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Secretaria do Meio Ambiente do Estado de So Paulo Instituto de Botnica - Ncleo de Pesquisa em Ficologia

FERNANDA RIOS JACINAVICIUS, WATSON ARANT ES GAMA JNIOR, MARIA TERESA DE PAIVA AZEVEDO & CLIA LEITE SANTANNA

MANUAL PARA CULTIVO DE


CIANOBACTRIAS

CONTEDO
INTRODUO COLEO DE CULTURA DO INSTITUTO DE BOTNICA (CCIBT) INFRAESTRUTURA E EQUIPAMENTOS PLANEJAMENTO DO LABORATRIO EQUIPAMENTOS PARA ESTERILIZAO PARA PREPARO E CONSERVAO DOS MEIOS DE CULTIVO PARA TRANSFERNCIA E INOCULAO DAS CIANOBACTRIAS PARA CULTIVO E MANUTENO DAS CEPAS MTODOS PARA LAVAGEM E ESTERILIZAO LAVAGEM DE VIDRARIA ESTERILIZAO DE VIDRARIA ESTERILIZAO DOS UTENSLIOS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NO ISOLAMENTO MEIOS DE CULTURA PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE CULTURA BG-11 PROCEDIMENTO BG-11 CONCENTRADO PROCEDIMENTO BG-11 PARA USO IMEDIATO PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE CULTURA ASM-1 PROCEDIMENTO ASM-1 CONCENTRADO PROCEDIMENTO ASM-1 PARA USO IMEDIATO PROCEDIMENTO MEIO SLIDO PROCEDIMENTO MEIO LQUIDO E SLIDO COM CICLOHEXIMIDA DISTRIBUIO DOS MEIOS DE CULTURA DESCARTE DO MATERIAL CULTIVADO CULTIVO E ISOLAMENTO PROCEDIMENTO PARA O ISOLAMENTO DAS CEPAS PLAQUEAMENTO PESCARIA 1 2 3 3 4 4 5 5 5 6 6 7 7 8 8 9 10 10 11 12 12 13 13 14 15 15 15 16 17

MANUTENO DAS CEPAS PROTOCOLO PARA LAVAGEM DE CLULAS DE CIANOBACTRIAS COM EXTRAN 0,1% TIPOS DE CULTURA PRODUO DE BIOMASSA ESQUEMA PARA OBTENO DE UMA CULTURA UNIESPECFICA DETERMINAO DAS CURVAS DE CRESCIMENTO DENSIDADE (CLULAS. ML-1) BIOMASSA (BIOVOLUME MM L-1)

18 19 21 21 23 24 24 25

DETERMINAO DAS TAXAS DE CRESCIMENTO, TEMPO DE DUPLICAO E RENDIMENTO CELULAR MXIMO 26 HIGIENIZAO E BIOSSEGURANA REFERNCIAS 26 27

FIGURA 1: ESQUEMA DA TCNICA DE PLAQUEAMENTO............................................................................................ 17 FIGURA 2: ESQUEMA DA TCNICA DE PESCARIA ..................................................................................................... 18 FIGURA 3: ESQUEMA DO PROCESSO DE REPICAGEM ................................................................................................ 19 FIGURA 4: LINHAGEM ANTES E DEPOIS DA LAVAGEM COM EXTRAN 0,1% .................................................................. 20 FIGURA 5: CULTURA BATCH .............................................................................................................................. 21 FIGURA 6: OBTENO DE BIOMASSA ................................................................................................................... 23 FIGURA 7: RESUMO DO ORGANOGRAMA.............................................................................................................. 23 FIGURA 8: CMARA DE FUCHS-ROSENTHAL UTILIZADA PARA CONTAGEM DE CLULAS OU FILAMENTOS E EM DESTAQUE UM DOS
CAMPOS DA CMARA. .............................................................................................................................. 25

TABELA 9: FATORES DE CONVERSO PARA DETERMINAO DO N DE CLULAS. ML .................................................... 25

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T ABELA 1. C OMPOSIO E QUANTIDADE DAS SOLUES ESTOQUES .................................................................. 9 TABELA 2. COMPOSIO DOS METAIS TRAOS ( * ) .................................................................................................. 9 TABELA 3. QUANTIDADES UTILIZADAS PARA O PREPARO DO MEIO PARA USO IMEDIATO ................................................. 11 TABELA 4. COMPOSIO E QUANTIDADE DAS SOLUES ESTOQUES ........................................................................... 11 TABELA 5. QUANTIDADES UTILIZADAS PARA O PREPARO DO MEIO PARA USO IMEDIATO ................................................. 12

INTRODUO As cianobactrias so organismos procariontes capazes de realizar fotossntese oxignica por possurem clorofila a e fotossistema II (Reviers 2006). Atualmente, a taxonomia destes organismos fundamenta-se na chamada abordagem polifsica, isto , a identificao taxonmica de acordo com caractersticas de mltiplas reas de pesquisa, tais como morfologia, ecologia, fisiologia, ultraestrutura e biologia molecular (Komrek 2005). Alm de produtores primrios, as cianobactrias tambm tm grande importncia para o meio ambiente e para a sade pblica, dado que algumas so capazes de formar floraes e produzir toxinas (SantAnna et al. 2008), alm de geosmina e MIB (2-metil isoborneol) que causam forte odor na gua (Tanaka et al. 1996). Adicionalmente, muitas espcies tm demonstrado capacidade de produzir grande diversidade de substncias com propriedades bioativas (Gault & Marler 2009). Contudo, nem a taxonomia polifsica e tampouco a investigao de toxinas, compostos causadores de odor e bioativos seriam possveis sem o cultivo das cianobactrias. Inicialmente, as pesquisas envolvendo estudos em cultura eram voltadas principalmente para investigaes taxonmicas e ecofisiolgicas. Contudo, com o avano da interdisciplinaridade, estudos de biotecnologia revelaram um potencial at ento desconhecido das cianobactrias. Mais recentemente, o conhecimento sobre protemica e genmica ampliou muito o entendimento sobre a evoluo destes organismos, sendo isso possvel graas ao cultivo desses procariotos. No Brasil, o primeiro manual sobre cultivo de microalgas foi desenvolvido por Vieira (1977), sendo uma adaptao de vrias tcnicas amplamente utilizadas em outros pases e voltadas para o cultivo do fitoplncton marinho. Desde ento, outros trabalhos descrevendo tcnicas para cultivos de microalgas foram desenvolvidos no Brasil (Vieira & Tundisi 1979, Loureno 2006), todos tratando do cultivo de microalgas aquticas em geral, tanto marinhas como de gua doce. Na literatura brasileira no h um compilado especfico de tcnicas de cultivo voltado apenas para cianobactrias, sendo estas informaes encontradas dispersas em dissertaes/teses e artigos cientficos. Conforme Loureno (2006), os bancos de cultura de cianobactria existentes no Brasil so os seguintes:

Coleo de Cultura do Instituto de Botnica (CCIBt) Instituto de Botnica de So Paulo (IBt) Laboratrio de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactrias (LETC) - Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho (UFRJ) Brazilian Cyanobacteria Collection (BCCUSP) Universidade de So Paulo (USP) Laboratrio de Cincias Ambientais Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Coleo de Culturas de Microalgas de gua Doce Universidade Federal de So Carlos (UFSCar) Coleo de Culturas do Laboratrio de Ecologia Molecular de Cianobactrias (CENA) Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA) Coleo de Cultura de Cianoprocariotos (CCC) Universidade Estadual de So Paulo (UNESP- So Jos do Rio Preto) Unidade de Pesquisas em Cianobactrias (UPC) Fundao Universidade Federal do Rio Grande (FURG) Visando disseminao das tcnicas de cultura, este manual tem como objetivo descrever mtodos para o estabelecimento e manuteno de laboratrios para o cultivo de cianobactrias.

COLEO DE CULTURA DO INSTITUTO DE BOTNICA (CCIBT) A Coleo de Cultura do Instituto de Botnica (CCIBt) possui culturas de trs grupos distintos de organismos: fungos, cianobactrias e macroalgas marinhas. As culturas de cada grupo so coordenadas separadamente: Dra. Clia Leite SantAnna, responsvel pelas culturas de cianobactrias, Dra. Nair Sumie Yokoya, responsvel pelas culturas de macroalgas marinhas e Dra. Marina Capelari/Dra. Carmen L.A.P. Zotarelli/Msc. Marcela Castilho Boro responsveis pelas culturas de fungos. O laboratrio no qual mantido o cultivo de cianobactrias e macroalgas marinhas denominado Marilza Cordeiro Marino em homenagem pesquisadora que iniciou a estruturao do laboratrio e os estudos em cultura de algas marinhas no Instituto de Botnica.

O cultivo de cianobactrias no Instituto de Botnica iniciou-se em 1986 com as Dras. Maria Teresa P. Azevedo e Clia L. SantAnna, sendo utilizado como ferramenta complementar para a taxonomia (Yokoya & Azevedo 2002). As primeiras cepas depositadas na coleo foram isoladas de diversos corpos dgua do estado de So Paulo, sendo a maioria de espcies planctnicas. Recentemente, alm dos ambientes aquticos, vrias cepas tm sido isoladas de ambientes terrestres, principalmente da Mata Atlntica e Pantanal, alm de algumas cepas do cerrado. Hoje, a CCIBt possui 479 linhagens de cianobactrias isoladas de diferentes ecossistemas brasileiros, incluindo ambientes aquticos e terrestres. Com a consolidao do laboratrio e ampliao das linhas de pesquisa, estas linhagens vm sendo utilizadas em estudos ecofisiolgicos, toxicolgicos e de bioprospeco, alm de serem ferramentas em estudos de taxonomia e biologia molecular.

INFRAESTRUTURA E EQUIPAMENTOS

PLANEJAMENTO DO LABORATRIO

Para o cultivo apropriado de cianobactrias, o ideal contar com quatro salas distintas: o Sala para preparo dos meios: deve contar com bancadas, pia e armrios para armazenar, separadamente, vidrarias e reagentes. Equipamentos como potencimetro, agitador magntico e balana analtica tambm devem estar presentes nesta sala. Ressalta-se que a balana analtica deve ficar numa bancada anti-vibratria separada daquelas utilizadas para preparo dos meios e solues. o Sala para repicagem e isolamento: esta sala deve conter apenas a cmara de fluxo laminar, uma bancada de suporte, microscpio e ar condicionado. o Sala para manuteno das culturas: local onde sero mantidas as cepas. Esta sala deve ter acesso restrito e condies controladas (temperatura, fotoperodo e luminosidade).

Alternativa A sala de cultivo pode ser substituda por cmaras de cultivo. uma opo quanto h falta de espao disponvel ou quando preciso manter cepas em diferentes condies. o Sala de lavagem: nesta sala ficam a pia principal para lavagem da vidraria, a estufa para secagem de vidraria, alm de outros itens de laboratrio. Dentre os principais equipamentos dispostos nesta sala tm-se a autoclave e o destilador de gua, que ficam em rea prxima janela e existe ventilador de teto para circular o ar. Ateno: importante separar todos estes equipamentos dos demais devido elevada umidade e calor gerados por eles, o que pode levar a oxidao de outros equipamentos e problemas com fungos nas outras salas. A osmose reversa uma tima alternativa ao destilador de gua convencional, sendo um equipamento que produz gua de melhor qualidade e diminui bastante o desperdcio.

EQUIPAMENTOS

PARA ESTERILIZAO

o Autoclave esterilizao de vidraria, meios de cultura e descarte das cepas. o Cmara de fluxo laminar, equipada com: o Bico de Bunsen esterilizao de materiais utilizados no momento da transferncia e inoculao das cianobactrias. o Lmpada germicida (UV) esterilizao do fluxo laminar e da sala de repicagem e isolamento. o Estufas para esterilizao e secagem. o Estojos para autoclavagem de pipetas e tubos.

PARA PREPARO E CONSERVAO DOS MEIOS DE CULTIVO o Vidraria Erlenmeyer: 50 mL, 100 mL, 200 mL, 500 mL, 1L, 2L e 4L; Proveta: 50 mL, 100 mL, 500 mL, 1L e 2L; Pipeta graduada: 5 mL, 10 mL e 20 mL; Balo Volumtrico: 1L e 2L; Becker: 100 mL, 200 mL, 500 mL, 1L. o Agitador magntico o Potencimetro o Balana analtica o Frascos plsticos: 100 mL, 500 mL, 1L e 2L o Freezers o Refrigeradores o Pra de suco

PARA TRANSFERNCIA E INOCULAO DAS CIANOBACTRIAS o Alas de nquel cromo o Agulhas de inoculao o Pipetas Pasteur de vidro o Ala de Drigalski o Bulbo de borracha para pipetas Pasteur

PARA CULTIVO E MANUTENO DAS CEPAS o Sala de cultivo e/ou cmara de cultivo o Tubos de ensaio o Placas de Petri o Parafilm o Rolhas de gaze e algodo hidrfobo ou rolha plstica o Grades para tubos de ensaio

o Prateleiras com lmpadas luz do dia para manuteno de cepas e crescimento de

cianobactrias.

Para obteno de biomassa: o Erlenmeyer de 6L e 9L o Rolhas para Erlenmeyer com sada de ar o Compressor de ar/ Bomba de aqurio o Mangueiras para conduo de ar o Filtro de ar o Agitador

MTODOS PARA LAVAGEM E ESTERILIZAO

LAVAGEM DE VIDRARIA A lavagem da vidraria, seja ela nova ou j de uso rotineiro do laboratrio, deve obedecer seguinte sequncia: Imerso em soluo de cloro ativo com concentrao entre 2 e 2,5% por 12 horas para desinfeco; Lavagem manual com sabo no residual (Extran ou similar) para remover os resqucios mais grosseiros como material orgnico ou gar aderido no interior na vidraria; Enxgue em gua corrente at que todo sabo seja retirado; Enxgue em gua destilada, no mnimo trs vezes, para remoo de possveis sais deixados pelo sabo ou pela gua da torneira; Secagem em estufa a temperatura aproximada de 60C; Embalagem da vidraria com filme PVC transparente; Estocagem das vidrarias devidamente embaladas em armrios fechados.

ESTERILIZAO DE VIDRARIA A vidraria previamente lavada deve ser esterilizada pouco antes do uso, a fim de se evitar contaminao. O processo de esterilizao deve seguir os seguintes passos: Vedao apropriada da vidraria No caso de tubos de ensaio e Erlenmeyers a vedao pode ser feita com rolhas de gaze e algodo ou com rolhas plsticas autoclavveis; As placas de Petri devem ser envoltas em papel sulfite ou pardo e colocadas em sacos plsticos autoclavveis; Autoclavagem por 30 minutos a 125C e presso de 1,5 atm; Secagem em estufa a temperatura de 60C Neste ponto importante averiguar se as rolhas de gaze e algodo e os papis envoltos nas placas esto devidamente secos, para evitar que futuramente sejam colonizados por fungos. Ressalta-se que toda vidraria autoclavada s deve ser aberta no momento do uso e dentro da cmara de fluxo laminar.

ESTERILIZAO DOS UTENSLIOS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NO ISOLAMENTO Os utenslios no autoclavveis e equipamentos utilizados no isolamento devem ser esterilizados com lmpada germicida (UV) dentro da cmara de fluxo laminar durante, no mnimo, 30 minutos imediatamente antes do uso. Alm disso, os materiais utilizados devem ser limpos com soluo de etanol 70% e aqueles resistentes ao fogo (pinas e alas) devem ser flambados em bico de Bunsen imediatamente antes do uso por cerca de 60 segundos. A lmpada germicida acoplada cmara de fluxo laminar tambm funciona como esterilizador do ar da sala de repicagem. Por este motivo, durante o uso da cmara fundamental que o fluxo de ar entre a sala de repicagem e o ambiente externo seja o menor possvel.

MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura so utilizados com a finalidade de isolar e cultivar as cianobactrias em laboratrio, geralmente em culturas uniespecficas. Um meio de cultura pode ser classificado quanto consistncia como slido ou lquido. O meio slido contm agentes solidificantes (gar) e utilizado para o isolamento. O meio lquido utilizado para a manuteno das cepas e produo de biomassa para anlises diversas. Em relao aos estudos taxonmicos, deve-se atentar para o meio utilizado no cultivo, pois a cepa pode apresentar morfometria distinta segundo a consistncia ou/e composio do meio. Alguns dos meios comumente utilizados para cultivo de cianobactrias so: Meio BG-11 Meio ASM-1 lquido; slido (com ou sem cicloheximida) lquido; slido (com ou sem cicloheximida)

A utilizao de diferentes meios de cultura em diferentes condies motivada pelas distintas concentraes e tipos de nutrientes, o que propiciam as condies nutricionais adequadas especficas para alguns grupos de cianobactrias. A cicloheximida um antibitico usado para eliminar organismos eucariontes, facilitando
o isolamento de cianobactrias.

PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios so preparados em trs etapas: 1. So preparadas as solues que compem o meio com concentrao 100:1 que so suficientes para um perodo aproximado de 12 meses e so armazenadas em frascos plsticos e levadas para o freezer, onde permanecem congeladas at o momento de uso (chamadas solues-estoque - tabelas 1 e 2); 2. A partir das solues estoque preparado o meio concentrado que render 20 L de meio para uso imediato; 3. A ltima etapa, o preparo do meio para uso imediato, onde o meio concentrado descongelado e em seguida diludo em gua deionizada (tabela 3).

PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE CULTURA BG-11 (RIPPKA, R. 1979)

Tabela 1. Composio e quantidade das solues estoques NUTRIENTES - Solues Estoque EDTA (C10H16N2O8) Citrato frrico amoniacal (C6H8O7 x Fe 3+ + yNH3) Soluo de metais traos * Nitrato de Sdio (NaNO3) Fosfato cido dipotssio trihidratado (K2HPO4 + 3H2O) Sulfato de magnsio heptahidratado (MgSO4 + 7H2O) Cloreto de clcio dihidratado (CaCl2 + 2H2O) Carbonato de sdio (Na2CO3) cido ctrico (C6H8O7+ H2O) Quantidade (g) 0,1000 0,6000 ( *) 150,0000 4,0000 7,5000 3,6000 2,0000 0,6000

Tabela 2. Composio dos metais traos (*) Solues Estoque H3BO3 MnCl2 + 4H2O ZnSO4 + 7H2O NaMoO4 CuSO4 + 5H2O Co(NO3)2 + 6H2O Quantidade (g) 2,8600 1,8100 0,2220 0,3900 0,0790 0,0494

Estes compostos so diludos em 1.000 mL de gua deionizada e as solues formadas so armazenadas no freezer em frascos plsticos.

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PROCEDIMENTO BG-11 CONCENTRADO Para render 20 L de meio de cultura: 200 mL da soluo de EDTA; 200 mL da soluo de citrato frrico amoniacal; 20 mL da soluo de metais traos; 200 mL da soluo de NaNO3; 200 mL da soluo de K2HPO4 + 3H2O; 200 mL da soluo de MgSO4 + 7H2O; 200 mL da soluo de CaCl2 + 2H2O; 200 mL da soluo de Na2CO3; 200 mL da soluo de cido Ctrico. Adicionar todas as solues acima e nesta sequncia, especialmente os dois primeiros porque do contrrio o ferro precipita, em um Erlenmeyer com volume suficiente para a agitao do meio (utilizar agitador magntico). Feito isto, preciso ajustar o pH da soluo que deve ser 7,4, adicionando HCl (cido clordrico) 1M para acidificar o meio e NaOH (hidrxido de sdio) 1M para elevar o pH. Seguidas todas as etapas, o meio de cultura concentrado guardado no freezer at ser diludo para uso.

PROCEDIMENTO BG-11 PARA USO IMEDIATO Descongelar o meio BG-11 concentrado e acrescentar gua deionizada dependendo da quantidade a ser utilizada. importante lembrar que a gua deionizada no pode ser estocada, pois perde sua validade de ser isenta de sais. Portanto deve-se recolher a gua apenas no momento de uso. Adicionada gua e completando o volume de meio, agita-se bem para homogeneizar.

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Tabela 3. Quantidades utilizadas para o preparo do meio para uso imediato gua Deionizada (mL) 50 100 200 500 1.000 5.000 Meio Concentrado (mL) 4,05 8,1 16,2 40,5 81 405

PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE CULTURA ASM-1 Modificado de Gorham et al. (1964) e Zagatto & Arago (1992). Tabela 4. Composio e quantidade das solues estoques Solues Estoque Sol. A NaNO3 MgSO4 + 7H2O MgCl2 + 6H2O CaCl2 + 2H2O Sol. B KH2PO4 Na2HPO4 + 12H2O Sol. C H3BO3 MnCl2 + 4H2O FeCl2 + 6H2O ZnCl2 CoCl2 + 6H2O CuCl2 + 2H2O Sol. D EDTA titriplex Nutrientes Quantidade (g) 8,5000 2,4500 2,0500 1,4500 8,7000 17,8000 28,4000 13,9000 10,8000 3,3500 0,1900 0,0140 18,6000

Para cada soluo (A, B, C e D) os compostos so diludos em 1.000 mL de gua deionizada e armazenados no freezer em frascos plsticos.

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PROCEDIMENTO ASM-1 CONCENTRADO Para render 20 L de meio so necessrios: 400 mL de soluo - estoque A; 40 mL de soluo - estoque B; 2 mL de soluo - estoque C; 8 mL de soluo - estoque D; Adicionar todas as solues acima e nesta sequncia em um Erlenmeyer com volume suficiente para a agitao do meio (utilizar agitador magntico). Feito isto, preciso ajustar o pH da soluo que deve ser 7,4, adicionando HCl (cido clordrico) 1M para acidificar o meio e NaOH (hidrxido de sdio) 1M para elevar o pH. Seguidas todas as etapas, o meio de cultura concentrado guardado no freezer at ser diludo para uso.

PROCEDIMENTO ASM-1 PARA USO IMEDIATO O modo de preparo para os meios ASM-1 (lquido/slido/cicloheximida) idntico ao procedimento anteriormente descrito para o meio BG-11. O que modifica so apenas as concentraes dos nutrientes (Tabela 5). Tabela 5. Quantidades utilizadas para o preparo do meio para uso imediato gua Deionizada (mL) 50 100 200 500 1.000 5.000 Meio Concentrado (mL) 1,125 2,250 4,500 11,25 22,50 112,50

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PROCEDIMENTO MEIO SLIDO Para o preparo do meio slido, deve-se pesar 10g de gar para cada 1.000 mL de meio de cultura. Para dissolver a mistura, so utilizados dois mtodos: autoclavagem ou banhomaria, dependendo do recipiente a ser utilizado.

PROCEDIMENTO MEIO LQUIDO E SLIDO COM CICLOHEXIMIDA Meio lquido A quantidade de cicloheximida indicada no mtodo de 50 mg/L. Para preparar o meio lquido, deve-se dissolver o meio concentrado normalmente, autoclavar e deixar que esfrie at aproximadamente 50C. Isso importante, pois a cicloheximida perde atividade acima desta temperatura. Em seguida, o antibitico deve ser adicionado ao meio dentro da cmara de fluxo laminar, a fim de evitar contaminao. Quantidade de meio diludo (mL) 1.000 500 300 100 Quantidade de Cicloheximida (g) 0,05 0,025 0,015 0,005

Meio slido Para preparar 1.000 mL de meio, utilizamos 1 Erlenmeyer de 2.000 mL e outro de 1.000 mL. (A quantidade de cicloheximida indicada no mtodo de 50 mg/L e o gar de 10 g/L.) Pesar a cicloheximida e o gar, reservar; Medir meio concentrado (81 mL de meio BG-11 ou 22,50 mL de meio ASM-1) e diluir em 500 mL de gua deionizada, reservar;

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Reservar tambm 500 mL de gua deionizada; No Erlenmeyer de 2.000 mL, colocar o gar (10g) e a gua deionizada (500 mL); No Erlenmeyer de 1.000 mL, colocar o meio concentrado diludo em 500 mL de gua; Levar ambos os Erlenmeyers para a autoclave durante 30 minutos, a 125C e 1,5 atm. Aps este perodo, resfriar o Erlenmeyer que contm o meio at aproximadamente 50C para que a cicloheximida possa ser dissolvida sem perder suas propriedades; Em seguida, levar os dois Erlenmeyers para o fluxo laminar e adicionar a cicloheximida naquele com meio e agitar at dissolver totalmente. Posteriormente, transferir o meio com cicloheximida para o Erlenmeyer que contm o gar, homogeneizar levemente e ento distribuir em placas de Petri previamente esterilizadas.

DISTRIBUIO DOS MEI OS DE CULTURA Os meios lquidos so distribudos em tubos de ensaio, num volume de 17 mL para cada tubo; em seguida so tampados com rolhas de algodo com gaze e ento autoclavados durante 30 minutos. Depois de retirados da autoclave e atingirem temperatura ambiente esto prontos para uso ou ento so guardados na geladeira em temperatura de 8C. Os meios slidos so distribudos em dois recipientes diferentes: tubos de ensaio e/ou placas de Petri. Tubos de ensaio: o meio preparado colocado em banho-maria at dissolver, feito isso o meio deve ser rapidamente distribudo nos tubos antes do seu resfriamento, o que dificultaria a distribuio uniforme. Aps distribuio, os tubos so tampados e autoclavados. Quando sarem da autoclave, devero ser resfriados inclinados a fim de aumentar a superfcie para o crescimento das cianobactrias, facilitando a visualizao do crescimento sem ter necessidade de abrir o tubo. Placas de Petri: o meio preparado autoclavado antes da distribuio e s deve ser colocado nas placas dentro da cmara de fluxo laminar.

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Ainda dentro da cmara de fluxo laminar, as placas permanecem semi-abertas at que o meio chegue temperatura ambiente e solidifique e no forme condensao na tampa. Em seguida so fechadas, embrulhadas em papel e guardadas em geladeira com a tampa para baixo, evitando assim que o meio fique mido.

DESCARTE DO MATERIAL CULTIVADO

O material a ser descartado, tanto aquele mantido em meio slido como lquido, deve ser retirado das condies de cultivo e mantido isolado em seu recipiente original at que o processo de descarte seja finalizado. Para tanto, os tubos (com as rolhas) e placas de Petri (sem o parafilm) devem ser autoclavados em temperatura de 125C e presso de 1,5 atm. Em seguida o material descartado e os recipientes so colocados imersos em soluo de cloro ativo com concentrao entre 2 e 2,5% por cerca de 12 horas, sendo lavados normalmente em seguida. Tal procedimento de suma importncia para a segurana das pessoas que manipulam o material e para evitar contaminao do laboratrio e do meio ambiente atravs da produo de resduos.

CULTIVO E ISOLAMENTO PROCEDIMENTO PARA O ISOLAMENTO DAS CEPAS H dois mtodos bsicos para o isolamento das cianobactrias em cultura: plaqueamento e seleo por capilar (pescaria). Ambos so eficazes, porm algumas cepas no se adequam bem ao meio slido e a tcnica de pescaria requer prtica e pacincia. Para se obter melhor resultado, recomenda-se que os procedimentos de isolamento sejam feitos na maior variabilidade possvel de meios, a no ser que se saiba previamente qual o melhor para o cultivo da cepa de interesse. A seguir os mtodos so detalhados:

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PLAQUEAMENTO Coloca-se nas placas de Petri os meios de cultura, ASM-1 ou BG-11, slidos e com cicloheximida; Na cmara de fluxo laminar, homogenizar a amostra e colocar trs gotas de material sobre o meio slido, espalhando uniformemente com o auxilio da ala de Drigalski ou basto, previamente flambados no bico de Bunsen. importante que, ao se espalhar o material, no haja sobreposio de inculo (figura 1); Aps inoculao, as placas so vedadas com parafilm e colocadas na sala de cultivo. importante que a parte na qual se encontra o meio esteja para cima, pois comum que na tampa acumule gua, o que pode ocasionar contaminao; Cada placa com o inculo deve ser etiquetada com informaes relevantes como local e data de coleta, data do plaqueamento e meio utilizado, ou algum cdigo que resuma estas informaes; Aps 2-3 semanas possvel visualizar o crescimento de diferentes massas de cianobactrias. Nesse exame (visualmente e depois ao microscpio) so analisadas: cor, estrutura, e consistncia do crescimento. Os diferentes crescimentos so marcados e colnias isoladas ou pequenas fraes dos crescimentos so retirados com o auxlio de uma ala metlica e ento so inoculados em um tubo de ensaio contendo meio lquido; Estas placas ainda so mantidas para isolamento, pois algumas cianobactrias tm crescimento lento e sero visveis apenas aps 30 ou mais dias aps o plaqueamento.

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Figura 1: Esquema da tcnica de plaqueamento

Caso no ocorra o isolamento aplica-se novamente a tcnica, at que se obtenha culturas uniespecificas.

PESCARIA Flamba-se uma lmina de vidro, espera-se esfriar e em seguida coloca-se uma gota da amostra e vrias gotas de meio de cultura estril (figura 2); Ao microscpio, visualiza-se o espcime a ser isolado, escolhendo-se

preferencialmente um que esteja numa rea limpa; Para formao do capilar, afina-se uma pipeta Pasteur na chama do bico de Bunsen, quebrando-se a ponta de acordo com o tamanho do organismo de interesse selecionado; Aps a pescaria do organismo, passa-se o espcime pescado para a gota de meio estril, sendo esse procedimento repetido at que se obtenha apenas o indivduo de interesse;

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Em seguida feita a transferncia para o tudo de ensaio contendo meia carga de meio de cultura (cerca de 8 mL);

Se for necessrio, utilizar mais de uma lmina e deve-se fazer o processo da mesma forma. Pode acontecer que o organismo selecionado no se desenvolva, tanto pela sua

fragilidade ou pela perda do mesmo durante o processo. Assim, o ideal que sejam feitos vrios tubos, em mdia 5 para cada cepa.

Amostra com vrios indivduos

Gota com apenas o indivduo que ser inoculada no tubo de ensaio com meio de cultura

Figura 2: Esquema da tcnica de pescaria MANUTENO DAS CEPAS Cada cultura uniespecifica deve ser mantida em trplicas em tubos de ensaio contendo 17 mL de meio de cultura, sob condies controladas. No caso da coleo de culturas de cianobactrias do Instituto de Botnica, as condies so as seguintes: temperatura 232
o

C, irradincia 40-50 mol ftons m-2.s-1 e

fotoperodo 14-10h claro-escuro. Dos trs tubos, um mais antigo (repicagem anterior) e os outros dois so da repicagem atual, portanto tm a mesma data. A troca do meio de cultura feita aproximadamente a cada 30 dias, seguindo o procedimento abaixo (figura 3): Dentre os tubos com a mesma data escolhe-se um para funcionar como inculo e os outros dois so descartados; A partir do tubo escolhido so feitas duas repicagens em tubos com meios novos, resultando nos trs tubos a serem mantidos;

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importante que se mantenha o tubo com a cultura antiga por segurana, pois a repicagem pode falhar;

Figura 3: Esquema do processo de repicagem

PROTOCOLO PARA LAVAG EM DE CIANOBACTRIAS COM E XTRAN 0,1%

CLULAS

DE

(Protocolo desenvolvido por Ricardo Y. Honda e Elaine Crespim Centro de Energia Nuclear na Agricultura, CENA-USP) O objetivo das lavagens com Extran dissolver e eliminar grande parte da mucilagem produzida por cianobactrias, visando a eliminao das bactrias (contaminantes) que crescem endogleicamente (dentro da mucilagem) (figura 4). As lavagens so feitas seguidamente com meio de cultura com o objetivo de retirar o Extran das clulas de cianobactrias e diminuir o impacto causado s mesmas durante o procedimento. Abaixo so descritas todas as etapas: 1. O inculo inicial pode partir de 500 L a 1 mL de cultura em meio lquido, sendo este transferido para um microtubo de 1,5 mL. Para todo o processo, utilizar somente material e solues estreis; 2. Centrifugar os tubos a 5.000 rpm (ou, no mximo, 7.000 rpm) por 5 minutos, para a formao de pellet. Com relao centrifugao, para manter as clulas a temperatura adequada, aconselha-se programar a temperatura da centrfuga para cerca de 20 C. No aumentar a rotao para 10.000 rpm, pois o pellet formado pode ficar compactado demais e no se dissolver novamente; 3. Retirar o sobrenadante com pipeta, se possvel evitando que as clulas que ficaram aderidas parede do tubo sejam retiradas junto. Descartar o

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sobrenadante. Aconselha-se retirar o sobrenadante com pipeta durante todo o procedimento para evitar maior perda de clulas que poderia ocorrer se os tubos fossem virados no frasco de descarte; 4. Suspender o pellet em 500 L de Extran 0,1% e homogeneizar completamente, com cuidado para no lisar as clulas. (Obs.: se durante qualquer parte do protocolo o contedo dos tubos ficar mais azulado, isto pode indicar lise das clulas); 5. Deixar os tubos em repouso por 30 minutos; 6. Adicionar aos tubos 500 L de meio de cultura lquido e homogeneizar cuidadosamente por inverso. Centrifugar por 5 minutos a 5000 rpm; 7. Descartar o sobrenadante. Suspender o pellet novamente em 500 L de Extran 0,1%, homogeneizar e deixar os tubos em repouso por 30 minutos; 8. Adicionar aos tubos 500 L de meio de cultura lquido, homogeneizar, centrifugar a 7000 rpm por 5 minutos e descartar o sobrenadante; 9. Suspender o pellet em 1 mL de meio de cultura lquido, homogeneizar e centrifugar a 7000 rpm por 5 minutos. Descartar o sobrenadante; 10. Suspender o pellet em 500 L de meio de cultura, homogeneizar e centrifugar novamente a 7000 rpm por 5 minutos. Descartar novamente o sobrenadante; 11. Suspender o pellet novamente em 500 L de meio de cultura. Homogeneizar e centrifugar a 5000 rpm por 15 minutos. Descartar todo o sobrenadante e suspender o pellet cuidadosamente em 1 mL de meio de cultura lquido; 12. Transferir essa cultura do micro tubo para Erlenmeyers de 50 mL e deixar as culturas crescendo nas condies apropriadas.

Figura 4: Linhagem antes e depois da lavagem com Extran 0,1%

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TIPOS DE CULTURA

CULTURA BATCH: Volume de meio fixo (sistema fechado), figura 5

CULTURA EM FED- BATCH: Adio gradual de meio (aumento do volume)

CULTURA EM BATCH SEMI-CONTNUA: adio de meio e remoo de meio e clulas (a intervalos pr-estabelecidos)

CULTURA CONTNUA adio de meio e remoo de meio e clulas (contnua)

Figura 5: Cultura Batch PRODUO DE BIOMASSA As cepas uniespecficas e no axnicas tambm so cultivadas em grandes quantidades (figura 6). O processo consiste em 3 etapas e em cada uma delas o inculo em fase exponencial de 10% do volume total do meio. As condies abaixo so usadas nas etapas 1 e 2: Agitao: 70 rotaes por minuto Iluminao: 15-20 mol ftons m-2s-1 Temperatura: 24 1 C

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Fotoperodo: 14-10h claro-escuro

Na etapa 3: Aerao: constante Iluminao: constante Temperatura: 24 1 C Fotoperodo: 14-10h claro-escuro

A produo de biomassa realizada a partir de um repique do banco de cultura, conforme as seguintes etapas: 1) 5 mL de inculo so transferidos para recipiente com 50 mL de meio de cultura: os frascos so mantidos em agitador de bancada com rotao constante (70 rotaes.minuto-1). 2) constatado o crescimento da cultura, transfere-se os 50 mL do inculo para 500 mL de meio, mantendo sempre a mesma rotao mencionada. As cepas ficam sob esta condio durante 1-2 semanas (tempo mdio para que a cultura atinja a fase exponencial de crescimento). Portanto, o inculo inicial para determinao da curva foi retirado na fase exponencial. 3) 500 mL de inculo so transferidos para Erlenmeyer de 6.000 mL com 5.000 mL de meio de cultura. Os Erlenmeyers so colocados na sala de cultivo com iluminao constante, sem rotao, mas com aerao.

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Figura 6: Obteno de biomassa

ESQUEMA PAR A UNIESPECFICA

OBTENO

DE

UMA

CULTURA

Figura 7: Resumo do organograma

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DETERMINAO DAS CUR VAS DE CRESCIMENTO As curvas de crescimento podem ser estabelecidas a partir do biovolume das cianobactrias (mm.L-) ou por nmero de clulas (clulas. mL-1) plotados contra o tempo de cultivo (n=3). Para realizar a contagem de clulas necessrio que a mucilagem seja eliminada para que as clulas fiquem livres no meio e, para isto, utilizamos alguns procedimentos: Para colnias grandes, com muita mucilagem, tratar o cultivo com adio de NaOH 1M na proporo de 2:1 (1 mL da cultura : 0,5 mL de NaOH) e deixar em banhomaria a 60C durante 10 min. Para colnias pequenas, com pouca mucilagem, tratar apenas em banho-maria a 80C, durante 5 min. Obs.: em alguns casos, como colnias que possuem mucilagem difcil de romper, utilizado concentrao de NaOH 2-3M, em banho-maria a 80C, durante 15 min. Fixar as amostras com soluo de formol 4% sempre que a contagem for realizada em outro momento. Contar em cmara de Fuchs-Rosenthal (hemocitmetro) (figura 8). DENSIDADE (CLULAS. ML -1 ) Para determinao das curvas de crescimento realiza-se a contagem das clulas de no mnimo uma rea da cmara, o que corresponde a 16 quadrados da mesma. As contagens so realizadas diariamente ou a cada dois dias, sendo estabelecido um nmero mximo de 400 clulas por contagem (quando exceder este nmero, uma nova contagem ter que ser realizada aps a diluio da amostra). So feitas contagens nos dois lados da cmara e, caso haja diferena maior que 10% entre os lados, tambm realizada uma nova contagem. Para determinao da curva de crescimento de gneros filamentosos so realizadas contagens dos tricomas e este nmero multiplicado pelo nmero mdio de clulas dos tricomas (n=90). As contagens tambm so realizadas diariamente ou a cada dois dias em cmara de Fuchs-Rosenthal, em todo o campo (16 reas) o que corresponde a 256 quadrados da cmara.

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1 rea

Figura 8: Cmara de Fuchs-Rosenthal utilizada para contagem de clulas ou filamentos e em destaque um dos campos da cmara.

A tabela 9 apresenta o fator de multiplicao necessrio para converso do nmero de clulas contadas para n. de clulas. mL-1.

Tabela 9: Fatores de converso para determinao do n de clulas. ML-1 (Honda 2005) rea 1/16 de A 1/8 de A 1/4 de A 1/2 de A 1 A (16 ) 2 A (32 ) 4 A (64 ) 8 A (128 ) 16 A (256 ) N de Clulas.mL-1 n de cel. X 80.000 n de cel. X 40.000 n de cel. X 20.000 n de cel. X 10.000 n de cel. X 5.000

n de cel. X 2.500 n de cel. X 1.250 n de cel. X 625 n de cel. X 312,5

BIOMASSA (BIOVOLUME MM L -1 ) O volume celular (V) pode ser obtido a partir da mdia do comprimento (a) e dimetro (b) de trinta clulas, usando modelos geomtricos aproximados forma das clulas das cianobactrias (Sun & Liu 2003).

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O biovolume total estimado multiplicando-se a densidade celular por seus respectivos volumes (Sun & Liu 2003). Os valores obtidos em m.mL- so divididos por 10-6 para converso em mm.L-.

DETERMINAO DAS TAXAS DE CRESCIMENTO, T EMPO DE DUPLICAO E RENDIME NTO CELULAR MXIMO. Aps a determinao da curva de crescimento, so calculadas as taxas de crescimento (.dia -1) e o tempo de duplicao (G.dia -1) para a fase exponencial de cada cepa analisada. Estas taxas so calculadas com a mdia das contagens dos trs frascos (n=3), segundo as frmulas apresentadas por Fogg & Thake (1987): = ( Ln N- Ln No). (t-to)-1 G= ln 2. -1

a velocidade especfica de crescimento. G o tempo de duplicao celular, calculado a partir de . No o nmero inicial de clulas. mL-1 no tempo inicial to. N o nmero final de clulas. mL-1 no tempo t .

Pode ser calculado tambm o rendimento celular mximo (R), medido em clulas. mL-1, que corresponde ao nmero mximo de clulas menos o nmero de clulas do inculo (Carneiro 2009).

HIGIENIZAO E BIOSS EGURANA Para o bom andamento do trabalho algumas normas gerais de segurana e higiene precisam ser adotadas: - Uso obrigatrio do avental branco em todas as atividades laboratoriais, preferencialmente de algodo; -Desinfeco das superfcies com lcool etlico 70%; -Higiene e desinfeco das mos; - Trabalhar dentro da zona de segurana do bico de Bunsen: recipientes com meios de cultura devem ser abertos prximos chama do bico; -Ao utilizar tringulos, alas e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por flambagem antes e aps cada operao efetuada com as culturas;

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- Evite falar enquanto distribui os meios de cultura para no contamin-los; - Flambar rapidamente a boca dos frascos imediatamente aps abri-los e antes de fechlos; -Use apenas pipetas previamente aultoclavadas e armazenadas em embalagens hermeticamente fechadas; - Nunca pipetar com a boca, o correto usar peras ou pipetadores apropriados.

REFERNCIAS

CARNEIRO, R. L., SANTOS, M. E.V., PACHECO, A. B. F., & AZEVEDO, S. M. F. O. 2009. Effects of light intensity and light quality on growth and circadian rhythm of saxitoxins production in Cylindrospermopsis raciborskii

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