Sequenciamento de DNA em MegaBACE DNA Analysis Systems

Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto

ls_pinto@hotmail.com

TGTGAACACACGTGTGGATTGG...

Sequenciamento do DNA Definio

Identificao da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA.

Importncia
O conhecimento da seqncia de bases de um gene fornece importantes informaes sobre sua estrutura, funo e relao evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes).

O organismos Os i possuem padres d

As molculas tambm tambm.

Histrico O sequenciamento de DNA no tempo

Watson & Crick Nobel 1962

Histrico O sequenciamento de DNA no tempo

Frederick Sanger Prmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980 J. Mol. Biol. v.94, p. 441-448, 1975

Walter Gilbert Prmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980 PNAS, vol. 74 No. 2 p. 560-564, 1977

Tecnologias de sequenciamento
- Maxam & Gilbert, mtodo qumico qumico- 1972 - Sanger sequencing - PNAS 74 (1977) (1977), n n. 12 12, 5463 5463-5467 5467 - Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas) - Pirosequenciamento - Science 281 (1998) (1998), n. n 5375, 5375 363-365 - Nature 437 (2005), 362-7 - Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)

Mtodos de Seqnciamento q

Mtodo dideoxi dideoxi de F. Sanger

Dezembro de 1977:
Tambm chamado de Mtodo de Terminao da Cadeia; Baseado na utilizao de um anlogo ao dNTPs, o ddNTP:

Reao de polimerizao

OH

Reao de sequenciamento com radioistopos

Reao de sequenciamento e marcao do DNA

Leitura das sequncias Manual Radioistopos Leitura das sequncias A Automtica i Fluorescenas

Eletroforese

em placa l capilar p

Reao de sequenciamento e leitura automatizada

anelamento dos primers p

desnaturao

Exemplo p de gel g utilizado nos seqenciadores q de placa p (ex.: ( 377). ) A diferena de tamanho permite a separao dos grupos de fragmentos, e esta distribuio normal da passagem dos fragmentos representada pelo g (ou ( cromatograma) g ) de cada seqncia q (read). ( ) eletroferograma

Generic Sequencing Instrument

Electrical Field

Laser

GCTATAGTTGATTCCT

DYEnamic ET Terminators Pr Mix

Energy Transfer Dyes Fluorescein Donor Dye Standard Rhodamine Acceptor Dyes
Fluorescein R110 ddGTP Fluorescein-R110Fluorescein-R6G-ddTTP Fluorescein-TAMRA-ddATP Fluorescein-ROX-ddCTP

N+
CO 2

ddNTP
Ar+ Laser

Transferncia de energia aumenta t a fluorescncia fl i

OH

Radiationless
O
CO 2 Energy Transfer

N+
CO 2

ddNTP

DYEnamic ET terminator - espectro de emisso

100% %

Norm malized Fluo orescence E Emission (Excitation n at 488 nm m)

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

Organizando as Seqncias de DNA

5 5 3 3

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTTACT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT T ATGCTTCT ATGCTTC T ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTC TGGCAGATCT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTC TGGCAGATCTGAACAGTGTT T ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTC TGGCAGAT T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Leitura da seqncia de DNA

Pirosequenciamento q
Science 281 (1998), n. 5375, 363-365

Pirosequenciamento q
Ronaghi et al., 1996, 1998. Monitoramento em tempo real da sntese de DNA: Sntese com primers pela DNA polimerase; A incorporao monitorada pela deteco luminosa da liberao do PPi, em uma reao envolvendo a enzima Luciferase; Complexo com 4 Enzimas includas:
Fragmento Klenow da DNA Polimerase I; ATP Sulfurilase; Luciferase; Apyrase. Apyrase

Os Substratos:
Fosfosulfato de adenosina (APS); D-Luciferina; D L if i O DNA molde de seqenciamento com um primer anelado.

Os 4 nucleotdeos so adicionados, um de cada vez, iterativamente, em uma maneira cclica.

Seqenciamento q 454
Ligao dos fragmentos a pequenas esferas (beads), e realizao de uma PCR em emulso, resultando em 10 milhes de cpias de DNA molde em cada bead.

DNA genmico g isolado, , fragmentado, ligado a adaptadores e separado em ssDNA

Quebra da emulso, desnaturao das fitas de DNA e deposio das beads em slide de fibra tica Pequenas Beads, com as enzimas necessrias ao piroseqenciamento imobilizadas, so depositadas em cada poo.

O sequenciador 454

Cmara de fluxo contendo as amostras e as fibras pticas (1,6 milhes/slide) Bombeamento de fludos

Cmera de d CCD

Computador

Um pmol de DNA numa reao de pirosequenciamento produz 1011 molculas de ATP gerando mais de 109 ftons, com comprimento de onda de 560 nm, nm em um perodo de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma cmera de CCD.

Pirosequenciamento q

http://www.roche-appliedscience.com/publications/multimedia/genome_sequencer/flx_mul timedia/wbt.htm

Pirograma

Illumina/Solexa Ill i /S l Genome G Analyzer A l Sequenciamento por sntese + clustering PCR

- O adaptador d d permite i que o DNA se li ligue a uma placa l na superfcie dos canais de fluxo; -PCR em fase slida permite que as molculas resultantes de uma PCR fiquem q prximas. Ciclo repetido p p vrias vezes; -Adio de polimerase, primers e de nucleotdeos, marcados por fl f fluorforos, com o 3OH inativado i ti d - adio di de d um nucleotdeo l td por vez. Aps incorporao, h a deteco do fluorforo, reverte-se a inativao do 3 3OH OH e e retira-se retira se o fluorforo fluorforo. Ciclo se repete. repete

Sequenciamento q por sntese com p Illumina Solexa

http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=HtuUFUnYB9Y&feature=related

Sequenciamento por sntese com Illumina Solexa

Sequenciamento por sntese com Illumina Solexa

Sequenciamento q usando nanotecnologia g

Sequenciamento q usando nanotecnologia g

http://www.youtube.com/watch?v=pKi30ai35mU

Sequenciamento q usando nanotecnologia g

http://www.nanoporetech.com./

http://www.youtube.com/watch?v=HbjAMJehSlg

Applied Biosystems SOLiDTM Sequencer q

http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp

Applied Biosystems SOLiDTM Sequencer q

- O adaptador ligado ao DNA e a grnulos magnticos. Ocorre PCR em emulso l e as fitas fi de d DNA so d depositadas i d numa placa, l - Ligao de primer universal n ao adaptador e de ligos degenerados (7 bases) marcados contendo duas primeiras bases fixas, do sinal, clivagem g das duas ltimas bases e - Ocorre deteco adio de novos ligos, - Ao fim de n rounds, a fita resultante liberada e h a ligao de um novo primer i universal, i l (agora ( n-1). 1) Ciclo Ci l se repete mais i trs vezes (at n-4). http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp

Applied Biosystems SOLiDTM Sequencer

Sanger vs Pirosequenciamento
SANGER Outros tipos

Depende de clonagem em bactria (2 semanas de trabalho) 1 milho de pb em 24 horas Reads de ~700 bp Clones de fita dupla permitem seqenciamento em ambas direes (facilita orientao i t e montagem) t ) 6 meses de sequenciamento, 24 horas p por dia, ,p para sequenciar o genoma de um fungo

No h clonagem 25 milhes de bp em 4 horas (100x mais rpido) Reads de ~100 bp Fragmentos fita simples no permitem seqenciamento em ambas direes 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Concluso : a unio faz a fora

PNAS 103 (2006), 11240

Anlise dos resultados por Bioinformtica

Montagem g

Limpeza das seqncias: remoo de seqncias ribossmicas, ribossmicas remoo de seqncias de vetor, remoo da regio de poliA, corte por qualidade, eliminao das derrapagens

O programa PHRED l o chromatograma identificando e dando uma ma nota para cada base que forma a sequncia : 0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...
Genome Research 8 (3) (1998), 175-185

background

- A identificao id ifi dos d picos i feita f i atravs de d uma transformada f d de d fourier do sinal - A nota ligada com a resoluo entre os picos vizinhos e a altura do background

Analisando o cromatograma Regio de qualidade alta

Picos bem definidos e grandes. Linha de base boa. Distncia entre picos anterior e posterior constante constante.

Regio de qualidade mdia poucas ambigidades

Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho mdio. Linha de base boa a razovel. Distncia entre picos anterior e posterior razovel razovel.

Regio de qualidade baixa baixa confiabilidade

Picos mal definidos e de tamanho pequeno. Li h de Linha d base b confusa. f Distncia entre picos anterior e posterior inconstante.

- Sequenciamento produz seqncias da ordem de 500 pb

Onde q a nota phred e P a probabilidade encontrar uma base errada : - Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%) - Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)

Qualidade DNA Fundamental para o sequenciamento Sequenciador Capilar

Minipreps - Plasmdeos
100 - 200 ng DNA / reao

PCR sequenciamento
100 - 400 ng DNA / reao
L 1 2 L 1Kb plus 1 PCR purificada em coluna (conc. adequada d d para MegaBACE) M BACE) 2 PCR purificada em coluna (pouco DNA para sequenciar no MegaBACE) G l de Gel d agarose 1%, 1% 3ul 3 l de d PCR

1859: Charles Darwin A Origem das Espcies

1831-1836: 83 836: V Viagem age do Beagle eag e

2004-2006: Viagem do Sorcerer II

Animaes

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangerseq.html http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html http://www dnalc org/ddnalc/resources/cycseq html http://www.biomolweb.kit.net/pages_html/sequencing.html