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Rev Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.32, n.4, p.225-232, out./dez. 2008. Disponvel em www.cbra.org.

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Anlise computarizada de espermatozides: reviso de literatura


Computer-assisted sperm analysis (CASA): a review D.L. Matos1, A.A. Arajo, I.G. Roberto, R. Toniolli
Programa de Ps-graduao em Cincias Veterinrias FAVET/UECE Universidade Estadual do Cear, Campus do Itaperi, CEP: 60700-000, Fortaleza-CE 1 Correspondncia: dadamatos@hotmail.com.br

Resumo A avaliao da motilidade e morfologia so essenciais na anlise da qualidade do smen. A anlise desses parmetros tem sido baseada na avaliao subjetiva, resultando em variaes de at 60%. Para reduzir a subjetividade, sistemas automticos de anlise seminal (CASA) vm sendo desenvolvidos, fornecendo confiabilidade e velocidade de obteno dos dados, mas seu uso limitado devido necessidade de validao dos dados, controle de qualidade e padronizao das anlises. A uniformizao desse instrumento permitir a comparao de resultados e fornecer subsdios para melhorar as biotecnias da reproduo. Diante de sua importncia, faremos uma breve reviso das informaes disponveis sobre esta tecnologia, abordando o funcionamento, as vantagens e aplicaes do CASA. Palavras-chave: anlise computadorizada de smen, motilidade espermtica, morfologia espermtica. Abstract The assessment of sperm motility and morphology are essential for examination of sperm quality. The analysis of these parameters has been based on subjective evaluation, resulting in variations of up to 60%. To reduce the subjectivity, computer-assisted sperm analysis (CASA) have been developed providing reliability and speed for semen analysis, but its use is limited due the need of validation of data, quality control and standardization. The uniformity of this instrument will allow comparison of results and provide allowance to improve the biotechnologies of reproduction. In view of its importance, we will make a brief review about this methodology, approaching the function of the CASA, benefits of its use and applications. Keywords: Computer-assisted sperm analysis (CASA), sperm motility, sperm morphology. Introduo O CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) um sistema automtico (hardware e software) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, fornecendo informaes acuradas, precisas e significativas do movimento individual de cada clula bem como de subpopulaes de clulas espermticas (Amann e Katz, 2004). A anlise da motilidade e morfologia espermtica tm sido apontadas por muitos autores como importante ferramenta na seleo de um ejaculado, sendo a determinao da porcentagem de espermatozides mveis, o teste mais utilizado para predizer a qualidade seminal (Verstegen et al., 2002). Tradicionalmente, a quantificao da qualidade espermtica tem sido baseada na avaliao subjetiva, usando estimativa visual de parmetros como motilidade massal e individual, contudo, estudos relatam existir uma variao de 30 a 60% na estimativa desses parmetros devido limitao do ser humano em quantificar as diferentes subpopulaes espermticas na amostra (Amann e Hammerstedt, 1980; Verstegen et al., 2002). Para reduzir a subjetividade, nos ltimos 15 anos, sistemas automticos para anlise computadorizada de smen (CASA) vm sendo desenvolvidos com o objetivo de fornecer dados acurados da motilidade de cada espermatozide e resumo estatstico das subpopulaes (Verstegen et al., 2002). Este equipamento pode ainda ser utilizado para mensurar o nmero de clulas por unidade de volume e ser modificado para capturar dados aproximados para classificao morfomtrica de cada clula examinada (Amann e Katz, 2004). Os diferentes instrumentos CASA tm demonstrado altos nveis de preciso e confiana usando diferentes metodologias de classificao que fornecem uma grande ferramenta para melhorar nosso conhecimento e habilidade para analisar espermatozides (Verstegen et al., 2002), tornando-se essencial pesquisa, ao treinamento de pessoal e padronizao entre laboratrios (Amann e Hammerstedt, 1980). Diante da sua importncia, faremos aqui, uma breve reviso do estado atual do conhecimento da tecnologia CASA, abordando seu funcionamento, aplicaes, vantagens, limitaes e impactos na biologia espermtica e clnica.

_________________________________________ Recebido: 5 de junho de 2008 Aceito: 23 de junho de 2009

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Evoluo da metodologia de anlise espermtica computadorizada No incio da dcada de 40, estudiosos tiveram a necessidade de obter dados objetivos na porcentagem de espermatozides mveis e informaes sobre a velocidade do movimento dessas clulas. Acreditavam que, se fossem obtidos dados precisos do movimento espermtico, seria possvel predizer o potencial de fertilidade de um macho ou selecionar o melhor procedimento para preparao do espermatozide (Amann e Katz, 2004). Entre os vrios mtodos de avaliao idealizados, Lord Rothschild, ainda na dcada de 40, introduziu o uso de fotografias em tempo real, usando iluminao de campo escuro para criar imagens da trajetria do movimento do espermatozide e, manualmente, determinar a velocidade de deslocamento (Verstegen et al., 2002; Amann e Katz, 2004). Esse sistema e outros desenvolvidos na mesma poca eram incapazes de mensurar a velocidade individual das clulas, o que s foi possvel a partir de 1978, quando surgiu o primeiro sistema automtico capaz de avaliar a trajetria do movimento espermtico baseado na avaliao individual (Verstegen et al., 2002; Amann e Katz, 2004). Vale ressaltar que o pioneiro Expert Vision desenvolvido pela Motion Analysis Corporation, Santa Rosa, Califrnia, mais tarde chamado Cell Track, no era um sistema especfico para esse tipo de anlise (Amann e Katz, 2004). O primeiro sistema CASA para comercializao desenvolvido especificamente para avaliao da motilidade espermtica foi o CellSoft (CRYO Resources, Montgomery, New York) comercializado por volta de 1985 para uso em laboratrio de pesquisa e laboratrios mdicos (Mack et al.,1988). Em 1986, surgiu o HTM 2000 Hamilton-Thorn Research, Beverly, Massachusetts, tambm desenvolvido especificamente para esse tipo de anlise (Amann e Katz, 2004). Em 1992, surgiu o HTM-IVOS Sperm Analyzer, um sistema integrado de computador e microscpio que permitia a aquisio de imagens digitalizadas, fornecendo classificao automtica dos movimentos espermticos, informando porcentagem de mveis, mdia de velocidade e porcentagem de progressivos (IguerOuada e Verstegen, 2001). Atualmente, a HTM disponibiliza verses como HTM-IVOS 10 e HTM-CEROS 12.1. A verso HTM-IVOS 10 proposta para avaliao do smen humano, mas j foi validado para outras espcies como a canina. A verso HTM-CEROS 12.1 permite ainda avaliar morfologia e morfometria espermtica (IguerOuada e Verstegen, 2001). Atualmente em adio ao HTM, existe outro sistema comercial de CASA, o SMCMA (Stromberg-Muka Band Feilnback, Germany; Davis e Katz, 1993), entre outros disponveis no mercado. Independente do fabricante, os diferentes instrumentos so baseados em princpios similares, mas diferem em termos de ptica usada e de software para a identificao do espermatoszide e a construo da trajetria, respectivamente (Kraemer et al., 1998). Nos ltimos anos, relatos utilizando esse sistema tm aumentado significativamente, e a principal espcie no qual tem sido utilizado a humana. Os centros de avaliao da fertilidade em humanos tem usado este equipamento para avaliao da qualidade espermtica para posterior uso em biotcnicas da reproduo e para estudar a existncia ou no de correlao da qualidade espermtica (morfologia e motilidade) com a fertilidade (Verstegen et al., 2002). Em medicina veterinria, o CASA ainda no uma prtica rotineira. Embora j seja verificada sua validao em vrias espcies como bovina, suna, esse sistema ainda no est inteiramente padronizado para todas as espcies de animais (Verstegen et al., 2002). Vantagens e desvantagens da tcnica O sistema adequado para quantificar um grande nmero de clulas com padro de motilidade heterogneo em um curto perodo de tempo (Mack et al., 1988; Farrel et al., 1996), fornecendo dados de concentrao de espermatozides/mL, morfologia, motilidade e velocidade, detectando mudanas suts nos parmetros sob vrias condies experimentais (Kraemer et al., 1998). Alm da execuo do exame, o sistema permite a catalogao de pacientes num banco de dados, assim como, o armazenamento de informaes relevantes, criando um ambiente de trabalho caracterizado pela confiabilidade, versatilidade, facilidade de manuseio e de configurao. As avaliaes so rapidamente executadas, e os resultados so facilmente catalogados, permitindo que seja atingido alto nvel de automao em laboratrios, clnicas, empresas e universidades. Embora o sistema tenha muitas vantagens, ele apresenta algumas desvantagens que tornam seu uso limitado (Verstegen et al., 2002): o elevado custo do equipamento e a necessidade de validao, o controle de qualidade e a padronizao das avaliaes realizadas (Davis e Katz, 1993).

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Aplicaes do sistema CASA Resultados significativos tm sido obtidos em pesquisas bsicas, o que no teria sido possvel sem a tecnologia CASA. O sistema tem demonstrado ser uma ferramenta til no monitoramento da qualidade espermtica de amostras submetidas a diferentes tratamentos experimentais (Farrel et al., 1996), na pesquisa de novos diluidores seminais, crioprotetores ou outros tipos de processamento (Amann e Katz, 2004). tambm valioso na quantificao da hiperativao, no estabelecimento da relao entre qualidade do smen do doador e a verdadeira fertilidade da amostra e nas avaliaes gerais da convenincia do uso de machos para reproduo (Farrel et al., 1996; Verstegen et al., 2002). Funcionamento do CASA No mtodo de anlise espermtica computadorizada, a avaliao de motilidade em seus diversos parmetros realizada rigorosamente por um sistema estroboscpico de alta preciso totalmente controlado por computador. Utiliza-se vdeomicrografia que faz o monitoramento constante e anlise seqencial do movimento do espermatozide (Mortimer, 2000; Amann e Katz, 2004). Embora seja o flagelo a parte do espermatozide que origina a motilidade, os sistemas automticos avaliam o movimento da cabea, porque tecnicamente mais fcil acompanhar esse movimento do que o do flagelo (Amann e Katz, 2004). Isso porque a freqncia do batimento flagelar muito alta (acima de 80 batimentos por segundo para espermatozide humano lavado), sendo ento necessrio, pelo menos, 200 observaes por segundo para mensurar o padro do batimento flagelar corretamente. Atualmente, os sistemas de vdeo analisam 25-60 imagens/s, ou seja, usam uma menor freqncia que a necessria para avaliao do batimento flagelar, impossibilitando a aquisio de boas imagens. J a cabea no se move to rapidamente como a cauda, o que possibilita a obteno de imagens relativamente claras, utilizando a tecnologia de vdeo convencional (Mortimer, 2000). Por meio do uso de microscpio com contraste de fase, as clulas espermticas so mais claramente visualizadas no meio onde elas se encontram, o que permite a deteco e o rastreamento dessas clulas. O processo de deteco automtica das clulas, denominado segmentao, ento realizado pelo sistema comparando a intensidade da imagem adquirida com um limiar de intensidade pr-estabelecido (Mortimer, 2000). O tamanho mnimo e mximo aceitvel para a cabea do espermatozide de cada espcie padronizado pelo sistema, e o computador ir reconhecer um objeto que cair dentro da faixa de tamanho de cabea espermtica pr-estabelecida. Partculas presentes na imagem com tamanho abaixo deste limiar sero considerados parte do fundo (Mortimer, 2000). Anlise das imagens e obteno dos parmetros de motilidade Para a anlise da motilidade propriamente dita, primeiro cada imagem captada pela cmera acoplada ao microscpio convertida em imagem digital, e a organizao seqencial de diversas imagens digitais do origem a um filme. Cada conjunto de imagens captadas em diversos campos de observao da amostra espermtica em avaliao so automaticamente analisadas (Donald et al.,1988). O software reconhece as clulas e desenha para cada espermatozide uma seqncia completa do movimento para reconstituir sua trajetria, classificando-a conforme os padres definidos como: mvel no progressivo, linear lento, linear rpido e imvel (Mortimer, 2000). Em seguida, uma srie de outras caractersticas de movimento espermtico calculada, fornecendo parmetros de motilidade como: porcentagem de mveis, velocidade curvilnea (VCL), velocidade mdia da trajetria (VAP), velocidade linear progressiva (VSL), retilinearidade (STR) e linearidade (LIN). Estes valores so usados para diferenciar os padres do movimento espermtico (Mortimer, 2000). Quando o CASA usado, todos os espermatozide em um campo de viso e suas trajetrias so reconstrudas simultaneamente. Todas as clulas espermticas de um campo so identificadas e avaliadas antes que as imagens do prximo campo, captadas na seqncia, sejam analisadas (Donald et al.,1988). Parmetros da motilidade espermtica avaliados pelo CASA De acordo com Verstegen et al. (2002) os parmetros reportados pelo CASA so: Velocidade curvilnea (VCL- m/s): a velocidade da trajetria real do espermatozide. sempre a maior das trs velocidades e serve como elemento de clculo para a linearidade. Velocidade linear progressiva (VSL- m/s): a velocidade mdia em funo da linha reta estabelecida entre o primeiro e o ltimo ponto da trajetria do espermatozide. sempre a mais baixa das trs velocidades.

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Velocidade mdia da trajetria (VAP- m/s): a velocidade da trajetria mdia do espermatozide. Em casos onde a trajetria da cabea espermtica muito regular e linear com pouco movimento lateral da cabea, a VAP quase a mesma que a VSL, porm com trajetrias irregulares, no lineares ou onde existe um alto grau de movimento lateral, a VAP ser maior que a VSL. Amplitude de deslocamento lateral da cabea (ALH - m): a amplitude do deslocamento mdio da cabea do espermatozide em sua trajetria real. A mensurao desse parmetro esta relacionada com a capacidade de penetrao na zona pelcida do vulo, assim, a ALH um dos parmetros que tem efeito sobre a fertilizao. Freqncia de batimento flagelar cruzado (BCF- Hz): o nmero de vezes que a cabea do espermatozide cruza a direo do movimento. Se existem mais batimentos/segundos que imagens/segundos, ento, a BCF ir ser subestimada. Retilinearidade (STR - %): a relao percentual entre VSL e VAP. Estima a proximidade do percurso da clula a uma linha reta. Linearidade (LIN - %): Relao percentual entre VSL e VCL, ou seja, a porcentagem de clula que tem index linear > 0.7, ngulo absoluto menor que 25 e ngulo algbrico menor que 3. Quanto mais o espermatozide se afasta da velocidade em linha reta, menor ser sua linearidade (Mortimer, 2000). Os valores de velocidade so determinados como percurso relevante percorrido em um perodo de tempo e so representados em m/s, enquanto os valores de LIN, e STR so determinados como raio dos valores de velocidade (Amann e Katz, 2004). Avaliao da hiperativao espermtica A hiperativao um processo que o espermatozide apresenta durante o seu progresso no oviduto da fmea, sendo descrito como um movimento vigoroso, no progressivo, no linear e est relacionado com o processo de capacitao e fertilizao (Verstegens et al., 2002). Durante a hiperativao, o padro e o vigor da trajetria do espermatozide so alterados, passando a ser caracterizados por uma larga amplitude do batimento flagelar, aumento mdio do movimento lateral da cabea e cauda do espermatozide associados tambm com uma motilidade lenta ou no progressiva de baixa freqncia de batimento flagelar (Mortimer e Mortimer, 1990; Suarez, 1996; Kay e Robertson, 1998; Verstegen et al., 2002). A mensurao objetiva desse processo fisiolgico pode ser usada como biomarcador no apenas na predio da fertilidade, mas tambm na avaliao de agentes farmacolgicos administrados para tratar infertilidade masculina e monitorar o efeito dos contraceptivos na funo espermtica (Kay e Robertson, 1998). A avaliao da hiperatividade do espermatozide utilizando o sistema CASA possvel a partir do uso de alta freqncia. O uso de 60Hz permitiu melhor discriminao entre motilidade progressiva e motilidade hiperativada quando comparada a anlises feitas a 30Hz (Mortimer e Swan, 1995, citado por Cancel et al., 2000). O uso da alta freqncia de capatao de imagens combinado com o aumento da resoluo do sistema ptico e do uso de melhores computadores, tornaram eficiente o registro da trajetria dos espermatozides com alta velocidade e trajetria irregular, que at ento eram difceis de ser analisados (Cancel et al., 2000). No smen humano, o espermatozide hiperativado aquele que apresenta: VCL 70m/s, ALH 7m, LIN 30% e VSL 30 m (Mortimer e Mortimer, 1990; Verstegen et al., 2002). Avaliao da morfologia espermtica A classificao da morfologia do espermatozide tem se tornado uma parte integral da rotina da anlise de smen. A razo disso que a morfologia espermtica um importante indicador de fertilidade, tanto em homens como em animais, alm de ser um bom indicador para danos espermticos conseqentes de agentes fsicos ou qumicos (Verstegen et al., 2002; Garcia-Herreros et al., 2006). Segundo Hirai et al. (2001), a anlise automtica da morfometria espermtica tem sido aplicada em vrias espcies incluindo a bovina (Gravance et al., 1996), a caprina (Gravance et al., 1995), a ovina (Gravance et al., 1998) e a humana (Davis e Katz, 1993). Esses sistemas so programados para classificar objetos e diferenciar imagens das clulas espermticas do detrito seminal e/ou superposio de clulas, medindo parmetros como dimetro mximo, dimetro mnimo, rea da cabea, porcentagem de acrossomo (obtido dividindo rea do acrossomo pela rea da cabea) e fator de elipse (obtido dividindo-se o dimetro mnimo da cabea pelo mximo), que so utilizados para classificar as clulas segundo sua forma em: normal (formato de cabea regular), afilada, redonda, macro, micro ou amorfo (cabea irregular). Mesmo sendo uma avaliao objetiva, o sistema CASA apresenta variao nos resultados entre 11 e 23%, o que pode ser atribuda a fatores como preparao da amostra incluindo tcnica de fixao e tcnica de

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colorao, bem como fatores como correta iluminao, foco, aumento, sistema de classificao, interpretao e experincia do profissional (Hirai et al., 2001; Verstegen et al., 2002). CASA e avaliao da fertilidade A habilidade do espermatozide para migrar atravs do trato reprodutivo da fmea e penetrar no ocito depende da resistncia exercida pela secreo presente no trato genital feminino e do potencial hidrodinmico conferido pela curvatura flagelar. Sua fora de propulso definida pelas propriedades cinemticas dessas clulas, o que pode levar a diferenas na eficincia de migrao entre espermatozides de alguns machos (Cox et al., 2006). A motilidade espermtica comumente apontada como uma das mais importantes caractersticas associadas com a habilidade fertilizante do espermatozide (Cox et al., 2006), porm, quando mensurada microscopicamente, no bem correlacionada com a fertilizao in vivo ou in vitro, pois alm do erro humano durante a avaliao subjetiva desse parmetro, existe ainda a limitao do mtodo para avaliar detalhadamente as caractersticas do movimento espermtico (Liu et al., 1991). Nos ltimos anos, os sistemas de avaliao automtica tm mostrado ser uma ferramenta til na avaliao das propriedades cinemticas do espermatozide de forma individual do ejaculado, mostrando grande potencial para predizer a fertilidade do macho, por meio da correlao da velocidade de natao do espermatozide com a fertilizao de ocito in vitro e in vivo (Cox et al., 2006). Na tentativa de correlacionar os parmetros do CASA com a taxa de fertilizao, verificou-se que os valores de VAP, VSL e VCL so significativamente maiores em amostras que produzem mais de 50% de ocitos fertilizados do que naquelas onde a taxa de fertilizao de ocito menor que 50% (Verstegen et al., 2002). Amostras com elevados valores desses parmetros de velocidade e de LIN e BCF apresentam melhor migrao e penetrao no muco cervical (Mortimer, 2000; Verstegen et al., 2002). Entretanto, entre os parmetros cinemticos fornecidos pelo o CASA, a VCL e a ALH tm mostrado grande correlao com taxa de fertilizao pela maioria dos estudos. Parmetros como BCF e LIN tm revelado correlao positiva com a taxa de prenhez em alguns estudos, mas correlao negativa em outros (Verstegen et al., 2002). Espermatozides humanos com boa capacidade de penetrao no muco cervical apresentam um grupo de propriedades cinemticas semelhantes a: VAP = 25m/s e ALH = 4,5m (Mortimer, 2000) enquanto, em caprinos, espermatozides com velocidade eficiente na migrao do muco cervical in vitro apresentam LIN > 50% e ALH = 4,8m (Cox et al., 2006). Outro parmetro preditivo de fertilidade a porcentagem de espermatozides mveis. Em varres com leitegadas maiores que 10 leites, foi observado alta porcentagem de espermatozides mveis, cerca de 93%, enquanto em varres, com tamanho de leitegada menor, a porcentagem de espermatozides mveis registrado foi em torno de 80% (Hirai et al., 2001). Fatores que influenciam a anlise automtica Vrios fatores podem gerar uma variabilidade na estimativa dos parmetros das caractersticas dos espermatozides mensurados pelo CASA, entre os quais podem-se citar: experincia do observador, identificao da espcie, acurcia da cmara utilizada, temperatura de anlise, tempo entre a colheita da amostra e sua anlise, mtodo de processamento da amostra, instrumento usado, concentrao espermtica e freqncia de aquisio de imagens (Davis e Katz, 1993; Farrel et al., 1996; Mortimer, 2000). Experincia do observador importante que o observador seja treinado e experiente para reconhecer e desconsiderar dados de velocidade de movimento resultante de alteraes momentneas que porventura possam ocorrer (Verstegen et al., 2002). O observador deve ter habilidade para perceber que o sistema pode no diferenciar a cabea do espermatozide de outras clulas ou detritos, eventualmente presentes na amostra avaliada, nesses casos, as estimativas podem ser verificadas manualmente por ele a fim de se evitar que dados de concentrao espermtica e porcentagem sejam superestimados e inseguros (Mortimer, 2000). Identificao da espcie O sistema apresenta uma configurao diferente para cada espcie, assim o primeiro passo fazer a identificao correta da espcie e da amostra porque parmetros estabelecidos para a anlise de smen puro, por exemplo, difere do smen lavado ou descongelado, da mesma forma que os parmetros estabelecidos para a espcie suna diferem da usada para a bovina. Baseado nisso, as caractersticas de motilidade no devem ser

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vistas como valores absolutos, devendo ser interpretados de acordo com parmetros estabelecidos (Verstegen et al., 2002). Acurcia da cmara utilizada A profundidade da cmara pode afetar a estimativa da concentrao ou influenciar a expresso de motilidade por restringir o deslocamento ou por levar interaes das clulas com as suas paredes (Verstegen et al., 2002). Assim, ela deve ser profunda o suficiente para que o padro de motilidade seja avaliado (Kay e Robertson, 1998). Temperatura de anlise A temperatura influencia a motilidade do espermatozide,. baseados nisso, estudos em diferentes espcies foram realizados para determinar qual a temperatura ideal para se realizar as anlises no sistema CASA, sendo recomendada por vrios autores, a temperatura corporal de 37 e 38 C para algumas espcies (Verstegen et al., 2002). Efeito da concentrao A concentrao espermtica tambm tem influncia nos resultados do CASA. Estudos com smen humano e de animais tm demonstrado que o sistema CASA no eficaz para avaliaes de amostras espermticas com alta ou baixa concentrao, assim para uma correta anlise, a concentrao espermtica deve estar entre 20 a 50 x106/ml (Budworth et al., 1987; Davis e Katz, 1993). Efeito da diluio e diluidores O efeito das solues de diluio sobre os parmetros de cintica tem sido pouco estudado, mas tem sido demonstrado que a diluio e o tipo de meio diluidor podem afetar a anlise de motilidade (Farrel et al., 1996). Por exemplo, gotculas de lipdeos da gema de ovo podem ser contadas se estas possurem a mesma dimenso da cabea de um espermatozide.. Efeito do tempo entre a colheita da amostra e sua anlise Com relao influncia do tempo de incubao, Farrel et al. (1996),verificaram o declnio na velocidade espermtica durante incubao de 2 horas, registrando reduo de 3-6% na porcentagem de espermatozides mveis em amostras de smen humano e de camundongo. O mesmo foi observado avaliando smen resfriado de bovino (Tardif et al., 1997) e de suno (Holt et al.,1997). Assim, aconselhvel que a avaliao da amostra seja realizada em um curto perodo de tempo aps colheita ou processamento a fim de evitar erros de leitura por subestimar parmetros de motilidade e de velocidade. Efeito da freqncia de aquisio de imagens Segundo Mortimer et al. (1988 citado por Kraemer et al., 1998), a freqncia de aquisio de imagens tambm importante. Mortimer (2000), demonstrou que a reconstruo da trajetria pode ser influenciada pelo nmero de imagens capturadas por segundo, assim, algumas trajetrias podem parecer simples quando reconstitudas a 30 imagens/segundo, mas complexas quando reconstitudas a 60 imagens/segundo. Isso ocorre porque o aumento da freqncia de captura de imagens resulta em mais informaes da trajetria afetando o aspecto do movimento espermtico. Davis e Katz (1993) demonstraram que em baixa freqncia de aquisio de imagens, erros nos valores mdios de ALH, LIN, VCL e BCF eram de 0,9, 57, 33 e 33% respectivamente, mas quando a freqncia foi aumentada para 60 Hz os erros eram reduzidos para 0,05, 11, 9,5 e 8.9%, respectivamente, assim, .uma melhora significativa na acurcia das avaliaes foi encontrada quando a freqncia de aquisio foi aumentada de 30 para 60Hz. Segundo Mortimer e Swan (1995), citados por Cancel et al., (2000), o uso de 60Hz, permite uma melhor discriminao entre a motilidade progressiva e a motilidade hiperativada em espermatozide humano quando comparado a anlises feitas a 30Hz. Mtodos de processamento Processos como lavagem, capacitao, congelao, descongelao, diluio e resfriamento tm efeito substancial sobre os parmetros analisados, o que pode levar a variabilidade de resultados nas amostras avaliadas

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antes e depois de diferentes tratamentos, assim, o avaliador deve considerar essas observaes ao interpretar os resultados obtidos. Tardif et al. (1997) verificaram o aumento do deslocamento lateral da cabea espermtica aps resfriamento do smen bovino. Mack et al. (1988), verificaram melhora em todos os parmetros cinemticos, exceto LIN, aps lavagem do smen humano. Um estudo na espcie suna, comparando anlises de smen fresco e descongelado, mostrou no existir diferena significativa entre elas em relao aos dados de ALH, BCF, STR e LIN, mas verificou uma queda da motilidade total de 93% para 51% e da motilidade progressiva de 64 para 21%, provocados pela criopreservao (Eriksson e Rodriguez-Martinez, 2000). Controle de qualidade e validao Para que ocorra o desenvolvimento dessa tecnologia e seja possvel a comparao, a interpretao e a reproduo de resultados, muitos autores tm mencionado a necessidade da padronizao de procedimentos para manipulao do smen. Embora vrias modificaes no procedimento sejam necessrias para diferentes espcies, os princpios para as avaliaes da qualidade espermtica utilizando o CASA so similares para todas as espcies de mamferos (Farrel et al., 1996; Amann e Katz, 2004; Garcia-Herreros et al., 2006). As amostras de smen com concentraes maiores do que a recomendada pelo fabricante devem ser diludas a concentraes entre 20-50 x 106 espermatozides/mL, mas diluidores a base de leite ou gema de ovo, que contem partculas com tamanho similar a cabea do espermatozide, devem ser evitados, porque no so diferenciadas dos espermatozides imveis (Verstegen et al., 2002). Todas as anlises devem ser realizadas a temperatura fisiolgica de cada espcie, a cmara deve ter profundidade adequada, com no mnimo 10m de profundidade e avaliaes bsicas de smen podem ser feitas a 30Hz, mas as amostras com espermatozides mais rpidos devem ser avaliadas a 60Hz (Davis e Katz, 1993; European Society of Human Reproduction and Embryology - ESHRE, 1998). Aps a anlise, o usurio deve verificar se todos os espermatozides mveis no campo de viso tiveram suas trajetrias reconstrudas e recomendado fazer uma avaliao comparativa entre a anlise automtica e a subjetiva (Eshre, 1998; Verstegen et al., 2002). Mesmo com essas recomendaes gerais, at que seja desenvolvido um apropriado procedimento de controle de qualidade e mtodos de calibrao do instrumento CASA, a comparao de resultados entre laboratrios ser limitada (Davis e Katz, 1993). Consideraes finais Nos ltimos anos, tem sido rpido o desenvolvimento de equipamentos e procedimentos para facilitar a anlise automatizada de espermatozides. O CASA permite uma mensurao objetiva de diferentes caractersticas da clula espermtica, mostrando alto nvel de preciso e segurana, sendo atualmente utilizado como uma ferramenta para melhorar o nosso conhecimento e habilidade para manipular espermatozides, abolindo a subjetividade das anlises realizadas pelo mtodo convencional. A futura uniformizao e a padronizao desse instrumento daro a oportunidade de analisar, objetivamente, resultados de motilidade e morfometria espermtica, definindo universalmente valores aceitos como normais e dando subsdio para melhorar a aplicao das biotcnicas da reproduo. Agradecimentos Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (FUNCAP), pelo suporte financeiro. Referncias Amann R, Katz DF. Reflections on CASA after 25 years. J Androl, v.25, p.317-325, 2004. Amann RP, Hammerstedt RH. Validation of a system for computerized mensurements of spermatozoal velocity and percentage of motile sperm. Biol Reprod, v.23, p.6478-645, 1980. Budworth PR, Ammann RP, Hamersted RH. A microcomputer photographic method for evaluation of motility and velocity in bull sperm. J Dairy Sci, v.70, p.1927-1936, 1987. Cancel A, Lobdell D, Mendolo P, Perreault D. Objective avaliation of hyperactivated motility in rat spermatozoa using computer-assisted sperm analysis. Hum Reprod, v.15, p.1322-1328, 2000. Cox JF, Alfaro V, Montenegro V, Rodriguez-Martinez H. Computer-assisted analysis of sperm motion in goats and its relationship with sperm migration in cervical mucus. Theriogenology, v.66, p. 860-867, 2006. Davis RO, Katz DF. Operational standards for CASA instruments. J Androl, v.14, p.385-395, 1993. Donald TS, Hickman R, Hoskins DD. Description, validation and performace characteristic of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biol Reprod, v.38, p.577-586, 1988.

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