PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANA MEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LQUIDO

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MONTERIA CORDOBA 2008

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INFORMACION GENERAL Produccin de enzimas amilasa microbiana, mediante fermentacin en estado lquido

Ttulo del proyecto Lder principal responsable del proyecto Miembros e integrantes Unidad acadmica Empresa donde realizar el proyecto Fecha de inicio Fecha de finalizacin Costo total del proyecto (incluyendo descargas pago de personal -). Montos de contrapartida (Entidad o dependencia que cofinancia). Lnea de trabajo o rea del conocimiento en la cual se inscribe el proyecto.

Eder Durango Ballesteros

Alfonso Batista Jimnez Ibeth Cepeda Jimnez Hctor Alberto Tobn Guzmn Facultad de Ingeniera Agroindustrial Universidad Pontificia Bolivariana Junio de 2008 Junio de 2009

$ 21.826.281 $ 9.427.881
Desarrollo de nuevos materiales y nuevas aplicaciones

B. RESUMEN El surgimiento de plantas de alcohol carburante de primera generacin a partir de almidn, en la regin Caribe, implica la transformacin de la materia prima por procesos de hidrlisis mediante la accin de un complejo de amilasas capaces de degradarlo en azucares. La implementacin de hidrlisis enzimtica conlleva generar altos costos de produccin, factor que genera una problemtica en las empresas de este gnero y a su vez en buscar soluciones para dicha temtica. Este proyecto tiene el principio de desarrollar e implementar aplicaciones microbiolgicas y biotecnolgicas para la produccin de un complejo de amilasa microbial a partir de fermentacin en un estado liquido, con el objeto de buscar soluciones factibles en cuanto a la problemtica planteada del proceso de hidrlisis del almidn. C. DESCRIPCION DEL PROYECTO:

1. Planteamiento del problema: La tendencia actual y las altas exigencias ambientales han impulsado el desarrollo de nuevas tcnicas agroindustriales. Actualmente, en Colombia se plantea un dficit general en torno a la agroindustria enzimtica a causa de la carencia de investigacin, infraestructura y poca motivacin para desarrollar empresas que basen sus fundamentos en el progreso de este campo de la biotecnologa. Su desarrollo, as como el de otras reas de la biotecnologa, est afectado por problemas como la creciente brecha cientfica y tecnolgica con respecto a los pases industrializados. Segn la firma internacional, Frost & Sullivan, analistas dedicados al estudio de mercados mundiales, el comercio de enzimas esta seccionado en distintos segmentos dependiendo la industria y la aplicabilidad de estas. Segn el estudio, para el ao 2003 se gener cerca de 142 millones de dlares solo en la industria alimenticia siendo el sector ms innovador el de la ingeniera gentica a partir de organismos modificados, OGM. Con un 47.3%, las
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enzimas destinadas al procesamiento del almidn (amilasas) y los azucares componen el sector mas amplio en la industria.1 Esta crisis remarcada en el ficticio mercado enzimtico colombiano afecta gran diversidad de industrias incluso las que estn en va de desarrollo como las de alcohol carburante de primera generacin cuya materia prima para produccin es el almidn, ya que para la transformacin de sta se hace necesario catalizar el polisacrido por medio de un complejo de enzimas amilasas capaces de desdoblar este compuesto; el uso de este complejo representa el 12% del valor total de produccin de alcohol a base de esta materia prima. En la costa Caribe el empleo de estas enzimas esta concretamente en el Ingenio Sicarare (Codazzi-Cesar) y en la planta piloto de CORPOICA-TURIPANA en Crdoba, lo que les incrementa el valor por litro de producto dado la necesidad de importacin de este complejo. Las plantas de alcohol carburante de primera generacin con base en almidn se ven obligadas a importar complejos de amilasas para la hidrlisis del polisacrido, lo que implica un aumento significativo en los costos de produccin de las compaas por el hecho de incurrir en gastos de importacin, aranceles y dems impuestos. Las enzimas a escala industrial, son importadas de diversos pases de Europa, Japn, Estados Unidos, Canad y Mxico.2 En conclusin, la creciente agroindustria de los biocombustibles de primera generacin a partir de almidn ha establecido un hecho que evidencia la necesidad de producir complejos de amilasas para reducir costos de operacin. Por lo que se plantea esta investigacin para buscar alternativas de produccin de enzimas amilolticas y su aplicacin en las plantas de alcohol carburante en base de almidn.
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Consultado en: < www.agrobio.org/bioboletines.php?id=34>. boletn 34 publicado en junio de 2004 [en lnea]; consultado el 09 de febrero de 2008.
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CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 10.

2. Impacto esperado

Con este proyecto se busca incorporar soluciones biotecnolgicas para establecer un protocolo de produccin de un complejo de enzimas amilasas para catlisis de almidn. Bajo esta temtica se permitir lograr avances en trminos de investigacin en el rea enzimtica. La profundidad de esta investigacin radica en buscar fuentes orgnicas capaces de producir complejos amilolticos para hidrlisis del almidn con el fin de mejorar el desarrollo de este proceso. 3. Marco terico y estado del arte: 3.1 Antecedentes Mundialmente, la produccin de enzimas esta desarrollndose aun ms, bajo el principio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicacin de esta industria gira en torno a pases industrializados que tienen la capacidad de investigar y producir a gran escala estas protenas, lo cual margina a pases menos desarrollados a causa de carencia de recursos, infraestructura y desarrollo en el campo biotecnolgico. Sin embargo, esta afirmacin no ha sido un impedimento para que en diversos lugares del mundo se investigue en el rea de la enzimologa y el impacto que estas ocasionan en los procesos y reacciones qumicas. Enzimas amilasas son las mas estudiantes en este campo debido a su influencia directa en la degradacin del almidn, uno de los productos alimentarios mas explotados a nivel mundial. Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus sp., aislado de semillas de lentejas3. Este proyecto se llevo a cabo en Bogot - Colombia y su
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CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIEROS Y. Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas. Consultado en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogot

objetivo fue aislar microorganismos productores de amilasas para producir enzimas hidrolticas del almidn. El agente productor detectado fue una cepa del genero Aspergillus sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Este microorganismo fue llevado a medio de cultivo en agar YPD bajo parmetros especficos de incubacin. Luego de 18 das se realizo cambio de sustrato a salvado de trigo y se llevo a cabo pruebas de Lugol, medicin de actividad enzimtica y extraccin del complejo enzimtico. Los resultados indican que las amilasas presentes en el complejo enzimtico obtenido del cultivo de Aspergillus sp., sobre salvado de trigo, fueron activas en el desdoblamiento de la molcula de almidn a pH 5.0 y temperatura de 37C demostrando su carcter dbilmente cido y su proveniencia mesfila. El equivalente de dextrosa como medida cuantitativa de la hidrlisis del polisacrido fue de 6.5, evidenciando la capacidad enzimtica amiloltica del complejo enzimtico obtenido. En este trabajo se confirm teora antes mencionada y la capacidad de hongos del gnero Aspergillus sp., para la produccin de amilasas.

Produccin de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos en cultivos de aguas de lavado de dos empresas alimentarias 4. El objeto de este proyecto fue de analizar la produccin de enzimas amilasas por cepas de Aspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y crnicas para determinar la capacidad de produccin de proteasas, amilasa y de depuracin de medio donde crecen. La metodologa aplicada se baso en la creacin de un medio de cultivo de aguas de lavado con aplicacin de nutrientes que mejoren la adaptacin del agente. Se implement pruebas de azucares, niveles de nitrgeno y fosforo y demanda qumica de oxigeno (DQO). Se analizaron los parmetros de produccin de enzima, pH, temperatura y concentracin de iones. Los resultaron indican que los niveles de amilasa y proteasa obtenidos son marcadamente
Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008. 4 SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering.

dependientes de la concentracin inicial de almidn en el medio de cultivo. Las fuentes de nitrgeno (peptona, aminocidos y extracto de levadura) fueron totalmente influyentes en la produccin de enzimas. El pH ptimo encontrado fue de 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50C. Produccin de amilasas de levaduras floculantes 5. Este proyecto desarrollado en Pakistn se destino en la consecucin de seis especies de levaduras productoras de amilasas. Para analizar sus niveles de produccin bajo el medio de cultivo agar almidn y como fuente de carbono se agrego extracto de levadura, almidn y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio estuvo contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptacin del microorganismo incubado a una temperatura de 25C., se realizaron pruebas de produccin de enzima, degradacin de sustrato, turbidimetra y velocidad de crecimiento. Del la metodologa ejecutada se aislaron 3 cepas de levadura correctamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabaj con saliva humana, produciendo 28 U/ml, la cual present una estabilidad en el rango de 2560C. Los niveles de las dems cepas fueron muy inferiores al registrado anteriormente.

Detergente con formulacin enzimtica de amilasa obtenida de Aspergillus niger. Un estudio comparativo en detergentes comerciales 6. El proyecto manifiesta una problemtica de la necesidad de compuestos naturales y eficaces para la industria de detergentes. El presente articulo describe la produccin, purificacin y parcial caracterizacin de un complejo de amilasa producido por A. niger y uso potencial en formulacin de detergentes . Se diseo un cultivo con distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que mejor resultados otorgar en cuanto a produccin de amilasa se refiere. Se trabajo con medio APM
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NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2003 6 MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene. Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent formulations. Bioresource technology. 19 de agosto de 2005.

usando residuos industriales de protena de soy y almidn como fuente de carbono adems de minerales. Se realizaron ensayos analticos con pruebas de DNS, iodometra y control de los parmetros de pH y temperatura. El extracto obtenido del complejo enzimtico fue comparado en tres formulaciones comerciales de detergentes para determinar su actividad de limpieza en equipos de hospitales, ciruga y endoscopia. Los resultados indicaron que el microorganismos con mejor performance en la produccin de amilasa fue el Aspergillus niger con una produccin de 3.9 U/ml en medio sumergido y una actividad excelente de degradacin de en el rango de 50-55C y un pH de 4.0.

3.2 Enzima amilasa: Accin y clasificacin Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan molculas de almidn dando como productos dextrinas y polmeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa7 Esta familia de enzimas hidrolticas esta compuesta por a protenas catalticas: alfa-amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradacin del almidn en la germinacin de las semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misin digestiva; y en diversas especies de microorganismos como hongos y bacterias8. Como bien es conocido las cadenas de almidn estn compuestas por dos grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por atacar los enlaces 1,4-alfa-glicosdicos en el centro de la cadena de los

ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P 950
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TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind. apha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary structureby homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry. p. 1623.

polisacridos, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligosacridos. La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y

pequeos compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de degradar parcialmente la amilopectina y el glucgeno debido a que no es capaz de desdoblar los enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificacin de la cadena del polisacrido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantas y bacterias, tambin cumple la funcin de degradar los enlaces 1,4-a-glucosdicos pero comienza su accin por el extremo libre no reductor del almidn, liberando maltosa al igual que la enzima alfa-amilasa. La hidrlisis se detiene en los puntos de ramificacin de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina lmite. La pululanasa o isoamilasa, tambin perteneciente a la esta familia, hidroliza los enlaces 1,6-alfa-glicosdicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas. Si existe un acompaamiento general del complejo de las amilasas se puede lograr efectiva una degradacin total del almidn.
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En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la familia amilasa, mundialmente se reconoce a la comisin enzimologica (E.C.) quien es el encargado de identificar a todas y cada una de las enzimas existentes. Este instituto reconoce la enzima alfa-Amilasa como E.C. 3.2.1.1. Su nombre sistemtico es alfa-1,4-glucan-4glucanohidrolasa. Otros nombres comunes en el comercio y el mbito cientfico son glucogenasa y endoamilasa. Estas se caracterizan en llevar a cabo la reaccin de endohidrlisis que se sita de los enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos en polisacridos que contienen 3 o ms enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos. Los grupos reducidos son liberados en una configuracin alfa. Este termino alfa, esta relacionado con la configuracin anomrica inicial de los grupos de azucares liberados10.
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CARRILLO Leonor. Microbiologa Agrcola. 2003.Universidad Nacional de Salta. ISBN 987-9381-16-5 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]
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-amilasa bacteriana (EC 3.2.1.1). La -amilasa hidroliza el enlace glucosdicos interno dando lugar a productos de bajo peso molecular, solubles y menos viscosos, cuya ruptura est limitada por la presencia de los enlaces glucosdicos a-1-6 en los puntos de ramificacin de la molcula del almidn nativo (amilopectina). Los productos de hidrlisis tienen configuracin a en la glucosa del extremo reductor. Se piensa que la enzima acta por la accin combinada de los grupos carboxilo e histidina del centro activo. Las a-amilasas obtenidas de Bacillus subtilis var amyioliqtedaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado por molcula, que es necesario para la actividad de! enzima y que lo estabiliza en gran medida frente a! calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de dos horas a 85 C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilizacin de cido clorhdrico que produce excesivos compuestos coloreados y la formacin de productos de reversin. Debido a que los almidones de patata y de cereales cerosos no pueden tratarse por gelatinizacin, se les somete a un proceso en dos etapas, en el que se aade una segunda dosis de enzima y se contina et tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa 11. La enzima Beta-amilasa es reconocida en la comisin enzimolgica como E.C. 3.2.1.2., su nombre sistemtico corresponde al de 1,4-alfa-D-glucan maltohidrolasa. Su funcin es actuar en la reaccin de hidrlisis de los enlaces alfa-1,4-glucosidicos del almidn con inversin en la configuracin del carbono 1 pasndolo de la configuracin alfa a la beta; as como de remover las unidades de maltosa continuas presentes en los terminales no-reductores de la cadena polisacrida. Los grupos sulfihidrilos son esenciales para la actividad, por lo que la

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WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985. p.319

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enzima se inactiva por oxidacin, por los metales pesados y sus sales. producto es beta-maltosa.

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. Su

Beta-amilasa ha sido descrita como una protena abundante la cual se puede encontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de almacenamiento de almidn y rganos de plantas13. Muchos Cereales contienen tambin la enzima beta-amilasa y alfa-amilasa aunque esta ultima en concentraciones menores, tan solo ocupa aproximadamente 30% de contenido total de protenas sintetizadas durante la germinacin. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el punto de inactivacin que presentan a un pH determinado. La enzima alfa-amilasa es inactivada a un pH en el rango de 4.8 - 5.0. Mientras que a este mismo rango la beta-amilasa es estable. La enzima E.C. 3.2.1.2., es inactivada en un pH alrededor de 6.0-7.0, y en caso reciproco condiciones14. Otra enzima perteneciente a esta peculiar familia es la Glucoamilasa tambin reconocida como amiloglucosidasa. En la nomenclatura internacional esta identificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemtico es 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa. Su funcin es actuar en la reaccin de hidrlisis en cadenas de polisacridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que estn de manera residual despus de haberse expuesto la cadena a la accin de alfa y beta amilasa15. El principal producto final de la accin de la glucoamilasa sobre el
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las alfa-amilasa son estables bajo estas

CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11.
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OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz; MAINARDI Janana A.; PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase expression and starch degradation during banana ripening. 10 de noviembre de 2005. Posthaverst Biology and Technology. p 41
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OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative studies on a-amylases from malted maize (Zea mays),millet (Eleusine coracana) and Sorghum (Sorghum . 5 de mayo de 2006. Carbohyfrates Polymers. P 72.
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IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]

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almidn es glucosa, lo que la diferencia claramente de la alfa y beta amilasas. La enzima tambin produce pequeas cantidades de oligosacridos. La sacarificacin del almidn puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La accin de la enzima causa inversin de la configuracin, produciendo beta-glucosa. Las glucoamilasas son inactivas sobre almidn nativo. Su actividad es mxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55-65 0C. La rata de reaccin cae rpidamente a medida que disminuye el tamao de la molcula de sustrato, siendo mxima sobre almidones previamente sometidos a licuefaccin 16. Amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3). Las amiloglucosidasas (glucoamilasa, a-amilasa o a-1-4 glucohidrolasa) catalizan la etapa de hidrlisis de los enlaces -1-4 del almidn y los oligosacridos, liberando molculas de -glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados -1-4 tambin se hidrolizan, pero mucho mas lentamente, formndose un jarabe de glucosa, un contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacridos grandes. El enzima es capaz de hidrolizar tambin, aunque lentamente, los enlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura slida. La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la industria de procesado del almidn en tanques discontinuos a 55-60 C y pH de 4,5 y con perodos de incubacin de 48-92 horas, para transformar las dextrinas formadas por la a-amilasa en glucosa. El calcio la estabiliza frente a la desnaturalizacin por el calor o los lcalis, y la hidrlisis puede llevarse a cabo fcilmente aadiendo el enzima soluble al almidn una vez que la a-amilasa ha realizado del 15 al 30 % de la hidrlisis posible 17. Una ventaja particular en el uso de enzimas en lugar de HCl para la hidrlisis del almidn es que puede utilizarse una materia prima menos pura, ya que las
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CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11
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WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985. p.320

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protenas contaminantes no se hidrolizan hasta aminocidos, que podran dar lugar a reacciones de pardeamiento. Despus de la sacarificacin con amiloglucosidasa, el jarabe resultante se filtra para eliminar protenas y grasas y se purifica con columnas de carbn activo seguido de otras con resinas de intercambio inico. La glucoamilasa es un enzima extracelular producido por diversas especies de Aspergillus o Rhizopus. La amilogluosidasa de Rhizopus puede separarse en isoenzimas con propiedades semejantes a los isoenzimas de A. niger. El enzima es una glicoprotena que contiene maosa, glucosa, galactosa y cido urnico, y tiene un pH ptimo de 4,3-4,5. Una de sus desventajas es su relativa falta de actividad frente a los enlaces -1-6, lo que hace necesario el uso de grandes dosis o de grandes perodos de incubacin para lograr el grado de hidrlisis deseado. Por tanto, se ha propuesto el uso combinado de amiloglucosidasa y la enzima desramificante pululanasa, logrando aumentos del contenido de dextrosa del 1 al 2 %, a pesar de llevar a cabo la reaccin a pH 5,5-6,0, en el que la amiloglucosidasa es menos activa18. El resto de la cadena del polisacrido es atacado por la enzima isoamilasa o pululasa, reconocida oficialmente como E.C. 3.2.1.68. Participa en la reaccin de hidrlisis de polisacridos especficamente en los enlaces 1,6-alfa-D-glucosidicos; su nombre sistemtico es glucgeno alfa-1,6-glucoanohidrolasa. Su actuar es directamente sobre la amilopectina, glucgeno y dextrinas, pero es incapaz de hidrolizar el pululano y las alfa-dextrinas limite. Su misin en participar en la reaccin de hidrlisis de ramificacin que contengan enlaces 1,6-alfa-glucosidicos por lo que tambin se le conoce como enzimas desramificadora. Su nombre sistemtico es glucgeno 1,6-alfa-D-glucanohidrolasa 19.
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El nico producto de

WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985. p.320 19 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]

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reaccin es maltosa. La temperatura ptima est alrededor de 45 0C y el pH entre 4y5 3.3 Usos y aplicacin de las enzimas Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos, a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de trabajo). Adems, lograr ms material procesado con el mismo equipo y menos consumo de energa tambin ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industria alimentaria nos ofrece la ventaja de: Reducir viscosidad (hidrlisis). Mejorar extracciones (degradacin de pectina). Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa). Causar separaciones (separacin del suero en queso). Sustitucin de ingredientes y coadyuvantes en procesos. Ahorro con procesos ms eficientes obteniendo menos subproductos indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento de producto. Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto nico (jarabe de alta concentracin de fructosa).20 Las enzimas amilasas por su capacidad hidroltica han tenido gran significancia en las ltimas dcadas en diversas industrias que han visto una mejor manera de optimizar sus procesos aplicando tcnicas biotecnolgica extensivas basadas en enzimas. Industrias como la panadera, repostera, alimentaria, textilera, cervecera, papel, azucarera entre muchas ms han visto en estas protenas una gran oportunidad de comercio. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el mercado enzimtico llegando a sustituir completamente procesos de hidrolisis
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MUNDO ALIMENTARIO. Aplicacin de las enzimas en la produccin industrial. Consultado en: http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.pdf. [consultado:10 de febrero de 2008]

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qumica en la industria del almidn. Esto se debe a una caracterstica esencial dentro de esta familia de protenas. La termoestabilidad de esta enzima, industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos procesos.21 Procesos industriales que aplican enzimas22

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3.4.1 Industria del almidn y del azcar. Dependiendo de las enzimas utilizadas, a partir del almidn se pueden obtener jarabes de diferente composicin y propiedades fsicas. Los jarabes se utilizan en una variedad de alimentos tales como gaseosas, dulces, productos horneados, helados, salsas, alimentos para bebs, frutas enlatadas, conservas. Hay tres etapas bsicas en la conversin enzimtica del almidn: licuefaccin, sacarificacin e isomerizacin. 3.4.2 Productos Lcteos. La aplicacin de enzimas en el procesamiento de leche est bien establecida, por el uso del cuajo (quimosina) en la produccin de queso, que tal vez representa el empleo ms antiguo de enzimas en alimentos. Otras enzimas que participan en la produccin de quesos son las lipasas presentes en la leche, las cuales hidrolizan el componente graso, proporcionando cambios caractersticos en el sabor. Para algunos quesos se pueden aumentar las lipasas naturales, aadiendo enzima extra. Por otra parte, tambin se recomienda agregar enzimas exgenas de tipo proteoltico para acelerar el proceso de maduracin de algunos quesos. 3.4.3 Molineros y Panadera. El uso de enzimas en estas industrias se debe principalmente a la deficiencia en el trigo y en la harina, de las enzimas naturalmente presentes. El contenido de a amilasa de la harina depende de las condiciones de crecimiento y de cosecha. En climas hmedos la tendencia ser a
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ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P 950. 22 CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 13

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tener alta actividad de a amilasa debido a germinacin de los granos, en tanto que en climas secos el nivel de a amilasa ser bajo debido a escasa germinacin. Esto conlleva a grandes diferencias en el contenido de amilasa de diferentes lotes de harina. 3.4.4 Transformacin del almidn.23Los procesos encaminados a la produccin

de edulcorantes estn basados en la degradacin del almidn y han sido empleados durante muchos aos, aunque originalmente se llevaba a cabo mediante hidrlisis catalizada por cidos. Durante el curso del desarrollo y la expansin de la transformacin industrial del almidn, se ha producido un cambio de la catlisis acida por el uso de enzimas. La elevada especificidad de estas reacciones enzimticas, acopladas con la gran actividad de las preparaciones disponibles, ha permitido directamente el que pueda ser incrementada y adems la formacin de derivados indeseables se ha minimizado. De todas las aplicaciones a escala industrial, la ms afortunada es la produccin de jarabe de maz con fructosa elevada (HFCS). El propsito de este proceso es obtener un material de poder edulcorante semejante a la sacarosa a partir de una materia prima de bajo precio (almidn de maz). Esta conversin requiere el uso secuencial de tres enzimas. En primer lugar, el almidn (un polmero de la Dglucosa) se degrada parcialmente, empleando alfa-amilasa microbial. Este material es degradado posteriormente para rendir una solucin donde el carbohidrato presente est en forma de D-glucosa en una concentracin del 94-96 %. La glucosa tiene algunas aplicaciones en las industrias de alimentacin y farmacuticas, pero su uso est restringido debido a su solubilidad limitada a concentraciones elevadas y a su bajo poder edulcorante comparado al de la sacarosa. Por estas razones, la glucosa total obtenida se transforma en una

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GACESA, Peter; HUBBLE, John. Tecnologia de las enzimas. Editorial Acribia, ZaragozaEspaa. 1990. p.111

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mezcla de glucosa y fructosa mediante el empleo de la enzima glucosa ismerasasa. 3.4.5 Productoras de Jugos de Frutas.24 Las primeras enzimas empleadas en

las industrias de jugos de frutas fueron las enzimas pcticas para la clarificacin del jugo de manzana. Actualmente las enzimas pcticas se usan en el procesamiento de muchas otras frutas, junto con amilasas y celulasas. Durante el procesamiento de los jugos cuando se desintegran los tejidos vegetales, parte de la pectina, que es un componente estructural de las frutas, pasa a la solucin, parte se satura con el jugo y parte permanece en las paredes celulares. Las enzimas pcticas se usan para facilitar el prensado, la extraccin del jugo y la clarificacin ayudando a la separacin del precipitado floculante. 3.4.6 Fermentacin Alcohlica25 El almidn proveniente de maz, patatas, cebada, yuca y otras fuentes debe someterse a un tratamiento previo con hidrolasas, con objeto de producir su licuacin y sacarificacin, antes de hacerlo fermentar mediante levaduras u otros organismos para obtener alcohol utilizable. Estas enzimas son y amilasas y amiloglucosidasas, que pueden agregarse en forma de malta (cebada germinada), aunque este proceso es caro. La malla no slo contiene y amilasas sino tambin enzimas que degradan los enlaces -16 de las dextrinas limite. Recientemente se han aadido enzimas bacterianas para suplementar las enzimas endgenas asociadas con el almidn. Por ejemplo, en los procesos discontinuos americanos para la produccin de alcohol para bebidas, la adicin de a-amilasa bacteriana durante la coccin para hidrolizar parcialmente el almidn gelatinizado representa una ventaja, puesto que reduce la viscosidad de la mezcla facilitando su agitacin y mezclado. Posteriormente, la mezcla se enfra y despus se aade a-amilasa bacteriana para continuar la hidrlisis, que se
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CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14 25 WISEMAN, John. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza Espaa. 1985. p. 335.

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completa mediante la adicin de amiloglucosidasa. Despus se inoculan en la mezcla levaduras, de forma que contine la sacarificacin y fermentacin simultneamente hasta el agotamiento de la dextrosa, y se destila el alcohol. La produccin comercial de alcohol industrial, destinado a usarse como carburante en motores de combustin interna se ha incrementado rpidamente en las ltimas dcadas, particularmente en Brasil, que lo obtiene de la fermentacin de !a caa de azcar o de la yuca. Tambin se ha propuesto el empleo de clulas inmovilizadas. Se ha obtenido etanol a partir de melazas de caa diluidas, no estriles, durante medio ao. 3.4.7 Industria Cervecera. La cebada se utiliza tradicionalmente para la

fabricacin de bebidas alcohlicas como la cerveza. En su produccin se deben considerar dos operaciones distintas: la maltera y la cervecera. La preparacin de la malta se logra por germinacin de la cebada, durante la cual se incrementa el contenido de alfa-amilasa. Las enzimas alfa y beta amilasas naturalmente presentes en el grano actan sobre el almidn produciendo dextrinas y maltosa, que sirven como sustratos para la fermentacin posterior. La sacarosa es hidrolizada por al enzima invertasa la cual queda divida en una molcula de glucosa y una molcula de fructosa, ambas podran ser asimiladas de forma glucolitica. Tambin las enzimas cumplen la funcin de transportar la maltosa y la maltotriosa a las clulas de las levaduras para posteriormente ser convertidas en glucosa por la maltasa26. Otra aplicacin patentada recientemente en industrias inglesas consiste en el uso de la enzima -acetolactato descarboxilasa, aislada de Enterobacter aerogenes. Esta protena es capaza de desintegrar o eliminar el -acetolactato y acetohidroxibutirato de la cerveza recin fermentada en 24 horas a 10 C para de este modo conseguir niveles de Diacetilo y 2,3-Pentanodiona por debajo de los
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CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en lnea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com. consultado 05 de noviembre de 2007.

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umbrales permitidos para productos de este tipo. Se consigue con ello grandes ahorros.27 Hay muchas enzimas disponibles comercialmente para el proceso cervecero, pero todas ellas caen en tres categoras: proteasas, amilasas y glucanasas. La accin de estas enzimas durante las primeras etapas consiste en mejorar la licuefaccin del almidn, regular el contenido de azcar y nitrgeno, mejorar la extraccin, facilitar la filtracin y controlar la turbidez. En la filtracin del mosto reduccin de las gomas y de la viscosidad. En la ebullicin, control de la turbidez, eliminacin final del almidn. En esta etapa se inactivan las enzimas. Durante la fermentacin y maduracin la adicin de enzimas sirve para controlar la turbidez. 3.4.8 Procesamiento de Carne. Las enzimas importantes para ablandar carne son proteasas de origen vegetal o de microorganismos ( Bacillus subtilis y Aspergillus oryzae). Las enzimas se inyectan antes del sacrificio al animal o se trata la carne con las enzimas antes de cocerla, con lo que se logra un franco ablandamiento sin provocar una protelisis importante. 3.4.9 Industrias de Grasas y Aceites.28 El uso de enzimas en las industrias de

aceites y grasas es muy bajo, aunque se encuentran disponibles enzimas que pueden resolver algunos problemas, por ejemplo minimizar los subproductos indeseables. Las enzimas tambin se pueden usar para producir aceites y grasas novedosas. Lipasas especficas, pueden seleccionar los cidos grasos de algunas posiciones del triglicrido, para incorporar determinados cidos grasos, sin cambiar los de otras posiciones. De tal manera que es posible modificar por interesterificacin el contenido de cidos grasos, o por transesterificacin lograr el reordenamiento de algunos de ellos. Por ejemplo la mantequilla de cacao se
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CASTAE,F.X.; DAMM, S.A.. Los tanques cilindro.-conicos y el tiempo de guarda de la cervzeza. Industria cervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.
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CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14

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requiere en la produccin de chocolate y con frecuencia la disponibilidad y el costo fluctan ampliamente. Sin embargo, aceites como el de palma son baratos y se encuentra buen abastecimiento. Lo que se plantea es modificar el aceite de palma por reaccin con cido esterico mediante interesterificacin enzimtica. La grasa resultante tiene propiedades similares a la mantequilla de cacao .

3.5 Produccin y sustrato Fuentes de enzimas. Las clulas microbianas son la fuente usual de enzimas para uso industrial excepto para algunos enzimas provenientes de animales y plantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papana, ficina y bromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina, empleada en la manufactura del queso. La inmensa mayora de los enzimas microbianos se producen a partir de aproximadamente 25 organismos, incluyendo una docena de hongos, pero se ha calculado que slo aproximadamente el 2 ^o de los microorganismos existentes en el mundo han sido estudiados como fuente de enzimas29. Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (lipasa pancretica y tripsina) debido a que stas pueden ser reemplazadas por otras similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos, aunque catalticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicacin. Los recientes avances en este campo han permitido la adaptacin de las tcnicas del ADN recombinante para posibilitar que ciertos genes de mamferos sean clonados en las bacterias o levaduras idneas, facilitando as la produccin de enzimas originariamente de animales por medio de la tecnologa convencional de la fermentacin.

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WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985. p.281

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Las plantas tambin han sido fuente tradicional de un cierto nmero de enzimas. A partir del ltex producido por la papaya, higuera, pia y, en menor grado, otras especies se ha aislado sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen la ventaja de que su ltex es fcil de obtener, principalmente a partir de los frutos y utilizando mano de obra no cualificada. Las enzimas microbianas son ms tiles que los derivados de las plantas o animales por la gran variedad de actividades catalticas de que disponen, y porque usualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de forma regular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante cultivo de superficie o usualmente mediante tcnicas de fermentacin aerbica de cultivos profundos, tcnica muy utilizada en la produccin de antibiticos. Adems los enzimas microbianos son en general ms estables que los homlogos de las plantas o animales, y su proceso de produccin es ms fcil y seguro que el seguido con plantas y animales. La manipulacin gentica y ambiental para incrementar el rendimiento, o la actividad enzimtica de las clulas haciendo a ste de inters constitutivo30. Estas tcnicas son especialmente importantes en el caso de la actividad o estabilidad del enzima que sea la etapa limitante en conversiones multienzimas, cuando haya que eliminar los controles de regulacin normales en la sntesis de la enzima deseada, cuando se desea reducir o eliminar la inhibicin por el substrato o el producto, mecanismo este ltimo para prevenir la sobreproduccin del producto de una va metablica, o para obtener algunas otras caractersticas favorables31. Generalmente el objetivo es maximizar la velocidad de formacin del enzima y la concentracin de enzima en las clulas o en el caldo de fermentacin para minimizar los costos de produccin de la enzima. El ideal es combinar de forma
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GACESA, Peter; HUBBLE, John; Tecnologa de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza Espaa. 1990. p.16. 31 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza Espaa. p.281

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ptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recuperacin y fermentacin y el equipo ms apropiado en buenas condiciones de traba jo. Usualmente, las clulas crecen sumergidas, en fermentadores bien agitados y aireados, aunque un nmero significativo de enzimas importantes industrialmente se obtienen en fermentadores slidos o semislidos, entre los que se incluyen la lactasa, la a-amilasa y una proteasa de A. oryzae, la pectinasa, una proteasa de A. niger, la a-amilasa de Rhizopus, y el cuajo de Mucor pusius32. Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimas para usos clnicos e industriales, y acumulan productos de desecho en las vacuolas. Estos compuestos son frecuentemente inhibidores enzimticos y/o toxinas, particularmente cuando se oxidan al contacto con el aire. Estos desechos, muchos de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la clula, contaminando y frecuentemente inactivando cualquier enzima extrado. Las hidrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales. Dentro de ellas podemos encontrar las enzimas alfa-amilasa, beta-amilasa como las ms comunes para las sntesis del almidn produciendo productos de bajo peso molcula. Estas enzimas son producidas, especialmente alfa-amilasa, por gran diversidad de microorganismos, Producen amilasas muchos hongos del suelo as como bacterias de los gneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras. El principal genero que esta siendo tratado para la produccin de dicha enzima es el bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este genero son el Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus amyloliquefacien quienes son aplicados en procesos industriales para alimentos, textiles, fermentacin, papelera entre otros33.
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WISEMAN, John. Manual de biotecnologia de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza Espaa. 1985. p.282
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ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex organic substrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology..p 150.

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Tambin otros gneros han sido reportados en proyectos de investigacin. La especie Aspergillus produce una amplia variedad de enzimas extracelulares entre las cuales adems de estar las amilasas se puede identificar las proteasas. Aspergillus rizhopus esta identificado como un gran productor de enzimas 34. La induccin de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces alfa1,4 glucosdicos, adems de maltosa, dextrina y almidn. La Glucosa, as como es el producto final de la hidrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la sntesis de enzima como un mecanismo conocido como represin catabolitica. Sin embargo, se ha encontrado que algunos microorganismos en distintos sustratos que tienen como fuente de carbono a los carbohidratos no inducen la produccin de amilasas35. Este hecho contrasta con los registrados en artculos de investigacin y compaas dedicadas a la produccin de enzimas donde la fuente de produccin de las protenas son microorganismos. La produccin industrial ha desarrollado tcnicas de aprovechamiento de recursos o residuos de produccin de diversas industrias con el objeto de adquirir enzimas utilizando sustratos de bajo costo, as como los desechos agrcolas. En aos recientes, se ha presentado un incremento en el esfuerzo y la aplicacin eficiente del bagazo de caa de azcar como medio de produccin. Este es un subproducto agroindustrial de extensa cadenas celulsicas. Esta es una importante fuente de carbono que ha sido empleada en los ltimos aos para la produccin de enzimas y a su ves la fermentacin de azucares para la elaboracin de etanol. Se ha

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SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 94.
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NAHAS Ely, WALDEMARIN Mirela M.; Control of amylase production and growth characteristics of Aspergillus ochraceus . revista latinoamericana de microbiologia. Vol #1. Enero de 2002. p.5

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identificado que el microorganismo optimo para reproducirse en este medio y sintetizar alfa-amilasa es el Bacillus subtilis36. Los medios de cultivo han facilitado para los microorganismos el desarrollo de enzimas con propiedades fsico-qumicas muy deseables. La produccin de alfaamilasa puede darse en medio sumergido o en estado solido o por procedimientos de fermentacin. La concentracin de metabolitos para el crecimiento de los agentes microbiales es importante. Influye directamente la composicin del medio as como las fuentes de carbono, de nitrgeno y el contenido de sales inorgnicas37.

En cuanto a trminos de aplicabilidad industrial, es necesario estudiar la produccin de enzimas y analizar el factor de termoestabilidad, ya que se ha demostrado que la temperatura esta ligada directamente a la velocidad de reaccin de la enzima, menor viscosidad en el sustrato y disminucin de la contaminacin microbiana. Los microorganismos apropiados para la produccin de enzimas deben tener ciertas propiedades como rapidez de crecimiento, adaptacin a nutrientes relativamente baratos y sin necesidad de inductores. Adems, se debe obtener un alto rendimiento de enzima, de forma que sea fcil aislarlo, purificarlo y concentrarlo sin que se produzca la formacin concomitante de metabolitos txicos o inmunognicos38. Tambin puede ser una estrategia til la de seleccionar cepas que hiperproduzcan enzimas a partir de organismos genticamente modificados OMG que no tengan
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RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource Techonology. p.2
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DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z. BENNAMOUN L.. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC 16404 grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 191
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WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- Espaa. 1985. P.271

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necesidad de inductores debido a que sus centros represores estn inactivos, a que tienen una baja represin por los catabolitos, a que sufren retroinhibicin o a que tienen enzimas relativamente resistentes a la inhibicin por el producto final. De hecho, a pesar de los enormes avances obtenidos recientemente en el campo de la ingeniera gentica, las tcnicas clsicas de seleccin de enzimas son todava muy productivas, particularmente cuando se estudian ambientes nuevos y/o exticos, para buscar clulas microbianas que desarrollen enzimas con propiedades exepcionales. Entre ellos destacan los enzimas clorantes obtenidos a partir de microorganismos marinos, y un enzima que produce un nuevo azcar, la isomatulosa, de forma muy productiva a partir de una bacteria patgena del ruibarbo. Muy recientemente se han hecho descubrimientos ms excepcionales si cabe, por ejemplo, los microorganismos que crecen a unos 250 C en fuentes volcnicas en aguas marinas profundas que poseen enzimas extremadamente estables al calor, o un microorganismo del intestino de un gusano que perfora la madera, que es capaz de degradar la celulosa y de fijar el nitrgeno 39. En resumen, la mayora de los enzimas empleados comnmente en la industria son de origen microbiano y se producen por fermentacin sumergida aerobia convencional, que permite un mayor control de las condiciones de crecimiento que la fermentacin en estado slido. Se sabe mucho acerca de la seleccin de cepas de organismos y condiciones de cultivo, aunque menos sobre la regulacin de la sntesis, degradacin y secrecin de la enzima por el organismo productor. Estas enzimas son con frecuencia extracelulares, lo que facilita su aislamiento y purificacin.

4. Objetivos

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WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- Espaa. 1985. P.272

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4.1 General Obtener amilasa microbiana por fermentacin lquido para aplicacin en procesos agroindustriales de alcohol carburante a base de almidones. 4.2 Especficos Identificar microorganismos productores de enzimas amilasa mediante tcnicas de aislamiento microbiolgicas Determinar la cintica del crecimiento de los microorganismos aislados mediante fermentacin en estado lquido. Comparar la actividad del complejo enzimtico obtenido con respecto a la actividad de una enzima comercial STARGEN 001.

5. Metodologa Propuesta: 5.1 Aislamiento e identificacin de los microorganismos Los microorganismos sern obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperie a contaminacin ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 das. Para ello se realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrn en bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estn ejerciendo un proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solucin con 10% de harina de yuca, con agitacin constante a 120 rpm, durante 5 das, al cabo del cual se realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los microorganismos con mayor capacidad de degradacin, y se sembraran en medio solido de YPS, para su purificacin e identificacin.

26

5.2.1

Medio Slido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch) . 40. De acuerdo con

distintos microorganismos presentes en la solucin de yuca, se aislarn cada uno de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadas sobre las que se servir medio microbiolgico YPS. Para descartar contaminacin ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estril sobre medio el mismo cultivo. 5.2.2 Medio para fermentacin. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1 Litro, de medio de cultivo YPS lquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto de levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4 7H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 y harina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarn a 110C durante 15 minutos y se colocarn en agitacin orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5 das. El medio de cultivo para fomentacin ser inoculado con un complejo de dos microorganismos aislados, utilizando 5 ml de solucin del complejo microbial.
5.2.3

Cuantificacin de Biomasa del complejo 41. Se har determinacin por el

mtodo de peso seco y el mtodo de protenas . Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5 das. Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105 grados.

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ABU ,E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.
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KONSOULA Zoe, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES Maria. Co-production of a-amylase and bgalactosidase by Bacillus subtilis in complex organic substrates. Bioresource Technology. 20 de diciembre de 2005. p. 152

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 Determinacin de protenas42. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El proceso se llevar a cabo realizando choque trmico y centrifugado de las muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le determinara protenas totales por el mtodo de Biuret. Las muestras se leern a una longitud de onda de 550 nm. Los datos obtenidos se compararan con una curva patrn de BSA, para determinar la concentracin de protenas presentes en la muestra. 5.2.4 Medicin de producto43. Se tomarn 3 ml del medio de cultivo, cada 3 horas durante 5 das y se realizar prueba de azucares reductores con 3,5 acido dinitrosaliclico, las lecturas se harn a 540 nm, para glucosa y a 520 nm para maltosa, los datos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa y maltosa respectivamente. 5.2.5 Medicin de sustrato44. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentacin cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datos se compararan con la curva estndar preparada con harina de yuca para determinar la concentracin presente de sustrato en la muestra. 5.2.6 Curva de Calibracin para protena. Se harn determinaciones de protenas partiendo de una protena conocida (Albmina del suero Bovino o BSA de Sigma). Para ello se preparara una solucin estndar de BSA al 0,5 % y se diluirn como se muestra en la Tabla 3.

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SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus licheniformis a-amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007. p. 998 43 ASGHER M., JAVAID M. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. Jornal Of Food Engineering. 29 de marzo de 2006. p.951
44

CHERRY H.M.; HOSSAIN Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989.

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Tabla 3. Diluciones para la construccin de la curva de calibracin para Biuret.

Tubos Solucin (ml) Biuret Solucin Estndar BSA H2O 1 8.0 2.0 0.0 2 8.0 1.6 0.4 3 8.0 1.2 0.8 4 8.0 0.8 1.2 5 8.0 0.4 1.6 6 8.0 0.0 2.0

Se mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una . = 550 nm 5.2.7 Curva de Calibracin para Maltosa y Glucosa. Se establecer una curva con D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia de las muestras de fermentacin a unidades de actividad enzimtica de la amilasa, es decir, la liberacin de un micromoles de azcar reductor, calculado como maltosa o glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo (ver Tabla 4). Tabla 4. Diluciones para la construccin de la curva de calibracin para Maltosa.
Tubos Solucin (ml) DNS Solucin Estndar Maltosa o Glucosa al 0,5% H2O 1 1.0 2.5 6.5 2 1.0 2.0 7.0 3 1.0 1.5 7.5 4 1.0 1.0 8.0 5 1.0 0.5 8.5 6 1.0 0.0 9.0

A las solucin de D-maltosa y D-glucosa se les adicionara DNS y se pondrn en agua hirviendo por 5 minutos, se deja reposar, y se le agrega agua hasta completar 10 ml segn la tabla, las lecturas se realizaran a = 520 nm para maltosa y a 540 nm para glucosa El complejo enzimticos obtenido en cada muestra en los diferentes das, se leern a la misma longitud de onda que las curvas de calibracin. Para ello se

29

realizaran 3 repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas, glucosas y protenas.

5.2.8 Cintica del complejo enzimtico.

El comportamiento enzimtico del se comparara con el complejo

complejo obtenido por la fermentacin lquida

comercial de amilasa (stargen 001), determinando los factores que afectan la accin cataltica del complejo de amilasas, analizndolos bajo un modelo superficie de respuesta, con diseo compuesto central: 2^3 + principal, de acuerdo con los niveles y factores mostrados en la tabla 5. Los datos obtenidos se analizaran con el software estadstico Statgraphics versin 5.1 Tabla 5. Factores y niveles para evaluar la actividad enzimtica
Factores Dosis pH Temperatura Unidades ml de caldo enzimtico/g de pulpa base seca Adimensional C Niveles Inferior Superior 0.5 1.0 4 5.5 30.0 50

6. Resultados Esperados La base del estudio, anlisis, desarrollo y aplicacin de este proyecto es producir un complejo de enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto de determinar la aplicabilidad de dichas protenas en los procesos agroindustriales del departamento. Este complejo servir como base para la planeacin de muchos procedimientos industriales como la hidrlisis del almidn, el cual presenta elevados costos en las empresas del departamento de Crdoba, especialmente plantas de biocarburantes.

7. Estrategia Comunicacin:

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Los resultados de este proyecto sern editados mediante formatos de informes o trabajos de investigacin en revistas y ponencias en encuentros de investigacion. Adems, 8. Estrategias con el medio A travs de conferencias, foros y/o ponencias institucionales internas y/o externas, es un medio apto para la promulgacin del objeto, mtodo, resultados y alcance del estudio de este proyecto. Bajo este concepto, se desea divulgar el propsito de llevar a cabo este proyecto y a su vez demostrar la realidad de los efectos que traera consigo aplicarlo en escala industrial.

9. Cronograma de actividades
Tiempo Actividad Recopilacin de bibliografa Tajado de chips de yuca y seleccin de lugar para contaminacin microbial Aislamiento e Identificacin de microorganismos Preparacin de los medios de cultivo solido y liquido Muestreo y anlisis del medio Estudio de la cintica Comparacin de cintica con STARGEN 001 Interpretacin de los resultados Publicacin de informe final 1 2 3 4 5 Meses 6 7 8 9 10 11 12

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10. Bibliografa ABU, E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005 ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable aamylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Engineering. CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en lnea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com. consultado 05 de noviembre de 2007. CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. CASTAE,F.X.; DAMM, S.A. Los tanques cilindro-cnicos y el tiempo de guarda de la cerveza. Industria cervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.

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11. Usuarios Directos e Indirectos Entre los interesados en los resultados de este proyecto se encuentran: Plantas de alcohol carburante Grupos y centros de investigaciones 12. Posibles Pares Evaluadores Nombres y Apellidos Cargo Institucin Telfono

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D.

Presupuesto

Tabla 1. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR FUENTES DE FINANCIACION RUBROS

PERSONAL EQUIPO MATERIALES VIAJES BIBLIOGRAFIA * SOFTWARE PUBLICACIONES* SERVICIOS TECNICOS CONSTRUCCIONES MANTENIMIENTO ADMINISTRACION OTROS*

FUENTES Facultad de Ingeniera Agroindustrial $ 12.398.400 $ 1.480.000

Patrocinador $ 30.864.040 $ 2.453.841

TOTAL $ 12.398.400 $ 32.344.040 $ 2.453.841

TOTAL
Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR VIGENCIAS RUBROS
PERSONAL EQUIPO MATERIALES VIAJES BIBLIOGRAFIA SOFTWARE PUBLICACIONES SERVICIOS TECNICOS CONSTRUCCIONES MANTENIMIENTO ADMINISTRACION OTROS

$ 47.196.281

AO 1

AO 2

AO 3

TOTAL

$ 12.398.400
$ 32.344.040

$ 12.398.400
$ 32.344.040

$ 2.453.841

$ 2.453.841

TOTAL

$ 47.196.281

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Tabla 3. DESCRIPCION DE LOS GASTOS DE PERSONAL

Participante Nombre Eder Durango Ballesteros Alfonso Bautista Jimnez Ibeth Cepeda Jimnez Hctor Tobn Guzmn FORMACION MsC. Biotecnologa MsC. Microbiologa Esp, Ing. De alimentos. Ing. Agroindustrial FUNCION DEDICACION HORAS 4. 2. 2. 6. DEDICACION No. MESES 12 5 5 12 RECURSOS(en pesos colombianos)

FUENTE 1 Fac.de Ing. Agroindustrial Fac. de Ing. Agroindustrial Fac. de Ing. Agroindustrial Fac. de Ing. Agroindustrial

TOTAL

Investigador Principal Coinvestigador Coinvestigador Auxiliar

$ 4.665.600 $ 972.000 $ 972.000 $ 5.788.800 $ 12.398.400

TOTAL

Tabla 4. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA ADQUIRIR

EQUIPO Plancha de calentamiento marca schott - modelo slk2- con JUSTIFICACION Preparacin de muestras y pruebas de anlisis Censar temperatura de las muestras Anlisis y determinacin de compuestos en muestra Conservacin de muestras Control de tiempo en las pruebas Homogenizacin y preparacin de medios Medicin de alcohol RECURSOS

Patrocinador X X X X X X X

TOTAL

placa en cermica
Termmetro digital Espectrofotmetro Nevera-congelador de 9 pies

Cronometro digital. Cassio modelo hs-3 Agitador magnetico Refractmetro digital porttil TOTAL

$ 620.000 $ 863.040 $ 25.000.000 $ 700.000 $ 81.000 $ 2.100.000 $ 1.500.000 $ 30.864.040

Tabla 5. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA UTILIZAR

EQUIPO
Agitador orbital Centrfuga eba20 pHmetro Balanza analitica

JUSTIFICACION
Agitacin de los medios de cultivo Separacin de slidos Medicin de ph de las muestras y soluciones Pesaje de reactivos para soluciones

UNIDAD(ES) A LA CUAL PERTENECE EL EQUIPO

Lab. De biotecnologa Lab. De biotecnologa Lab. De biotecnologa Lab. De biotecnologa

Horas de asignacin al proyecto 8 2 1 2

Valor hora

Valor total $ 800.000 $ 280.000 $ 150.000 $ 250.000 $ 1.480.000

TOTAL

Tabla 6. DESCRIPCIONDE LOS MATERIALES A UTILIZAR

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MATERIAL
Erlenmeyer 250 ml Erlenmeyer 600 ml Erlenmeyer 1000 ml Transferpipetas de 100 a 1000

JUSTIFICACION
Recipiente para cultivos Recipiente para cultivos Recipiente para cultivos Control de muestras tomadas

RECURSOS Unidades Patrocinador Acadmicas $ 2.900,00 $ 4.060,00 $ 348,00 $ 2.320,00 $ 389.760 $ 121.800 $ 136.787 $ 206.480 $ 215.667 $ 275.500 $ 313.200 $ 53.522 $ 266.800 $ 232.000 $ 143.376 $ 89.320

TOTAL $ 2.900,00 $ 4.060,00 $ 348,00 $ 2.320,00 $ 389.760 $ 121.800 $ 136.787 $ 206.480 $ 215.667 $ 275.500 $ 313.200 $ 53.522 $ 266.800 $ 232.000 $ 143.376 $ 89.320 $ 2.453.841

glucosa anhidra (500g) maltosa (100g) BSA (500G) agar pda extracto de levadura (500g) sulfato acido de potasio(250g) sulfato de magnesio heptahidratado(500g) sulfato de manganeso tetrahidratado(100g) sulfato de zinc monohidratado(500g) sulfato de hierro heptahidratado(500g) cloruro de cobalto hexahidratado(125g) sulfato de amonio(1kg) TOTAL

Preparacin de estndares para curvas de calibracin Preparacin de estndares para curvas de calibracin Preparacin de estndares para curvas de calibracin Multiplicacin y aislamiento de microorganismos Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo Suplemento para el medio de cultivo

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