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Curso prctico Microbiologa de Aguas - 2013

Investigacin de coliformes totales, coliformes termotolerantes y Escherichia coli.

Mtodo de tubos mltiples Nmero Ms Probable ISO 9308:2 SMWW

1.Principio El mtodo se basa en la inoculacin de porciones de muestras en una serie de tubos con medio de cultivo lquido que contienen lactosa. Luego de incubarlos por 24h (48h) a 35-37 , los tubos que presentan turbidez y produccin de gas se subcultivan en un medios lquidos confirmatorios, incubando a 35-37C 48h para coliformes totales (BL BG) y a 44 C 24h para coliformes termotolerantes (EC) . Para confirmar E coli, se subcultivan los tubos positivos para coliformes termotolerantes para evidenciar la produccin de indol. Se calcula el Nmero Ms Probable (NMP) de coliformes totales, coliformes termotolerantes (fecales) y presuntivo E coli por 100ml de muestras, utilizando tablas estadsticas considerando tubos. 2- Material y equipo Tubos de ensayo de 16x 160 mm Gradillas Pipetas estriles de 10 y 1 mL o micropipetas Estufa o bao de incubacin (35 o37 C y 44-44.5 C) Medios de cultivos prueba presuntiva: Caldo Lauril Triptosa Sulfato ( contiene lactosa) Medio de cultivo prueba confirmatoria para coliformes totales: Caldo Bilis Verde Brillante Lactosa (BGBL o BRILA) Medio de cultivo prueba confirmatoria coliformes termotolerantes Caldo EC Medio de cultivo prueba confirmatoria E coli Agua de Triptona

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3- Procedimiento Se realizar en las siguientes etapas: 1. Prueba presuntiva

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Se incuba porciones de muestra en Caldo Lauril Sulfato luego de incubarse a 35-37 C durante 24(48h), los tubos que presentan gas y turbidez se consideran positivos y pasan a la etapa confirmatoria 2- Confirmacin - Para Coliformes totales: se evidencian ciertas caractersticas que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas y desarrollarse en presencia de sales biliares a 35-37 C durante 24h (48h). - Para coliformes termotolerantes: se evidencian ciertas caractersticas que diferencian los coliformes termotolerantes de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 44-44,5 C durante 24h. 3- Produccin de indol La especie Escherichia coli se diferencia de otros coliformes termotolerantes por su capacidad de produccin de indol 4- Estimacin del NMP para cada grupo segn tablas NMP

3.1 -. Prueba Presuntiva

Se preparan en una gradilla tres series de tres tubos con Caldo LTS. La primera serie con 10 ml medio con doble concentracin y las otras llevan el medio con simple concentracin.

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Sembrar tubos de Caldo LTS En 1 serie de tubos doble concentracin se vierte 10 ml de muestra sin diluir. En 2 serie, tubos simple concentracin, se vierte 1 mL de la muestra sin diluir. En 3 serie, tubos simple concentracin, se vierte 1 mL de la -1 dilucin 10 de la muestra.

Los tubos llevan campana de Durham para observar la produccin de gas.

Incubar las tres series a 35 o 37 1C, haciendo lecturas a las 24 (48 horas)

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Lectura de la Prueba Presuntiva La reaccin es positiva cuando se evidencia la fermentacin de la lactosa. El gas en la campana de Durham indica fermentacin de la lactosa con formacin de gas a la temperatura de incubacin. Seleccionar los tubos positivos fermentacin + gas y desechar los otros.

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3.2 Confirmacin para coliformes totales La confirmacin es positiva cuando se comprueba el crecimiento en presencia de sales biliares y la fermentacin de la lactosa a 35 o 37 C Se utilizan nicamente los tubos positivos (fermentacin y gas) en Caldo LTS seleccionados en la prueba presuntiva.

En condiciones estriles y se toma la muestra del tubo positivo (LTS), con ansa en anillo.

Y se inocula en un tubo con Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante Esto se repite con todos los tubos positivos de la prueba presuntiva. Incubar todos los tubos inoculados a 37 C durante 18-24 h

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La turbidez indica crecimiento en presencia de sales biliares. El gas en la campana de Durham indica fermentacin de la lactosa con formacin de gas a 35 o 37 C (en presencia de sales biliares)

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Anotar la combinacin de tubos confirmados para Coliformes Totales Ej, Medio LTS Caldo Bilis Verde Brilante Combinacin Tubos 10 ml +++ - ++ 2 1 Tubos 1ml ++ - + 0 Tubos 0,1 ml -1 (10 ) + -

Calcular por Tabla el NMP de coliformes totales /100ml de muestra=

3-3- Confirmacin para coliformes termotolerantes La confirmacin es positiva cuando se comprueba el crecimiento en presencia de sales biliares y la fermentacin de la lactosa a 44 o 44.5 C Se utilizan nicamente los tubos positivos (fermentacin y gas) en Caldo LTS seleccionados en la prueba presuntiva.

En condiciones estriles y se toma la muestra del tubo positivo (LTS), con ansa en anillo.

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Y se inocula en un tubo con Caldo EC Esto se repite con todos los tubos positivos de la prueba presuntiva.

Incubar todos los tubos inoculados a 44.5 C durante 18-24 h

La turbidez indica crecimiento en presencia de sales biliares. El gas en la campana de Durham indica fermentacin de la lactosa con formacin de gas a 44,5 C (presencia de sales biliares)

Anotar la combinacin de tubos confirmados para Coliformes termotolerantes Ej, Medio LTS EC Combinacin Tubos 10 ml +++ - -+ 1 Tubos 1ml ++ - + 1 Tubos 0,1 ml -1 (10 ) + 0

Calcular por Tabla el NMP de coliformes totales / 100ml de muestra Todos los tubos confirmados como positivos (turbidez + gas) de organismos coliformes termotolerantes en cada dilucin se utilizan para el aislamiento de Escherichia coli en agar EMB o Levine y comprobacin bioqumica de la produccin de indol.

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3.4 Escherichia coli Para la investigacin de E. coli se parte de los tubos confirmados como positivos (crecimiento y formacin de gas en caldo E.C. a 44,5C) en el medio E.C.

Siembra en agua triptona (TW) a partir de los tubos positivos de EC Incubar en estufa o en bao maria a 44-44,5 C durante 24h

Simultneamente se siembra en agar Levine (EMB) para aislamiento de las colonias y observar la morfologa y coloracin tpica de Escherichia coli

Incubar a 44,5 C con las placas invertidas durante 24 h

Observar el brillo metlico de las colonias de Escherichia coli en agar EMB

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Caractersticas de las colonias de E. coli sobre agar EMB o Levine: 2-3 mm de dimetro, planas o ligeramente cncavas, centros azul oscuros o casi negros, que ocupan las 3/4- partes de la colonia. Con luz reflejada, se observa un brillo metlico verdoso; a veces, este brillo metlico no se manifiesta.

Otras colonias se descartan como pertenecientes a Escherichia col: incoloras o trasparentes (como las producidas por Proteus y Salmonella) rosas o marrones con centro azul oscuro ( como las producidas por Klebsiella y Enterobacter). El brillo metlico verdoso con luz reflejada nunca la presentan las especies de estos generos

Realizar la prueba de indol en los tubos de agua triptona (TW) Aadir 0,5 mL (aprox, 3 gotas) del reactivo de Kovacs a cada tubo.

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La reaccin positiva se manifiesta por la formacin de un anillo rojo en la superficie del medio. La reaccin negativa muestra anillo amarillento. Escherichia coli al desaminar e hidrolizar el triptfano del medio, produce indol que se pone de manifiesto al aadir el reactivo de Kovacs

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Con aquellos casos en que se comprueba la presencia de Escherichia coli por la produccin de indol y el crecimiento caracterstico sobre agar EMB, se hace la lectura en la tabla del NMP para obtener el nmero de E. coli por mililitro de muestra.

Anotar la combinacin de tubos confirmados para Escherichia coli Ej, Medio LTS EC Agar EMB Indol Combinacin Tubos 10 ml +++ - -+ + + 1 Tubos 1ml ++ - + 0 Tubos 0,1 ml -1 (10 ) + -

Calcular por Tabla el NMP de Escherichia coli / 100ml de muestra

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