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PCR: Princpios e tipos de reao Breve Histrico

Desenvolvida por Saiki, et al. (1985) e principalmente por Mullis, et al. (1987). Kary Mullis, que percebeu que possua uma importante ferramenta em mos, tentou publicar seus experimentos nas duas revistas cientficas mais Importantes do mundo, a Science, americana, que prontamente lhe negou a publicao, e a Nature, britnica, que procedeu da mesma forma. Mullis, designado, conseguiu publicar ento seu artigo sobre amplificao do gene da -globina humana na Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor. Apesar dos fracassos iniciais, a Perkin-Elmer Cetus, uma reconhecida empresa de insumos para pesquisa comprou-lhe a patente, o que lhe rendeu bons lucros, no antes de ser agraciado com o prmio Nobel de Qumica em 1993. Hoje a Perkin-Elmer repassou os direitos Roche Molecular Systems (valor da compra: US$ 300.000.000,00), que possui todas as patentes envolvidas no processo de PCR, inclusive as relacionadas aos termocicladores convencionais.Porm, a tecnologia tornou-se to difundida que o custo de pagamento da patente tornou-se acessvel s suas concorrentes, e a variedade de reagentes e aparelhos atualmente no mercado grande.

Figura 1: Kary Mullis, inventor da PCR, Em foto de 1994 (Nobel Academy) 1

Na verdade, Saiki j havia descrito a tcnica, mas Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cpia de apenas segmentos especficos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na utilizao de uma DNA polimerase termoestvel. At ento, a precursora da PCR demandava grandes quantidades de enzima, adicionadas a cada ciclo de amplificao. Alm disso, desenvolveu-se vrios equipamentos para a automatizao da adio da enzima aps cada ciclo, todos de custo elevadssimo (os primeiros termocicladores). Mullis utilizou a ento recm descrita Taq, DNA polimerase termoestvel isolada da bactria de fontes termais Thermus aquaticus. Esta enzima se mantm estvel em temperaturas de at 117C, com temperatura tima de 72C. Estes dois passos tornaram a tcnica muito mais fcil de se realizar. Porm, a realizao manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de tubos em vrios banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constitua um fator dificultante do processo. Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automtico. At hoje, a maioria dos termocicladores automticos funciona com o mesmo princpio: aquecimento por resistncias eltricas e refrigerao com ventoinhas e tubulaes em serpentina preenchidas por etileno glicol. Aperfeioou-se os sistemas de contagem de tempo, para aumentar a confiabilidade das reaes. Em meados dos anos 90 surge o padro Peltier, cujo bloco de aquecimento composto por uma liga metlica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada.

Figura 2: Termociclador atual. Observa-se a presena do bloco de ensaio. A repercusso da inveno da PCR foi to grande, que o mdico Michael Crichton, escritor de Parque dos Dinossauros, afirmou que teve a idia de escrever este roteiro ao ler a descrio da tcnica, fato que refora a idia da versatilidade do processo. Ainda sobre a repercusso da tcnica, hoje existem grandes empresas e grupos de pesquisa tentando descobrir alternativas PCR, sem grande expresso devido ao sucesso da criao do qumico norte-americano Kary Mullis.

Fundamentos e Objetivos
Multiplicar um trecho especfico do DNA (gene ou parte dele, regies supervariveis, Junk DNA, etc.) utilizando desoxinucleotdeos como monmeros at um ponto em que sua concentrao em dada soluo seja to alta que possa ser facilmente detectvel por mtodos simples e clssicos de separao e identificao de substncias. Portanto, Kary Mullis na verdade props uma tcnica que consegue resolver um grande problema da anlise de cidos nuclicos: sua baixa quantidade na maioria dos tecidos vivos. A multiplicao destes trechos especficos se d alternando-se a temperatura de ensaio entre: a) Denaturao das cadeias do DNA genmico; b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a sequncia a ser amplificada; c) temperatura tima especfica da enzima: 72C; d) reincio do ciclo.

Fig. 3: Esquema dos processos realizados numa reao de PCR. Aps a denaturao das fitasmolde, ocorre o pareamento dos primers. A enzima, representada em verde, adiciona os desoxinucleotdeos complementarmente s fitas-me.

Figura 4: Passos finais de uma reao de PCR. A figura mostra as duas fitas-me, pareadas com as suas fitas-filha complementares, sintetizadas a partir da adio dos desoxinucleotdeos pela DNA polimerase.

A quantidade de DNA final segue uma funo exponencial, onde:

N = N0 . 2 n
N = Nmero final de cadeias de DNA N0 = Nmero inicial de DNA molde (template) n = Nmero de repeties do ciclo

Portanto, a concentrao final do DNA molde na soluo muito maior (da ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificao.

Reagentes Necessrios para a Reao


A reao SEMPRE parte de um DNA molde, extrado convenientemente da amostra, ou de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar). O ideal que o cido nuclico esteja livre de impurezas (protenas, lipdeos, outro cido nuclico, reagentes de extrao, etc.) e numa concentrao mnima de 5g/mL, apesar de quantidades bem menores o derem ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a utilizar quantidades de at 10-12 mol de DNA). A DNA polimerase: A mais utilizada ainda a Taq, numa concentrao que varia de 1 a 4U por microlitro de soluo. Normalmente, a maioria das DNA polimerases disponveis no mercado so fornecidas conjuntamente com uma soluo-tampo especfica, cuja composio varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas solues contm ons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condies de reao. Alguns tampes contm ainda detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formao de dmeros das cadeias enzimticas, protenas estabilizantes (BSA = Bovine Serum Albumin = Albumina Srica Bovina) e algumas substncias que agem na denaturao da cadeia molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, -mercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrognio entre as bases. Um reagente de importncia crtica o MgCl2 , doador muito estvel de ons Mg2+, que so cofatores indispensveis para atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam outros ons metlicos como cofatores. Um desses casos, e talvez o mais interessante a enzima Tth (Thermus thermophillus) Polimerase. Esta enzima possui atividade DNA polimersica em presena de ons Mg2=; porm, na presena de Mn2+ esta mesma enzima apresenta atividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir de uma cadeia de RNA.

Os desoxinucleotdeos so a matria-prima propriamente dita para a sntese as fitas-filhas. So compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP) esoxilados no carbono 5 da desoxirribose. So adicionados pela polimerase complementarmente fita-me. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTPs em concentraes iguais reao. Os dNTPs so ligados fita-me pela polimerase numa rea delimitada pelos primers, que so pequenas sequncias de DNA (12 a 35 bases) complementares s bordas.

Tipos de reao de PCR mais comuns


RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): Esta reao composta de 2 partes: a transcrio reversa e a amplificao propriamente dita. Seu principal diferencial que na verdade esta reao no parte de um molde de DNA diretamente extrado da amostra; a amostra fornece o RNA, que convertido em cDNA (DNA complementar). Ferramenta til em estudos de expresso gnica, pois avaliando o mRNA, podemos detectar quais protenas esto sendo efetivamente expressas. No entanto, o estudo direto do RNA (principalmente o mRNA) invivel, devido sua alta sensibilidade a vrios fatores e a altas temperaturas. O primeiro passo da reao consiste na sntese de uma fita de DNA utilizando como template uma fita de RNA numa reao catalisada por uma transcriptase reversa. Usualmente, so utilizadas duas enzimas desta classe, extradas de vrus: a AMV (Avian Mieloblastosis Vrus) e a M-MuLV (Moloney Murine Laeukemia Vrus). Alm disso, tambm so utilizados primers, mas inespecficos e nunca em pares. So oligonucleotdeos compostos por vrias timinas consecutivas (6 a 35), que so anelados s regies Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Aps este ciclo, obtm-se o cDNA que ser utilizado na PCR. importante ressaltar que o round de transcrio reversa no altera o nmero de fitas de RNA ou DNA. Multiplex PCR: Mais de um segmento genmico amplificado numa nica reao, cada um com seu par de primers especfico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigao de paternidade, onde vrios marcadores genmicos devem ser analisados. Tambm til para a introduo de um controle de reao (a ser discutido posteriormente). Nested PCR: Para melhorar a especificidade e a eficincia da reao, o segmento genmico amplificado primeiro de forma abrangente, copiando at mesmo sequncias localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificao da real sequncia-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reaes separadamente, caracterizando o SemiNested PCR.

Figura 5: Esquema de uma reao de Nested PCR. O produto da amplificao do 1 Round utilizado com template no 2 round. No final das duas etapas, obtm-se um produto menor que o da primeira amplificao. Este tipo de reao tem como vantagem o ganho em especificidade e eficincia, uma vez que o DNA-molde do 2 round est em concentraes altssimas, e os primers da segunda etapa tm menos chances de anelamento em sequncias inespecficas, dada a reduo do tamanho do molde. PCR Competitiva: Alm do DNA molde, adicionado reao um outro trecho de DNA, de sequncia, tamanho e concentrao conhecidos (controle), cujas extremidades so complementares tambm aos primers que iro amplificar a sequncia-alvo. O resultado a amplificao de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. Esta ltima, levando-se em conta a quantidade inicial e dados sobre a eficcia da reao serve de padro para a quantificao do DNA-alvo. Em resumo, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as condies da reao, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. Esta tcnica utilizada principalmente em kits diagnsticos (Carga Viral de HIV).

Identificao dos produtos das reaes


Eletroforese: Os ensaios de eletroforese se valem do princpio que determina que a carga global de uma fita de DNA negativa. Portanto, uma soluo que possua ons livres (eletroltica) e que tenha molculas de DNA em suspenso pode ser purificada aplicandose uma dada voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estaro prximas ao catodo (positivo), atraente de molculas de carga negativa. No entanto, o foco da tcnica separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reao gera
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fragmentos de mesma extenso. A soluo peneirar o resultado da PCR por peneiras moleculares. As cadeias so empurradas atravs da peneira pela corrente eltrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas sero retidas ou liberadas. Na verdade, nos valemos do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da peneira, e cadeias menores viajam mais rapidamente atravs dela. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. So os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que so misturas de trechos de DNA com tamanhos variveis, normalmente equidistantes entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na prtica que ele mostrar vrias bandas, cada uma maior 50 pares de base do que a anterior (50bp, 100bp, 150bp, 200bp, 250bp...). Existem dois modelos bsicos de eletroforese: Baseada em gis de agarose ou em gis de poliacrilamida. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada. Em qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida).Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA) Quanto aplicao das amostras no gel, importante ressaltar que antes disso elas so misturadas a uma outra (Tampo de amostra), que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Alm disso, o tampo de amostra possui um corante, que possibilita a visualizao do andamento da corrida. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampo de corrida apropriado para cada reao. Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nvel de dificuldade de realizao, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho, e no quanto sequncia. Agarose: Polissacardeo em forma de p. Quando suspenso em soluo aquosa e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se agarosamente conforme a temperatura cai. Enquanto est em forma lquida, colocado num molde que lhe dar o formato de um bloco quando resfriar. Enquanto isso so feitos pequenos furos (poos) em uma das suas extremidades, perpendicularmente ao seu comprimento com o uso de um pente; so os poos que recebero o produto da PCR.

Figura 6: Montagem de gel de agarose. A agarose fundida despejada nesta cuba de montagem, onde deixada at a polimerizao. Na foto pode-se ver o pente, utilizado para a formao dos poos. Aps o trmino da polimerizao, o pente retirado e em seu ligar ficam espaos cujo volume pode variar de 10 a 150L, dependendo do volume de agarose e do sistema de montagem. Aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200 V, e corrente de 50 a 3000mA. So utilizadas concentraes de 0,5 a 3% de agarose no gel. Quanto maior a concentrao, maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos prximos, fator denominado DEFINIO. Por exemplo, um gel de agarose a 1% pode separar fragmentos com uma diferena de tamanho de 80 pares de bases, enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com diferena de no mnimo 30 pares de bases. A visualizao dos produtos no gel aps a corrida se d pela reao de ligao do DNA com Brometo de Etdio. Este composto tem a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescncia quando excitado com radiao ultravioleta. Pode-se adicionar o EtBr (10g/mL) no gel liquefeito antes da corrida ou levar o bloco a uma soluo de EtBr com a mesma concentrao e deixar descansar por alguns minutos.

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Figura 7: Gel de agarose montado em cuba de eletroforese e sendo submetido uma voltagem de 69V.

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Figura 8: Gel de agarose corado com Brometo de Etdio e visualizado num ransluminador, aparelho que emite raios UV. As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes. A seta mostra a corrida do padro de peso molecular.

Poliacrilamida: Polimeriza-se a partir da reao da acrilamida (C3H5NO) com a BisAcrilamida (N,N- Metileno-bis-acrilamida) em presena de perssulfato de amnio e catalisada por TEMED (N,N,N,N-Tetrametiletilenodiamino). A mistura, dissolvida no tampo de corrida desejado, posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Tambm posto um pente para a formao de poos.

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Figura 9: Gel de poliacrilamida em polimerizao. Pode-se visualizar o pente ainda inserido no sistema. Aps a polimerizao, os procedimentos so os mesmos em relao a um gel de agarose: Cobertura pelo tampo de corrida na cuba de eletroforese, aplicao das amostras e do ladder, aplicao da corrente eltrica.

Figura 10: Gel de poliacrilamida montado em cuba de eletroforese e sendo submetido uma voltagem de 69V.

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Normalmente, utiliza-se gis com concentraes de 4 a 25% de acrilamida. A poliacrilamida apresenta definio muito maior do que a agarose: um gel de 10% pode em certas condies separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por apenas um par de bases. A identificao dos produtos pode ser feita pela colorao com EtBr, porm o mtodo mais utilizado a impregnao do DNA contido no gel por nitrato de prata. Logo aps a corrida e gel fixado com uma soluo de etanol e cido actico, para impedir a eluio (forma borres no gel) das amostras. Em seguida, colocado por alguns minutos numa soluo de nitrato de prata. Este composto escurece quando oxidado, o que feito passando o gel para uma soluo contendo hidrxido de sdio e formaldedo. A colorao por prata de bem mais fcil visualizao do que a oferecida pelo EtBr, alm de ser mais segura, levandose em conta o fato de que este altamente carcinognico.

Figura 11: Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido alta sensibilidade do mtodo de colorao, observa-se bandas inespecficas e DNA no amplificado no p da foto. A seta indica a corrida do Ladder.

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Caractersticas das Reaes e Padronizao


O advento da PCR foi certamente um dos maiores passos das Cincias Biolgicas durante o Sculo XX. Sem a PCR dificilmente se conseguiria o sequenciamento de genomas, a expresso de genes em sistemas recombinantes, o estudo de gentica molecular, a determinao rpida da paternidade de alguns indivduos, o diagnstico rpido de doenas virais, entre outros processos. Como comparao, o perodo compreendido entre a infeco de uma pessoa por HIV e a capacidade de um mtodo imunolgico detect-la (janela imunolgica) estimado entre 4 meses a 1 ano. Utilizando a PCR, este perodo pode ser reduzido para um valor entre 40 e 70 dias. Ainda pode-se levar em conta os avanos tecnolgicos indiretos impulsionados pela PCR: com o grande volume de amostras genmicas, a indstria computacional foi forada a desenvolver servidores com maiores capacidades de processamento e armazenamento de dados para lidar com a estrondosa quantidade de dados obtidos em grandes projetos de sequenciamento; tcnicas de DNA recombinante foram revolucionadas aps sua conjugao com a PCR; organismos transgnicos so mais facilmente gerados e sua presena facilmente detectada em amostras por PCR... A lista enorme. Sobre o custo, uma reao de PCR completa (extrao de NA+PCR+Eletroforese) hoje pode custar muito menos que uma reao sorolgica, devido ao alto preo de alguns anticorpos comerciais. Anlises de receptores de membranas celulares, antes restritas citometria de fluxo (altssimo custo) podem ser feitas rapidamente e com baixos gastos por RT-PCR. Por causa de sua alta sensibilidade, fcil realizao e atual baixssimo custo por reao, a PCR adotada como Gold Standard (Padro de Ouro), ou seja, como prova irrevogvel em algumas situaes. Por exemplo: Em ginecologia, quando os exames citolgicos e colposcpicos detectam leses causadas por HPV, o material levado anlise molecular, a fim de se determinar se o vrus desta paciente tem potencial oncognico ou no. Por outro lado, a comunidade cientfica e as grandes indstrias farmacuticas exigem que as reaes de PCR sejam altamente especficas, de total eficincia e total reprodutibilidade. Portanto, para um protocolo padronizado atingir o status descrito acima deve, no mnimo, atender a estas condies. Para garantir estes nveis de confiana, o biologista molecular deve padronizar seu protocolo a fim de se obter a melhor performance possvel. Produtos inespecficos, ausncia de bandas, contaminaes DNA/RNA e RNA/DNA, impureza das amostras, so situaes que podem ser resolvidas de maneiras muito simples tendo-se o conhecimento dos reagentes, processos e aparelhos utilizados.

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Composio das reaes


DNA Polimerase, Buffers (Solues-Tampo) e MgCl2: A DNA polimerase escolhida deve sempre operar sob as condies de reao institudas e mantidas pelos tampes especficos, alm de ser ativada pela presena de um on metlico especfico, e de obrigatoriamente ser termoestvel. A mais utilizada ainda a Taq, porm cada vez mais pura e com maior atividade. Algumas variedades (Gold, da Perkin-Elmer, Platinum, da LifeTechnologies) so vendidas em concentraes levemente maiores que o usual (5 ou 10 U/L), apresentando maior eficcia.
Existem enzimas Taq de origem recombinante, de custo bem menor, mas no recomendadas para uso em PCR (destinadas clonagem de vetores gnicos sem o uso de organismos vivos), apesar de apresentarem bons resultados em algumas reaes. Devido sua popularidade, a Taq a DNA polimerase mais utilizada em reaes convencionais; porm, em alguns protocolos seu uso contra-indicado. Esta enzima classificada com Non-Proofreading, o que quer dizer que pode haver alguns erros na sequncia do fragmento final. Enzimas desta classe percorrem a fita de DNA apenas uma vez, dando chance de que algum erro durante a duplicao no seja reparado. Alm disso, ela ainda adiciona uma adenina extra s extremidades 3 do DNA, o que pode dificultar o uso posterior do amplificado (insero em vetores). Para casos com estes, existem as enzimas da classe Proofreading, que alm de percorrerem a fita me no mnimo 2 vezes (a enzima pode percorrer a cadeia tanto no sentido 5-3 quanto no 3-5), e em geral no adicionam nucleotdeos extras nas bordas das cadeias-filhas. A lista destas enzimas vasta e cresce espantosamente, mas podemos ressaltar a Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis). Todas as enzimas listadas tm temperatura tima entre 72 e 74C, e meia-vida a 95C em torno de 300 minutos, o que as torna apropriadas para PCR. Como so diretamente responsveis pela atividade da enzima, os tampes e o MgCl2 so considerados fatores crticos. Altas atividades levam a bandas inespecficas ou inativao por baixa quantidade relativa de substrato; baixas atividades levam ausncia de produto, as duas situaes regidas principalmente por essas duas solues.

Primers: Antes das etapas experimentais, deve-se planejar cuidadosamente a sequncia e algumas caractersticas dos primers. Anteriormente concebidos por mtodos manuais, hoje existem programas que desenham oligonucleotdeos e preveem seu comportamento nas reaes. Alm da complementaridade, um ponto importantssimo da natureza deste reagente o seu Ponto de Fuso Mdio, denominado Tm (Temperature of Melting), que a temperatura na qual metade dos iniciadores est anelada s fitas de DNA e a outra livre na soluo.

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Figura 12: Grfico de determinao de Tm. Na temperatura indicada pela seta no eixo x, metade dosprimers est anelada s cadeias de DNA-molde.

Para cada par de primers que utilizado, um Tm diferente determinado. Se utilizssemos uma temperatura em que todos os primers estivessem anelados, teramos grande taxa de formao de primer-dimers, que nada mais so primers anelados entre si. A temperatura mdia garante que, enquanto metade deles est nas cadeias-me, a outra metade est inteiramente disponvel para o prximo ciclo. Os dois componentes do par (Sense e Antisense Primers) devem possuir Tm igual ou muito prximo para evitar alguns problemas na reao. A partir do valor de Tm podemos determinar o Ta, que a temperatura tima de reao do par de primers. Estas temperaturas so afetadas diretamente pela concentrao
+

do on Na na soluo (pode precipitar os primers para o fundo do tubo, prejudicando a cintica da reao;porm necessrio na manuteno do pH e dH da reao) e na presena de agentes adstringentes, que inibem o anelamento (formamida; DMSO=Dimetilsulfxido; Glicerol sob certas condies). A sequncia de bases dos primers deve ser conferida quanto chance de formao de Primer-Dimers (anelamentos Sense/Antisense), Self-Dimers (anelamentos Sense/Sense ou Antisense/Antisense) e Hairpins (dobramentos da cadeia de um primer , fazendo com que ela se pareie consigo mesma). DNA Molde: Sua concentrao deve ser adequada s condies da reao. Produtos inespecficos podem indicar excesso de template nas reaes. O ideal utilizar 5 L de uma soluo de 5g/mL de DNA dissolvido em gua ou em algum tampo apropriado ( TE = Tris-EDTA; HEPES; NaOH 0,8M em gua, etc.). Estes tampes devem ser escolhidos com cuidado: EDTA pode inibir drasticamente a atividade das DNA polimerases se estiver em excesso (acepta ons metlicos), por exemplo. Portanto, o DNA preferencialmente deve ser diludo em gua deionizada estril, a menos que se pretenda estoc-lo por longos perodos de tempo; neste caso, tampes levemente alcalinos (pH 7,8 a 8,0) so indicados. Contaminaes com RNA ou DNA de outra amostra devem ser levadas em conta
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e evitadas ao mximo. Usualmente utiliza-se RNAses para a purificao do DNA, e DNAses para a purificao de RNA. Alm disso, a adio de algumas etapas extra aps a extrao no sentido de purificar e dessalinizar a amostra de cido nuclico considerada medida de bom senso. Apesar de ser relativamente termoestvel, o DNA deve ser estocado a 20C, onde pode permanecer sem alterao perceptvel por at 2 anos em tampo apropriado. Recomenda-se o armazenamento do DNA a 80C e nunca em nitrognio lquido (temperaturas baixas demais fazem o DNA adsorver molculas de N2 na sua superfcie, impossibilitando o seu uso). Para RNA o armazenamento obrigatrio a 80C. As reaes contm ainda dNTPs e gua.

Extrao de cidos Nuclicos


Anteriormente, a extrao de DNA se resumia ao cozimento do material biolgico por alguns minutos em banho-maria, adio de NaCl em altas concentraes (3 a 6M) e etanol, com alguns passos de centrifugamento. Apesar de render quantidades razoveis de DNA, o pellet resultante ainda continha muitos restos celulares (membranas, lipdeos, etc.), o que poderia comprometer o resultado da PCR. Todos os principais protocolos atuais de extrao de cidos nuclicos seguem o mesmo esquema, otimizado: 1) Coleta, separao e lise do material vivo; 2) Separao da soluo em fases e 3) Precipitao e lavagem do produto. Todos os reagentes devem estar preferencialmente gelados, e a centrfuga usada a 4C.

Coleta, separao e lise do material biolgico: A integridade do material extrado depende principalmente deste incio de processo. Para remover fases dispensveis, costuma-se usualmente centrifugar imediatamente aps a coleta o material. Assim, uma amostra de clulas sanguneas no ter traos significativos de plasma; uma suspenso fecal estar livre de partculas slidas; uma amostra de urina ou de lquor se tornar livre de clulas. Cuidados especiais devem ser tomados com amostras com alta celularidade (sangue), grande quantidade de inibidores enzimticos (urina), lipdeos (tecido nervoso) e protenas (tecido heptico). Quanto ao sangue, durante a coleta no se pode usar heparina como anticoagulante, pois esta substncia forte inibidor das DNA polimerases, especialmente a Taq. A urina deve ser centrifugada e sofrer o mnimo de contato possvel com a atmosfera para inibir a oxidao de certos componentes.

A lise consiste no tratamento das membranas celulares com detergentes (aninicos, catinicos ou zwitterinicos). Normalmente utiliza-se o N-Lauroil-Sarcosino ou o SDS (Sodium Dodecyl-Sulphate). Assim, todo o contedo citoplasmtico torna-se livre na soluo. Para bactrias, que possuem parede celular, no se utiliza lise: solues de altas concentraes de glicose alteram a osmolaridade extracelular e foram a expulso do citoplasma para o meio. Tecidos vegetais so tratados inicialmente com nitrognio lquido, que petrifica a membrana celulsica ou formaes como esclernquima. Nesse estado, o material triturado por esmagamento, e depois a lise realizada. Aps a lise pode ocorrer a adio de sais caotrpicos em altas concentraes (4 a 8M), que inibem a formao de duplas-fitas e impedem que o DNA (ou RNA) fique preso em restos celulares. O Tiocianato de Guanidina ou a Guanidina-HCl so os compostos mais eficientes para este propsito. No caso de partculas virais, a etapa de lise no ocorre: os compostos de guanidina so suficientemente eficazes na quebra dos capsdeos.
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Compostos caotrpicos so, portanto, altamente denaturantes e permitem o fracionamento total do material.

Separao da Soluo em fases: Aps fragmentar o material completamente, deve-se criar uma soluo heterognea, de modo que o cido nuclico de interesse seja solvel em apenas uma das fases. Utiliza-se ento uma soluo de fenol, dissolvido em TE e pH em torno de 8,0 para extrair DNA e 7,2 para RNA (o DNA mais solvel em meio alcalino; o RNA nem tanto). O fenol, solvente orgnico, no se mistura gua. Porm o DNA e o RNA so altamente solveis em fenol, assim como os lipdeos. Para separar os lipdeos, adiciona-se clorofrmio mistura.Em tecidos ricos em lipdeos adiciona-se aproximadamente 40% a mais de clorofrmio. A seleo entre DNA e RNA feita pelo pH da soluo, como dito acima. Adiciona-se sais, normalmente Acetato de Sdio e/ou de Potssio, para a precipitao do material. Aps centrifugamento, obtm-se pelo menos duas fases: uma aquosa e uma fenlica. A fase fenlica contm o DNA; a aquosa, aps centrifugamento, o RNA. Ento separa-se a frao de interesse. Precipitao e lavagem do produto: Adiciona-se isopropanol fase recuperada na etapa anterior. Para a recuperao de RNA, recomenda-se incubao overnight a 20C para otimizar a precipitao. Para DNA, centrifugamento a 13000xg por alguns minutos. Descarta-se o isopropanol e adiciona-se etanol, preferencialmente 70% e gelado, com a funo de precipitar totalmente as cadeias de cido nuclico em centrfuga. Etanol absoluto pode desidratar demais a amostra, dificultando a dissoluo do produto final, alm de no permitir a dessalinizao completa da amostra (os acetatos so mais solveis em gua do que em etanol). Aps centrifugamento, surge no fundo do tubo um pellet, variando do transparente ao branco. Pellets amarelados indicam impurezas, o que requer a repetio deste passo final. o caso do tecido heptico, rico em protenas e de difcil purificao. A purificao adequada das amostras de grande importncia: traos de fenol, protenas e sais so reconhecidamente complexantes das reaes de PCR. Aps secagem, o material ressuspenso como descrito acima e quantificado. Utiliza-se a espectrofotometria por UV de 260nm como padro.
Relaes absorbncia/concentrao

dsDNA: 1 A260 - 50mg/mL (0,15mM) ssDNA : 1 A260 - 33mg/mL (0,1mM) ssRNA : 1 A260 - 40mg/mL (0,12mM)
A absorbncia a 280nm tambm medida. Sua relao com A260 usada para determinar o grau de pureza da amostra. Para DNA, a relao A260/A280 deve estar entre 1,7 e 1,9; para RNA entre 1,8 e 2,0.
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PCR
Na verdade, cada reao possui suas prprias caractersticas quanto concentrao de reagentes e condies de temperatura. No entanto, durante a padronizao podemos adotar um ponto de partida, ou standard protocol. Partindo destes parmetros, ajusta-se as condies de reao para a otimizao dos resultados.

Concentrao de Enzima: Recomenda-se concentraes de 0,4 a 1U para cada 25L de soluo final. Outras concentraes podem ser utilizadas em casos especiais (LD-PCR = Long Distance PCR = PCR que amplifica grandes fragmentos de DNA, como vetores inteiros). No entanto, deve-se observar as especificaes de cada fabricante e de cada produto (a enzima adequada para PCR ?; qual a concentrao (em U/L)?; existe alguma condio especial para operao?). Algumas opes podem ser consideradas, como HotStart, Taq Beads, leo mineral, anticorpos anti-Taq, etc. Assume-se que a Taq convencional permanea ativa mesmo depois de 40 ciclos na reao. Para reaes mais longas, recomenda-se o uso de outra enzima ou uma concentrao levemente maior. dNTPs: Utiliza-se uma soluo estoque de 10mM em gua e pH 7,0 de todos os dNTPs utilizados (ATP, TTP, CTP e GTP) em concentraes iguais (salvo em alguns casos). Adiciona-se reao uma quantidade suficiente para se obter uma concentrao final entre 20 e 200M, dependendo tambm do tamanho do segmento que se quer amplificar e da durao da reao. Normalmente a concentrao final de deoxinucleotdeos na reao ajustada para 25M. Altas concentraes de dNTPs podem afetar a especificidade dos primers, pareando-se a eles. MgCl2: Obrigatrio para o funcionamento da enzima, o MgCl2 encontrado na soluo de reao em concentraes em torno de 0,5 a 2,5 mM. Como todo on, pode afetar as temperaturas de denaturao das fitas de DNA e de anelamento de primers. Alm disso, altas concentraes so responsveis pelo aparecimento de produtos inespecficos, formados por aumento excessivo da atividade da polimerase e pela formao de primerdimers. importante que a presena de quelantes de ons, como o EDTA, podem alterar a concentrao do magnsio livre na reao. Outros Componentes: Os tampes de reao, fornecidos juntamente com as polimerases, possuem uma grande diversidade de componentes, cujo efeito no pode ser desprezado. Normalmente, os tampes possuem um pH a 20C entre 8,3 e 8,8. Possuem Tris (Tris(hidroximetil)aminometano), importante para o tamponamento, NaCl, KCl, e outros reagentes descritos anteriormente. Deve-se observar as concentraes de ons: at 50mM de NaCl e/ou KCl pode facilitar o anelamento dos primers (sabe-se que concentraes de KCl maiores que isso inibem a atividade das polimerases). Quando se trabalha com sequncias ricas em G e C, torna-se mais difcil a denaturao das fitas, devido presena de ligaes de lata energia. O simples aumento de temperatura para mais de 95C no recomendvel (denaturao dos dNTPs, reduo da atividade enzimtica, alterao excessiva do pH da soluo). Portanto, podemos utilizar um agente denaturante, como o DMSO (Dimetilsulfxido), que ajuda na denaturao das fitas. Utilizase uma concentrao final de 0,1 a 10% deste reagente na soluo. Concentraes acima de 10% inibem drasticamente a atividade da enzima (DMSO um solvente orgnico que em altas concentraes destri as ligaes da molcula da enzima).
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Durao dos ciclos de temperatura: Descrio da programao do termociclador passo a passo


I) Denaturao inicial: 4 minutos a 95C suficiente para a grande maioria dos casos. II) Denaturao: 1 minuto a 95C. III) Anelamento: 1 minuto operando na temperatura de anelamento especfica do primer, podendo ser aumentada at 90 segundos. IV) Extenso: Temperatura tima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1 minuto a 72C, podendo ser aumentada at 2 minutos de acordo com a quantidade utilizada, o nmero de ciclos e o tamanho do produto desejado. V) Extenso Final: Aps o trmino dos ciclos, costuma-se acrescentar um passo de 4 minutos a 72C, como oportunidade adicional para a polimerase agir. VI) Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4C, para manter as amostras conservadas at o momento de estocagem. Informaes sobre desenho de primers e a padronizao das temperaturas de anelamento sero discutidas posteriormente.

Referncias bibliogrficas:
http://www.fea.br/Arquivos/Biotecnologia/Material%20Prof%C2%AA%20Cristina%20%20Biologia%20Celular/Principios_da_PCR.pdf http://www.etallcorp.xpg.com.br/aula2.pdf

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