NUMERACION DE Bacillus cereus Fundamento Recin a comienzos de 1,950 se estableci que Bacillus cereus es un microorganismo capaz de provocar una

enfermedad transmitida por los alimentos (ETA). La estadstica de varios pases le adjudican a este agente porcentajes que varan del 1 al 23% de los brotes de origen bacteriano confirmados. B. cereus ha sido tambin recientemente sealado como agente de infecciones extraintestinales, El microorganismo es un bastn Gram positivo, mvil, aerobio-anaerobio facultativo esporulado. Dos formas clnicas diferentes de gastroenteritis se producen por la ingesta de alimentos confirmados con un nmero considerable de Bacillus Cereus el denominado sndrome diarreico y el emtico. Ambos sndromes se producen por diferentes toxinas excretadas por el microorganismo. El desarrollo de las clulas vegetativas tpicas ocurre entre 10C a 50C, con temperaturas ptimas entre 28C y 35C. Sin embargo, se han aislado variantes psicotrofas capaces de desarrollar y alterar la leche cruda a 5C. El rango de pH es de 4.35-4.90 a 9.30 y la actividad acuosa (aw) mnima 0.912-0.950. Bacillus Cereus; es un microorganismo de distribucin universal se halla presente en tierra, barro, sedimentos, aguas naturales, polvos vegetales y muchos tipos de alimentos. Las principales fuentes de contaminacin que provocan el sndrome diarreico se encuentran en los alimentos derivados de la carne, sopas, vegetales, salsas y flanes mientras que el arroz cocido (arroz frito servido por restaurantes asiticos) y pastas son la principal fuente de contaminacin para el desarrollo del sndrome emtico. Considerando que la temperatura ambiente permite la multiplicacin del microorganismo, los alimentos mal cocinados a base de cereales, principalmente la comida china, comida en restaurantes y las listas para el consumo, mantenidas a temperaturas inadecuadas, constituyen un riesgo potencial para la salud de los consumidores. El sndrome ocasionado por la toxina emtica reviste mayor gravedad que el de la toxina diarreica presentando un periodo de incubacin variable entre 1 y 6 horas con nuseas, vmitos y muy raramente diarrea, el nmero de clulas que se necesita para desencadenar la sintomatologa se cifra alrededor de los M 109 'UFC/g de alimento. El sndrome diarreico, se inicia entre las 8 y las 16 horas despus de la ingestin de alimentos contaminados con aproximadamente 105 UFC/g. La naturaleza ubicua de Bacillus Cereus hace que inevitablemente se le encuentre en los alimentos. Sin embargo su presencia en nmero

reducido no constituye un problema; por ello se debe prevenir la germinacin de las esporas y la multiplicacin de las clulas vegetativas en los alimentos cocidos listos para el consumo. 1. Objetivo Disponer de un mtodo para demostrar la presencia de un nmero elevado de Bacillus cereus. 2. Alcance Laboratorio de mediana y alta complejidad. 3. Consideraciones Generales Un hallazgo de nmeros altos de Bacillus cereus, en los alimentos puede demostrar su implicacin o participacin potencial en un brote de intoxicacin alimentaria. En los medios con yema de huevo, B.cereus, produce una zona opaca alrededor de las colonias, mientras que otras bacterias aerobias esporuladas, como B. thuringiensis, no producen esta zona opaca o es reducida. La metodologa analtica considera como medio de seleccin el sembrado en Agar Manitol Yema de Huevo Polimixina (MYP), incubando a 30C durante 24 a 48 horas, seguido de un recuento presuntivo de las colonias sospechosas de B. cereus; estas son rugosas, secas, con un sustrato de color rosado, rodeadas por un espeso anillo de precipitado blanco. Luego se aslan estas colonias en Agar Tripticasa de Soya (TSA) a partir del cual se realizan las prueba para la identificacin bioqumica de B. cereus: deteccin de B-hemlisis en Agar de Sangre, de movilidad y reduccin de nitrato y de licuefaccin de la gelatina. 4. Recursos Necesarios 4.1. Recursos Humanos Balarla elctrica de 2,000 g de capacidad, sensibilidad de 0,1 g Personal adiestrado en microbiologa. 4.2. Equipos y Materiales Bao Mara de 48-50C Incubadoras, 30C y 35C Stomacher y/o licuadoras Microscopio, portaobjetos microscpicos y placas de cubierta Contador de colonias Gradillas Mecheros Bunsen Mezclador Vortex Asas de alambre de platino o micrn Placas petri, estriles, 15 x100 mm Pipetas de 1,5 y 10 mL graduadas en unidades de 0.1 mL Tubos de ensayo 16 x 125 Plumn de tinta indeleble

Esptula de Drigalski 4.3. Medios de Cultivo Agar Manitol Yema de Huevo Polimixina (MYP) Agar Tripticasa de Soya (TSA) Infusin Cerebro Corazn (BHI) Agar Sangre Base Medio de Gelatina Agar movilidad-nitrato Peptona 4.4. Reactivas Alfanaftilamina, solucin acuosa al 0.5% en cido actico 5N cido sulfanlico, solucin acuosa al 0.8% en cido actico 5N Reactivos para tincin de Gram 4.5. Aditivos Emulsin de yema de huevo al 50% Sangre desfibrinada de ovino 4.6. Soluciones y Colorantes Solucin acuosa de polimixina B al 0.1% Solucin salina 4.7. Patrones y Cepas de Referencia Cepa Bacillus cereus. Mtodo de Recuento en Placa 5. Procedimiento DIA 1 Con ayuda de cucharas o tenedores estriles, pesar aspticamente, 10 g representativos de la muestra problema en el vaso homogeneizador y aadir 90 mL de agua peptonada al 0.1%; homogeneizar durante un minuto aproximadamente, a partir de esta dilucin inicial de 1:10, hacer diluciones decimales en serie en eI mismo diluyente (hasta 10-3). Sembrar 0.1 mL por duplicado de cada una de stas 3 diluciones en la superficie seca de placas de agar manitol yema de huevo polimixina (MYP) y con la ayuda de la esptula de Drigalsky o bastones de vidrio, esparcir cuidadosamente el inoculo sobre toda la superficie del agar hasta su completa absorcin. Incubar las placas invertidas a 30C durante 24a 48 horas. DIA 2 Dar corno recuento de B. cereus, las colonias que presenten bordes entrecortados, dimetro aproximadamente de 5 mm, rodeados de un halo amplio de hidrlisis de lecitina, sobre un fondo rojo violeta. Transplantar de 5 a 7 colonias tpicas a tubos con Agar Tripticasa de Soya (TSA) e incubar a 35C durante 24 horas.

DIA 3 A partir de los cultivos puros en TSA, realizar las pruebas Bioqumicas siguientes: Verificacin de la B-hemolisina en agar sangre. Transplantar mediante estras en placas de agar sangre. Incubar a 30C de 18 a 24 horas. Prueba de movilidad y reduccin de nitrato Transplantar por puntura a tubos con agar de movilidad nitrato. Incubar a 35C durante 18 a 24 horas. El B. cereus, presenta movilidad positiva en 50 a 90 % de los casos y reduce el nitrato a nitrito. Licuefaccin de la gelatina: Transplantar a tubos que contengan medio de gelatina. Incubar a 35C durante 24 horas. Antes de la lectura, dejar durante unas dos horas bajo refrigeracin.
DIA 4

La lectura de la B-hemolsina en Agar Sangre, el B.cereus, es B-hemoltico. En los tubos de movilidad nitrato, aadir 0,3 mL de cido sulfanlico y 0,3 mL de alfanaftolamina. La aparicin del color rojo naranja indica positividad. En el medio gelatina, antes de la lectura, dejar durante unas 2 horas bajo refrigeracin. La licuefaccin del medio caracteriza una reaccin positiva (B.cereus hace lquida la gelatina), En caso de hallar B. cereus, guardar las cepas positivas.
6. Informe

Cuando los resultados de las pruebas bioqumicas concuerdan con el patrn indicado, se confirma que el aislamiento es de B. cereus. Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o por mL, multiplicando el nmero de colonias en las placas por el factor de dilucin. Cuando la prueba es negativa se expresa como <102 UFC/g mL Cuando la prueba es positiva (nmero de colonias) por factor de dilucin. Cuando el nmero de colonias es excesivo >105 UFC/g mL.
Lmites Permisibles

El lmite permisible para B. cereus, en alimentos estar de acuerdo a la clase de alimentos y al criterio de interpretacin que se adopte.
8. Bioseguridad

Las muestras que se manejan pueden contener patgenos de clase 2 clase 3, es por lo tanto es necesario en todos los casos y durante el proceso se apliquen prcticas de bioseguridad acorde a estos niveles de riesgo.
9. Referencias

American Public Health Association, 1985. Standard Methods Examination of Dairy Products, 15th ed. APHA, Washington, DC. American Public Health Association, 1989. Standard Methods

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Examination of Dairy Products, 17th ed. APHA, Washington, DC. The International Commission on Microbiological Specifications for Foods of the International Association of Microbiological Societies. Microorganismos de los Alimentos- Tcnicas de Anlisis Microbiologa Vol. I, Segunda ed. Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa. Food and Drug Administration Bacteriolgical Analytical Manual. 7th Ed. 1992. Published and Distributed by AOAC International USA. Organizacin Panamericana de la Salud - Organizacin'Mundial de la Salud. Gua Tcnica N003 para el Estudio "Evaluacin del Riesgo Microbiolgico de los Alimentos Vendidos en la Va Pblica en ciudades de Amrica Latina" 1994.
10. Anexos

Flujograma de secuencia de anlisis Diagrama de secuencia de anlisis Cuadro de identificacin Bioqumica

NUMERACIN DE Bacillus cereus

10g Muestra + 90 mL AP 0.1%

DILUCIONES -2, -3
INCUBAR A 30 C/24-48 Hs.

AGAR MYP

CONTEO DE COLONIAS SOSPECHOSAS SELECCIN DE 3 5 COLONIAS

AGAR TSA

INCUBAR A 35 C/24 Hs.

AGAR GLUCOSA

CALDO VOGES PROSKAUER

AGAR NITRATO MOVILIDAD

INCUBAR A 35 C/24 Hs.

FERMENTACION DE LA GLUCOSA AMARILLO

ROJO (+)

NITRATO (+) MOVILIDAD (+)