hbrido (PEREIRA, 2006). A reao da polimerase em cadeia apesar de comercialmente ser menos utilizada que a tcnica de captura hbrida, pois a primeira tem a vantagem da automatizao, tem melhor sensibilidade e especificidade, sendo de rotina nos laboratrios de pesquisa e em alguns laboratrios de patologia. Alm disso, pode ser usada na tipagem dos HPVs. O material amplificado pode ser detectado por eletroforese em gel de agarose, nos quais os produtos amplificados so visualizados de acordo com a sua massa molecular ou, por hibridao, para revelao a presena do DNA viral (PEREIRA, 2006).

CONSIDERAES FINAIS

A reao em cadeia de polimerase (PCR) aumentou a acurcia diagnstica, mas as tcnicas ainda no foram padronizadas e os resultados variam entre os laboratrios (que dados de laboratrios diferentes vc teve acesso para afirmar isto?). Tambm tornou-se possvel determinar o gentipo do patgeno por mtodo de diagnstico molecular em laboratrios clnicos, o que pode ser til em situaes especficas. A disponibilidade de diferentes testes viabiliza o diagnstico precoce, minimizando o potencial para disseminao da infeco e torna relevante a discusso das indicaes de cada teste a partir de sua sensibilidade e especificidade. H quase vinte anos aps os primeiros relatos do emprego da PCR para o diagnstico molecular terem sido publicados, tais testes ainda no foram disponibilizados comercialmente e no so usados alm do ambiente de pesquisa. Alm do custo, pode ser citada a necessidade de sua execuo em laboratrios com elevada tecnologia e com espao exclusivo para a sua realizao, como os principais fatores limitantes no que diz respeito ao emprego do teste de PCR em situao ambulatorial ou hospitalar, ou mesmo na rotina dos bancos de sangue. Como os protocolos no so padronizados, os resultados variam entre os laboratrios. Diante desta situao, existe a necessidade de padronizao das tcnicas de PCR em diagnsticos por meio de mais estudos de como devem ser os padres-ouro, para depois ocorrer uma padronizao nas tcnicas que culminem, inclusive, na sua reduo de custo, tornando-a disponvel nos ambientes clnicos e hospitalares.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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